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Tincin de Gram

Bacterias grampositivas de Bacillus anthracis (bacilos morados)


que producen una enfermedad llamada carbunco, encontrados
en una muestra de lquido cerebroespinal. Si hubiera una especie
de bacteria gram negativa, aparecera de color rosa. El resto son
los leucocitos que atacan la infeccin.

Bacterias Escherichia coli (gram negativas) vistas al microscopio


tras ser teidas con la tincin de Gram.

Bacterias Clostridium perfringens (grampositivas).

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un ti- Una tincin de Gram en la que se observa un mezclado de
po de tincin diferencial empleado en bacteriologa para Staphylococcus aureus (coco gram positivo) y Escherichia coli
la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras cl- (bacilo gramnegativo).
nicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian
Gram (1853-1938), que desarroll la tcnica en 18841 .
3. Dejar secar a temperatura ambiente o jarlas utiliSe utiliza tanto para poder referirse a la morfologa cezando un mechero.
lular bacteriana, como para poder realizar una primera
4. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al
aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerncalor (ameado tres veces aproximadamente).
dose bacterias grampositivas a las que se visualizan de
color morado, y bacterias gramnegativas a las que se vi5. Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de gensualizan de color rosa, rojo o grosella.
ciana) y esperar un minuto.
6. Enjuagar con agua no directamente sobre la muestra

Metodologa

7. Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.

1. Recoger muestras para ubicarlos en el microscopio.

8. Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos segn la concentracin del reactivo (parte

2. Hacer el extendido con un palillo de madera.


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TEORAS

crtica de la coloracin). (las gram - se decoloran, El matiz de color de la p-rosanilina se intensica al aulas gram + no)
mentar el nmero de grupos metilo en la molcula; por
consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es
9. Enjuagar con agua.
la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte ms
ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los
10. Tincin de contraste agregando safranina o fucsina nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se
bsica y esperar un minuto. Este tinte dejar de color reeren al nmero de grupos metilo contenidos. La lerosado-rojizo las bacterias gram negativas.
tra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El
violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se consi11. Lavar levemente con agua.
dera como el mejor colorante primario para teir por el
mtodo de Gram.
Para observar al microscopio ptico es conveniente haLa facultad de las clulas para tomar la coloracin gram
cerlo a 100x con aceite de inmersin.
no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que
las clulas de plantas y animales superiores no conservan
1.0.1 Explicacin
la primera coloracin; los mohos se tien con cierta irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas
colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni conslas clulas bacterianas (tanto gram positivas como gram
tante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del
negativas) a travs de la pared bacteriana. El lugol es un
medio, y quiz por otras causas.
compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI
(yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se je con mayor intensidad a
2 Teoras
la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas
y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pacristal violeta..
red celular sana. El mismo microorganismo, si sufre dao
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo.
realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el Esto indica la importancia de la pared para la retencin o
complejo I2 /cristal violeta. Los organismos gram positi- el escape del colorante. Una posible teora del mecanismo
vos no se decoloran, mientras que los gram negativos s de tincin es la siguiente:
lo hacen.
El colorante bsico entra al microorganismo, donde forPara poner de maniesto las clulas gram negativas se ma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o
utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un la acetona empleados para aclarar, deshidrata las parecolorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. des de los microorganismos gram positivos, tratados con
Despus de la coloracin de contraste las clulas gram mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atranegativas son rojas, mientras que las gram positivas pervesar. En las clulas gram negativas, los lpidos de la pamanecen violetas.
red (ms abundantes que en las clulas gram positivas) se
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape
tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que po- del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autone de maniesto las bacterias gram negativas. Al trmino res objetan esta teora, pero es indudable la importancia
del protocolo, las gram positivas se vern azul-violceas y general de la pared celular.
las gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin Varias son las teoras emitidas para explicar el mecanisde contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina). mo de la tincin de Gram. Stearn (1923) bas la suya en
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta,
an despus de tratarlos con un decolorante, y el color no
se modica al aadir ste; otros pierden con facilidad el
primer tinte, y toman el segundo. Los que jan el violeta,
se calican de gram positivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen la segunda, de gram negativos.
Basndonos pues, en la reaccin gram, podemos clasicar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los
colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados
dan en la coloracin gram. Los representantes ms usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o
de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre
atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina.

una combinacin qumica entre el colorante y las protenas de las bacterias, las protenas y aminocidos son cuerpos anfteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con
cidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones cidas, reaccionan con los cidos, y en
soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera, comprobaron que la reaccin de tincin de las bacterias obedece en gran parte a su contenido protenico;
estos microorganismos se conducen como cuerpos anfteros, al combinarse con colorantes cidos en soluciones
cidas y con los bsicos en medio alcalino. La combinacin con ambos tipos de colorante no se produce en el
punto isoelctrico. Como los microorganismos contie-

3
nen ms de una protena, ese punto no tiene un valor preciso y denido, sino que constituye ms bien una gama
o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Segn Stern y Stearn, los microorganismos gram positivos
tienen una escala isoelctrica de pH inferior a la de los
microorganismos gram negativos; y, a base de sus datos
experimentales, deducen las siguientes conclusiones:

coloracin de Gram y las protenas de la pared celular,


sera de esperar que las bacterias desintegradas por medios fsicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento
no podra cambiar el carcter qumico de los materiales
de dicha pared. Por el contrario, los grmenes gram positivos desintegrados pierden su capacidad de retener el
colorante primario y no se tien

La pared celular de los microorganismos gram positivos


Los microorganismos gram positivos pueden hacer- y gram negativos es permeable al violeta cristal. Sin emse gram negativos al aumentar la acidez.
bargo, la de los primeros no lo es al complejo de yodo y
colorante formado en el interior de la clula. Los resul Los microorganismos gram negativos pueden hacertados experimentales obtenidos con una difusin celular
se gram positivos al aumentar la alcalinidad.
exenta de protenas, y la escasa solubilidad del complejo
Los microorganismos de reaccin positiva a los co- de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen suslorantes cidos pueden hacerse gram negativos por tentar la opinin de que la reaccin gram positiva consiste esencialmente en la formacin, dentro de la clula, de
aumentar la alcalinidad.
una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante
Los microorganismos de reaccin positiva a los co- difcil de eliminar con el disolvente. La pared celular de
lorantes bsicos pueden hacerse gram negativos por los microorganismos gram positivos, a diferencia de la de
aumentar la acidez.
los gram negativos, sera prcticamente impermeable al
violeta cristal. Los microorganismos aparecern teidos
En la zona isoelctrica caracterstica de cada espe- despus de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido
cie es muy escasa la tendencia a retener cualquier el colorante en la supercie externa de la pared celular, y
colorante.
el disolvente eliminar sin dicultad el complejo formado
despus del tratamiento con yodo.
Parece estar bien demostrado que las protenas de
las bacterias no son simples, sino ms bien una d- Ni los grupos sulfhidrilo ni las protenas bsicas han inbil combinacin de sustancias protenicas con otras uido especcamente en el mecanismo del colorante de
Gram. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permealipoideas o grasas.
bilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa so La materia grasa extrada de los microorganismos lubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y
gram positivos diere de la obtenida de los micro- acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo consorganismos gram negativos, en que la primera con- tituido, son los principales factores que intervienen en el
tiene una proporcin mucho mayor de cidos no sa- mecanismo de esa coloracin.
turados que muestren gran anidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo)
empleados en la coloracin gram son oxidantes; su
3 Bacterias resistentes a la tincin
efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxide Gram
dada un carcter ms cido. Esto aumenta la anidad de un microorganismo por los colorantes bsicos.
Las siguientes bacterias de naturaleza gram positiva se
tien como gram negativas:
El cambio de respuesta a la coloracin de Gram
con el tiempo es propio, sobre todo, de los microor Mycobacterias (estn encapsuladas).
ganismos dbilmente gram positivos cultivados en
Mycoplasmas (no tienen pared).
los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reaccin se vuelve cida en el curso
Formas L (prdida ocasional de la pared).
del desarrollo.
Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared, respectivamente).
Gianni (1952) comprob que las bacterias gram positivas Bacillus subtilis y Bacillus anthracis originaban una
reaccin negativa cuando los cultivos databan de dos a
tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia gram posi- 4 Utilidades
tiva debajo de la pared celular y se inverta la reaccin.
Otra explicacin de la reaccin de Gram puede ser la po- En el anlisis de muestras clnicas suele ser un estudio
sible existencia de una capa exterior alrededor de un n- fundamental por cumplir varias funciones:
cleo gram negativo. Libenson y Mcllroy, han comunicado
Identicacin preliminar de la bacteria causal de una
que si la reaccin gram positiva depende de que se forme
infeccin.
una combinacin compleja entre los componentes de la

7 BIBLIOGRAFA
Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identicados en
la tincin de Gram se deben de corresponder con
aislamientos bacterianos realizados en los cultivos.
Si se observan mayor nmero de formas bacterianas
que las aisladas hay que reconsiderar los medios de
cultivos empleados as como la atmsfera de incubacin.

A partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esfrica. Pueden aparecer aislados despus de la divisin celular (micrococos), aparecer por pares (diplococos), formar
cadenas (estreptococos), o agruparse de manera irregular
(estalococos).
Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen
agruparse en forma de cadena (estreptobacilos) o en empalizada.
Tambin pueden distinguirse los espirales, que se clasican en espirilos (si son de forma rgida) o espiroquetas
(si son blandas y onduladas). Si por el contrario, poseen
forma de coma (o curvados) entonces se los designa
vibrios.

terias gram negativas es soluble en solventes orgnicos,


como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa
de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo
que se form previamente, y por lo tanto este complejo
se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Por
el contrario, las bacterias gram positivas, al poseer una
pared celular ms resistente y con mayor proporcin de
peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros, cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el
complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violeta.

6 Factores que alteran la tincin de


Gram
Edad de la bacteria.
Errores del operador.
Uso de antibiticos

A pesar de la gran utilidad de la tincin de Gram, este m5 Fundamentos de diferenciacin todo debe ser valorado con precaucin, ya que la reaccin
puede variar segn la edad de las clulas (cultivos viejos
de gram positivo y gram negati- de bacterias gram positivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teirse como gram negativos) y la tcnica
vo
empleada (al decolorar por un tiempo muy prolongado se
puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tiLos fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias an como gram negativas). Por esta situacin, junto a la
entre las paredes celulares de las bacterias gram positivas muestra deben teirse controles con bacterias gram posiy gram negativas
tivas (por ejemplo Staphylococcus aureus) y gram negatiLa pared celular de las bacterias gram positivas posee una vas (por ejemplo, Escherichia coli).
gruesa capa de peptidoglicano, adems de dos clases de
cidos teicoicos: anclado en la cara interna de la pared
celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el 7 Bibliografa
cido lipoteicoico, y ms en la supercie, el cido teicoico
que est anclado solamente en el peptidoglicano (tambin
1.-Gram, C. (1884). The dierential staining of Schiconocido como murena).
zomycetes in tissue sections and in dried preparaPor el contrario, la capa de peptidoglucano de las bacte- tions. Fortschritte der Medizin, 2, 185-9. Disponible
rias gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una en http://www.asmusa.org/ccLibraryFiles/FILENAME/
segunda membrana plasmtica exterior (de composicin 0000000235/1884p215.pdf .
distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene
2.-Aulton Michael E. (2004): Ciencia y diseo de formas
una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior farmacuticas. Espaa: Elsevier, segunda edicin, 2004.
est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido.
3.-Bergey, David H.; Holt, John G.; Krieg, Noel R.;
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferen- Sneath, Peter H. A. (1994): Bergeys manual of determicialmente debido a estas diferencias constitutivas de su native bacteriology. Lippincott Williams & Wilkins, nopared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el mate- vena edicin, 1994. ISBN 0-683-00603-7.
rial que conere su rigidez a la pared celular bacteriana, y 4.-Madigan, M. T; Martinko J., Parker J. (2004): Brock
las gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin biology of microorganisms. Lippincott Williams & Wilkins, dcima edicin, 2004. ISBN 0-13-066271-2.
que las gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la deco- 5.-Sgaard, M.; Nrgaard, M.; Schnheyder, H. (2007):
loracin se debe a que la membrana externa de las bac- First notication of positive blood cultures: high accu-

5
racy of the Gram stain report, artculo en la revista Journal of Clinical Microbiology, 45: pg. 1113; 2007.

8 ORIGEN DEL TEXTO Y LAS IMGENES, COLABORADORES Y LICENCIAS

Origen del texto y las imgenes, colaboradores y licencias

8.1

Texto

Tincin de Gram Fuente: https://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram?oldid=91003119 Colaboradores: Javicaci, Rosarino,


Ascnder, Ramjar, El Moska, Huhsunqu, Natrix, RobotQuistnix, Omega~eswiki, Alhen, Yrbot, Maleiva, Vitamine, YurikBot, Gaijin,
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8.2

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(PHIL), with identication number #2995. Artista original:
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8.3

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