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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA


PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA

VINICIUS VESCOVI

EXTRAO, PURIFICAO E IMOBILIZAO DE


LIPASES VEGETAIS DESTINADAS SNTESE DE
BIODIESEL E STERES

SO CARLOS-SP
2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS


DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA

VINICIUS VESCOVI

EXTRAO, PURIFICAO E IMOBILIZAO DE


LIPASES VEGETAIS DESTINADAS SNTESE DE
BIODIESEL E STERES

Dissertao submetida ao Programa de PsGraduao em Engenharia Qumica da


Universidade Federal de So Carlos como
requisito para a obteno do ttulo de Mestre
em Engenharia Qumica, rea de concentrao
em Pesquisa e Desenvolvimento em Processos
Qumicos.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Waldir Tardioli.

SO CARLOS-SP
2012

Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da


Biblioteca Comunitria da UFSCar

V575ep

Vescovi, Vinicius.
Extrao, purificao e imobilizao de lipases vegetais
destinadas sntese de biodiesel e steres / Vinicius
Vescovi. -- So Carlos : UFSCar, 2012.
79 f.
Dissertao (Mestrado) -- Universidade Federal de So
Carlos, 2012.
1. Engenharia qumica. 2. Extrao. 3. Enzimas purificao. 4. Lipase. 5. Imobilizao. 6. Adsoro
hidrofbica. I. Ttulo.
CDD: 660 (20a)

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratrio de Engenharia de Processos


Enzimticos (LabEnz) do Departamento de Engenharia Qumica (DEQ) da Universidade
Federal de So Carlos (UFSCar).
Contou com o apoio financeiro do programa PRH-ANP/MCT N 44.

AGRADECIMENTOS
difcil agradecer todas as pessoas que de algum modo, nos momentos serenos
e ou apreensivos, fizeram ou fazem parte da minha vida, por isso agradeo primeiramente a
todos de corao.
Agradeo a toda minha famlia pelo apoio, em especial, aos meus pais pela
determinao e luta na minha formao e tambm pelo apoio incondicional durante essa longa
caminhada, e os meus avs pelos conselhos e ensinamentos.
Ao Professor Paulo que tanto contribuiu para o meu crescimento durante a
orientao dessa dissertao e pela sua enorme pacincia.
Aos companheiros de repblica Gabriel, Carlos e o agregado Alfredo, pela
companhia, amizade, apoio e pelos importantes momentos de descontrao.
A coordenao do Programa de Ps-graduao em Engenharia Qumica pela
confiana.
Agncia Nacional do Petrleo ANP e Financiadora de Estudos e
Projetos FINEP que por meio do Programa de Recursos Humanos da ANP para o Setor de
Petrleo, Gs e Biocombustveis PRH-ANP/MCT, financia o PRH 44 - Formao de
Pessoal em Biocombustveis

RESUMO
Lipases (glicerol ster hidrolases, EC 3.1.1.3) catalisam reaes de hidrlise,
esterificao e transesterificao. As lipases podem ser obtidas de fontes animais, microbianas
e vegetais, sendo que as de origem microbiana representam a grande maioria das lipases
produzidas atualmente. No entanto, o uso dessas enzimas em escala industrial ainda restrito
devido ao alto custo de produo, favorecendo, assim, a busca por novas fontes de lipase. Este
trabalho teve por objetivo a utilizao de sementes de oleaginosas como fontes de lipases,
visando sua aplicao na sntese de steres de cidos graxos e hidrlise de leos vegetais.
Inicialmente sementes de soja, girassol e mamona foram trituradas em tampo fosfato de
sdio 50 mM, pH 7, seguida por agitao de 11 horas em temperatura ambiente. Sob essas
condies, as produtividades mdias foram de aproximadamente 237, 100 e 81 U/g de
sementes secas. Os slidos foram removidos do extrato enzimtico bruto por filtrao e o
extrato enzimtico foi clarificado por centrifugao. O extrato clarificado foi purificado por
ultrafiltrao em membrana de polipropileno com dimetro de corte de 100 kDa. Esse
procedimento permitiu a recuperao de 40, 35 e 11% da atividade inicialmente presente nos
extratos enzimticos brutos obtidos a partir de sementes de soja, girassol e mamona,
respectivamente. Lipases de sementes de soja, girassol e mamona foram imobilizadas por
adsoro hidrofbica em slica ativada com grupos octil (slica-octil), obtendo-se
biocatalisadores com atividades recuperadas de 683%, 413% e 1494%, respectivamente.
Eletroforese SDS-PAGE do extrato enzimtico da soja e ensaios de atividade durante a
imobilizao em slica-octil sugeriram a presena de duas isoformas de lipases, com massas
moleculares de aproximadamente 20 e 30 kDa. O pH e a temperatura de mximas atividades
hidrolticas do extrato enzimtico da soja foram de 8,0 e 47C, respectivamente, enquanto
para a enzima imobilizada foram de 6,0 e 57C, respectivamente. O tempo de meia-vida da
enzima imobilizada a 50C e pH 7 foi de 8 h. Na sntese de butirato de butila, realizada a
40C, obteve-se uma converso de aproximadamente 15% em 9 h de reao. A produtividade
de lipases de sementes de soja pode ser aumentada por germinao das sementes por 12 h,
seguida da extrao a 25C por 12 h com soluo salina (tampo fosfato de sdio, pH 7,0)
com uma concentrao de 100 mM e adio de Tris-HCl 1% (m/v).
Palavras-chave: Extrao; Purificao; Lipase vegetal; Imobilizao; Adsoro hidrofbica;
Slica-octil.

ABSTRACT
Lipases (triacyl-glycerol-hydrolases) are enzymes that catalyze hydrolysis,
esterification and transesterification reactions. Lipase can be obtained from animals, microbial
and vegetable sources. Nowadays, commercial lipases are majority produced from microbial
sources. The use of these enzymes in industrial scale is still limited because of its high cost of
production, favoring then, the search for new sources of lipases. This work aimed the
utilization of oilseeds as lipase sources, aiming its use in the synthesis of fatty esters and in
the hydrolysis of vegetable oils. To achieve this goal, the protein content of seeds of
sunflower, castor bean and soybean was solubilized in buffered medium. The oilseeds were
crushed in the presence of sodium phosphate buffer pH 7.0 (50 mM), followed by 11 hconstant stirring at room temperature. Under these conditions, the average productivities were
ca. 237, 100 and 81 U/g of dried seeds. The solids were withdrawal from the crude extract by
filtration, followed by centrifugation. The clarified crude extract was purified by ultrafiltration
in 100 kDa cut-off polypropylene membrane. This procedure allows an activity recovery of
40, 35 and 11% for soybean, sunflower and castor bean, respectively. The purified lipases
from soybean, sunflower and castor bean seeds were immobilized on hydrophobic support
(silica-octyl) by interfacial adsorption, yielding biocatalysts with recovered activities of
683%, 413% and 1494%, respectively. SDS-PAGE electrophoresis and activity assays during
the immobilization of the purified lipases on silica-octil suggested the presence of two lipase
isoforms with molecular weights around of 20 and 30 kDa. Soluble soybean lipase exhibited
optimum pH and temperature for hydrolysis of olive oil around 8.0 and 47 C, respectively,
while for immobilized soybean lipase (derivative) were 6.0 and 57C, respectively. The halflife of the immobilized lipase at 50oC and pH 7 was around 8 h. The synthesis of butyl
butyrate at 40oC catalyzed by immobilized lipase yield a conversion of approximately 15%
after 9 h of reaction. The productivity of lipases from soybean seeds can be increased by
germination of the seeds for 12 h, followed by extraction at 25oC for 12 h with salt solution
(sodium phosphate buffer pH 7.0) at 100 mM concentration, supplemented with 1% (m/v)
Tris-HCl.
Keywords: Extraction; Purification; Plant lipase; Immobilization; Hydrophobic adsorption;
Silica-octyl.

LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1 - Representao esquemtica das reaes de hidrlise, esterificao e
interesterificao catalisadas por lipase. ..................................................................................... 7
Figura 2 - Reaes catalisadas por lipases do tipo no especifica e 1,3 especifica. ................... 8
Figura 3 - Mecanismo cataltico da lipase. (a) ataque nucleoflico da hidroxila da serina
ao carbono suscetvel da ligao ster; (b) intermedirio tetradrico; (c) intermedirio acil
enzima e ataque nucleoflico da gua; (d) intermedirio tetradrico; (e) enzima livre. ............. 9
Figura 4 - Superposio dos esqueletos das lipases de Rhizomucor miehei (a) e de
pncreas humano (b), mostrando a mudana conformacional da tampa da enzima. A
tampa esta destacada em verde. ................................................................................................ 10
Figura 5 - Atividade em funo do tempo de germinao. ...................................................... 13
Figura 6 - Classificao dos suportes para a imobilizao de enzimas. ................................... 22
Figura 7 - Adsoro interfacial de lipase sobre uma superfcie hidrofbica. ........................... 24
Figura 8 - Reao de alcolise e transesterificao. ................................................................. 27
Figura 9 - Produo de biodiesel por transesterificao alcalina (A) e enzimtica (B) de
leos e gorduras. ....................................................................................................................... 28
Figura 10 - Nmero de publicaes entre 1996 e 2011 usando como palavras chave lipase
e biodiesel. ................................................................................................................................ 29
Figura 11 Diagrama de blocos do processo (I) de extrao e purificao de lipases
vegetais ..................................................................................................................................... 34
Figura 12 Diagrama de blocos do processo (II) de extrao e purificao de lipases
vegetais ..................................................................................................................................... 35
Figura 13 - Esquema geral de funcionamento do sistema de ultrafiltrao tangencial. ........... 36
Figura 14 Perfis de protenas e atividade hidrofbica no sobrenadante de imobilizao
de lipase de soja em octil-slica (25C, pH 7,0)........................................................................ 47
Figura 15 Eletroforese SDS-PAGE (gel de poliacrilamida 12%) dos extratos
enzimticos de sementes de soja .............................................................................................. 50
Figura 16 Perfis de atividade em funo da temperatura (pH 7,0) e do pH (37 C).
Atividades medidas com azeite de oliva como substrato. A maior atividade foi tomada
como 100%. .............................................................................................................................. 51
Figura 17 Estabilidade trmica de lipase de soja solvel e imobilizada em octil-slica, a
50C, pH 7,0. ............................................................................................................................ 53
Figura 18 Consumo de butanol na sntese de butirato de butila a 40C em heptano.
Relao cido butrico/n-butanol = 1,5 (mol/mol), concentrao de biocatalisador = 0,05
g/ml. .......................................................................................................................................... 53
Figura 19 Efeito da fora inica na extrao de lipases de gros de soja .............................. 55
Figura 20 Efeito da germinao na extrao da lipase a partir da semente de soja (% em
relao a maior atividade)......................................................................................................... 56
Figura 21 Efeito do tempo na extrao da lipase a partir da semente de soja. ...................... 57
Figura 22 Efeito da adio de aditivos no tampo de extrao (fosfato de sdio 50 mM)
de lipases a partir de sementes de soja. .................................................................................... 58

LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Aplicaes industriais da lipases. ............................................................................ 6
Quadro 2 - Propriedades complementares atribudas ao biodiesel em comparao ao leo
diesel comercial. ....................................................................................................................... 25
Quadro 3 - Vantagens e desvantagens do processo qumico e enzimtico na produo do
biodiesel. ................................................................................................................................... 29

LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Extrao de lipases a partir de diferentes vegetais. ................................................ 15
Tabela 1 Extrao de lipases a partir de diferentes vegetais (Continuao). ........................ 16
Tabela 1 Extrao de lipases a partir de diferentes vegetais (Continuao). ........................ 17
Tabela 2 Purificao de lipases a partir de diferentes vegetais. ............................................ 19
Tabela 2 Purificao de lipases a partir de diferentes vegetais (Continuao). .................... 20
Tabela 3 - Produo anual de biodiesel em m3 no Brasil nos ltimos anos. ............................ 25
Tabela 4 Produtividade de lipases de sementes de oleaginosas, atividades especficas
dos extratos enzimticos (bruto e purificado) e parmetros de purificao. ............................ 43
Tabela 5 Atividades totais (em Unidades) e rendimentos de extrao e purificao de
lipases de sementes de oleaginosas (soja, girassol e manona) ................................................. 44
Tabela 6 Parmetros da imobilizao de lipases vegetais em octil-slica (25C, pH 7, 15
horas) ........................................................................................................................................ 45
Tabela 7 Produtividade de lipase de gros de soja, atividades especficas dos extratos
enzimticos (bruto e purificado) e parmetros de purificao. ................................................ 46
Tabela 8 Parmetros da imobilizao de lipase de soja em octil-slica (25C, pH 7, 2,5
horas) ........................................................................................................................................ 48
Tabela 9 Comparativo do efeito da temperatura na extrao de lipase a partir de sementes
de soja ....................................................................................................................................... 55
Apndice 1 - Lipases de origem vegetal ................................................................................... 75
Anexo 1 - Lipases obtidas a partir de fungos ........................................................................... 78
Anexo 2 - Lipases obtidas a partir de bactrias ........................................................................ 79

SUMRIO
1 INTRODUO ..................................................................................................................... 1
1.1

Objetivos ............................................................................................................................. 3

2 REVISO BIBLIOGRFICA ............................................................................................. 4


2.1 Enzimas ...................................................................................................................................... 4
2.2 Lipases ....................................................................................................................................... 6
2.2.1 Reaes catalisadas por lipases ........................................................................................... 6
2.2.2 Especificidade das lipases .................................................................................................... 7
2.2.3 Mecanismo de reao das lipases ....................................................................................... 8
2.2.4 Estrutura das lipases .......................................................................................................... 10
2.2.5. Fontes vegetais de lipases ................................................................................................ 11
2.2.5.1 Germinao ................................................................................................................... 11
2.2.5.2 Extrao de lipases vegetais.......................................................................................... 13
2.2.5.3 Purificao de lipases .................................................................................................... 18
2.3 Imobilizao enzimtica .......................................................................................................... 21
2.4 Imobilizao de lipases ............................................................................................................ 23
2.5 Biodiesel .................................................................................................................................. 24
2.5.1 Matrias-primas para a produo do biodiesel ................................................................. 26
2.5.2 Processo de produo do biodiesel ................................................................................... 26
2.6 Produo de steres ................................................................................................................ 30

3. MATERIAIS E MTODOS .............................................................................................. 31


3.1 Material ................................................................................................................................... 31
3.1.1 Sementes, suporte e substratos ........................................................................................ 31
3.1.2 Reagentes especficos e membranas ................................................................................. 31
3.2 Mtodos .................................................................................................................................. 32
3.2.1 Determinao da concentrao de protena ..................................................................... 32
3.2.2 Determinao das atividades hidrolticas .......................................................................... 32
3.2.2.1 Hidrlise do azeite de oliva ........................................................................................... 32
3.2.2.2 Hidrlise do butirato de p-nitrofenila (PNPB) ............................................................... 33
3.2.3 Eletroforese SDS - PAGE ..................................................................................................... 33
3.2.4 Extrao e purificao de lipases vegetais ......................................................................... 34
3.2.4.1 Extrao ......................................................................................................................... 35
3.2.4.2 Purificao ..................................................................................................................... 36
3.2.4.2.1 Centrifugao ............................................................................................................. 36
3.2.4.2.2 Ultrafiltrao .............................................................................................................. 36
3.2.4.3 Produtividade ................................................................................................................ 37
3.2.4.4 Avaliao de diferentes parmetros na extrao de lipase vegetal ............................. 37

3.2.4.4.1 Efeito da temperatura ................................................................................................. 37


3.2.4.4.2 Efeito da fora inica ................................................................................................... 38
3.2.4.4.3 Efeito da germinao ................................................................................................... 38
3.2.4.4.4 Efeito do tempo ........................................................................................................... 38
3.2.4.4.5 Efeito da presena de aditivos ..................................................................................... 38
3.2.5 Imobilizao de lipase em suporte hidrofbico ................................................................. 39
3.2.5.1 Modificao qumica da superfcie da slica com grupos octil ...................................... 39
3.2.5.2 Imobilizao de lipase em octil-slica ............................................................................ 39
3.2.5.3 Clculo dos parmetros de imobilizao ...................................................................... 39
3.2.5.3.1 Rendimento de imobilizao em termos de protena ............................................... 39
3.2.5.3.2 Rendimento de imobilizao em termos de atividade .............................................. 40
3.2.5.3.3 Atividade recuperada ................................................................................................. 40
3.2.6 Caracterizao da lipase isolada (solvel e imobilizada) ................................................... 40
3.2.7 Aplicao de lipase de soja imobilizada na produo de steres ...................................... 41
3.2.7.1 Produo de biodiesel (mistura de steres etlicos) ..................................................... 41
3.2.7.2 Produo de butirato de butila ..................................................................................... 41

4 RESULTADOS E DISCUSSO ........................................................................................ 42


4.1 Extrao de lipases a partir de sementes de oleaginosas ....................................................... 42
Todas as etapas foram realizadas em triplicatas e os desvios padres no excederam a 6% ... 44
4.2 Extrao, purificao, imobilizao e caracterizao de lipase isolada de gros de soja ....... 45
4.2.1 Imobilizao em slica-octil de lipase de soja purificada pelo processo II ......................... 46
4.2.2 Eletroforese........................................................................................................................ 48
4.2.3 Propriedades catalticas do extrato enzimtico e da lipase imobilizada ........................... 50
4.2.3.1 Efeito do pH e temperatura na atividade da lipase livre e imobilizada ........................ 51
4.2.3.2 Estabilidade trmica ...................................................................................................... 52
4.2.4 Sntese do butirato de butila ............................................................................................. 53
4.2.5 Produo de biodiesel........................................................................................................ 54
4.3 Extrao de lipases a partir de sementes de soja ................................................................... 54
4.3.1 Efeito da temperatura........................................................................................................ 54
4.3.2 Efeito da fora inica ......................................................................................................... 55
4.3.3 Efeito da germinao ......................................................................................................... 55
4.3.4 Efeito do tempo ................................................................................................................. 56
4.3.4 Efeito da presena de aditivos ........................................................................................... 57

5 CONCLUSES.................................................................................................................... 59
6 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTURO ............................................................... 61

7 REFERNCIAS .................................................................................................................. 62
APNDICES ........................................................................................................................... 75
ANEXOS ................................................................................................................................. 78

1 INTRODUO
Uma gama de produtos de interesse econmico (cidos orgnicos, steres,
biocombustveis, antibiticos, vitaminas, aromas, protenas, dentre muitos outros) pode ser
obtida a partir de processos que utilizam microrganismos, clulas animais, vegetais, ou
enzimas.
A grande motivao pelo uso de enzimas deve-se, dentre outras vantagens,
reduo do consumo energtico do processo, pois enzimas atuam em condies brandas de
temperatura e presso, e reduo dos custos na etapa de purificao do produto final, pois,
devido alta seletividade e especificidade das enzimas, no h a formao de subprodutos
indesejveis.
O uso de enzimas industriais tem-se intensificado nos ltimos anos. O mercado
global dessas enzimas atingiu US$ 3,6 bilhes em 2010, e espera-se que em 2016 atinja US$
6 bilhes (BCC RESEARCH, 2011).
Dentre as diversas enzimas industriais, comercializadas mundialmente,
merecem destaque as proteases, amilases, celulases e lipases. A utilizao de lipases nos
setores de alimentos, bebidas e produtos de limpeza, e ainda, avanos biotecnolgicos na rea
de biocombustveis, alavancaram o crescimento do mercado mundial desta enzima.
As lipases (glicerol ster hidrolases, E.C 3.1.1.3), enzimas capazes de catalisar
reaes de hidrlise, esterificao e transesterificao, destacam-se dentre as enzimas mais
investigadas e com vasto potencial de aplicao industrial.

Diante da versatilidade das

reaes catalisadas pela lipases, a aplicao industrial destas enzimas estende-se a vrios
setores. Reaes catalisadas por lipases podem ser usadas industrialmente para vrios
propsitos, tais como, hidrlise de leos e gorduras, sntese de steres de cidos graxos como
ingredientes de cosmticos ou surfactantes, produo de intermedirios para sntese orgnica,
etc. (BASTIDA et al., 1998; PALOMO et al., 2002).
Outra caracterstica marcante das lipases a sua ativao na presena de
interfaces hidrofbicas (micelas de substrato, solventes orgnicos imiscveis, etc.). Na
ausncia de interfaces, o stio ativo das lipases frequentemente coberto por uma tampa,
tornando-o inacessvel ao substrato. Entretanto, na presena de interfaces hidrofbicas a
estrutura tridimensional da lipase rearranjada, levando abertura da tampa. Essas
mudanas conformacionais expem superfcies hidrofbicas da enzima que podem interagir
com interfaces hidrofbicas, conferindo funcionalidade enzima (BASTIDA et al., 1998).
1

Enzimas so estruturas frgeis, facilmente inativadas em condies extremas


de pH e temperatura. Alm disso, so solveis e esto em baixa concentrao no meio
reacional, o que torna sua recuperao invivel do ponto de vista econmico. Esses
inconvenientes podem ser contornados ou pelo menos minimizados com a imobilizao da
enzima em um suporte slido. Enzimas imobilizadas so normalmente mais estveis que as
solveis, podem ser facilmente recuperadas e reutilizadas em vrias bateladas, permitem fcil
controle do processo (formao de menos subprodutos), reduo do volume reacional e
utilizao de diferentes configuraes de reatores (batelada, leito fixo, fluidizado, etc.)
(ZANIN; MORAES, 2004). Lipases podem ser imobilizadas por vrios mtodos, incluindo
adsoro, ligao covalente ou encapsulamento (PALOMO et al. 2002; MATEO et al. 2007;
MENDES, 2009). Entretanto, devido ao seu mecanismo de ativao interfacial, as lipases
podem ser seletivamente imobilizadas sobre superfcies hidrofbicas, podendo-se obter em
uma nica etapa purificao, ativao e estabilizao da enzima (BASTIDA et al., 1998;
PALOMO et al., 2002; FERNNDEZ-LORENTE et al., 2008, CABRERA et al., 2009). A
adsoro interfacial envolve regies hidrofbicas que circundam o stio ativo da enzima e a
face interna da tampa. Portanto, lipases adsorvem-se a superfcies hidrofbicas com a tampa
aberta (forma ativa), tornando o stio cataltico acessvel a pequenos substratos, mesmo que
este esteja voltado para o suporte (VERGER et al., 1997; BASTIDA et al., 1998;
FERNNDEZ-LORENTE et al., 2008, CABRERA et al., 2009).
Lipases podem ser obtidas de tecidos vegetais (tecidos de reserva) e animais
(pancretica, heptica, e gstrica) ou produzidas por fermentao de fungos e bactrias
(SHARMA; CHIST; BANERJEE, 2001; PAQUES; MACEDO, 2006; POLIZELLI, 2008). O
alto custo de isolamento e purificao de enzimas microbianas e animais podem restringir sua
aplicao industrial em larga escala. Entretanto, esse custo pode ser reduzido pelo uso de
lipases vegetais, que podem ser obtidas a partir de fontes renovveis produzidas em larga
escala e as quais no exigem alto grau de purificao (CARO et al., 2000), e utilizando-se
ainda de mtodos de purificao mais simples e com custos mais baixos, como por exemplo a
utilizao da ultrafiltrao em membranas. Diante de tal contexto este trabalho teve como
objetivo principal a obteno de uma lipase imobilizada de baixo custo com propriedades
adequadas para sua aplicao em sntese de steres e biodiesel.

1.1 Objetivos
(i) Seleo de fontes vegetais produtoras de lipases;
(ii) Preparao de suporte hidrofbico e funcionalizado base de slica;
(iii)Extrao, purificao e imobilizao de lipases obtidas a partir das sementes
selecionadas em (i);
(iv) Seleo da melhor semente a ser utilizada nas snteses de ster e biodiesel;
(v) Caracterizao (pH e temperatura timos) da lipase selecionada em (iv);
(vi) Uso do biocatalisador em reaes de esterificao e transesterificao.

2 REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 Enzimas
Enzimas desempenham a funo de catalisarem reaes biolgicas atravs da
quebra ou juno de molculas para formar novos

compostos,

combinando-se

transitoriamente com os reagentes para produzir um estado de transio que apresenta uma
energia de ativao, energia necessria para que se rompa ou forme uma ligao qumica,
menor que a do estado de transio da reao no catalisada, acelerando assim as reaes. Um
bom exemplo para tal acelerao foi comparao feita por LEHNINGER (1976), onde a
decomposio do perxido de hidrognio foi realizada primeiramente na ausncia de
catalisador, sendo depois utilizado um catalisador qumico (platina) e por fim a decomposio
na presena de um catalisador enzimtico (catalase). O resultado observado foi que o uso da
platina reduziu a energia livre de ativao da reao de 75,2 kJ/mol (decomposio realizada
sem a catalisador) para 48,9 kJ/mol, enquanto que o uso de catalase reduziu a energia livre da
decomposio do perxido de hidrognio para 23,0 kJ/mol.
A complexa estrutura molecular enzimtica majoritariamente constituda por
uma parte proteica, porm a ela podem estar associadas outras molculas, como carboidratos e
lipdeos. Para apresentar atividade cataltica, algumas enzimas requerem a participao de
molculas menores (cofatores) de natureza no proteica, como ons inorgnicos (Fe2+, Mg2+,
Mn2+ ou Zn2+) ou molculas orgnicas (NELSON; COX, 2011).
As protenas so heteropolmeros formados por aminocidos ligados entre si
por meio de ligaes peptdicas. Os aminocidos, por sua vez, so molculas orgnicas que
possuem ligados ao mesmo tomo de carbono (denominado de carbono ) um tomo de
hidrognio, um grupo amino, um grupo carboxlico e uma cadeia lateral R, caracterstica
para cada aminocido. Essa cadeia lateral o que difere os aminocidos em sua estrutura,
tamanho, cargas eltricas e solubilidade em gua. Alm de conferir propriedades fsicoqumicas diferentes a cada aminocido, as cadeias laterais so tambm responsveis por
foras estabilizadoras (interaes fracas do tipo ligaes de hidrognio, hidrofbicas,
eletrostticas, etc.) que mantm as estruturas conformacionais enoveladas das protenas
(NELSON; COX, 2011).
A variao no nmero e na sequncia desses aminocidos permite que haja um
grande nmero de protenas com diferentes funes. No caso das enzimas, o nmero de
4

aminocidos componentes de sua cadeia e a ordem em que eles se encontram, vo determinar


a sua estrutura e consequentemente a forma de interao no meio reativo. Atualmente estimase que das 25000 enzimas presentes na natureza, cerca de 2800 foram classificadas e perto de
400 so comercializadas na forma pura (JOO; ZANELLA, 2000).
Na classificao das enzimas, o nome da mesma no especifica a sua estrutura,
mas contrariamente, define a principal reao catalisada e, por isso, as enzimas so
classificadas em seis classes diferentes, cada uma com subclasses, com base nos tipos de
reaes que catalisam, a saber: oxidorredutases, transfereases, hidrolases, liases, isomerases e
ligases (NELSON; COX, 2011).
A cada enzima atribudo um nmero classificatrio de quatro dgitos, que
identifica o tipo de reao catalisada por ela. Por exemplo, a enzima lipase, segundo a Unio
Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular (IUBMB), classificada como
triacilglicerol hidrolase, EC 3.1.1.3, onde EC significa Enzyme Commission, o primeiro digito
(3) refere-se ao nome da classe (hidrolase); o segundo digito (1) refere-se subclasse (atua
sobre ligaes ster); o terceiro digito (1) refere-se sub-subclasse (carboxil ster hidrolase);
e o quarto digito (3) o numero de srie dentro da sub-classe e significa que a enzima atua
sobre triacilglicerdeos (SAAD, 2005).
As enzimas tm grande importncia na rea de biotecnologia, sendo que a
utilizao desses biocatalisadores no setor industrial tem-se mostrado uma opo interessante,
tanto em termos de processo como em termos ambientais.
O mercado mundial de enzimas est em franca ascenso. Segundo relatrio
publicado em maro de 2012 pela Business Communications Company Inc. (BCC Research),
o mercado global de enzimas industriais (enzimas para detergentes, papel e celulose,
manufatura de couros, alimentos, bebidas, alimentao animal, etc.) foi avaliado em US$3,6
bilhes em 2010, com uma projeo para 2016 de US$6 bilhes. Enzimas para alimentos e
bebidas compreendem o maior segmento das enzimas industriais com receitas prximas a
US$1,2 bilho em 2010 e expectativa de US$2,1 bilhes para 2016. O segundo maior
segmento so as enzimas tcnicas (enzimas destinadas indstria txtil e de produtos de
limpeza), com receitas de aproximadamente US$1,1 bilho em 2010 e expectativa de US$1,7
bilho para 2016.

2.2 Lipases
Lipases (triacilglicerol ester hidrolases, EC 3.1.1.3) compreendem um grupo de
enzimas hidrolticas que atuam na interfase orgnica aquosa, catalisando a hidrlise de leos
e gorduras com a liberao de cidos graxos, diacilgliceris, monoacilgliceris e glicerol. Em
meios com baixa concentrao de gua, as lipases catalisam reaes de esterificao,
transesterificao e interesterificao (MENDES et al., 2012). Essa versatilidade das lipases
permite que estas enzimas sejam empregadas em diversos setores da indstria (Quadro 1) na
formulao de detergentes, produo de frmacos, cosmticos, alimentos, perfumaria,
diagnsticos mdicos, sntese de compostos opticamente ativos, produo de aromas e
fragrncias e modificaes de leos e gorduras (SHARMA; CHIST; BANERJEE, 2001).
Quadro 1 Aplicaes industriais da lipases.

Fonte: Sharma; Chist; Banerjee, 2001.

2.2.1 Reaes catalisadas por lipases


Conforme dito anteriormente, as lipases alm de promoverem a hidrlise de
leos e gorduras tambm so capazes de catalisar reaes reversas, como por exemplo, a
formao de steres, a partir de um lcool e cido carboxlico com liberao de gua, em um
processo denominado esterificao (PAQUES; MACEDO, 2006). Esses processos de
6

hidrlise e esterificao podem ser combinados numa sequncia resultando em reaes


denominadas de transesterificao (Figura 1), que dependo dos reagentes de partida, podem
ser acidlise (quando o grupo acila deslocado entre um ster e um cido carboxlico),
alcolise (quando o grupo acila deslocado entre um ster e um lcool) e interesterificao
(quando dois grupos acila so deslocados entre dois steres), sem ocorrer nem consumo nem
formao de gua (CARVALHO et al. 2003; CASTRO et al., 2004).
Figura 1 - Representao esquemtica das reaes de hidrlise, esterificao e interesterificao
catalisadas por lipase.

Fonte: Adaptado de Paques; Macedo, 2006.

2.2.2 Especificidade das lipases


Muitas vezes, as lipases so confundidas com esterases (EC 3.1.1.3), que
possuem uma atividade restrita hidrlise de substratos hidrossolveis e de cadeia carbnica
curta, enquanto lipases exibem elevada atividade na hidrlise de steres de cidos graxos de
cadeia longa e de baixa solubilidade em gua (FORJAN et al., 2000). A especificidade

preferencial das duas enzimas ao substrato tambm empregada como parmetro para a
diferenciao entre lipase e esterases.
As lipases podem ser classificadas em grupos de acordo com sua
especificidade; o primeiro grupo (Figura 2) refere-se s regiosseletivas, as quais so
subdivididas em: (A) lipases no especficas hidrolisam molculas de triacilgliceris,
produzindo cidos graxos livres, glicerol, monoacilgliceris e diacilgliceris como
intermedirios (CASTRO et al., 2004); (B) lipases 1,3 especficas catalisam apenas os
cidos graxos das posies 1 e 3 dos triacilgliceris; (C) cidos graxos especficos que atuam
no carbono de numero nove. O segundo grupo refere-se especificidade em relao ao
resduo de cido graxo, no qual a lipase especifica ao comprimento da cadeia ou presena
da dupla ligao na cadeia do resduo de cido graxo (CASTRO, 2004).
Figura 2 - Reaes catalisadas por lipases do tipo no especifica e 1,3 especifica.

Fonte: Paques; Macedo, 2006.

2.2.3 Mecanismo de reao das lipases


As lipases so enzimas que apresentam um mecanismo peculiar de atuao; o
seu sitio ativo geralmente caracterizado pela trade composta dos aminocidos serina (Ser),
histidina (His) e cido asprtico (Asp), complexos acil-enzima sendo intermedirios cruciais
em todas as reaes catalisadas por lipases (JAEGER; REETZ, 1998; SAAD, 2005). Devido
semelhana estrutural entre o stio ativo de lipases e proteases, o mecanismo cataltico para
lipase segue o modelo proposto para a quimotripsina, uma serina protease. O mecanismo
(Figura 3) composto por cinco etapas. Inicialmente, a histidina aumenta a nucleofilicidade
do grupo hidroxila da serina do stio cataltico atravs de uma ligao de hidrognio (a).
Ento, o grupo hidroxila da serina age como uma base atacando o carbono suscetvel da
ligao ster, abrindo a ligao C=O, dando origem ao intermedirio tetradrico (b), que
8

estabilizado por ligaes de hidrognio formadas com as ligaes amida. Nesta fase, a
histidina atrai o hidrognio liberado pela serina e o aspartato ou o glutamato estabilizam a
carga positiva que se forma na histidina (JAERGER et al., 1999; REIS et al., 2009).
Figura 3 - Mecanismo cataltico da lipase. (a) ataque nucleoflico da hidroxila da serina ao carbono
suscetvel da ligao ster; (b) intermedirio tetradrico; (c) intermedirio acil enzima e ataque
nucleoflico da gua; (d) intermedirio tetradrico; (e) enzima livre.

Fonte: Adaptado de JAEGER et al., 1994.

Aps a sua estabilizao o intermedirio tetradrico desfeito pelo retorno da


ligao C=O e consequente clivagem da ligao ster liberando assim um lcool, cujo
oxignio recebe um prton proveniente da histidina, formando-se assim um complexo acil
enzima (c). Esse complexo tem o seu carbono suscetvel atacado pelo on hidroxila da gua
abrindo assim a ligao C=O, formando um segundo intermedirio (d). Por fim, o retorno da
ligao C=O desfaz o intermedirio tetradrico, ocorrendo assim a liberao do cido
carboxlico e da enzima livre (e). (JAERGER et al., 1999; REIS et al. 2009).

2.2.4 Estrutura das lipases


Por serem obtidas a partir de diferentes fontes, as lipases podem variar
amplamente quanto a massa molecular (9,4 a 195 kDa) e ao pH (4,5 a 11) e temperatura (25 a
80C) de mxima atividade cataltica. Os apndices e anexos 1 e 2 resumem os dados dessas
propriedades compilados a partir de diversas referncias bibliogrficas.
A determinao da estrutura da lipase foi estudada atravs de tcnicas de
cristalografia realizadas na presena de meios aquosos homogneos, revelando que o stio
cataltico formado pela trade cataltica Ser-His-Asp/Glu, que se repete em todas as lipases,
sendo esta trade frequentemente protegida na molcula por uma tampa hidrofbica ou
lid, e devido presena do lid, a lipase pode se apresentar em duas diferentes
conformaes (Figura 4) (BRADY et al., 1990; REIS et al., 2009). Na primeira conformao
o stio ativo da enzima est fechado pela tampa polipeptdica que isola o stio ativo do meio
de reao (nesta conformao a lipase considera inativa). Na segunda conformao, a
enzima torna-se ativa em contato com uma interface hidrofbica, ocorrendo assim a abertura
da tampa polipeptdica. De acordo com Paiva, Balco e Malcata (2000) a abertura da tampa
consiste em uma reestruturao conformacional da lipase que cria uma regio nucleoflica (a
desprotonao da serina ocasiona a formao de oxinios, nuclefilos que atacam ligaes
steres) em torno do resduo serina: a tampa helicoidal vira-se para trs encobrindo seu lado
hidroflico em uma cavidade polar, antes preenchida com gua, e expondo totalmente o lado
hidrofbico da tampa. Essa exposio faz com que a superfcie apolar em torno do stio ativo
seja expandida acomodando assim o estado de transio tetradrico. Um exemplo de expanso
durante o processo de ativao na lipase de Rhizomucor miehei foi relatado por Derewenda et
al (1992). Segundo esses autores, a espinha dorsal da tampa foi deslocada um pouco mais que
7 , expandindo em aproximadamente 750 2 a rea hidrofbica da superfcie da enzima.
Figura 4 - Superposio dos esqueletos das lipases de Rhizomucor miehei (a) e de pncreas humano (b),
mostrando a mudana conformacional da tampa da enzima. A tampa esta destacada em verde.

Fonte: BRADY et al., 1990.

10

2.2.5. Fontes vegetais de lipases


Lipases podem ser obtidas de tecidos de vrios vegetais e animais ou
produzidas por fermentao de vrias espcies de microrganismos (bactrias e fungos). Em
eucariotos, as lipases esto envolvidas em vrios estgios do metabolismo, incluindo digesto
de gorduras, absoro, reconstituio e metabolismo de lipoprotenas (SHARMA; CHIST;
BANERJEE, 2001). Nas plantas so encontradas em tecidos de reserva de energia. As
sementes oleaginosas usam esta enzima durante os primeiros estgios da germinao,
iniciando a metabolizao de triglicerdeos estocados atravs de hidrlise dos cidos graxos
(QUETTIER; EASTMOND, 2009). Os cidos graxos liberados so levados s vias de
produo de energia, fornecendo assim energia para o crescimento do embrio.
As lipases vegetais tm sido caracterizadas e aplicadas em reaes de
biotransformao. De acordo com Pahoja e Sethar (2002) a atividade hidroltica foi
identificada em vrios tecidos de plantas, no entanto concentraes relativamente elevadas
foram encontradas apenas em sementes.
Sementes so o principal local de armazenamento das substncias de reserva
(fonte compacta de energia necessria para as funes vitais e para o desenvolvimento da
semente na fase de germinao). As principais substncias de reservas armazenadas pelas
sementes durante o seu desenvolvimento so os carboidratos, lipdeos e protenas. Alm
disso, encontram-se ainda enzimas como invertases, amilases, lipases, proteinases, alfagalactosidases, e outras, responsveis pela converso das macromolculas (reservas) em
metabolizveis (amido em glicose, triglicerdeos em glicerol e cidos graxos, e polipeptdios
em peptdeos menores ou diretamente em aminocidos), que sero transferidas aos pontos de
crescimento durante a germinao das sementes (MARTINS et al., 2007; QUETTIER;
EASTMOND, 2009).
2.2.5.1 Germinao
Wang, Lin e Huang (1984) verificaram que a quantidade de lipase nas plantas
de milho jovem de diferentes variedades foi proporcional quantidade de triacilglicerol nelas
armazenada, mostrando que a lipase esta intimamente ligada ao lipdeo, tanto fisicamente
quanto metabolicamente e ainda que a lipase sintetizada na proporo metablica
necessria.
11

O efeito da germinao na composio qumica e aspectos nutricionais variam


de acordo com as espcies de vegetais e as condies de germinao das sementes. A
germinao consiste na retomada do desenvolvimento que havia sido interrompido por
ocasio da maturidade fisiolgica, e com isso a taxa de respirao aumenta (NEDEL, 2003).
Organismos armazenam o excesso de energia podendo liber-lo quando eles
sofrem de privao de energia, sendo que para a maioria dos eucariontes os compostos de
armazenamento preferido so lipdeos na forma de triacilgliceris, j que a oxidao completa
de um lipdeo produz duas vezes mais energia que a oxidao de protenas ou hidrlise de
carboidratos (MURPHY, 2001; QUETTIER; EASTMOND, 2009). Nas plantas o principal
local de armazenamento do triacilglicerol no embrio. A maior parte da atividade da lipase
tambm encontrada nesses tecidos (URQUHART et al. 1984; SUZUKI; HONDA;
MUKASA, 2004).
Durante a germinao ocorre a degradao do triacilglicerol presente na
semente e esta degradao proporciona uma fonte de carbono que ir abastecer o crescimento
da planta e permitir que ele se torne uma muda fotossinteticamente ativa com um sistema de
razes e folhas (cotildones). Resumidamente, o processo consiste da hidrlise dos
triacilgliceris em cidos graxos e gliceris pela ao da lipase, e posteriormente tanto o
glicerol quanto o cido graxo sofrem reaes biolgicas at serem convertidos em acares
que iro sustentar o crescimento do embrio durante a germinao (GRAHAM, 2008;
QUETTIER; EASTMOND, 2009). Os cidos graxos so ativados a acil-CoA e depois
convertidos para acares, entretanto, segundo Hills, Murphy e Beevers (1989) o composto
acil-CoA atua como um inibidor natural da lipase, ou seja, a ao da lipase provoca um
aumento na concentrao dos cidos graxos e por sua vez aumento na concentrao de acilCoA, provocando a inibio da lipase.
A variao da atividade enzimtica durante a germinao nos gros de trs
diferentes cultivares de aveia foi estudada por Urquhart et al. (1984) (Figura 5). Os autores
observaram um aumento de 60% na atividade enzimtica aps 12 horas de germinao, porm
a partir de 24 horas os valores de atividade eram inferiores, e ainda aps 48 horas os valores
de atividade observados eram inferiores aos valores encontrados no gro no germinado.
Janecke (1951)1 citada por Urquhart et al. (1984) tambm observou um comportamento
semelhante, o mximo de atividade ocorreu aps 8 horas do inicio da germinao seguida por

JANECKE, H. ber die Haferlipase. v.3, p.29-34, 1951.

12

uma diminuio, e aps trs dias de germinao os nveis de atividade encontrados foram
ligeiramente inferiores aos dos gros no germinados.
Portanto, pelo aumento na atividade enzimtica de lipases extradas de
diferentes sementes germinadas, a germinao torna-se um parmetro de significativa
importncia, proporcionando um ganho de atividade significativo ao final do processo de
extrao da lipase.
Figura 5 - Atividade em funo do tempo de germinao.

Fonte: Adaptado de Urquhart et al. (1984).

Urquhart et al. (1984) estudaram tambm o efeito da maturao dos gros na


atividade da lipase presente nas trs diferentes cultivares de aveia analisadas. Nas trs
cultivares analisadas, os picos de atividade enzimtica ocorreram entre 23 e 30 dias aps o
florescimento, quando os gros j tinham atingido a sua maturidade fisiolgica. Outra
observao feita foi que a lipase ainda estava presente nos gros mesmo aps a colheita,
embora em nveis muito reduzidos. Segundo os autores, a diminuio da atividade era causada
pela perda de umidade, que promovia inativao da enzima por desnaturao.
2.2.5.2 Extrao de lipases vegetais
A extrao uma etapa preliminar purificao, sendo o seu objetivo a
obteno de um extrato bruto contendo a enzima na forma solvel.
O mtodo de separao de protenas baseado nas diferenas de solubilidade
est entre os processos mais utilizados nas fases inicias da purificao. Neste mtodo, os sais
13

tm efeitos na solubilidade das protenas, podendo tanto aumentar quanto diminuir a


solubilidade da protena na soluo. Em concentraes reduzidas, os sais aumentam a
solubilidade de muitas protenas (salting-in, efeito ocasionado por alteraes na tendncia
ionizao dos grupos R dissociveis da protena), enquanto em concentraes elevadas, a
solubilidade da protena reduzida (salting-out, a hidratao dos ons do sal reduz a
disponibilidade de molculas de gua que circundam as regies hidrofbicas da superfcie da
protena, ocorrendo a sua precipitao). A capacidade desses sais de influenciar a solubilidade
das protenas uma funo de sua fora inica, que depende tanto da sua concentrao como
do nmero de cargas eltricas dos ctions e nions que formam o sal. Entretanto, o efeito do
aumento ou da reduo da fora inica na solubilidade pode ser diferente para cada tipo de
protena (LEHNINGER, 1976).
Para lipase de origem vegetal, o mtodo de extrao tambm se baseia na
solubilidade do soluto (semente, flor, folha e etc.) com o solvente (tampo). De acordo com
Copabiango et al. (2006), diferentes procedimentos utilizando solventes para extrair as
protenas dos cereais so relatados na literatura, nos quais fatores como concentrao e tipo de
solvente, temperatura e tempo da extrao variam com o intuito de aumentar a eficincia do
processo. A Tabela 1 apresenta estes e outros fatores nas extraes de diferentes lipases
obtidas a partir de diferentes vegetais.
Observando a Tabela 1 possvel notar que os sais mais usados nos solventes
de extrao so o Tris-HCl e tambm o fosfato de sdio (ambos em concentraes reduzidas),
o pH mais usado na extrao varia de 7 a 8, o tempo de extrao varia de 30 min a 12 h, a
temperatura mais usada de 4C e por fim a relao solvente/soluto varia de 1 a 10 (v/m).

14

Espcie

R.

Farelo de arroz

Sim

Tabela 1 Extrao de lipases a partir de diferentes vegetais.


Solvente
pH t (h) T (oC)

Tampo Tris-HCl 100 mM

7,5

12

[mLsolvente/gsemente]

Referncia

BHARDWAJ; RAJU;
RAJASEKHARAN, 2001

(Oryza sativa)
Semente de nogueira

Sim

Tampo fosfato de sdio (100 mM)

7,0

NT

7,0

YEILOLU; DEMIRKAN, 2010

Sim

Tampo fosfato de sdio (50 mM com 0,5 mM de CaCl2)

7,0

NT

4,0

SAGIROGLO, A.; ARABACI, N.

(Juglans regia L.)


Semente de girassol

2005

(Helianthus annuus L)
Semente de Vernonia

No

Tampo Tris-HCl (150 mM, com 0,4 M sacarose, 2 mM

7,5

4,0

NCUBE, I. et al., 1995

7,5

ABIGOR, R. D. et al., 2002

10

KAPRANCHIKOV; ZHEREBTSOV;

EDTA (cido etilenodiamino tetra-actico) e 0,5 mM DTT

galamensis

(Ditiotreitol))
Semente de Jatropha curcas

No

mM EDTA, 1 mM MgCl2 e 2 mM DTT)

L.
Germe de Trigo
(Triticum aestivum L.)

Tampo tricina (150 mM com 0,6 M Sacarose, 10 mM KCl, 1

Sim

Vrios tampes foram testados, mas o melhor resultado foi


obtido com o tampo Tris-HCl (50 mM com 8 mM mercaptoetanol e 2 mM EDTA)

15

POPOVA, 2004

Espcie

R.

Semente de trigo

No

Tabela 1 Extrao de lipases a partir de diferentes vegetais (Continuao).


Solvente
pH t (h) T (oC) [mLsolvente/gsemente]
Tampo acetato-NaOH (50 mM com 1 mM EDTA)

5,0

10

Sim

chinesa (vrias variedades)


Flor de trigo

SUZUKI; HONDA; MUKASA,


2004

(Fagopyrum esculentum)
Semente de mamona

Referncia

Tampo Tris-HCl (165 mM com 0,4 M sacarose, 10 mM KCl,

7,5

ER-ZHENG, S. et al., 2010

7,4

TANI; OHISHI; WATANABE,

1 mM EDTA, 1 mM MgCl2 e 2 mM DTT)


Sim

Tampo Tris-HCl (100 mM com 1 mM acetato de clcio)

1994
Semente de Brassica napus

Sim

Tampo fosfato de sdio (5 mM)

7,0

SANA, N. K. et al., 2004

No

Tampo Tris-HCl (50 mM com 10 mM EDTA e 10 mM

8,0

25

POLIZELLI, P. P. 2008

8,0

2-5

HELLYER; CHANDLER;

L.
Semente de Pachira
aquatica (Bombacaceae)
No informado

metabissulfito de sdio)
No

Tampo Tris-HCl (50 mM)

BOSLEY, 1999
Semente de trigo
(Avena sativa L.)

No

Tampo Tris-HCl (50 mM com 1% triton X-100, 0,2%


benzeno)

16

7,5

URQUHART, A. A. et al., 1984

Tabela 1 Extrao de lipases a partir de diferentes vegetais (Continuao).


Solvente
pH t (h) T (oC) [mLsolvente/gsemente]

Espcie

R.

Referncia

Farelo de Arroz (Oryza

Sim

Tampo fosfato de potssio (50 mM com 0,5 mM CaCl2)

7,0

10

KIM, H. Y. 2004

No

Tampo fosfato (0,1 M)

8,0

Tamb

WEERASOORIYA;

sativa)
Semente de Hevea

GUNASEKARA, 2011

brasiliensis
Semente de Laurus nobilis

Sim

Tampo Fosfato (100 mM)

7,0

Tamb

2008

L.
Farelo de Arroz

ISBILIR; OZCAN; YAGAR,

Sim

Tampo fosfato (50 mM com 0,5 mM de CaCl2)

(vrias variedades)
t - Tempo de extrao em horas.
T - Temperatura de extrao em C.
R. - Ressecamento do gro quanto presena de leo.
[mLsolvente/gsemente] - Relao de mililitro de solvente por grama de semente, usada para a extrao.
NT - Noite toda.
Tamb Temperatura ambiente.

17

7,0

1/2

10

PRABHU, A. V. et al., 1999

2.2.5.3 Purificao de lipases


De modo geral, o nmero de etapas empregadas no processo de purificao
dependente da purificao desejada e tambm do uso a que se refere o produto final. Durante
o processo de purificao, perde-se atividade em cada etapa, por isso, para aumentar o
rendimento, um nmero mnimo de etapas deve ser efetuado. Portanto, as escolhas das
tcnicas a serem empregadas devem estar vinculadas s propriedades inerentes a cada enzima
(LIMA et al., 2001).
A purificao de lipases tem, em geral, dois objetivos bsicos: (a) obteno da
enzima pura, para melhor estudo de suas caractersticas bioqumicas e de sua estrutura e (b)
obteno de um produto com maior atividade especfica para aplicao em diversos processos
(PALEKAR; VASUDEVAN; YAN, 2000; KOBLITZ; PASTORE, 2004).
Lipases tm sido purificadas por diferentes processos que podem envolver o
uso de mtodos como: filtrao, precipitao, cromatografia de troca inica, ultrafiltrao,
cromatografia de interaes hidrofbicas e cromatografia por afinidade (SAXENA et al.,
2003).

Nas fases iniciais, so muito utilizadas operaes unitrias como a filtrao, a

precipitao por sais ou mesmo por solvente, para a eliminao de impurezas grosseiras. No
entanto, esses mtodos apresentam uma baixa capacidade de resoluo, sendo ento
necessrias etapas complementares usando mtodos com maior capacidade de resoluo,
como os mtodos cromatogrficos (LEHNINGER, 1976). A Tabela 2 apresenta de forma
resumida o procedimento de purificao de lipase adotado por vrios autores para diferentes
lipases vegetais, bem como o substrato adotado para anlises de atividade. Nessa tabela
tambm so apresentados os fatores de purificao e o rendimento de purificao de cada
trabalho.
A partir da Tabela 2 observa-se que a precipitao com sulfato de amnio foi
utilizada em cerca de 70% dos trabalhos analisados, sendo o sal responsvel pela precipitao
das protenas presentes no extrato bruto. Aps a solubilizao desse precipitado, em
aproximadamente 50% dos trabalhos foi realizada uma dilise como etapa preparatria para a
ltima etapa do processo de purificao, onde foram utilizados mtodos de alta resoluo de
separao, como a cromatografia e a ultrafiltrao.

18

Espcie

AE (U/mg)

Farelo de arroz

0,38

(Oryza sativa)
Semente de nogueira

180,2

Tabela 2 Purificao de lipases a partir de diferentes vegetais.


Substrato
Sistema de purificao adotado
2-Palmitoil e

Filtrao com gazes, centrifugao e cromatografia em coluna

Triolena

de octil-Sepharose

Azeite de

Precipitao com sulfato de amnio, dilise e cromatografia

oliva

em coluna Sephadex G-100

Azeite de

Precipitao com sulfato de amnio, dilise e cromatografia

oliva

em coluna Sephadex G-75

RP

FP

Referncia

22,80

7,6

BHARDWAJ; RAJU;
RAJASEKHARAN, 2001

31,00

28,6

YEILOLU; DEMIRKAN,
2010

(Juglans regia L.)


Semente de girassol

555

603

SAGIROGLO; ARABACI,
2005

{Helianthus annuus L)
Semente de Vernonia
galamensis

11905

Centrifugao e cromatografia em coluna Sephacryl S-300.

28,00

73

NCUBE et al., 1995

Germe de trigo

0,62

Azeite de

Precipitao isoeltrica, filtrao em gel (Sephadex G-25),

4,40

61,1

KAPRANCHIKOV;

oliva

cromatografia de troca inica (DEAE-CELULOSE) e por fim

ZHEREBTSOV; PO

cromatografia em gel (Sephadex G-150)

POVA, 2004

(Triticum aestivum L.)

Semente de trigo

0,360

p-Nitrofenil
Laurato

(Fagopyrum esculentum)

Precipitao com sulfato de amnio, dilise, coluna DEAE Sepharose e por fim uma nova cromatografia usando uma
coluna Sephacryl S-200.

1,70

Precipitao com sulfato de amnio, dilise, coluna DEAE Sepharose e por fim uma nova cromatografia usando uma
coluna Sephacryl S-200.

2,30

60,2

SUZUKI; HONDA;
MUKASA, 2004

(Lipase I)
Semente de trigo (Lipase
II)

0,858

p-Nitrofenil
Laurato

19

143

SUZUKI; HONDA;
MUKASA, 2004

Espcie

AE (U/mg)

Sementes de mamona

324,2

Tabela 2 Purificao de lipases a partir de diferentes vegetais (Continuao).

Substrato

Sistema de purificao adotado

RP

FP

Referncia

Azeite de

Precipitao, cromatografia em coluna DEAE-Sepharose Cl-

17,70

16,1

ER-ZHENG et al., 2010

oliva

6B e por fim em coluna Butyl-Sepharose CL-4B

614,3

Eletroforese (13% de poliacrilamida)

7,00

9,6

POLIZELLI, 2008

366,54

Azeite de

Precipitao com sulfato de amnio, dilise, liofilizao,

24,60

67,6

SANA et al., 2004

oliva

cromatografia usando uma coluna Sephadex G-50, depois uma

62,14

7,6

WEERASOORIYA;
GUNASEKARA, 2011

80,24

2,0

PRABHU et al., 1999

Chinesa (vrias
variedades)
Semente de Pachira
aquatica (Bombacaceae)
Semente de Brassica Napus
L.

coluna DEAE - Sepharose e por fim uma coluna de


carboximetil celulose (CM CELULOSE).
Semente de H. Brasiliensis

2,43

leo vegetal

Precipitao com sulfato de amnio, dilise, e por fim uma


cromatografia de troca inica usando uma coluna de
dietilaminoetil - celulose (DEAE-CELULOSE)

Farelo de Arroz

0,0153

(vrias variedades)

Tributirina

Centrifugao, ultrafiltrao em membrana de 100 kDa e


ultrafiltrao em membrana de 10 kDa.

AE Atividade especfica no final da purificao


RP Rendimento da purificao (%).
FP Fator de purificao relao entre as atividades especficas antes e aps o processo de purificao.

20

2.3 Imobilizao enzimtica


A utilizao de enzimas na indstria cresceu sensivelmente nos ltimos anos
devido s vantagens frente aos catalisadores qumicos, dentre as quais se destacam, elevada
atividade cataltica, especificidade por determinado substrato e elevada atividade em
condies brandas de temperatura e presso (HASAN; SHAH; HAMEED, 2006). No entanto,
o seu uso na indstria pode ser limitado devido sua relativa instabilidade em soluo, custos
elevados de isolamentos e purificao e dificuldade de recuperao da enzima ativa aps o
trmino do processo cataltico.
Este inconveniente pode ser minimizado pelo uso de tcnicas de imobilizao,
tornando as enzimas mais estveis cataliticamente e simplificando as etapas de recuperao
do produto. A imobilizao pode ocorrer atravs da adsoro ou ligao covalente da enzima
a um material insolvel, confinamento em matrizes formadas por gis polimricos ou
encapsulao em uma membrana polimrica (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI,
2004; MATEO et al. 2007; SECUNDO et al. 2008).
A seleo do mtodo de imobilizao deve ser baseada em parmetros como as
caractersticas de regenerao e inativao, custo do procedimento, e propriedades finais
desejadas para a enzima imobilizada (MALCATA et al., 1990). Outro parmetro importante a
ser considerado na seleo do mtodo de imobilizao o suporte. Para ser efetivo na
imobilizao o suporte deve deixar a enzima acessvel aos substratos, manter sua atividade
por um longo perodo e permitir que o sistema (suporte/enzima) seja regenerado no final do
processo, sem que ocorram perdas na atividade (MATEO et al. 2007).
A natureza do suporte muito importante para a eficincia da imobilizao e as
principais caractersticas a serem observadas na seleo de um suporte para determinada
aplicao so: rea superficial, permeabilidade, insolubilidade, capacidade de regenerao,
composio, natureza hidroflica ou hidrofbica, resistncia ao ataque microbiolgico,
resistncia mecnica, resistncia compactao em operaes em altas vazes quando se
utiliza reatores de leito fixo, custo e outras (VILLENEUVE et al. 2000; DALLA-VECCHIA;
NASCIMENTO; SOLDI, 2004; MATEO et al. 2007). A Figura 6 apresenta um esquema com
os principais tipos de suporte utilizados para imobilizao.
As enzimas imobilizadas esto sempre competindo com as enzimas nativas. A
escolha por um determinado catalisador imobilizado vai depender do quanto as suas
propriedades melhoram quando comparadas com a forma nativa, ou seja, se a imobilizao da
21

enzima reduz custos ou eventuais danos ambientais. Portanto, a deciso mais adequada para o
uso de determinado tipo de enzima (imobilizada ou nativa) deve ser efetuada aps uma
anlise cuidadosa da situao (ZANIN; MORAES, 2004).
Figura 6 - Classificao dos suportes para a imobilizao de enzimas.

Fonte: ZANIN; MORAES, 2004.

O mtodo de imobilizao por adsoro fsica uma tcnica bastante simples,


tornando-o um dos mais amplamente usados na imobilizao de enzimas. Neste procedimento
a enzima imobilizada em um suporte slido por ligaes de baixa energia, tais como
interaes de van der Waals ou hidrofbicas, ligaes de hidrognio e inicas, entre outras
(VILLENUEVE et al. 2000; DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004).
Algumas vantagens apresentadas pela imobilizao por adsoro so a sua
simplicidade de execuo, menor custo e tambm a pequena interferncia na estrutura nativa
da enzima, e por isso, geralmente no promove perda de atividade enzimtica. O sucesso e a
eficincia da adsoro de uma enzima em um suporte, que em geral na superfcie, dependem
de vrios parmetros, tais como, tamanho da protena adsorvida, rea superficial do
adsorvente e, principalmente, porosidade e tamanho dos poros (VILLENEUVE et al., 2000).

22

2.4 Imobilizao de lipases


Dentre os mtodos de imobilizao disponveis, a adsoro ainda o mais
utilizado para a imobilizao de lipases, devido grande poro hidrofbica da protena,
facilidade de preparao, menor custo e menor agressividade em relao perda de atividade
enzimtica (SECUNDO et al., 2008; BARON, 2008). Dentre os diferentes suportes
disponveis, a slica se mostra como um suporte interessante para a imobilizao de lipases,
pois alm da sua natureza inorgnica, o que dispensa preocupao com contaminao
microbiana, mecanicamente resistente e pode ser facilmente funcionalizada com diferentes
grupos reativos.
A adsoro interfacial de lipases em suportes hidrofbicos foi proposta por
Palomo et al. (2002) como um mtodo simples para se preparar derivados de lipases teis em
todos os meios. A ideia do mtodo usar a afinidade da enzima por interfaces hidrofbicas
como uma estratgia de imobilizao. Usando-se suportes altamente hidrofbicos, que se
assemelham de algum modo s superfcies de gotas dos substratos naturais das lipases, e fora
inica muito baixa, as lipases tornam-se seletivamente imobilizadas nestes suportes
(BASTIDA et al., 1998; PALOMO et al., 2002; FERNNDEZ-LORENTE et al., 2008,
CABRERA et al., 2009). Outras protenas solveis em gua no so adsorvidas ao suporte
sob as suaves condies usadas, favorecendo somente a adsoro da lipase (BASTIDA et al.,
1998). Portanto, pode-se obter em uma nica etapa a imobilizao, a estabilizao e a
purificao da preparao enzimtica.
A adsoro interfacial envolve as reas hidrofbicas que circundam o stio
ativo (Figura 7) e a face interna da tampa (BASTIDA et al., 1998; PALOMO et al., 2002;
FERNNDEZ-LORENTE et al., 2008, CABRERA et al., 2009). Lipases imobilizadas por
adsoro interfacial apresentam-se na forma aberta (ativa), com o stio ativo acessvel a
substratos pequenos, independente da presena de interfaces hidrofbicas externas (VERGER
et al., 1997; BASTIDA et al., 1998; FERNNDEZ-LORENTE et al., 2008, CABRERA et al.,
2009). De fato, Bastida et al. (1998) e Palomo et al. (2002) observaram que lipases
imobilizadas por adsoro interfacial a suportes altamente hidrofbicos, tais como, octadecilsepabeads, phenil-sepharose e octil-agarose, exibiam atividade significativamente realada
(efeito este conhecido como hiperativao).
De acordo com Baron (2008), nos ltimos anos as pesquisas sobre
imobilizao de lipase vm sendo reportadas em duas vertentes. A primeira diz respeito a
23

estudos realizados visando a utilizao de novos materiais para imobilizao destas enzimas,
como nano fibras de polianilina magntica, membranas de algodo, dentre outros. Na
segunda, esto os estudos realizados com enzimas imobilizadas (normalmente comerciais),
visando altos rendimentos de reao, resoluo de misturas racmicas, e reutilizao da
enzima em reaes diversas, em especial na sntese de biodiesel e steres.
Figura 7 - Adsoro interfacial de lipase sobre uma superfcie hidrofbica.

Fonte: VOLPATO, 2009.

2.5 Biodiesel
Biodiesel uma mistura de steres alqulicos de cidos graxos, provenientes de
fontes vegetais ou gorduras animais, cuja utilizao est associada substituio ao diesel de
petrleo. Ele usado geralmente em motores do ciclo diesel ou para gerao de outro tipo de
energia que substitua parcial ou totalmente o diesel de petrleo (COSTA NETO et al., 2000).
A grande compatibilidade do biodiesel com o diesel de petrleo em praticamente todas as
suas propriedades o torna uma alternativa capaz de atender a frota de veculos j existente sem
custos de adaptao ao novo combustvel, alm de apresentar algumas vantagens adicionais
sobre o diesel de origem fssil, como ilustrado no Quadro 2 (COSTA NETO et al., 2000).
O uso de leos vegetais como substituto do leo diesel tem sido alvo de
pesquisas nacionais e internacionais h muitos anos, apesar de seu uso como combustvel no
ser nenhuma novidade, j que no ano de 1900 em uma exposio em Paris, Rudolf Diesel
apresentou um motor abastecido com leo de amendoim (SEBRAE, 2008). No Brasil, o
biodiesel saiu do estgio experimental para se transformar em um mercado promissor aps ser
sancionada a lei n 11.097 de 13 de janeiro de 2005 que introduziu o biodiesel na matriz
energtica brasileira, determinando uma mistura obrigatria de biodiesel no diesel de petrleo

24

e estabelecendo prazos para o cumprimento dessa adio (SEBRAE, 2008). Atualmente o


percentual obrigatrio de biodiesel misturado ao diesel de petrleo de 5%.
Quadro 2 - Propriedades complementares atribudas ao biodiesel em comparao ao leo diesel comercial.

Caractersticas

Propriedades Complementares

Caractersticas

Livre de enxofre e compostos aromticos, excelente

qumicas apropriadas

lubrificante, no txico e biodegradvel.

Menos poluente

Reduz sensivelmente as emisses de partculas de carbono


(fumaa), monxido de carbono, xidos sulfricos e
hidrocarbonetos aromticos.

Tecnicamente

Complementa todas as novas tecnologias do diesel com

competitivo

desempenho similar e sem exigncias da instalao de uma


infraestrutura ou politica de treinamento.

Regionalizao

Pequenas e mdias plantas para a produo de biodiesel


podem ser implantadas em diferentes regies do pas,
aproveitando a matria-prima disponvel em cada local.
Fonte: Adaptado de Costa Neto et al., 2000.

A expanso do Programa Nacional de Produo e Uso do Biodiesel, criado em


2005, fica comprovada quando se verifica a evoluo da produo nacional de biodiesel nos
ltimos anos apresentada na Tabela 3.
Tabela 3 - Produo anual de biodiesel em m3 no Brasil nos ltimos anos.

2005

2006

2007

2008

2009

736

69.002

404.329

1.167.128

1.608.448

2010

2011

2.396.399 2.640.703

Fonte: ANP, 2011.

A produo estimada inicialmente em 1 bilho de litros para os anos de 20082012 foi superada no ano de 2008, sendo ainda que em 2011 a produo nacional ultrapassou
a marca dos 2,5 bilhes de litros, produo esta estimada inicialmente apenas para o ano de
2013 (2,4 bilho de litros/ano). O sucesso do biodiesel no Brasil pode ser explicado devido ao
apoio do governo com a reduo de impostos, apoio s pesquisas e tambm grande
25

disponibilidade de matria-prima e, principalmente, a grande demanda, pois no Brasil a maior


parte do transporte de mercadorias feita atravs de caminhes que usam o diesel como
combustvel (SEBRAE, 2008).
2.5.1 Matrias-primas para a produo do biodiesel
Existem diferentes fontes de matrias-primas disponveis para a fabricao do
biodiesel. De modo geral, qualquer lipdeo de origem animal ou vegetal pode ser usado para a
produo de biodiesel. Entretanto, nem todos so adequados para tal uso, pois alguns leos e
gorduras apresentam propriedades no ideais, como alta viscosidade ou alto contedo de iodo
que so transferidos para o biodiesel e que o tornam inadequado para uso direto em motores
do ciclo diesel. Alm disso, fatores como disponibilidade, custo, propriedades do leo e
desempenho como combustvel iro determinar qual o potencial de uso de uma dada matriaprima na produo comercial de biodiesel (SAAD, 2005; TIOSSO, 2010).
No Brasil, a soja a matria-prima mais utilizada na produo do biodiesel.
Devido grande extenso territorial e condies climticas favorveis tambm podem ser
encontradas uma gama considervel de diferentes fontes de matrias-primas para a produo
desse bicombustvel. Algumas espcies so de ocorrncia nativa (como o babau, a mamona e
o buriti), enquanto outras constituem culturas de ciclo curto (soja, milho, girassol, amendoim,
etc.), e outras so de culturas perenes (cultura que aps ser plantada e concluir o ciclo
produtivo no necessita ser replantada, como por exemplo, palma, dend e outros) (SUAREZ
et al., 2009).
Dentre as gorduras animais com potencial para a produo de biodiesel,
destacam-se os leos de peixes, a banha de porco e por fim o sebo bovino que tem ganhado
destaque, pois uma fonte de matria-prima que apresenta alta taxa de produo de biodiesel
aliada a um baixo custo de comercializao (SUAREZ et al., 2009).
2.5.2 Processo de produo do biodiesel
Os leos vegetais so processados de modo a adquirir propriedades
semelhantes aos combustveis fsseis, tais como viscosidade, sendo que os principais mtodos
empregados so o craqueamento e a transesterificao, sendo esta a tecnologia para produo
industrial do biodiesel predominante no mundo (SUAREZ et al., 2009).
26

Transesterificao um termo geral usado para descrever uma importante


classe de reaes orgnicas nas quais um ster transformado em outro atravs da troca do
radical alcoxila (GERIS et al., 2007). Quando o ster original reage com um lcool, o
processo de transesterificao denominado alcolise (Figura 8a). A transesterificao o
processo de separao do glicerol do leo vegetal (Figura 8b). A remoo do glicerol atravs
da reao de transesterificao se faz necessria para que a mistura de steres resultante
(biodiesel) deste processo possa ser utilizada como combustvel em motores a diesel, pois o
glicerol que torna o leo mais denso e viscoso, j que cerca de 20% de uma molcula de leo
vegetal formada por glicerol (SEBRAE, 2008).
Figura 8 - Reao de alcolise e transesterificao.

Fonte: Geris et al., (2007).

As reaes de transesterificaes podem ser realizadas empregando-se


diferentes catalisadores. Entretanto, para a produo do biodiesel apenas o processo alcalino
realizado em escala industrial, devido a sua maior viabilidade econmica. Por outro lado, a
rota de produo de biodiesel pela transesterificao qumica apresenta algumas desvantagens
como: difcil separao dos produtos, substratos e tambm catalisadores envolvidos no
processo, necessitando-se de repetidas lavagens para se atingir o grau de pureza necessrio,
alm da formao de sabo na presena de gua e cido graxo livre. Por outro lado, reaes de
transesterificao catalisadas por enzimas imobilizadas so mais simples, como pode ser
verificado na Figura 9 (RANGANATHAN; NARASIMHAN; MUTHUKUMAR, 2008).

27

Figura 9 - Produo de biodiesel por transesterificao alcalina (A) e enzimtica (B) de leos e gorduras.

Fonte: Adaptado de RANGANATHAN; NARASIMHAN; MUTHUKUMAR, (2008).

28

No quadro 3 so apresentadas as vantagens e desvantagens dos catalisadores


qumicos e enzimticos.
Quadro 3 - Vantagens e desvantagens do processo qumico e enzimtico na produo do biodiesel.

Fonte: SAAD, 2008.

A busca por um processo de produo de biodiesel mais barato e eficiente tm


despertado grande interesse da comunidade cientifica, especialmente na utilizao de lipases
na produo do biocombustvel. Para quantificar tal interesse foi realizado em fevereiro de
2012 um levantamento no site Web of Science sobre o nmero de publicaes envolvendo
nos ltimos anos o tema lipase e biodiesel, Figura 10. A maior parte dessas pesquisas referese determinao da melhor fonte de enzima e dos fatores que influenciam na reao de
transesterificao, visando melhorar o rendimento do processo de produo, e assim tentando
tornar o biodiesel obtido atravs da rota enzimtica mais vivel economicamente quando
comparado ao biodiesel de rota qumica.
Figura 10 - Nmero de publicaes entre 1996 e 2011 usando como palavras chave lipase e biodiesel.

Fonte: Web of Knowledge.

29

2.6 Produo de steres


steres so importantes compostos orgnicos obtidos por sntese qumica
(envolvendo como catalisadores da reao cidos como cido sulfrico e bases como
hidrxido de sdio) ou enzimtica (usando lipases). Dentre suas diversas aplicaes, os
steres tm destaque como aromatizantes em produtos alimentcios, farmacuticos e
cosmticos e como agentes emulsificantes e, dependendo de sua composio, podem fazer
parte de sistemas emulsificantes para uso em cremes, molhos e loes (HARWOOD, 1989;
GANDHI et al., 1997). De acordo com a revista Perfumer & Flavorist (2010) o mercado
mundial para esses compostos foi avaliado em US$ 22 bilhes para o ano de 2009. Alm
disso, quando preparados por processos enzimticos podem ser caracterizados como naturais
ou idnticos ao natural, sendo, portanto, preferidos pelo mercado consumidor.
Embora a sua funo natural seja a quebra das ligaes de ster de
triacilgliceris com o consumo de molculas de gua (hidrlise), as lipases so tambm
capazes de catalisar a reao reversa sob condio restrita de gua, como por exemplo, a
formao de steres a partir de lcoois e cidos carboxlicos (GOMES, SILVA e CASTRO,
2004). Industrialmente, a esterificao usando lipases foi empregada comercialmente pela
empresa Unichema International para a produo de steres de cidos graxos de alto grau de
pureza e qualidade, como o isopropilmiristato, isopropilpalmitato e 2-etilexilpalmitato, que
so ingredientes empregados na formulao de cremes cosmticos e outros produtos de
higiene. O processo permite a recuperao da preparao enzimtica e sua reutilizao em
bateladas subseqentes (BOSLEY, 1997; GOMES, SILVA e CASTRO, 2004).
O uso de lipases na produo de steres ou de outros produtos de interesse
industrial apresenta grande potencial de aplicao, entretanto, a sua utilizao ainda invivel
devido ao alto custo das enzimas e a impossibilidade de reutilizao. Para que a
biotransformao possa competir com a rota qumica, faz-se necessrio o desenvolvimento de
um biocatalisador de baixo custo e que permita a sua reutilizao ao final do processo de
produo. A grande disponibilidade de matrias-primas vegetais de baixo custo (fontes
potenciais de lipases), aliada a processos de extrao e purificao que utilizam tcnicas
menos onerosas, tais como, ultrafiltrao e imobilizao em superfcies hidrofbicas,
possibilitando em uma s etapa a imobilizao, a purificao (somente lipases so adsorvidas)
e a ativao (lipase imobilizada com a tampa aberta), torna-se vital o estudo sobre a
possibilidade de se produzir um biocatalisador comercial a partir de lipases vegetais.
30

3. MATERIAIS E MTODOS
3.1 Material
3.1.1 Sementes, suporte e substratos
Neste trabalho, sementes de soja (Glycine max), girassol (Helianthus annuus) e
mamona (Ricinus communs L) foram selecionadas com fontes de lipases devido a sua
disponibilidade e baixo custo. Todas as sementes foram obtidas no comrcio local.
Slica macroporosa (Immobead S60S), utilizada como suporte na imobilizao
das lipases parcialmente purificadas, foi adquirida da Chiral Vision (Leiden, Holanda).
Azeite de oliva (Carbonell) e butirato de p-nitrofenila (p-NPB), utilizados
como substratos nos ensaios de atividade hidroltica, foram adquiridos no comrcio local e da
Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, EUA), respectivamente.
3.1.2 Reagentes especficos e membranas
Octiltrietoxisilano (C8-TEOS), albumina de soro bovino (BSA), TEMED
(tetrametilenodiamina), Triton X-100 (polietileno glicol tert-octil-fenil ter), Hepdecanoato
de metila, n-Butanol, Brij-35 (Brij L23, polioxietileno (23) lauril ter), cido butrico e
persulfato de amnio foram adquiridos da Sigma Aldrich Co. (St. Louis, EUA). Azul
brilhante de Coomassie G-250 foi adquirido da Bio-Rad Laboratories (Califrnia, EUA).
Acrilamida e bis-acrilamida foram adquiridas da Amersham Pharmacia Biotech Inc (EUA).
Azul brilhante de bromofenol foi adquirido da Merck (Alemanha). Dodecil sulfato de sdio
(SDS) e Tris(hidroximetil)aminometano hidrocloreto (Tris-HCl) foram adquiridos da Hexapur
(Califrnia, EUA). Goma arbica (resina natural composta de polissacardeos e
glicoprotenas) adquirido da Synth (Brasil) e fenolftalena adquirida da Qhemis (Brasil).
Membranas de polipropileno com 5 e 100 kDa de dimetro de corte foram adquiras da
Millipore Corporation (EUA). Todos os demais reagentes foram de grau analtico PA.

31

3.2 Mtodos
3.2.1 Determinao da concentrao de protena
O teor de protena das preparaes enzimtica foi determinado pelo mtodo
colorimtrico de Bradford (BRADFORD, 1976). A albumina de soro bovino (BSA) foi
utilizada na preparao da curva padro. Aps a ligao do corante azul brilhante de
Coomassie G-250 com a protena, a colorao da soluo convertida de castanho escuro a
azul, e a absorbncia pode ser medida em 595 nm aps 5 min.
3.2.2 Determinao das atividades hidrolticas
3.2.2.1 Hidrlise do azeite de oliva
A hidrlise do azeite de oliva foi realizada de acordo com a metodologia de
Soares et al (1999), com modificaes. O mtodo consistiu na mistura de 9 mL de uma
emulso composta por 2,45 ml de azeite de oliva, 170 mg de goma arbica, 2,45 ml de gua e
3,92 ml de tampo fosfato de sdio 100 mM, pH 7,0. A reao de hidrlise, conduzida a 37C
por 5 minutos, foi iniciada pela adio da soluo enzimtica ou do derivado (enzima
imobilizada). Aps esse perodo de tempo, adicionava-se 10 mL de etanol 95%-gua 5% (1:1,
base volumtrica). Os cidos graxos liberados eram titulados com soluo de KOH 0,025M,
utilizando fenolftalena como indicador. O clculo de atividade enzimtica foi realizado pela
Equao (1). Uma unidade de atividade (U) foi definida como a quantidade de enzima que
libera 1 mol de cido graxo por min nas condies acima descritas.
mol VA VB M 1000
Atividade

tE
min min

(1)

Em que: E a quantidade de enzima utilizada no ensaio (em ml para a enzima solvel e em


mg para a enzima imobilizada), M a molaridade da soluo de KOH, t o tempo de reao
(minuto), VA o volume de KOH gasto na titulao da amostra (mL) e VB o volume do
KOH gasto na titulao do branco (mL).

32

3.2.2.2 Hidrlise do butirato de p-nitrofenila (PNPB)


A hidrlise de PNPB foi realizada de acordo com Palomo et al. (2002), com
algumas modificaes. O ensaio consistiu na medida do aumento de absorbncia a 400 nm
produzido pela liberao de p-nitrofenol (PNP) na hidrlise de PNPB 3,53 M em tampo
fosfato de sdio 25 mM, pH 7, a 25C. A reao foi iniciada pela adio de 0,07 mL de
substrato em 2,9 mL de soluo enzimtica (2,5 mL de tampo fosfato de sdio 25 mM, pH
7,0 e 0,4 ml de extrato enzimtico). O clculo de atividade enzimtica foi realizado pela
Equao (2). Uma unidade de atividade (UPNPB) foi definida como a quantidade de enzima
necessria para hidrolisar 1 mol de PNPB por minuto sob as condies acima descritas.
A
VR
U
t
Atividade
g ou ml 1000 E l

(2)

Onde: A/ t o coeficiente angular obtido do grfico Absorbncia vs. Tempo, VR o


volume reacional (2,97 ml), E a quantidade de enzima utilizada no ensaio (ml para enzima
solvel e g para a enzima imobilizada), l o comprimento do caminho ptico (1cm) e o
coeficiente de extino molar do PNP (4871,4 M-1cm-1) a pH 7,0.
3.2.3 Eletroforese SDS - PAGE
As massas moleculares das protenas foram estimadas por eletroforese SDSPAGE (gel de poliacrilamida 12%) em condies desnaturantes (LAEMMLI, 1970) em um
sistema MiniProtean (Bio-Rad).
Poliacrilamida 12% (gel de separao) foi preparada misturando-se 3,04 ml de
soluo de acrilamida 30%, 1,9 ml de tampo de separao (Tris-HCl 2 M, pH 8,8), 0,076 ml
de soluo de SDS 10%, 2,55 ml de gua milli-Q, 0,076 ml de TEMED
(tetrametiletilenodiamina) e 0,076 ml de PSA (persulfato de amnia) 10%. Esta soluo foi
cuidadosamente transferida entre as placas de eletroforese, deixando aproximadamente 1 cm
livre, onde foi adicionado isopropanol para nivelar o gel e evitar o contato do gel com o ar.
Enquanto o gel de separao era polimerizado, o gel de empilhamento (poliacrilamida 4%) foi
preparado com a adio de 0,364 ml de acrilamida 30%, 0,7 ml de tampo de empilhamento
(Tris-HCl 2 M, pH 6,8), 0,028 ml de soluo de SDS 10%, 1,71 ml de gua milli-Q, 0,056 ml
de TEMED e 0,028 ml de PSA a 10%. Aps o trmino da polimerizao do gel, iniciou-se a
corrida, com durao de duas horas com uma voltagem de 150 V. As massas moleculares das
33

protenas presentes nas amostras foram determinadas utilizando-se padres de massa


molecular, na faixa de 7 a 175 kDa. O software de digitalizao de imagens Doc It LS UVP
foi utilizado para a documentao em foto.
3.2.4 Extrao e purificao de lipases vegetais
Os processos de extrao e purificao adotados neste trabalho so
apresentados a seguir nas Figuras 11 e 12. A Figura 11 representa o procedimento adotado
durante a fase inicial deste trabalho (processo I), que consistiu na escolha das sementes de
oleaginosas como fontes de lipases, visando sua aplicao futura na sntese de steres.
Enquanto a Figura 12 (processo II) representa o processo de extrao de lipases aps algumas
modificaes no processo I: alterao na temperatura e na velocidade de centrifugao,
alterao na temperatura de ultrafiltrao usando-se uma membrana de 100 kDa e por fim a
adio de uma nova etapa de ultrafiltrao, utilizando-se uma membrana de 5 kDa.
Figura 11 Diagrama de blocos do processo (I) de extrao e purificao de lipases vegetais

34

Figura 12 Diagrama de blocos do processo (II) de extrao e purificao de lipases vegetais

3.2.4.1 Extrao
A extrao foi iniciada com a triturao da semente em tampo fosfato de
sdio 50 mM, pH 7,0, contendo 0,5 mM de CaCl2, numa razo tampo/semente igual a 4,5
(v/m), em um processador de alimentos durante 3 minutos. Aps a triturao a suspenso foi
mantida sob agitao constante de 1.100 rpm durante 12 horas 25C. Essas condies foram
estabelecidas com base no trabalho de Sagiroglu e Arabaci (2005). Aps o perodo de
extrao, o extrato bruto foi filtrado e submetido s etapas de purificao. Amostras do
filtrado foram coletadas para medidas de atividade enzimtica e concentrao de protenas,
bem como para a anlise de eletroforese. A torta de filtrao foi tambm analisada quanto
umidade.

35

3.2.4.2 Purificao

3.2.4.2.1 Centrifugao
A centrifugao foi realizada com o intuito de remover partculas slidas do
extrato bruto, no removidas na etapa de filtrao e que poderiam causar entupimento da
membrana de ultrafiltrao. Amostras dos extratos clarificados foram coletadas para medidas
de atividade enzimtica e protenas, bem como para anlise de eletroforese. Mediu-se tambm
a umidade e a atividade enzimtica do precipitado.

3.2.4.2.2 Ultrafiltrao
O clarificado livre de partculas foi submetido a uma ultrafiltrao tangencial,
utilizando-se uma membrana de polipropileno com dimetro de corte de 100 kDa. Nesse
processo foram obtidas duas correntes: o concentrado, com molculas maiores do que 100
kDa, e o permeado, com molculas menores do que 100 kDa.
A Figura 13 mostra o esquema do sistema de ultrafiltrao utilizado. O
permeado de 100 kDa era coletado e o concentrado era reciclado at que seu volume final
fosse 10 vezes menor que o volume inicial do extrato clarificado. Esse procedimento tinha
como objetivo recuperar protenas de interesse (lipases) ainda presentes na corrente de
descarte. Para auxiliar essa recuperao e evitar problemas de entupimentos na membrana, foi
adicionado ao concentrado um novo volume de tampo fosfato de sdio (50 mM, pH 7,0 com
0,5 mM CaCl2) durante a ultrafiltrao. Amostras do permeado e concentrado foram coletadas
para medidas de atividade enzimtica e protena, bem como anlise de eletroforese.
Figura 13 - Esquema geral de funcionamento do sistema de ultrafiltrao tangencial.

Fonte: Adaptado de Santos et al., 2011.

36

A etapa adicional de ultrafiltrao em membrana de 5 kDa, introduzida no


processo II, tinha por objetivo a eliminao de protenas contaminantes de baixa massa
molecular e concentrao (reduo de volume) do extrato enzimtico. Neste processo, o
permeado era descartado e o concentrado (extrato enzimtico purificado) era reciclado at que
o seu volume final fosse reduzido em 10 vezes. Amostras do permeado e concentrado eram
coletadas para medidas de atividade enzimtica e protenas, bem como anlise de eletroforese.
3.2.4.3 Produtividade
A produtividade foi o parmetro usado para avaliar o potencial de produo de
lipases das fontes vegetais selecionadas. Este parmetro foi expresso em U/gseca (Unidade
lipoltica por grama de semente seca) e calculado atravs da equao 3.
Produtivida de

Atividade V
M

(3)

Em que: Atividade atividade enzimtica (U/ml) do extrato, V o volume total (ml) de


extrato e Mseca (g) a massa de semente seca usada no processo.
3.2.4.4 Avaliao de diferentes parmetros na extrao de lipase vegetal
De modo a identificar as melhores condies de extrao de lipases a partir de
sementes de soja, os seguintes parmetros foram investigados: temperatura, fora inica,
tempo de germinao, tempo de extrao e uso de aditivos no tampo de extrao.

3.2.4.4.1 Efeito da temperatura


A extrao de lipases da soja foi avaliada em duas temperaturas, 25C e 5C.
Os demais parmetros da extrao foram mantidos constantes: tempo de extrao (12 horas),
agitao (1.100 rpm), razo tampo/semente (4,5 v/m) e concentrao do tampo fosfato de
sdio (50 mM, pH 7,0 com 0,5 mM CaCl2). Aps o trmino da extrao, os dois extratos
foram filtrados e congelados para posterior anlise da atividade enzimtica.

37

3.2.4.4.2 Efeito da fora inica


A extrao de lipases da soja foi avaliada na presena de tampo fosfato de
sdio com concentraes variadas (5, 10, 25 50 e 100 mM) em pH 7,0 com 0,5 mM CaCl2. Os
demais parmetros de extrao foram mantidos constantes: tempo (12 horas), agitao (900
rpm), razo tampo/semente (4,5 v/m) e temperatura (25C). Aps o trmino da extrao, os
diferentes extratos foram filtrados e congelados para posterior anlise da atividade enzimtica.
3.2.4.4.3 Efeito da germinao
As sementes de soja foram divididas em diferentes recipientes e submersas em
gua destilada at que fosse atingido o perodo de germinao pretendido para o ensaio. As
protenas foram extradas das sementes germinadas com tampo fosfato de sdio (100 mM,
pH 7,0) temperatura de 25C, na razo tampo/semente de 4,5 (v/m) e agitao de 900 rpm
por 12 horas. Aps o trmino da extrao, os diferentes extratos foram filtrados e congelados
para posterior anlise da atividade lipoltica.
3.2.4.4.4 Efeito do tempo
A atividade lipoltica durante a extrao de lipases das sementes de soja foi
acompanhada por um perodo total de 52 horas. A extrao foi realizada com tampo fosfato
de sdio 50 mM, pH 7,0, com 0,5 mM CaCl2 numa razo tampo/semente de 4,5 (v/m). A
suspenso foi mantida sob agitao de 1.500 rpm 25C. Aps o trmino da extrao, os
diferentes extratos foram filtrados e congelados para posterior anlise da atividade lipoltica.

3.2.4.4.5 Efeito da presena de aditivos


Protenas da soja foram extradas com tampo fosfato de sdio 100 mM (pH
7,0) contendo 1% (v/v) de aditivos (SDS, Triton X-100, Tris-HCl e Brij-35). Uma extrao
na ausncia de aditivos (controle) foi tambm realizada para fins de comparao. Todas as
extraes foram realizadas 25C por 12 horas, usando uma razo tampo/semente de 4,5

38

(v/m) e agitao de 900 rpm. Aps o trmino das extraes, os diferentes extratos foram
filtrados e congelados para posterior anlise da atividade lipoltica.
3.2.5 Imobilizao de lipase em suporte hidrofbico
3.2.5.1 Modificao qumica da superfcie da slica com grupos octil
Com o intuito de aumentar a hidrofobicidade da superfcie, a slica foi
derivatizada com grupos octil conforme metodologia descrita por Tani e Suzuki (1996). A
ativao foi realizada pela preparao de uma suspenso contendo 1 g de slica seca e 20 mL
de uma mistura de octiltrietoxisilano e tolueno na razo volumtrica 1:10. Esta suspenso foi
mantida em refluxo por 3 horas a uma temperatura de aproximadamente 85C. Aps o perodo
de ativao, filtrou-se e lavou-se o suporte com tolueno, metanol e gua destilada.
3.2.5.2 Imobilizao de lipase em octil-slica
A imobilizao foi realizada em slica ativada com grupos octil (item 3.2.5), a
25C, pH 7,0 e baixa fora inica (tampo fosfato de sdio 50 mM).
Inicialmente coletou-se uma alquota para a dosagem de protena e atividade
inicial da soluo enzimtica. A seguir, o suporte ativado foi suspenso na soluo enzimtica
(1g de suporte/ 10 ml de soluo enzimtica). A suspenso de imobilizao foi mantida sob
suave agitao durante o intervalo de 2-15 horas a temperatura de 25C. Aps esse perodo, a
suspenso foi filtrada por suco a vcuo. O sobrenadante foi coletado para anlises de
atividade enzima, protenas e eletroforese. A enzima imobilizada foi seca temperatura
ambiente e armazenada sob refrigerao para uso posterior.

3.2.5.3 Clculo dos parmetros de imobilizao

3.2.5.3.1 Rendimento de imobilizao em termos de protena


A porcentagem de protena imobilizada (PI) foi calculada de acordo com a
equao 4, em que P0 a concentrao de protena (em mg/mL) no incio da imobilizao, e

39

Pf a concentrao de protena (em mg/mL) medida no sobrenadante ao final da


imobilizao.
PI(%)

P0 Pf
100
P0

(4)

3.2.5.3.2 Rendimento de imobilizao em termos de atividade


Rendimento de imobilizao (RI) enzimtica foi calculado pela equao 5,
onde Uo a atividade inicial da soluo enzimtica (branco de imobilizao); Uf a atividade
do sobrenadante final da imobilizao. U0 foi medida no final da imobilizao, pois a enzima
solvel pode inativar-se nas condies de reao (pH, temperatura, fora inica do tampo,
presena de inibidores, etc.).
RI(%)

U0 Uf
100
U0

(5)

3.2.5.3.3 Atividade recuperada


A atividade recuperada (AR) foi calculada pela equao 6, em que, UEI a
atividade aparente da enzima imobilizada (expressa em U/gsuporte); (UI x RI) a atividade
teoricamente imobilizada (expressa em U/gsuporte); UI a atividade oferecida para
imobilizao, expressa em U/gsuporte.

AR(%)

U EI
100
U I RI

(6)

A atividade oferecida para imobilizao calculada pela equao 7, onde UES


a atividade da enzima solvel (U/mL) medida nas condies descritas em 3.2.2; VES o
volume (mL) de enzima oferecida para imobilizao; MS a massa (em g) de suporte usado
na imobilizao.
UI

U ES VES
MS

(7)

3.2.6 Caracterizao da lipase isolada (solvel e imobilizada)


Lipase solvel e imobilizada foram caracterizadas quanto sua atividade tima
em funo do pH (solues de fosfato de sdio com pH de 3 a 10) em uma temperatura fixa
de 37C. Aps a determinao do pH timo foi realizada a caracterizao da enzima solvel e
40

imobilizada quanto a sua atividade tima em funo da temperatura (variando entre 27-67C)
em um pH fixo de 7,0.
A estabilidade trmica da enzima solvel e imobilizada foi avaliada a 50C, pH
7,0, por um perodo de 48 horas.
3.2.7 Aplicao de lipase de soja imobilizada na produo de steres
3.2.7.1 Produo de biodiesel (mistura de steres etlicos)
O ensaio de produo de biodiesel foi realizado em frascos fechados e
mantidos sobre agitao e temperatura constantes. A reao foi conduzida a 40C por 72
horas, utilizando uma razo leo/etanol de 1/7 (M/M) e uma relao biocatalisador/meio
reacional de 5% (m/v), sendo que o biocatalisador imobilizado apresentou uma atividade
hidroltica de 49 U/g . A concentrao dos steres foi determinada por cromatografia gasosa,
utilizando-se uma coluna carbowax (RTX - WAX), empregando como padro interno o
heptadecanoato de metila.
3.2.7.2 Produo de butirato de butila
A atividade de esterificao da lipase imobilizada foi determinada pela
formao do butirato de butila na reao de n-butanol (0,4M) com cido butrico (0,6M) em
heptano a 40C. A reao foi realizada em reator batelada equipado com camisa de circulao
de gua para termostatizao e condensador de refluxo para evitar perdas de reagentes ou
solventes por evaporao.
A reao foi iniciada pela adio da lipase imobilizada (1,0 g, base seca) ao
meio reacional (20mL), mantido sob agitao constante durante por 9 horas. Alquotas de
1mL foram retiradas do meio reacional no tempo zero e aps intervalos pr-determinados.
As concentraes de butanol e cido butrico foram determinadas por cromatografia gasosa,
utilizando-se uma coluna carbowax (RTX - WAX), empregando como padro interno
heptano, butanol e cido butrico.

41

4 RESULTADOS E DISCUSSO
Neste captulo so apresentados e discutidos os resultados experimentais
obtidos neste trabalho. Na fase inicial do trabalho, foram utilizadas as sementes de girassol,
mamona e soja na extrao, purificao e imobilizao de lipases. Com base nestes
resultados, uma semente de oleaginosa (sementes de soja) foi selecionada para os ensaios
posteriores.
Na segunda etapa, a partir da semente selecionada, foi realizada uma nova
extrao, purificao e imobilizao. O derivado obtido (lipase imobilizada) foi caracterizado
quanto a atividade e o pH de mxima atividade hidroltica e quanto estabilidade trmica. O
derivado caracterizado foi utilizado na produo de biodiesel e butirato de butila.
Na extrao da lipase a partir de sementes de soja (oleaginosa selecionada para
este trabalho), foram avaliados os efeitos de alguns parmetros na atividade lipoltica do
extrato bruto, tais como, temperatura, tempo de extrao e germinao, concentrao de
tampo fosfato de sdio, e presena de aditivos.
4.1 Extrao de lipases a partir de sementes de oleaginosas
Inicialmente realizou-se uma triagem de atividade lipoltica em sementes de
soja, girassol e mamona (processo I), a fim de se avaliar a produtividade de lipases de cada
oleaginosa, expressa como unidades hidrolticas por grama de semente seca (U/gseca). As
extraes foram realizadas em triplicata a fim de se avaliar a reprodutibilidade do processo.
Aps a filtrao, analisou-se protena e atividade nos filtrados (em triplicata). Os resultados
apresentados na Tabela 4 mostram uma excelente reprodutibilidade de extrao para as trs
sementes de oleaginosas testadas (os desvios padres no excederam a 5%). As
produtividades mdias foram de aproximadamente de 237, 100 e 81 U/gseca, respectivamente,
para as sementes de mamona, soja e girassol.
Embora as sementes de mamona tenham apresentado a melhor produo de
lipases, apresentaram baixos rendimento e fator de purificao comparado s sementes de soja
e girassol. O baixo rendimento de purificao deveu-se, principalmente, h grandes perdas de
atividade na etapa de centrifugao, aproximadamente 74% (ver Tabela 5). Essa grande perda
de atividade pode ser devido inativao da enzima por proteases e/ou perda de massa,
devido, provavelmente, a interaes entre enzima e outros compostos presentes no meio,
42

como protenas extremamente hidrofbicas, que podem estar ligadas s vesculas de lipdeos
das sementes.
Os resultados listados na Tabela 4 mostram que aps a etapa de ultrafiltrao,
as atividades especficas dos extratos enzimticos aumentaram em torno de 43, 47 e 11 vezes,
respectivamente para os extratos enzimticos obtidos a partir de sementes de soja, girassol e
mamona. Esses resultados mostram a eficincia da ultrafiltrao como processo de
purificao, em substituio a processos cromatogrficos onerosos e demorados. Mesmo para
o extrato enzimtico obtido a partir de sementes de mamona, cuja perda de atividade durante
os processos de centrifugao e ultrafiltrao foram elevadas, o fator de purificao
encontrado neste trabalho (FP 11) foi prximo ao valor obtido por ER-ZHENG et al., 2010
(FP 16) que utilizaram mtodos mais onerosos de purificao, tais como, cromatografias de
troca inica e hidrofbica. SAGIROGLO e ARABACI (2005) isolaram e purificaram uma
lipase de semente de girassol, obtendo um fator de purificao igual a 603. Entretanto,
utilizaram como processo de purificao, precipitao com sulfato de amnio, seguida de
dilise e permeao em gel. Alm disso, os autores no reportam o rendimento global do
processo (recuperao total de atividade). importante salientar que at onde sabemos, no
h resultados na literatura referentes extraes e purificaes de lipases de soja.
Tabela 4 Produtividade de lipases de sementes de oleaginosas, atividades especficas dos extratos
enzimticos (bruto e purificado) e parmetros de purificao.

Atividade

Atividade
Semente

Produtividade

(U/gseca)

Especfica do

Especifica do
Extrato Bruto

Extrato

Purificado

(U/mg)

(U/mg)

Rendimento
Global de
Purificao

Fator de
4

Purificao5

(%)

Soja

100,0 3,6

0,69 0,03

29,64 1,26

40,32

43,13

Girassol

81,1 2,3

1,08 0,03

47,13 1,76

35,46

46,89

Mamona

236,9 13,5

2,20 0,09

23,78 3,26

11,18

10,77

Extraes realizadas a 25C com tampo fosfato de sdio 50 mM, pH 7,0, contendo 0,5 mM de CaCl 2 (razo

tampo/semente = 4,5 v/m). A produtividade foi calculada como a razo entre a atividade total no filtrado (em
Unidades) e massa seca de sementes (em gramas); 2 Filtrado inicial; 3 Permeado da ultrafiltrao em membrana de 100
kDa; 4 (Unidades totais no permeado/Unidades totais no filtrado) x 100; 5 (Atividade especfica do permeado/Atividade
especfica do filtrado) x 100.

Observa-se na Tabela 5 que os maiores rendimentos de purificao foram


obtidos para as sementes de soja e girassol (em torno de 40% e 35%, respectivamente). A
43

partir de resultados da literatura, listados na Tabela 2, a maioria dos rendimentos de


purificao esto na faixa de 1,7 a 31%. Alguns valores maiores so encontrados (62,14 e
80,24%), entretanto, os fatores de purificao obtidos foram muito baixos (7,6 e 2,0,
respectivamente).
Tabela 5 Atividades totais (em Unidades) e rendimentos de extrao e purificao de lipases de sementes
de oleaginosas (soja, girassol e manona)

Etapas

Atividade Total Recuperada

Rendimento (%)

(U)
Soja

Girassol

Mamona

Soja

Girassol

Mamona

Filtrao

6760

5373

11820

100,00

100,00

100,00

Centrifugao

5010

2940

3026

74,11

54,72

25,60

Ultrafiltrao

2726

1905

1322

40,32

35,46

11,18

100 kDa (Permeado)


Todas as etapas foram realizadas em triplicatas e os desvios padres no excederam a 6%

Os extratos enzimticos purificados por ultrafiltrao foram incubados em pH


7,0 (tampo fosfato de sdio 50 mM) e em pH 10,0 (tampo bicarbonato de sdio 50 mM) a
25C. Este ensaio mostrou que as enzimas isoladas so lipases neutras, pois mantiveram
integralmente suas atividades em pH 7,0 aps 20 horas, ao passo que em pH 10,0 foram
totalmente inativadas aps uma hora.
As lipases de soja, girassol e mamona, parcialmente purificadas, foram
imobilizadas por adsoro hidrofbica em slica-octil a 25C, pH 7,0 (tampo fosfato de sdio
50 mM), por 15 horas. O principal objetivo desse ensaio foi verificar se as lipases isoladas
neste trabalho so ativadas na presena de superfcies hidrofbicas, fenmeno conhecido
como ativao interfacial (VERGER et al., 1997; BASTIDA et al., 1998; PALOMO et al.,
2002; FERNNDEZ-LORENTE et al., 2008, CABRERA et al., 2009).
A Tabela 6 mostra os resultados em termos de rendimento de imobilizao e
recuperao de atividade. Todas as lipases foram ativadas por imobilizao em octil-slica (4
a 15 vezes mais ativas que as enzimas solveis). Essa ativao deve-se ao fato da lipase ser
imobilizada com a tampa aberta, permanecendo adsorvida ao suporte na forma ativa
(BASTIDA et al.,1998; PALOMO et al,. 2002). Cunha et al. (2009) observaram ativao da
mesma ordem de grandeza (131 a 1132%) para lipase de Penicillium simplissicimum.

44

Tabela 6 Parmetros da imobilizao de lipases vegetais em octil-slica (25C, pH 7, 15 horas)

Soja

Girassol

Mamona

Carga de Protenas (mg/ g Suporte)

4,92

3,13

3,87

Carga Enzimtica (U/g Suporte)

0,22

0,27

0,10

Rendimento de Imobilizao em

87,98

88,72

77,98

1,29

0,99

1,17

683

413

1494

Atividade (%)
Atividade da Enzima Imobilizada
(U/ g Suporte)
Atividade Recuperada (%)

Atividades medidas com PNPB como substrato, conforme metodologia descrita em 3.2.2.2.

Com base nos resultados de produtividade de lipases (U/gseca), purificao


(fator de purificao e rendimento global de atividade) e ativao interfacial na presena de
superfcies hidrofbicas, selecionaram-se sementes de soja para as prximas etapas deste
trabalho. Outro fator fortemente ponderado na escolha dessa oleaginosa para extrao e
purificao de lipases foi ausncia de trabalhos na literatura a respeito do isolamento e
caracterizao de lipases da soja.
4.2 Extrao, purificao, imobilizao e caracterizao de lipase isolada de gros de
soja
Extraes de lipase de soja com diferentes lotes de sementes adquiridas no
comrcio local em perodos diferentes do ano mostraram que sob as mesmas condies
experimentais (25C, 900-1.100 rpm, tampo fosfato de sdio 50 mM, pH 7,0, razo
tampo/semente de 4,5 v/m) a produtividade mdia de atividade lipoltica foi de 95,95 31,61
(mdia de 8 amostragens).
A Tabela 7 mostra os resultados da extrao de lipase de soja utilizando-se o
processo II (Figura 12 da seo 3.2.4), cujas principais alteraes realizadas em relao ao
processo I (Figura 11) foram reduo velocidade de centrifugao (4C e 4000 g) e reduo da
temperatura de ultrafiltrao (etapa realizada em banho de gelo) e a adio de uma nova etapa
de ultrafiltrao, agora usando de uma membrana de 5 kDa . Com essas modificaes no
45

processo de extrao foi possvel aumentar o rendimento global do processo (de 40,32 para
49,92%) e o fator de purificao do extrato enzimtico (de 43,13 para 59,13). O aumento no
rendimento de purificao pode ser explicado pela reduo na velocidade de autlise
(digesto de lipases por proteases presentes nos gros de soja) devido reduo na
temperatura de centrifugao e ultrafiltrao (KLIBANOV, 1983).
O extrato enzimtico obtido na ultrafiltrao em membrana de 100 kDa foi
concentrado por ultrafiltrao em membrana de 5 kDa. Essa operao promoveu a
concentrao do extrato enzimtico em aproximadamente 8 vezes, no sendo observada
nenhuma perda de protena no permeado, conforme mostra a eletroforese SDS-PAGE deste
material (ver Figura 15 na seo 4.2.2). Esse extrato enzimtico concentrado foi utilizado nos
ensaios seguintes: imobilizao de lipases em octil-slica, eletroforese SDS-PAGE,
caracterizao enzimtica (perfil de temperatura, pH e estabilidade trmica da enzima solvel
e imobilizada).
Tabela 7 Produtividade de lipase de gros de soja, atividades especficas dos extratos enzimticos (bruto
e purificado) e parmetros de purificao.

Atividade
Semente

Produtividade1

Especifica do

(U/gseca)

Extrato Bruto2

Atividade

Especfica do
Extrato
Purificado3

(U/mg)
Soja
1

57,9 3,31

(U/mg)

0,29 0,03

17,74 2,69

Rendimento
Global de

Fator de

Purificao4

Purificao5

(%)
49,92 11,49

59,13 14,17

Extraes realizadas a 25C com tampo fosfato de sdio 50 mM, pH 7,0, contendo 0,5 mM de CaCl 2. A

produtividade foi calculada como razo entre a atividade total no filtrado (54.810 U) e massa seca de gros de soja
(947,8 g); 2 Filtrado inicial (54.810 U e 182,2 g de protenas); 3 Permeado da ultrafiltrao em membrana de 100 kDa
(27.360 U e 1,542 g de protenas);

(Unidades totais no permeado/Unidades totais no filtrado) x 100;

(Atividade

especfica do permeado/Atividade especfica do filtrado) x 100.

4.2.1 Imobilizao em slica-octil de lipase de soja purificada pelo processo II


Lipase de soja foi imobilizada por adsoro hidrofbica em octil-slica a 25C,
pH 7,0 (tampo fosfato de sdio 50 mM) e 2,5 horas de reao. Na Figura 14 so
apresentados os perfis de protena e atividade hidroltica no sobrenadante de imobilizao. O
perfil de atividade do branco (atividade do extrato enzimtico) praticamente constante,
mostrando que no houve perda de atividade da enzima solvel nas condies de
46

imobilizao. Os perfis de protena e atividade mostram que foram imobilizadas


aproximadamente 50% e 32% da protena e da atividade inicial, respectivamente.
Figura 14 Perfis de protenas e atividade hidrofbica no sobrenadante de imobilizao de lipase de soja
em octil-slica (25C, pH 7,0)

A Tabela 8 mostra que a imobilizao de lipase de soja em octil-slica rendeu


um derivado com 99,5 U/gsuporte. A lipase imobilizada foi aproximadamente 3 vezes mais
ativa que a enzima solvel (recuperao de atividade de 331%). A diferena no valor de
ativao da enzima imobilizada com relao ao obtido anteriormente (recuperao de
atividade de 683%, Tabela 6) pode ser devido utilizao de substratos diferentes na medida
de atividade. Azeite de oliva um triglicerdeo com cidos graxos de cadeias carbnicas
longas ligadas ao esqueleto de glicerol, enquanto PNPB um ster de cadeia carbnica curta
(apenas quatro carbonos). Portanto, a velocidade de hidrlise desses substratos diferente,
devido especificidade das enzimas por seus substratos. Em se tratando de lipases, a
especificidade uma propriedade que varia de acordo com a espcie produtora.
Suzuki et al (2004) estudaram a especificidade de lipases extradas de sementes
de trigo utilizando substratos com cadeias carbnicas de diferentes tamanhos, p-nitrofenil
acetato (dois carbonos), p-nitrofenil butirato (quatro carbonos), p-nitrofenil caproato (seis
carbonos) e p-nitrofenil laurato (doze carbonos). Os autores verificaram que a atividade
enzimtica era fortemente dependente do comprimento da cadeia carbnica. A maior
atividade foi exibida com p-nitrofenil laurato como substrato e a menor foi exibida com pnitrofenil butirato.
Prabhu et al (1999) verificaram que lipase extrada de farelo de arroz exibia
atividade hidroltica 4,5 vezes maior com tributirina (triglicerdeo com cidos butricos
ligados ao esqueleto de glicerol) como substrato, ao invs de azeite de oliva. Sagiroglu e
47

Arabaci (2005) verificaram que lipase extrada de semente de girassol apresentava duas vezes
mais atividade hidroltica frente a leo de oliva, ao invs de tributirina como substrato. A
utilizao de diferentes tipos de leos como substrato tambm foi motivo de estudo em alguns
trabalhos envolvendo o uso de lipases vegetais na hidrlise desses leos, sendo o azeite de
oliva o leo que apresentou uma alta atividade independente da origem da lipase (SANA et
al., 2004; YEILOLU, Y.; DEMIRKAN, B., 2010; ER-ZHENG et al., 2010).
Embora valores diferentes de ativao interfacial tenham sido obtidos neste
trabalho, evidente que lipases de soja possuem uma tampa moduladora de atividade. Na
presena de interfaces hidrofbicas (neste caso, octil-slica) a lipase de soja foi imobilizada
com a tampa aberta, permanecendo adsorvida ao suporte na forma ativa.
Tabela 8 Parmetros da imobilizao de lipase de soja em octil-slica (25C, pH 7, 2,5 horas)

Parmetros de Imobilizao
Carga de Protenas (mg/ gsuporte)

11,88

Carga Enzimtica (U/gsuporte)

92,25

Rendimento de Imobilizao

(% de

32,54

Atividade da Enzima Imobilizada (U/

99,5

atividade)

gsuporte)
Atividade Recuperada (%)

331

Atividades medidas com azeite de oliva como substrato, conforme


metodologia descrita em 3.2.2.1.

4.2.2 Eletroforese
Eletroforese SDS-PAGE foi utilizada para acompanhar qualitativamente o
processo de extrao e purificao da lipase de soja, alm de ser utilizada para uma estimativa
da massa molecular das lipases extradas.
A Figura 15 mostra inicialmente no filtrado (B) a presena de bandas fracas de
diferentes massas moleculares, que se mostram com maior intensidade aps a realizao da
centrifugao (C). Aps a etapa de ultrafiltrao em membrana de 100 kDa (D), foi possvel
48

observar

que

as

protenas

grandes

presentes

no

centrifugado

foram

reduzidas

significativamente, sendo apenas preservadas as protenas de baixa massa molecular. No


permeado da ultrafiltrao em membrana de 5 kDa (E) no foi detectada a presena de
protenas, mostrando que essa etapa serviu unicamente para a concentrao do extrato
enzimtico (F). Nessa frao, observa-se a presena de duas bandas de maior intensidade,
com massas moleculares de aproximadamente 20 e 30 kDa. Aps a imobilizao em octilslica, o sobrenadante final da imobilizao (G) mostra que a banda de 30 kDa praticamente
desapareceu, permanecendo com menor intensidade a banda de 20 kDa. Bandas de massas
moleculares maiores so observadas tanto no sobrenadante final da imobilizao como no
extrato enzimtico purificado (F). Esses resultados mostram que a imobilizao em octil-slica
foi seletiva para lipase. Alm disso, como apenas 32,54% da atividade lipoltica oferecida foi
imobilizada (Tabela 8), pode-se suspeitar da existncia de duas lipases no extrato enzimtico
das sementes de soja, uma de massa molecular de 30 kDa que imobilizada rapidamente em
octil-slica e outra de 20 kDa, presente em maior quantidade no extrato enzimtico (em torno
de 68%) e que imobiliza mais lentamente em octil-slica. Essas duas fraes devem ser
futuramente melhor estudadas a fim de se caracterizar completamente as duas possveis
lipases no extrato proteico das sementes de soja. A presena de duas lipases distintas em
extratos proteicos vegetais tambm foi observada por Suzuki, Honda e Mukasa (2004),
extraindo lipases das sementes de trigo. As lipases isoladas exibiram propriedades muito
distintas, uma com massa molecular de 150 kDa, pH timo de 3,0 e temperatura tima de
30C. A outra, com massa molecular de 28,4 kDa, pH timo de 6,0 e temperatura tima de
40C.

49

Figura 15 Eletroforese SDS-PAGE (gel de poliacrilamida 12%) dos extratos enzimticos de sementes de
soja

(A) padro da massa molecular, (B) filtrado da extrao de protenas da soja, (C) clarificado da centrifugao,
(D) permeado da ultrafiltrao em membrana de 100 kDa, (E) permeado da ultrafiltrao em membrana de 5
kDa, (F) concentrado da ultrafiltrao em membrana de 5 kDa (antes da imobilizao), (G) sobrenadante final da
imobilizao em octil-slica.

4.2.3 Propriedades catalticas do extrato enzimtico e da lipase imobilizada


A atividade cataltica de uma enzima imobilizada, por mais suave que seja o
mtodo de imobilizao, pode ser alterada devido a uma srie de efeitos (BLANCH; CLARK,
1997; VITOLO, 2001), dentre eles:
(i)

Efeitos conformacionais e estricos: a conformao da molcula de


enzima pode ser alterada pela imobilizao, influenciando sua
eficincia cataltica. Alm disso, a molcula de enzima pode ser
imobilizada com o stio ativo voltado para o suporte, tornando o acesso
do substrato mais difcil, acarretando reduo na atividade;

(ii)

Efeitos eletrostticos ou de partio: a concentrao de espcies


qumicas importantes (ons H+, molculas de substrato ou produto) no
microambiente prximo a enzima imobilizada pode ser diferente
daquela do resto da soluo, devido s propriedades fsico-qumicas do
suporte, como por exemplo, suportes carregados (positivamente ou
negativamente), inertes ou hidrofbicos;

(iii)

Efeitos difusionais: a velocidade da reao enzimtica pode ser limitada


pela taxa de difuso do substrato na superfcie externa do suporte e pela
taxa de difuso do substrato no interior dos poros do suporte;
50

(iv)

Mudana na estabilidade da enzima (trmica ou ao pH).

Portanto, para cada caso sistema enzima-substrato h de se determinar as


condies timas de operao, particularmente a temperatura e o pH.
Neste trabalho avaliou-se a temperatura e o pH timo para a atividade
hidroltica, bem como a estabilidade trmica da lipase solvel (extrato enzimtico
parcialmente purificado) e imobilizada em octil-slica (slica hidrofobizada com grupos octil).
4.2.3.1 Efeito do pH e temperatura na atividade da lipase livre e imobilizada
A Figura 16 mostra os perfis de atividade em funo da temperatura e do pH
para a lipase de soja na forma solvel e imobilizada.
Figura 16 Perfis de atividade em funo da temperatura (pH 7,0) e do pH (37 C). Atividades medidas
com azeite de oliva como substrato. A maior atividade foi tomada como 100%.

A atividade de mxima atividade cataltica da enzima imobilizada ficou em


torno de 57C, enquanto a da enzima solvel ficou em torno de 47C. A enzima solvel
manteve mais de 70% da atividade mxima em toda a faixa de temperatura estudada,
enquanto a enzima imobilizada tem sua atividade bruscamente reduzida fora da temperatura
tima.
O deslocamento da temperatura tima de 47C para 57C com a imobilizao
pode ser explicado por uma maior estabilidade trmica da lipase imobilizada, j que timo
aparente de temperatura observado nos perfis atividade-temperatura o resultado de dois
processos: aumento da velocidade de reao com a temperatura (Lei de Arrhenius) e crescente
51

desnaturao trmica da enzima acima de uma temperatura crtica (WHITAKER, 1994;


LENINGHER et al., 1995).
O pH de mxima atividade hidroltica para a lipase solvel foi de 8,0, enquanto
para a enzima imobilizada foi de 6,0. Novamente, a atividade mxima da enzima imobilizada
situa-se numa faixa estreita de pH, sendo bruscamente reduzida fora desta faixa. Por exemplo,
nos extremos da faixa de pH estudada, a enzima imobilizada apresenta aproximadamente 32%
(pH 3,0) e 15% (pH 10,0) da atividade mxima, enquanto a enzima solvel mantm em torno
de 55% (pH 3,0) e 45% (pH 10,0) da atividade mxima.
O deslocamento do pH timo de 8,0 (enzima solvel) para 6,0 (enzima
imobilizada) pode estar associado ao efeito de partio dos ons hidroxnio devido ao carter
cido da slica. Alm disso, merece destacar que o extrato enzimtico pode apresentar duas
isoformas de lipases, das quais uma preferencialmente imobilizada em octil-slica. Essas
provveis isoformas podem apresentar propriedades catalticas distintas, como observado por
Suzuki, Honda e Mukasa (2004) para isoformas de lipases isoladas a partir de sementes de
trigo: lipase I com pH e temperatura tima de 3,0 e 30C, respectivamente; lipase II com pH e
temperatura tima de 6,0 e 40C, respectivamente.
4.2.3.2 Estabilidade trmica
A estabilidade trmica das lipases solvel e imobilizada em octil-slica foi
realizada a 50C, pH 7,0 (tampo fosfato de sdio 50 mM). As atividades residuais foram
acompanhadas em intervalos regulares de tempo usando azeite de oliva como substrato.
A Figura 17 mostra que a enzima imobilizada inativou-se com o tempo,
apresentando uma meia-vida de aproximadamente 7 horas. No entanto, a enzima solvel
mostrou um comportamento atpico, com a atividade aumentando com tempo de incubao.
Ensaios de inativao foram realizados em triplicata e confirmaram tal comportamento. Esse
de aumento de atividade pode ser devido, provavelmente, presena de acares e outras
protenas contaminantes no extrato enzimtico que atuaram como preservantes da atividade
cataltica da lipase. A presena de acares ou outros poliis em solues aquosas de enzimas
fortalece as interaes hidrofbicas entre resduos de aminocidos apolares, rigidificando a
macromolcula de protena e, por conseguinte, tornando-as mais resistentes inativao por
preda da conformao tridimensional da estrutura proteica (KLIBANOV, 1983).

52

Figura 17 Estabilidade trmica de lipase de soja solvel e imobilizada em octil-slica, a 50C, pH 7,0.

4.2.4 Sntese do butirato de butila


Lipase de soja imobilizada em octil-slica foi utilizada na sntese de butirato de
butila em heptano a 40C, conforme metodologia descrita na seo 3.2.7.2. A reao foi
monitorada atravs do consumo de n-butanol por cromatografia gasosa.
A Figura 18 ilustra o perfil de consumo de n-butanol com o tempo, mostrando
uma converso de 15% em 9 horas de reao. Baixa converso desta reao tambm foi
obtida por Oliveira et al., 2000 (25% de converso em 10 h de reao a 45C) utilizando como
biocatalisador lipase de Candida rugosa.
Os resultados obtidos neste trabalho motivam a explorao do potencial de
aplicao deste biocatalisador (lipase de soja imobilizada em octil-slica) em reaes de
interesse industrial, tais como, sntese de aromas de frutas e biosurfactantes (steres de
acares de cidos graxos) e hidrlise de leos vegetais.
Figura 18 Consumo de butanol na sntese de butirato de butila a 40C em heptano. Relao cido
butrico/n-butanol = 1,5 (mol/mol), concentrao de biocatalisador = 0,05 g/ml.

53

4.2.5 Produo de biodiesel


Verificou-se neste trabalho que lipase extrada do gro germinado de soja e
imobilizada por adsoro hidrofbica em slica-octil no apresentou atividade de
transesterificao, pelo menos nas condies ensaiadas (40C, 72 horas de reao, relao
molar leo refinado de soja:etanol de 1:7). Uma possvel alternativa para contornar essa
deficincia seria a produo de biodiesel por hidroesterificao (TING et al., 2008), ou seja,
hidrlise enzimtica do leo de soja catalisada pela lipase de soja, seguida por esterificao
dos cidos graxos liberados via catlise enzimtica (usando outra lipase, por exemplo, lipase
de Candida antarctica) ou catlise cida.
4.3 Extrao de lipases a partir de sementes de soja
Esta etapa do trabalho objetivou selecionar as melhores condies para a
extrao de lipases de gros de soja. Foram investigadas as influncias da temperatura e do
tempo de extrao, fora inica e presena de aditivos no tampo de extrao e germinao
das sementes.
4.3.1 Efeito da temperatura
A Tabela 9 apresenta as atividades volumtricas e especficas dos extratos
enzimticos brutos obtidos por extrao de lipases a partir de sementes de soja 25C e 5C.
Os resultados mostram que a temperatura no influenciou significativamente na atividade
volumtrica do extrato bruto, portanto, o pequeno ganho de atividade na extrao a 5C no
justifica o custo extra de refrigerao. Durante a extrao das protenas da soja, outras
enzimas so solubilizadas, como as proteases. Essas enzimas podem inativar lipases por
hidrlise de ligaes peptdicas e essa inativao poderia ser maior temperatura ambiente.
Entretanto, durante a extrao de protenas da soja com solues salinas, inibidores de
proteases (inibidor de tripsina de soja Kunitz, KSTI, e inibidor de tripsina Bowman Birk,
BBI) tambm so solubilizados (CATSIMPOOLAS e EKENSTAM, 1969; WOLF, 1970), os
quais, provavelmente, auxiliaram na preservao da atividade lipoltica do extrato enzimtico.

54

Tabela 9 Comparativo do efeito da temperatura na extrao de lipase a partir de sementes de soja

Etapas

Filtrao

Atividade (U/ml)

Protena

Atividade

(mg/ml)

Especfica (U/mg)

T25C

T5C

T25C

T5C

T25C

T5C

14,53

16,51

14,23

18,63

1,02

0,89

Condies de extrao: Tampo fosfato de sdio 50 mM (0,5 mM CaCl2 pH 7,0), 12 h a 1.100 rpm, razo
tampo/semente (4,5 v/m).

4.3.2 Efeito da fora inica


A Figura 19 mostra o efeito da concentrao de fosfato de sdio na extrao de
lipases a partir de gros de soja. Observa-se que a atividade lipoltica do extrato enzimtico
bruto aumenta com o aumento da concentrao do tampo de extrao, atingindo seu maior
valor a uma concentrao de 100 mM, pelo menos para a faixa de concentraes avaliada. De
acordo com o processo de "salting-in" o aumento da fora inica favorece o aumento da carga
inica ao redor da enzima que, consequentemente, favorece sua solubilizao (LEHNINGER,
1976) Por isso, para a faixa de concentraes avaliadas, o aumento da concentrao de sal
aumentou a extrao de lipases de gros de soja.
Figura 19 Efeito da fora inica na extrao de lipases de gros de soja

4.3.3 Efeito da germinao

Observa-se na Figura 20 que a atividade lipoltica das sementes de soja


aumentou com o tempo de germinao, apresentando um pico de mxima atividade aps 12
horas de germinao. Urquhart et al. (1984) observaram comportamento semelhante na
55

germinao de gros de aveia. Aps 12 horas, observa-se um decrscimo da atividade


cataltica da enzima, devido, provavelmente, ao aumento da concentrao de acil-CoA
(produto da reao de -oxidao de lipdeos), que podem inibir a enzima durante o perodo
de germinao (HILLS; MURPHY; BEEVERS, 1989). H tambm a influncia do cido
giberlico sobre a ao da lipase, regulando a distribuio da enzima associada a protenas de
membrana (forma de armazenamento) para corpos de lipdeos (forma ativa) via difuso
lateral, expondo os stios ativos das lipases aos seus substratos (triacilglicerdeos estocados
dentro dos corpos de lipdeos) (FERNANDEZ; STAEHELIN, 1987).
Figura 20 Efeito da germinao na extrao da lipase a partir da semente de soja (% em relao a maior
atividade).

4.3.4 Efeito do tempo

A Figura 21 apresenta a atividade no extrato enzimtico bruto em funo do


tempo de extrao de lipases a partir de sementes de soja. Observa-se que o tempo no
influenciou significativamente a atividade enzimtica, permanecendo constante durante 12
horas de extrao. Uma explicao para esse comportamento deve-se ao fato que uma frao
de protenas da soja rapidamente solubilizada em soluo aquosa salina, incluindo nesta
frao algumas enzimas (proteases, lipases, etc.). Tempo maior de extrao requerido para a
solubilizao de protenas de alta massa molecular (glicinina e -conglicinina, por exemplo,
GARCIA et al., 1998; RIBLETT et al., 2001), as quais contaminariam o extrato enzimtico
bruto, reduzindo sua atividade especfica.

56

Figura 21 Efeito do tempo na extrao da lipase a partir da semente de soja.

4.3.4 Efeito da presena de aditivos

Neste ensaio verificou-se a influncia dos surfactantes Triton X-100, Brij-35


e SDS na extrao/solubilizao de lipases de sementes de soja. Triton X-100 e Brij-35
(Brij L23) so surfactantes no inicos (detergentes) que reduzem a tenso superficial da
gua, e so usados na solubilizao de protenas de membrana em condies suaves no
desnaturantes (SIGMA-ALDRICH). SDS (dodecil sulfato de sdio ou lauril sulfato de sdio)
um surfactante aninico, com propriedades detergentes e desnaturante forte de protenas. O
SDS se liga maioria das protenas na relao uma molcula de SDS para cada dois resduos
de aminocidos. Esta ligao confere molcula de protena grande carga negativa,
proporcionando inclusive a desdobra parcial da molcula, podendo leva-la inativao
(NELSON; COX, 2011).
A presena de surfactantes em soluo (abaixo da concentrao micelar crtica)
pode favorecer a solubilizao de lipases, dada a afinidade destas enzimas por estes
compostos. Na ausncia de surfactantes a lipase existe na forma fechada, enquanto na sua
presena, a tampa se abre, atingindo atividade mxima. Entretanto, acima da concentrao
micelar crtica o tensoativo pode inibir a ao da enzima decorrente da interao do tensoativo
com o seu stio ativo, podendo inclusive provocar distores destrutivas neste
(FERNNDEZ-LORENTE et al., 2007).
Verificou-se neste trabalho (Figura 22) que todos os surfactantes testados no
promoveram aumento na atividade enzimtica do extrato bruto, seja por solubilizao extra de
57

lipase, seja por ativao da enzima. A atividade especfica de todos os extratos enzimticos
ficou em torno de 1,1 0,1 U/mg. Surpreendentemente, o uso de Tris-HCl (1%, m/v) no
tampo de extrao praticamente triplicou a atividade enzimtica especfica do extrato bruto
(aproximadamente 2,6 U/mg). Esse comportamento requer um estudo mais detalhado, uma
vez que relatado que Tris inibe a ao de certas enzimas e, portanto, deve ser usado com
cautela no estudo de protenas (GHALANBOR et al., 2008).
Figura 22 Efeito da adio de aditivos no tampo de extrao (fosfato de sdio 50 mM) de lipases a
partir de sementes de soja.

58

5 CONCLUSES
As principais concluses deste trabalho foram as seguintes:

As sementes de oleaginosas investigadas neste trabalho mostraram grande potencial de


produo de lipases. Extraes com tampo fosfato de sdio 50 mM, pH 7,0, contendo
0,5 mM de CaCl2, a 25C, razo tampo/semente de 4,5 (v/m), renderam
produtividades mdias de (236,9 13,5), (100,0 3,6) e (81,1 2,3) U/gseca,
respectivamente para sementes de mamona, soja e girassol. Particularmente, as
sementes de soja despertaram interesse de investigao neste trabalho pela ausncia de
estudos na literatura a respeito de extrao, isolamento e caracterizao de lipases
desta oleaginosa.

As condies experimentais que maximizaram a produo e extrao de lipases de


soja foram germinao das sementes por 12 horas, extrao a 25C por 12 horas,
soluo salina (fosfato de sdio, pH 7,0) de 100 mM e adio de Tris-HCl (1%, m/v)
no tampo de extrao.

A clarificao do extrato bruto por centrifugao e a purificao por ultrafiltrao


tangencial em membrana de 100 kDa, permitiram a obteno de fatores de purificao
de aproximadamente 47, 43 e 11, respectivamente para as sementes de girassol, soja e
mamona. As recuperaes de atividade nos extratos enzimticos purificados ficaram
em torno de 40, 35 e 11%, respectivamente para soja, girassol e mamona.

A imobilizao das lipases de sementes de mamona, soja e girassol em suporte


hidrofbico (octil-slica) sugeriu que todas apresentam tampa moduladora de
atividade, exibindo ativao interfacial na presena de superfcies hidrofbicas.

A imobilizao de lipase de soja em octil-slica mostrou que possivelmente h duas


isoformas de lipases no extrato enzimtico, com massas moleculares de
aproximadamente 20 e 30 kDa.

Lipase de soja solvel apresentou atividade cataltica mxima em 47C e pH 8,0. A


imobilizao em octil-slica deslocou a atividade mxima para 57C e pH 6,0. A
enzima imobilizada apresentou meia-vida a 50C pH 7 de aproximadamente 8 horas.
No foi possvel estimar a meia-vida da enzima solvel, pois nas condies ensaiadas
sua estabilidade trmica aumentou com o tempo de incubao, devido provavelmente
presena de acares no extrato enzimtico.
59

Na sntese de butirato de butila, catalisada por lipase de soja imobilizada em octilslica, obteve-se uma converso em torno de 15% em 9 horas de reao a 40C, na
presena de heptano.

A lipase extrada e imobilizada a partir da semente de soja germinada no apresentou


atividade de transesterificao.

60

6 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTURO

Separar as duas possveis isoformas de lipases da soja a fim de caracteriz-las quanto


ao ponto isoeltrico, pH e temperatura de mxima atividade cataltica e estabilidade
trmica e ao pH;

Avaliar a eficincia de outras tcnicas de purificao (precipitao com sulfato de


amnio, adsoro em resinas hidrofbicas, etc.) na recuperao da atividade cataltica
no extrato enzimtico das sementes de soja.

Estudar a especificidade da lipase da soja quanto ao comprimento da cadeia carbnica


do substrato;

Avaliar a atividade enzimtica da lipase de soja na hidrlise de diferentes leos


vegetais, sntese de aromas de frutas, steres de acares de cidos graxos, etc.

Avaliar possveis aplicaes para os resduos da extrao de lipases a partir das


sementes de soja, tais como, farelo e frao proteica obtida no concentrado da
ultrafiltrao em membrana de 100 kDa.

61

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74

APNDICES
Apndice 1 - Lipases de origem vegetal

Origem

Massa

pH

Molecular

T C

Referncia

timo tima

(kDa)
Semente de Feijes

8,0

30

Africanos (Pentaclethra

ENUJIUGHA et al.,
2004.

macrophylla Benth)
Sementes de Mamona

60

4,6

35

Chinesa (vrias

ER-ZHENG et al.,
2010.

variedades)
Farelo de Arroz (Oryza

9,4

11

80

2001.

sativa)
Semente de Nogueira

9,0

70

22

7,5

50

7,5

35

8,5

nucifera linn)
Mudas de milho durante

SAGIROGLU e
ARABACI, 2005.

(Helianthus annuus L)
Semente de Coco (Cocos

YEILOLU e
DEMIRKAN, 2010.

(Juglans regia L.)


Semente de Girasol

BHARDWAJ et al.,

EJEDEGBA et al.,
2007.

7,5

LIN et al., 1983.

116 30

NCUBE et al., 1995.

8,0

50

ISBILIR et al., 2008.

o crescimento (vrias
variedades)
Semente de Vernonia
galamensis
Semente de louro
(Laurus nobilis L.)

75

Apndice 1 - Lipases de origem vegetal (Continuao)

Origem

Massa

pH

Molecular

T C

Referncia

timo tima

(kDa)
Germem de trigo

143

8,0

37

et al., 2004.

(Triticum aestivum L.)


Semente de Jatropha

KAPRANCHIKOV

7,5

37

ABIGOR et al., 2002.

curcas L (Pinho manso)


SUZUKI et al.,

Semente de Trigo
(Fagopyrum esculentum)

2004.
150

3,0

30

28,4

6,0

40

(Lipase I)
Semente de Trigo

SUZUKI et al.,
2004

(Lipase II)
Flor de Trigo

25

TANI et al., 1994.

Semente de Pachira

55

8,0

40

POLIZELLI, 2008.

60

4,5

EASMOND, 2004.

34

7,0

37

SANA et al., 2004.

8,0

40

WEERASOORIYA e

aquatica (Bombacaceae)
Semente de Mamona
(Ricinus communis)
Semente de Brassica
Napus L.
Semente de Hevea.

GUNASEKARA,

brasiliensis

2011.
Semente de Tremoo

5,0

25

(Lupinus albus cv

SANZ e OLIAS,
1990.

multotupa)
Semente de Amndoas

8,5

(Amygdalus communis

65

YEILOLU e
BAKURT, 2008.

L.)

76

Apndice 2 - Lipases obtidas a partir de animais

Origem

Massa

pH

T C

Molecular

timo

tima

Referncia

(kDa)
Inseto

76

ARRESE e WELLS,
1994.

Besouro

7,6

37

NANDANAN et al.,
1973.

eCordeiro

68

30

DSOUZA e ORIEL,
1992.

Leite de vaca

62-68

EGELRUD e
OLIVECRONA,
1972.

Camaro

Dois

8-10

30-40

PREZ et al., 2011.

monmeros:
95 / 63
Peixe

64

7-9

LIJIMA et al., 1998.

Escorpio

50

ZOUARI et al. 2005

77

ANEXOS
Origem

Anexo 1 - Lipases obtidas a partir de fungos

Arxulaadeninivorans

Massa Molecular
(kDa)
50

pH
timo
7,5

T C
tima
30

Boer et al. (2005)

Candida albicans ATCC

38

Fu et al. (1997)

36082

Referncia

Hube et al. (2000)

Candida curvata

195

5,0-8,0

60

Lazar and Schroder


(1992)

Candida rugosa ATCC

60

5,0

Lotti et al. (1993)

64

7,8

Benjamin and Pandey

14380
Candida rugosa DMS 2031
(A)

(2001)

Candida rugosa DMS 2031

62

7,8

Benjamin and Pandey

(B)

(2001)

Candida rugosa DMS 2031

60

7,8

Benjamin and Pandey

(C)

(2001)

Geotrichum candidum link

55

5,6-7,0

40

Tsujisaka et al. (1973)

Humicola lanuginosa

27,5

8,0

60

Veeraragavan et al.
(1990)

Mucor michei

8,0

40

Lazar and Schroder


(1992)

Penicillium cyclopium (A)

27

7,5

35

Iwai et al. (1975)

Penicillium cyclopium (B)

36

5,8

40

Iwai et al. (1975)

Rhizopus arrhizus

43

8,0

Lazar and Schroder


(1992)

Rhizopus delemar

41

5,6

35

Lazar and Schroder


(1992)

Saccharomyces cerevisiae

63

Oishi et al. (1999)

Trichosporon asteroides

37

5,0

50

Dharmsthiti and
Ammaranond (1997)

Fonte: Adaptado de SHARMA, D; SHARMA, B.; SHUKLA, 2011.

78

Origem

Anexo 2 - Lipases obtidas a partir de bactrias

Acinetobacter sp. RAG-1

Massa
Molecular
(kDa)
33

pH
timo

T C
tima

Referncia

Snellman et al.
(2002)

Bacillus sp.

22

Sugihara et al. (1991)

Bacillus sp.

45

Nawani and Kaur


(2000)

Bacillus sp. Strain398

50

Kim et al. (1994)

Bacillus sp. THLO27

69

Dharmsthiti and
Luchai (1999)

B. subtilis 168

19

Lesuisse et al. (1993)

Burkholderia sp.

30

Rathi et al. 2000,


2001; Bradoo et al.
(2002)

Pseudomonas sp. KWI-

33

56

Brune and Gots


(1992)

Pseudomonas sp. (PSL)

30

Dong et al (1999)

P. aeruginosa EF2

29

Gilbert et al. (1991)

P. fluerescens MC50

55

Brune and Gots


(1992)

P. mendocina 3121-1

62

Surinenaite et al.
(2002)

P.pseudoalcaligenes F-

32

Lin et al (1996).

Serratia marcescens

52

Abdou (2003)

S. hyicus

46

Simous et al. (1996)

S. haemolyticus

45

Oh et al. (1999)

Staphylococcus aureus

46

PAIVA, BALCO e

111

MALCATA. (2000)
Fonte: Adaptado de SHARMA, D; SHARMA, B.; SHUKLA, 2011.

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