ALTERNATIVAS DE REACTIVOS DEL REA DE PROCESAMIENTO DE

TEJIDOS
FIJACIN
Fijadores simples

Etanol: CH3-CH2-OH
Etanol, metanol, acetona. Fijan por deshidratacin y coagulacin de las
protenas, sobre todo las citoslicas. Extraen los lpidos de los tejidos, pero no
afectan a los carbohidratos. El metanol es mejor fijador que el etanol puesto
que no causa tanto endurecimiento del tejido y aporta una mejor preservacin.
En general, son buenos fijadores de muestras de pequeo tamao, y para
preservar protenas, como enzimas, glucgeno, y pigmentos. Se usan
frecuentemente para para fijar las extensiones citolgicas o secciones de
criostato obtenidas de tejido no fijado. Debido a que deshidratan, a la vez que
fijan, se pueden usar tambin como un conservante de las muestras. Tienen
algunos inconvenientes como producir endurecimiento y la retraccin de los
tejidos, muy evidentes en bloques de tejido muy grandes. Carecen de efecto
mordiente.

cido actico: CH3COOH

cido actico. No fija directamente a las protenas sino que su proceso de
fijacin consiste en cambiar el estado coloidal de las protenas. Se utiliza a una
concentracin que vara entre el 1 y el 5 %. Es el fijador ideal para cidos
nucleicos

nucleoprotenas.

Como

inconvenientes

cabe

destacar

la

destruccin de las mitocondrias y mala fijacin de membranas y citoplasma. Se

suele usar en combinacin con otros fijadores. Ejemplos: BOUIN , FFA . En
las mezclas de fijadores tambin es capaz de contrarrestar los artefactos que
pueden introducir el etanol o el cido pcrico.
Cloruro o sulfato de zinc. El cloruro de zinc se utiliz inicialmente como fijador
pero ms tarde pas a ser un componente de mezclas fijadoras. Se emplea
normalmente en combinacin con el paraformaldehdo. El cloruro de zinc ayuda
a la fijacin y preserva la antigenicidad si se necesita el tejido para pruebas
inmunocitoqumicas, ya que contrarresta el enmascaramiento de antgenos que
se

atribuye

al

paraformaldehdo.

Las

sales

de

zinc

han

sustituido

progresivamente a las sales de mercurio usadas tradicionalmente en las

mezclas fijadoras. Es importante sealar que el fijador no se prepara en sales
de fostato, como es habitual, y tras la fijacin ha de eliminarse el zinc mediante
lavados en agua destilada.

cido pcrico: C6H2OH(NO2)3

cido pcrico. La fijacin la produce gracias a que las sales del tipo picrato
coagulan las protenas de los tejidos. Se suele usar del 2 al 15 % de una
solucin saturada de cido pcrico. Preserva bien la estructura celular, no
produce retracciones cuando el tiempo de fijacin es ptimo, preserva bien
glucgeno y lpidos. Es un buen fijador para tinciones generales puesto que
tiene efecto mordiente y favorece la unin de los colorantes. Hay que eliminarlo
completamente antes de proceder a la inclusin en ceras como la parafina
puesto que dificulta la penetracin de la parafina. Se suele usar combinado con
otros fijadores. Ejemplos: BOUIN
Formaldehdo. Es un fijador ampliamente usado por la buena preservacin del
tejido, acta como conservante, produce poca retraccin tisular, es compatible
con la mayora de las tcnicas y tinciones histolgicas, incluidas las de
inmunocitoqumica e hibridacin de cidos ribonucleicos. El formaldehdo se
une a grupos funcionales de las protenas formando grupos hemiacetales. Esta
unin hace que muchos enzimas queden inactivas, lo que ayuda a evitar la
degradacin del tejido por las enzimas hidrolticas. Los grupos a los que se une
son amino, sulfidrilos, guanidilos, grupos hidroxilos alifticos, etctera. La unin
a uno de estos grupos produce un grupo hidroximetileno. Es el hidroximetileno
el que reacciona con grupos de otra, o de la misma, protena para la formacin
de puentes. El formaldehdo preserva bien los lpidos, sobre todo si se aade a
la solucin fijadora iones de calcio (reducen la solubilidad de los fosfolpidos), y
no reacciona con los carbohidratos.

La fijacin normalmente es de 24 a 50 h, aunque puede ser de 1 a 2 semanas.

Si el tejido va destinado a inmunohistoqumica es suficiente con 12-24 h a 4C.
Fijaciones muy prolongadas endurecen el tejido y pueden provocar
inestabilidad de los cidos nucleicos. Parte del fijador del tejido se puede
eliminar mediante lavados prolongados. Normalmente se usa en solucin
tamponada e isotnica. Se utiliza a concentraciones prximas al 4 %.
Actualmente se prepara a partir de paraformaldehdo, sustancia slida.
Ejemplos: formaldehdo tamponados , BOUIN, FFA , PLP .

Formaldehdo: CH2=O

Enlaces entre protenas formadas por el formaldehdo.

Glutaraldehdo
Glutaraldehdo. Es uno de los fijadores ms usados. En solucin polimeriza
formando dmeros y trmeros. Los grupos aldehdos que quedan dentro en la
molcula polimerizada reaccionan con los grupos aminos de los aminocidos
de las protenas, formando puentes entre las molculas de los tejidos. Los
grupos aldehdos de los extremos, sin embargo, quedan libres, y es importante
anularlos para evitar falsos positivos (por ejemplo, evitando que se unan los
anticuerpos durante la inmunocitoqumica o que se unan los aldhedos del
reactivo de Schiff). Por tanto, es una buena prctica eliminarlos, lo que se
puede hacer mediante la incubacin en borohidruro de sodio al 1 %. El
glutaraldehdo tiene poca velocidad de penetracin, por lo que la fijacin por
perfusin vascular es recomendada. Se usa a una proporcin de entre el 0,5 y
el 3 %. Tiene una alta capacidad para preservar la estructura celular puesto
que es capaz de entrelazar el tejido ms fuertemente que otros aldehdos, por
lo que es el fijador de referencia para observacin de ultraestructuras celulares
con el microscopio electrnico. Sin embargo, no se recomienda para
inclusiones en parafina puesto que dificulta la obtencin de secciones. Hay que
tener cuidado con su baja penetracin tisular y puede producir retracciones. Se
usa en soluciones tamponadas isotnicas y normalmente en combinacin con
el formaldehdo.

Tetrxido de osmio. OsO4.

Enlaces producidos por el OsO4 en los enlaces insaturados de los cidos

grasos.
A lo largo de la historia de la histologa se han usado diversos tipos de
aldehdos como fijadores, muchos de los cuales han dejado de usarse. Por
ejemplo, el hidrato de cloral para el sistema nervioso, la acrolena, muy txico y
usado para microscopa electrnica, o el glioxal.
Tetrxido de osmio. Es uno de los fijadores ms antiguos, se usa desde al
menos 1865. En solucin penetra poco en los bloques de tejido, y se
recomiendan tamaos no mayores de 0.5 o 1 mm. Se puede usar tanto en
solucin como en vapor. No produce artefactos pero hace a las muestras de
tejido frgiles. Forma puentes entre los enlaces insaturados de las cadenas de
cidos grasos de los lpidos de las membranas celulares. Las hace insolubles,
oscuras y opaca a los electrones. Por eso se emplea habitualmente para las
observaciones con el microscopio electrnico, ya que preserva y oscurece las
membranas celulares. Pero tambin en microscopa ptico se usa para estudiar

las grasas insaturadas, para observar los tractos de mielina, y es necesario

para las impregnaciones argnticas como el mtodo de Golgi. Por su fuerte
carcter oxidante no se usa para tinciones convencionales puesto que impide
la unin al tejido de los colorantes aninicos. Actualmente se usa mucho tras la
fijacin de las muestras con formaldehdo o glutaraldehdo, y antes de
deshidratar dichas muestras para su observacin al microscopio electrnico.
Mezclas fijadoras
La mayor parte de los procesos de fijacin usan varias sustancias fijadoras,
bien mezcladas en la solucin acuosa inicial o utilizadas sucesivamente en el
tiempo. Con ello se aprovechan las ventajas de cada una de ellas y se pueden
contrarrestar sus desventajas. Hay multitud de formas de usar los diferentes
fijadores, tanto en sus componentes como en las proporciones de stos,
dependiendo de las necesidades posteriores, es decir, qu tipo de tejido
queremos fijar y qu queremos ver de dicho tejido. Junto con las sustancias
fijadoras tambin se aaden a las mezclas otros componentes que afectan a
otros parmetros como la osmolaridad o el pH de la solucin. Por ejemplo, en
la mayora de los casos las sustancias fijadoras se disuelven en soluciones
tamponadas para controlar osmolaridad y pH, de manera que no se afecte a la
estructura del tejido. Pero tambin con otros propsitos, como por ejemplo el
etiln glicol que se aade a los fijadores para obtener secciones por
congelacin y adems evita la difusin de las enzimas.
A

continuacin

vamos

mencionar

algunas

combinaciones

usadas

frecuentemente porque tienen unas propiedades de fijacin que las hace

apropiadas para las observacin de una gran variedad de tejidos y para el uso
diversas de tcnicas de tincin.
Lquido de Bouin. Est formado por cido pcrico, formaldehdo y cido
actico glacial. Es una solucin muy utilizada para el procesamiento de tejidos
que se incluirn en parafina (ver captulo de inclusin) y a cuyas secciones se
le pueden aplicar un amplio espectro de tinciones. Es muy til para tejidos
blandos y embriones, y preserva bien el ncleo y el glucgeno. Hay que tener
cuidado con el tiempo de fijacin, que no debe exceder de 48 h en el caso de

fijaciones por inmersin. Tras la fijacin las muestras de tejido se pueden

conservar en alcohol de 70. No est recomendado para el rin ni para el
estudio de mitocondrias. Antes de la inclusin en parafina es conveniente
eliminar el cido pcrico mediante lavados en alcohol de 70 porque impide una
buena inclusin y que las tinciones no sean ptimas.
Solucin de Clarke. Est formada por etanol y cido actico glacial (3:1). Es
uno de los primeros fijadores usados, bueno para muestras que se incluirn en
parafina.
Carnoy. Es un buen fijador para el glucgeno, para los hidratos de carbono
simples y para las protenas fibrosas. Es bueno para visualizar los cidos
nucleicos, aunque no la morfologa nuclear, y para los grumos de Nissl del
sistema nervioso. Puede producir retracciones tisulares. Est formado por
etanol absoluto, cloroformo y cido actico glacial.
Mezclas con formaldehdo. El formaldehdo es quiz el fijador ms usado hoy
en da, tanto para tcnicas histolgicas comunes como para otras como la
inmunocitoqumica o la hibridacin de cidos nucleicos. Lo ms frecuente es
utilizarlo en solucin al 4 % junto con otros fijadores. Se suele disolver en
soluciones tamponadas que tienen una osmolaridad similar a la del tejido que
se pretende fijar. Para fijaciones de tejidos destinados a microscopa
electrnica se suelen utilizar soluciones fijadoras que contienen formaldehdo y
glutaraldehdo. La funcin del formaldehdo es iniciar una fijacin rpida, por su
mayor capacidad de penetracin, mientras que el glutaraldehdo realizar una
fijacin ms poderosa, pero ms lenta que no afectar a la estructura tisular
puesto que el formaldehdo ya ha realizado una fijacin previa. Ejemplos:
formaldehdo tamponado, BOUIN, FFA , PLP
Glutaraldehdo-tetrxido de osmio. Los fijadores en combinacin no tienen
necesariamente que usarse al mismo tiempo. Es habitual que los tejidos
destinados

microscopa

electrnica

sean

inicialmente

fijados

en

glutaraldehdo (1 al 3 %) y paraformaldehdo (2 al 4 %), para posteriormente

ser postfijados en tetrxido de osmio al 1 % en solucin tamponada. Este
ltimo es un buen preservador de la ultraestructura celular, sobre todo

membranas, en cooperacin con los aldhedos. Esto es importante porque el

proceso para microscopa electrnica supone incubar el tejido en solventes
orgnicos y polimerizacin de resinas a 60 C, durante las cuales el tejido debe
ser preservado.
DESHIDRATACIN
Alcoholes
*El

alcohol

absoluto

tiene

lo

ms

1%

2%

de

agua.

*Si se agrega unos ml de OH 100% al Xilol y se observa turbidez es por la

presencia de agua en un porcentaje mayor al 2% lo que produce una accin
inadecuada

imcompleta

+Alcohol

del

agente

etlico

*Es

hidroflico

*La

aclarante.

de

graduacin

Etanol
accin

produce

rpida.

la

retraccin.

*El uso por periodos de tiempo extendidos produce gran retraccin y

endurecimiento.
*Etanol junto con otros alcoholes mezclados disminuye la coloracin.
+Isopropanol
*La

eosina

es

*No

sirve

para

*Endurece
*Se

utiliza

insoluble
la

en
inclusin

y
principalmente

este

alcohol.

en

Celoidina.

retrae
en

procesos

para

poco.
plantas

animales.

Acetona
*Acta

rpido,

produce

excesiva

retraccin

es

muy

Solventes
*Deshidratan
*Dioxano,
+Dioxano

inflamable.
universales

y
Butanol

aclaran
terciario

al

mismo
y

tiempo.

Tetrahidrofurano.

*Produce

menos

*Acta

retraccin

durante

rpido

que

ms

*Se

debe

usar

*En

exposicin

larga

grandes
no

la
el

cantidades

produce

deshidratacin.

grandes

etanol.

de

volumen.

cambios

indeseables.

+Butanol

terciario

*Se usa en proporcin 50/50 con la parafina en la primera infiltracin.

+Tetrahidrofurano
*Es

miscible

con

todo

*Acta rpido sin causar fuerte retraccin y endurecimiento.

Deshidratante

Biopur

Deshidratante Biopur es un agente desarrollado especficamente para el

procesamiento

de

muestras

en

citologa

histologa.

Se trata de una combinacin de alcoholes de variado peso molecular que acta

como sustituto del inestable alcohol absoluto en las tcnicas antomopatolgicas. Por su baja evaporacin resulta ms conveniente que el etanol y la
acetona.
Sustituto

Deshidrata
del

alcohol

sin
absoluto

endurecer
para

usar

los
en

el

tejidos.
proceso

de

deshidratacin/hidratacin en tcnicas antomo-patolgicas y citolgicas.

Puede usarse en todos los procedimientos que requieran deshidratacin
inclusive inmunohistoqumicos que utilicen procesos de deshidratacin
alcohlicos. Mejora los resultados de las tinciones Hematoxilina-Eosina
respecto de los obtenidos mediante el uso de Alcohol Absoluto, brindando
excelentes detalles nucleares. Es el producto ideal para procesadores. Puede
utilizarse en cualquier tipo de procesador, inclusive los abiertos.
ACLARAMIENTO
En este paso del proceso se elimina el alcohol de los tejidos para que sea
remplazado por un lquido que disuelva la parafina en el tejido que despus
ser impregnado y volver transparentes los tejidos mediante la aplicacin de
agentes

aclarantes.

Entre los mejores tenemos al benceno, xileno, tolueno, ter de petrleo,

cloroformo, disulfato de carbono, esencia de cedro, tetracloruro de carbono y

aceite de anilina. Otros ms son la esencia de clavo, de bergamota, de

terpineol, el fenol en alcohol, la creosota, el carboxilol y el dioxano.
Xileno

(xilol)

Es un excelente aclarante pero tiende a hacer los tejidos excesivamente duros

y quebradizos. Es importante recordar no dejarlo ms de tres das ya que ser
difcil el hacer cortes. Al no haber un buena deshidratacin posteriormente a el
aclaramiento el xileno tomara un aspecto lechoso y se tendr que pasar de
nuevo por la ultima graduacin de alcohol. Es barato pero tiende a causar
demasiado encogimiento de tejidos. Y por ultimo no es muy recomendado para
tejidos

de

encfalo

ganglios.

Tolueno
Tiene las mismas propiedades generales que las del xilol, pero endurece
menos los tejidos. Sin embargo requiere de poco ms tiempo que el xileno o el
benceno.
Cloroformo
Es un excelente aclarante de tejido nervioso, ganglios linfticos y embriones,
produce poco encogimiento y no es inflamable. Con una buena ventilacin y
precauciones no hay peligro de intoxicacin. Aunque la inclusin en parafina es
lenta siendo tratado con cloroformo no hay problema en un mtodo automtico.
Sin

duda

es

el

aclarante

mas

utilizado.

Sin

embargo

es

caro.

Benceno
Es un buen aclarante, acta rpidamente, produce poco encogimiento no
endurece demasiado los tejidos, ni los vuelve quebradizos y se evapora
rpidamente del bao de parafina. Sin embargo ES TOXICO e inflamable.
Aceite

de

cedro

Aclara despus del alcohol de 95 y encoge muy poco los tejidos, no disuelve
los colorantes de anilina y es muy penetrante incluso en tejido puede estar por
tiempos prolongados sin riesgo de daos. Sin embrago su la inclusin en
parafina es muy lenta y necesita tres cambios de parafina. Es excelente para
piel

Esencia

musculo

liso

pero

su

cantidad
de

no

siempre

es

uniforme.
clavo

Tiende a hacer que los tejidos quebradizos pero puede ser evitado al
combinarse con esencia de bergamota. Causa muy poco encogimiento, pero la
inclusin en parafina es lenta y difcil, adems que elimina los colorantes de

anilina, disuelve la coloidina y es cara. Por lo tanto no es tan recomendad.

Esencia

de

Bergamota

Aclara despus del alcohol al 95; no extrae los colorantes de anilina y puede
ser

empleada

en

preparacin

Esencia

de

celoidina.

de

organo

Aclara despus del alcohol al 95 no disuelve la celoidina pero si a los colorante

de

anilina

es

cara.

Al

igual

Salicilato

que

la

esencia

de

sndalo.

de

(Esencia

metilo

de

gualteria)

Conviene para los tejidos delicados, ya que evita el efecto endurecedor del
alcohol. Sin embargo no se mezcla bien con la parafina por eso es mejor
colocar el tejido en cloroformo benceno. Es un mal deshidratante y resulta
destruido fcilmente por el agua. Es conveniente para tornar transparentes los
fragmentos

de

Disulfuro

tejidos.

de

carbono

Causa poco encogimiento, pero tiene un olor desagradable y es muy inflamable

sin

decir

que

su

inclusin

en

parafina

es

lenta

difcil.

Carboxileno
Se prepara aadiendo cristales anhdridos de fenol al xileno, hasta que cesa la
disolucin.

Es

ms

til

en

climas

hmedos.

Terpineol
Aclara despus del alcohol al 90 y no se debe confundir con el terpinol. Con
una cuarta parte de xileno y el resto de Terpineol se logra una solucin
excelente

para

tejidos

delicados

por

ejemplo

el

ojo.

Fenol
Es una solucin concentrada de alcoholes adecuada para trabajar con parafina
y celoidina. La creosota tiene propiedades muy parecidas a esta.
INCRUSIN
INCRUSIN EN PARAFINA

La tcnica de incrusin en parafina es una perfusin de la misma en los tejidos

para crear un medio homogneo, que permita la realizacin de los cortes de
menor grosor con gran facilidad y una precisin mayor que cuando los mismos
se realizan por congelacin. Como toda tcnica, presenta ventajas e
inconvenientes; sobre todo es en la modalidad de inclusin donde se pueden
discutir ciertos procesos que son vlidos en histologa animal pero que al
aplicarlos a los tejidos vegetales pueden originar alteraciones a veces
profundas, en las estructuras anatmicas e histolgicas; el primer problema
que nos encontramos al incluir en parafina un tejido es la apolaridad de la
misma; para poder incluir el tejido se han descrito varios mtodos de
deshidratacin, pero en general se sigue, como en histologa animal, la
deshidratacin por alcohol etlico en graduaciones crecientes hasta llegar a
alcohol absoluto.

INCRUSIN EN RESINA
Para la observacin de la ultraestructura celular es necesario hacer secciones
de tejido muy delgadas, del orden de nanometros, denominadas ultrafinas, y
usar un microscopio electrnico de transmisin. La obtencin de secciones
ultrafinas implica que tenemos que endurecer enormemente el tejido. Esto se
puede conseguir mediante congelacin, obteniendo entonces la secciones con
un ultracriotomo. Sin embargo, lo ms frecuente es incluir el tejido en un
material de alta dureza como son las resinas de tipo epoxy, y en menor medida
las resinas acrlicas como el metacrilato. Ambas se infiltran en el tejido en
forma lquida y posteriormente polimerizan sin afectar a la ultraestructura
celular.