UNIVERSITE CADI AYYAD, FACULTE DES SCIENCES SEMLALIA

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

ACIDES NUCLEIQUES
[STRUCTURE ET ANALYSE]

PROFESSEUR A. A. BENSLIMANE
-0-

STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES

SOMMAIRE
SITUATION GENERALE

OBJECTIFS GENERAUX

CHAPITRE 1

LES NUCLEOTIDES
A- ELEMENTS CONSTITUANTS LE NUCLEOTIDE
1- LACIDE PHOSPHORIQUE
2- LOSE
3- LA BASE AZOTEE
a-

Bases puriques (Pu)

b- Bases pyrimidiques (Py)

c-

Formes tautomres

B- ASSOCIATION DES TROIS ELEMENTS CONSTITUANT LE NUCLEOTIDE

1- LIAISON OSE-BASE @ NUCLEOSIDE
2- LIAISON ACIDE PHOSPHORIQUE-OSE
a-

Nomenclature des diffrents nuclotides

b- Cas particuliers : drivs nuclotidiques

CHAPITRE 2

16

ASSOCIATION DES NUCLEOTIDES DANS UN ACIDE NUCLEIQUE

A- LIAISON RELIANT LES NUCLEOTIDES
B- STRUCTURE PRIMAIRE DES ACIDES NUCLEIQUES
C- CONVENTIONS DECRITURE DUNE SEQUENCE DACIDE NUCLEIQUE

CHAPITRE 3

19

STRUCTURES ET CARACTERISTIQUES DU DNA

A- LE DNA SIMPLE BRIN (STRUCTURE PRIMAIRE)
B- LE DNA DOUBLE BRIN (STRUCTURE SECONDAIRE)
C- PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DU DNA
1- COMPOSITION
2- FORME ET TAILLE DU DNA
-1-

3- SPECTRE DABSORPTION
4- SOLUBILITE, PRECIPITATION ET EFFET DU pH
5- DENSITE DE FLOTTABILITE
6- DENATURATION, RENATURATION, HYBRIDATION

CHAPITRE 4

31

PROPRIETES TOPOLOGIQUES DU DNA

A- SURENROULEMENT DU DNA
B- NIVEAUX SUPERIEURS DE CONDENSATION DES MACROMOLECULES DE
DNA
1- STRUCTURE DU CHROMOSOME PROCARYOTE
2- STRUCTURE DU GENOME CHEZ LES EUCARYOTES
I. Nuclosome
II. Fibre de chromatine et niveaux suprieurs de condensation

CHAPITRE 5

38

ACIDES RIBONUCLEIQUES
A- LES DIFFERENTS GROUPES DE RNA
B- CARACTERISTIQUES GENARALES DU RNA
1- LOSE : RIBOSE
2- BASES AZOTEES
1- APPARIEMENT DES BASES
2- SPECTRE DABSORPTION, QUANTIFICATION
3- EFFET DU pH ALCALIN
4- DENATURATION THERMIQUE
5- DIVERSITE ET SYNTHESE DES RNA
I. RNA POLYMERASE I
II. RNA POLYMERASE II
III. RNA POLYMERASE III

CHAPITRE 6

43

INTRODUCTION AUX TECHNIQUES DANALYSE DES ACIDES NUCLEIQUES

A- ENDONUCLEASE DE RESTRICTION
B- SYNTHESE DUNE SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE
1- APPLICATION N1 : CONFECTION DUNE SONDE
2- APPLICATION N2 : CONFECTION DUN cDNA
C- ELECTROPHORESE
D- TRANSFERT SUR MEMBRANE HYBRIDATION
E- PCR ET RT-PCR
F- SEQUENCAGE METHODE DE SANGER
-2-

STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES

SITUATION GENERALE

DEFINITION :

les acides nucliques sont des macromolcules formes

par la rptition de sous units appeles nuclotides. On distingue deux types :
i - Lacide dsoxyribonuclique (ou DNA).
ii) Lacide ribonuclique (ou RNA).
Les acides nucliques permettent aux organismes vivants de reproduire leur
contenu complexe dune gnration lautre. Unique en son genre, le DNA (RNA
dans le cas de certains virus) fournit les directives pour sa propre rplication.
Cette reproduction molculaire est la base de la continuit de la vie.
Les acides nucliques constituent le support de linformation gntique que les
organismes se transmettent au fil des gnrations. Trs longue, la molcule de
DNA porte des milliers de gnes. Chaque gne occupe une position spcifique le
long de la macromolcule.
Lexpression de cette information gntique dans les cellules passe par la
synthse des protines. Cette synthse fait intervenir lautre sorte dacides
nucliques : les RNA qui servent dintermdiaires dans la circulation de
linformation gntique du DNA aux protines (transcription et traduction).

FIGURE 1

Ribosome

www.lacim.uqam.ca/.../
Rapports/Fred-Elisma/.

En plus des nuclotides majeurs qui composent les macromolcules de DNA et de

RNA, existent des drivs nuclotidiques qui jouent des rles essentiels dans le
mtabolisme cellulaire (stockage de lnergie : ATP et GTP. Intervention dans le
mtabolisme cellulaire comme co-enzyme (NADP, FAD, co-enzyme A) etc ...

-3-

STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES

OBJECTIFS GENERAUX
Connatre la structure des acides nucliques : savoir reconnatre les molcules
simples dont ils sont constitus, les classer daprs leurs proprits ou leur
fonctions.
Ltudiant doit savoir reconnatre nimporte quelle base azote, nucloside,
nuclotide ou nucloside polyphosphate.
Il doit savoir identifier les liaisons riches en nergie et distinguer les
groupements phosphate (, ou ) prsents dans ces molcules.
Il doit savoir interprter et manipuler les diffrentes reprsentations de la structure
primaire du DNA et du RNA, prciser la nature des liaisons impliques dans
lenchanement des nuclotides, distinguer une extrmit 5 dune extrmit 3 et
manipuler les units de taille (dalton, kb, pb, kpb, Mpb etc ...).
Ltudiant doit galement reconnatre les liaisons impliques dans la
complmentarit des bases ainsi que les lments structuraux essentiels dune
double hlice de DNA.
Comprendre le mcanisme de surenroulement du DNA et rendre compte de
limportance biologique des topoisomrases.
Reconnatre les lments structuraux essentiels de la chromatine et des
diffrentes espces de RNA
Comprendre et savoir exploiter les proprits physico-chimiques des acides
nucliques : absorption de la lumire UV, effet du pH et de la temprature, densit
de flottabilit.
Enumrer les facteurs qui permettent lhybridation de deux brins dacides
nucliques.
Dcrire lactivit de quelques enzymes qui permettent ltude des acides
nucliques et tre capable de montrer leffet de ces enzymes sur un exemple prcis
et dtaill (une squence dacide nuclique par exemple). Cet objectif comprend
au moins les activits des endonuclases de restriction, les polymrases et les
ligases.
Etre capable dinterprter des donnes exprimentales obtenues par les mthodes
couplant lectrophorse et hybridation sur filtre.
Expliquer le mcanisme de lamplification du DNA par PCR ou RT-PCR.
Expliquer le mcanisme dun squenage dacide nuclique

-4-

STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES

CHAPITRE 1
LES NUCLEOTIDES

A- ELEMENTS CONSTITUANT LE NUCLEOTIDE

Les acides nucliques sont des polymres linaires de nuclotides.
Les nuclotides sont composs de trois lments :

1) acide phosphorique,
2) oses,
3) bases azotes.

1- LACIDE PHOSPOHORIQUE
Figure 2 : (A) Lacide phosphorique possde trois fonctions acides
Figure 2 : (B) Deux des fonctions acides de lacide phosphorique peuvent tre
estrifies dans les acides nucliques.
Figure 2 : (C) De plus, deux acides phosphoriques peuvent se combiner par une
liaison anhydre dacide en donnant un acide pyrophosphorique.

(A)

FIGURE 2
+

(B)

(C)

X2

-5-

2- LOSE
Figure 3 : (Formes cycliques et numrotation en prime).
Dans les acides nucliques on peut rencontrer deux types dose :
(A) : le ribose (ou -D-ribofuranose) dans les RNA.
(B) : le dsoxyribose (ou -D-2-dsoxyribofuranose) dans les DNA.
(A)

(B)

FIGURE 3

3- LA BASE AZOTEE
Figure 4 : Les bases azotes drivent toutes de deux bases htrocycliques (c'est-dire contenant du carbone et de lazote) :
(A) la purine

(bases puriques).

(B) la pyrimidine

(bases pyrimidiques).
(A)

(B)

FIGURE 4

Lorsquon reprsente ce genre de cycles, on peut ne pas crire les atomes de

carbones. On prcise simplement les atomes dazote. Contrairement au ribose et
au dsoxyribose, la numrotation se fait ici sans prime.
Les bases azotes sont des bases faibles trs peu solubles dans leau, elles
contiennent des doubles liaisons conjugues ; ce qui leur confre un caractre
aromatique et donc une forte absorption de la lumire UV.

-6-

a) Bases puriques (Pu)

Figure 5 : Deux types de bases puriques majoritaires :
1-

A = adnine = 6-amino-purine.

2-

G = guanine = 2-amino-6-oxy-purine.

(1)

(2)

FIGURE 5

b) Bases pyrimidiques (Py)

Figure 6 : On rencontre dans les acides nucliques trois types de bases
pyrimidiques majoritaires :
1-

U = uracile = 2,4-dioxypyrimidine.

2-

C = cytosine = 2-oxy-4-aminopyrimidine.

3-

T = Thymine = 5-methyl-2,4-dioxypyrimidine.

FIGURE 6

(1)

(2)

-7-

(3)

c) Formes tautomres
La structure conjugue des bases azotes et la prsence de substituants
hydroxyls et amins font quil existe un quilibre entre des formes tautomres
de la mme base (par change dun proton).
Figure 7 : Pour les drivs hydroxyls : quilibre entre la forme lactime (ou nol)
et la forme lactame (ou cto).

FIGURE 7

Figure 8 : Pour les drivs amins : quilibre entre la forme imine et la forme
amine primaire.

FIGURE 8

Le dplacement de lquilibre dune forme vers lautre dpend du pH du milieu.

Au pH physiologique, ce sont les formes lactame et amine primaire qui
prdominent.
Figure 9 : formes tautomres de luracile en exemple.

FIGURE 9

-8-

B- ASSOCIATION DES TROIS ELEMENTS

CONSTITUANT LE NUCLEOTIDE
1- LIAISON OSE-BASE @ NUCLEOSIDE
Figure 10 : La liaison entre un ose et une base azote forme un nucloside. Cest
donc un htroside azot.

FIGURE 10

Liaison -osidique

Nucloside = ose + base

La liaison se fait au moyen dune liaison - osidique entre le carbone 1 du sucre

et lazote en position 1 pour les bases pyrimidiques ou lazote en position 9 pour
les bases puriques.

Tableau I : Noms des diffrents nuclosides.

-9-

Deux configurations sont possibles : syn ou bien anti : figures 11 et 12.

Figure 11 : Exemple avec une base purique (guanine)
Configuration
syn

Configuration
anti

FIGURE 11

Fig. 12 : Exemple avec une base pyrimidique (uracile)

Configuration
syn

Configuration
anti

FIGURE 12

2- LIAISON ACIDE PHOSPHORIQUE-OSE

Figure 13 : Un nuclotide est lassociation entre un nucloside et un acide
phosphorique au moyen dune liaison ester entre un groupement hydroxyle libre
du pentose (OH du carbone 5) et une fonction acide de lacide phosphorique.

FIGURE 13
- 10 -

Un nuclotide est donc form dune base azote, lie par une liaison osidique avec
un sucre, lui-mme li par une liaison ester avec un phosphate.
nuclotide = nucloside monophosphate = nucloside + H3PO4
nuclotide = nucloside monophosphate = ose + base + H3PO4
Figure13-bis : Dans le mtabolisme en gnral, celui des acides nucliques en
particulier, interviennent des substrats riches en nergie, les nuclosides di- ou
triphosphates. Un nucloside poly-phosphate est un nuclotide dont le phosphate
est lui-mme li un ou deux autres phosphates par des liaisons anhydrides
dacide. En exemple : base = adnine (AMP, ADP et ATP). La position des trois
groupements phosphoryl est indique par les lettres , et .

FIGURE 13-bis

Adnosine monophosphate
(Acide adnylique)

Adnosine diphosphate

Adnosine triphosphate

a) Nomenclature des diffrents nuclotides

Tableau II : Nuclotides base pyrimidique.
B = Base
S+B = nucloside : (dsoxy)radical + idine
S+B+P = nuclotide : acide (dsoxy)radical + idylique

Radical =

uracile : ur
cytosine : cyt
thymine : thym

Radical =

adnine : adn
guanine : guan

Tableau III : Nuclotides base purique.

B = Base
S+B = nucloside : (dsoxy)radical + osine
S+B+P = nuclotide : acide (dsoxy)radical + ylique
- 11 -

Tableau IV : Nomenclature des units nuclotidiques.

Les bases azotes sont conventionnellement dsignes par une initiale et par une
couleur : verte pour ladnine (A), jaune pour la guanine (G), bleue pour la
cytosine (C) et rouge pour la thymine.
Chaque nucloside peut tre li un, deux ou trois phosphates. On les dsigne par
des sigles conventionnels (M, D ou T).
On dsigne par nuclotide les nuclosides monophosphates. Les acides nucliques
sont forms par une polycondensation de nuclotides : (AMP, CMP, GMP et
UMP) pour les acides ribonucliques ; (dAMP, dCMP, dGMP et dTMP) pour les
acides dsoxyribonucliques
En fait dsoxythymidine est lappellation correcte mais on trouve souvent le terme
de thymidine de lpoque o lon pensait que la thymine nexistait que dans les
DNA.

b) Cas particuliers : drivs nuclotidiques

En plus des nuclotides majeurs des DNA et RNA, existent des drivs
nuclotidiques qui jouent des rles essentiels dans le mtabolisme cellulaire.
(1) Stockage de lnergie : ATP et GTP : Les fonctions acides phosphorique
distaux sont fortement ioniss au pH physiologique. Les liaisons anhydrides
unissant les acides phosphoriques sont des liaisons riches en nergie (G 31
kJ/mol).
- 12 -

Les drivs nuclotidiques sont souvent cits en biologie dans diffrentes

disciplines. Quelques exemples sont succinctement dcrits ci-dessous.
(2) Rle de messager hormonal intracellulaire : AMPc et GMPc

FIGURE 14

Adnosine-3, 5-monophosphate

Guanosine-3, 5-monophosphate

Ladnylate cyclase des cellules eucaryotes, localise dans la membrane

cytoplasmique, transforme lATP en AMPc. Cet enzyme est stimul par
certaines hormones apportes par le sang. LAMPc est galement appel
second messager parce quil transmet et amplifie lintrieur des cellules
les signaux chimiques provenant des hormones circulantes considres
comme premiers messagers.

(3) Rle coenzymatique :

(rappel : holoenzyme = apoenzyme + coenzyme)
Coenzymes non vitaminiques : certains nuclosides triphosphates simples (ATP,
UTP et CTP) ont des proprits activatrices lgard de molcules simples avec
lesquelles elles se combinent.
LATP, par certains de ces aspects, peut tre considr comme un
coenzyme dactivation. LUTP, en se fixant certains oses simples pour
former des UDP-oses, permet de nombreuses ractions (interconversion,
oxydation, amination des oses). Le CTP se fixe certains lipides comme
les acides phosphatidiques pour former des des CDP-diglycrides,
intermdiaires dans la biosynthse des phospholipides.

Coenzymes vitaminiques doxydorduction (dinuclotides irrguliers : NAD,

NADP, FAD), de transport de radicaux (coenzyme-A) et de rarrangement de
radicaux (adnosyl de cobalamine)
- 13 -

Figure. 15 : Nicotinamide ribonuclotide monophosphate (NRM) :

Il sagit dun ribonuclotide irrgulier (vitamine PP = nicotinamide au lieu dune base
habituelle purique ou pyrimidique). Il fait partie de la structure biochimique du NAD
(nicotinamide adnine dinuclotide) et du NADP (nicotinamide adnine dinuclotide
phosphate).
H H

FIGURE 15

Forme oxyde

Forme rduite

Figure 16 : Flavine mononuclotide (FMN) :

Il sagit dun ester phosphorique en 5 de la riboflavine (vitamine B2). Cest un
nuclotide irrgulier dans lequel le noyau dimthylisoalloxazine remplace la base
azote et le ribitiol (alcool drivant de la rduction du ribose) remplace le ribose. Il
fait partie de la structure du FAD (flavine adnine dinuclotide).
Ribitiol

FIGURE 16

Noyau dimthylisoalloxazine

Figure 17 : Le noyau isoalloxazine comporte deux doubles liaisons conjugues

capables de fixer rversiblement deux atomes dhydrogne.

FIGURE 17

Forme oxyde

Forme rduite

- 14 -

Figure 18 : Le coenzyme A (ou CoA-SH) joue le rle de transporteur de radicaux

acyl :
(ou actyl quand R est CH3).

FIGURE 18

coenzyme A (CoA-SH)

- 15 -

STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES

CHAPITRE 2
ASSOCIATION DES NUCLEOTIDES
DANS UN ACIDE NUCLEIQUE
A- LIAISON RELIANT LES NUCLEOTIDES
Dans les acides nucliques, les nuclotides sont associs entre eux par des liaisons
ester. Une molcule deau est limine entre une fonction acide de lacide
phosphorique et lalcool en position 3 du sucre. Ainsi, lacide phosphorique
engage deux fonctions acides en donnant naissance une liaison phosphodiester.
La troisime fonction de lacide phosphorique reste libre et confre des proprits
acides aux chanes de DNA et de RNA
Ces liaisons dfinissent un sens la molcule : le dbut tant le nuclotide dont
le phosphate en 5 ne serait li aucun autre nuclotide et la fin correspond au
nuclotide dont la fonction alcool en 3 nest pas estrifie.
En cas de pH neutre (pH>>pKa de la troisime fonction acide libre de lacide
phosphorique), chaque groupement phosphorique engag dans une liaison
phosphodiester possde une seule charge ngative. Les chanes dacides
nucliques sont par consquent des polymres anioniques hautement chargs.

Extrmit 5

FIGURE 19

Extrmit 3
- 16 -

Figure 20 : La liaison phosphodiester est trs mobile et peut permettre diffrentes

rotations rendant possible les structures secondaires et tertiaires que peuvent
adopter les macromolcules dacides nucliques.

Ct 5

FIGURE 20
Ct 3

B- STRUCTURE PRIMAIRE DES ACIDES

NUCLEIQUES
Dfinition : La structure primaire dun DNA ou dun RNA est la succession
ordonne de tous les nuclotides composant la macromolcule de lextrmit 5
vers lextrmit 3. Linformation gntique est apporte par la nature des bases
azotes (A, C, G, T ou U).
On peut utiliser le terme de chane nuclotidique, de filament ou de brin avec
ladjectif simple ou monocatnaire. On distingue sur ce filament deux parties :
(1) Une partie constante ou monotone qui sert de support. Cette premire partie
est constitue par une succession rgulirement alterne de rsidus de sucre
(ribose ou 2-dsoxyribose) et de groupements phosphate ralisant des ponts
phosphodiesters entre deux sucres successifs : figure 21.

Ct 3

Ct 5

FIGURE 21

Partie constante dun filament monocatnaire de DNA.

Il est important de dfinir le sens du filament 5 3.
- 17 -

(2) Une partie porteuse de linformation gntique sous forme dune

succession ordonne de bases azotes. Les bases sont fixes sur la partie
constante par des liaisons -osidiques. Les deux bases puriques sont ladnine
et la guanine, les bases pyrimidiques la thymine, la cytosine et luracile. La
thymine est spcifique du DNA, tandis quon ny trouve pas duracile. Au
niveau des molcules de RNA, la thymine est remplace par luracile.

Thymine

Cytosine

Adnine

Guanine

Ct 5

FIGURE 22

Ct 3

Filament monocatnaire de DNA.

C- CONVENTIONS DE DECRITURE DUNE

SEQUENCE DACIDE NUCLEIQUE
Une squence dacide nuclique correspond la succession ordonne des bases
azotes portes par un filament monocatnaire. Par convention, lcriture dune
squence primaire dacide nuclique se fait toujours partir de lextrmit 5
gauche vers lextrmit 3 droite.
Le modle dcriture qui sera choisi dpendra du contexte de ltude et du degr
dinformation disponible ou ncessaire pour lillustration de la squence tudie.
Figure 23 : modles dcriture (en exemple la partie dun filament monocatnaire
de RNA).

5 U p C p A p G p 3
5 Py p U p A p Pu p 3
5 U C A G 3
- 18 -

STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES

CHAPITRE 3
STRUCTURES ET CARACTERISTIQUES
DU DNA

Le DNA est la molcule-mmoire responsable de la transmission des caractres

hrditaires dune gnration la suivante. Les entits vivantes concernes
peuvent tre des organismes simples tels que certains virus, un tre unicellulaire
ou pluricellulaire, du rgne animal ou vgtal.

A- LE DNA SIMPLE BRIN

(STRUCTURE PRIMAIRE)
Figure 24 : Certains virus, tels que le phage M13 (6 400 nuclotides) et le phage
X174 (5 386 nuclotides), possdent un gnome constitu dune chane
monocatnaire circulaire de DNA.

FIGURE 24
Phage M13 (6 400 nuclotides)

La forme circulaire sobtient simplement par ltablissement dune liaison ester

entre lacide phosphorique lextrmit 5 et lhydroxyle libre qui se trouve
lautre extrmit 3 de la chane simple brin du mme DNA.
Chez le phage M13, on trouve galement une petite rgion qui se prsente sous
forme dune petite tige de 60 nuclotides. Dans cette rgion, le DNA nest pas
simple brin. Il forme une structure secondaire en double brin de DNA.

- 19 -

B- LE DNA DOUBLE BRIN

(STRUCTURE SECONDAIRE)
Figure 25 : Dans la majorit des cas, le DNA se prsente sous la forme double
brin (on dit aussi forme bicatnaire). Il sagit de la structure secondaire du
DNA. Cest une structure en double hlice compose de deux filaments de DNA
associs au niveau des bases par des liaisons hydrogne. Les deux filaments sont
complmentaires et antiparallles.

FIGURE 25

Figure 26 : Les deux brins sont unis les uns aux autres par des liaisons
hydrogne changes par les bases puriques ou pyrimidiques situes au mme
niveau et appartenant lun ou lautre brin de la structure.
Dans cette structure, un nuclotide adnine se lie avec un nuclotide thymine
et un nuclotide cytosine se lie avec un nuclotide guanine. On dit quils sont
complmentaires. On dit aussi quils sont apparis. Lappariement par
complmentarit des bases a comme rsultat le fait que la squence de lun des
brins dtermine obligatoirement celle de lautre.

-21 kJ

-63 kJ
G

A
FIGURE 26
- 20 -

Lassociation A=T (2 liaisons, -21 kJ) est moins stable que celle entre CG (3
liaisons, -63 kJ).
Les liaisons hydrogne sont des liaisons de faible nergie. Dans le cas des
nuclotides, ce type de liaison stablit de faon trs spcifique par
complmentarit entre les bases (A=T et CG ) qui doivent se trouver sous leur
forme lactame.
Les bases azotes tant des molcules aromatiques planes, les liaisons
hydrognes sont par consquent disposes dans le mme plan.
Figure 27 : Le modle en double hlice, attribu Watson et Crick 1953, est
caractris par les points suivants :

FIGURE 27
9 Les deux brins en hlice tournent
autour dun axe commun.
9 Les deux brins sont antiparallles.
9 Les bases azotes se trouvent
lintrieur de lhlice.
9 Les phosphates et les dsoxyriboses
lextrieur.
9 Lassociation des deux brins est
Double hlice B
assure par des liaisons hydrogne
entre bases complmentaires A=T et
CG. On dit que les deux brins sont
complmentaires.
9 Les interactions entre les bases
azotes empiles au milieu de la
macromolcule font adopter celle-ci
Gauche
la forme la plus stable (double hlice
droite A, B ou double hlice
gauche Z).
Droite

Petit sillon

Grand sillon

Double hlice Z

La structure en double hlice de Watson et Crick a une valeur scientifique

considrable car elle permet dexpliquer lessentiel du fonctionnement du matriel
gntique. Cette structure correspond la double hlice B qui constitue, ltat
naturel, le cas de la majorit des DNA (voir caractristiques : Tableau V).
En ralit, ce nest pas la seule structure que peuvent adopter les molcules double
brin de DNA. La forme DNA-A par exemple drive de la forme DNA-B par
dshydratation. Le DNA-A possde 11 paires de bases par tour. Les bases,
contrairement au DNA-B, ne sont pas perpendiculaires laxe mais sont inclines
de 70.
- 21 -

Ces structures sont possibles grce aux rotations libres qui existent au niveau des 4
liaisons du pont phosphodiester et des deux liaisons osidiques (figure 20). Ainsi,
diffrentes conformations peuvent tre conues avec des caractristiques chaque
fois diffrentes (A, B, C, D . Z).
Tableau V : Une conformation parait intressante et peut exister dans certaines
zones du DNA ltat physiologique, cest la double hlice Z.

DNA-B

DNA-Z
Double hlice gauche

Double hlice droite

Forme habituelle

Forme rare

Deux sillons

Sillon unique

10 pb par tour dhlice

12 pb par tour dhlice

3,4 nm / pas

4,6 nm / pas

2,0 nm de diamtre

1,8 nm de diamtre

Squelette sucre - phosphate

en spirale rgulire
Nuclosides puriques
et pyrimidiques
en conformation anti

Squelette sucre - phosphate

en zigzag
Nuclosides en conformation :
anti pour les bases pyrimidiques
et syn pour les bases puriques

Figure 28 : Vue latrale et axiale de la double hlice de DNA.

FIGURE 28

- 22 -

C- PROPRIETES PHYSICO - CHIMIQUES DU DNA

1- COMPOSITION
Rappelons les constituants lmentaires du DNA :
9 Acide phosphorique,
9 Ose = -D-2-dsoxyribofuranose,
9 Bases = A, T, C et G. (pour DNA double brin : % A = % T et % C = % G).
Figure 29 : Cependant, on trouve galement, en quantits minimes, des bases
modifies. La modification est ralise aprs synthse du DNA par un mcanisme
de mthylation. Les enzymes de modification sont des enzymes (mthylases de
modification) que possdent les bactries pour se protger dune autodestruction
(voir enzymes de restriction) en mthylant spcifiquement certains rsidus
cytosine ou adnine. Chez les mammifres, il existe un systme de mthylation
dune autre nature qui touche seulement les cytosines et o mthylation est
souvent synonyme de verrouillage de lexpression.
CH 3

FIGURE 29

CH 3

5-mthyl-cytosine

CH 2OH

5-hydroxymthyl-cytosine

6-N-mthyl-adnine

On trouve le DNA comme support de linformation gntique chez diffrentes

entits biologiques des plus simples aux plus complexes. La composition en AT
ou en GC est caractristique de lespce tudie.
Dans la majorit des cas, le DNA est double brin et nous avons donc des quantits
identiques en bases complmentaires A et T, C et G. Dans ce cas : A=T et C=G ;
Les rapports A/T = C/G = 1.
Dans le cas o le DNA est simple brin (Phage M13 ou X174 par exemple), la
composition en Bases est toujours caractristique mais il ny a pas de
correspondance entre les quantits en bases complmentaires.
A noter que pour ces phages, une fois que leur DNA simple brin circulaire est
inject dans la cellule hte, le deuxime brin complmentaire est alors synthtis
pour former une molcule circulaire double brin appele forme RF (ou forme
rplicative).

- 23 -

2- FORME ET TAILLE DU DNA

Le DNA en double hlice peut adopter deux formes :
9 Forme linaire : DNA de certains virus, chromosomes eucaryotes
9 Forme circulaire : DNA de certains virus, DNA du chromosome bactrien,
plasmide, pisome, DNA mitochondrial, DNA chloroplastique
Le poids molculaire (PM) moyen dun nuclotide est de 300 daltons, dune paire
de nuclotides (ou paire de bases) : 600 daltons. Le PM des DNA est toujours trs
lev et sa taille trs variable selon lorigine du DNA. Complter le tableau VI
suivant :

Tableau VI
Organisme

Phage
X 174
Phage
T2
Bactrie
(E. coli)
Levure
(S. cerevisae)
Drosophile
Homme

Taille

Longueur
(mm)

Nature

5,5 x 103 Monocatnaire

nuclotides (simple brin)
2,5 x 105
Bicatnaire
pb
(double brin)
Bicatnaire
pb
1,4 x 107
Bicatnaire
pb
1,7 x 108
Bicatnaire
pb
Bicatnaire
3,9 x 109
pb

Nombre de
macromolcules

PM

1,65 x
106

120 x 106

1,4

2,4 x 109

4,6

16

56

990

23

La taille dun DNA bicatnaire est le plus souvent estime en nombre de paires de
bases (pb) avec 1 kilo-paires de bases (1 kpb) = 1000 pb ; (Mga = 1 million) ...

3- SPECTRE DABSORPTION
Figure 30 : Le DNA absorbe dans lUV avec un maximum 260 nm. Ceci est d
la prsence des bases azotes.
Toutefois, cette absorption est nettement infrieure celle que lon obtiendrait
avec un mlange des mmes bases azotes aux mmes concentrations ltat
libre. Cest leffet hypochrome. La diffrence dabsorption rsulte du fait que les
noyaux aromatiques sont masqus (cachs) dans la structure en double hlice du
DNA.
- 24 -

FIGURE 30

Figure 31 : Spectre dabsorption caractristique dun DNA bicatnaire.

FIGURE 31

Labsorption de la lumire UV se fait de manire proportionnelle la teneur en

DNA (concentration). Ceci constitue lune des techniques destimation de la
quantit en DNA.
(DNA simple brin)

(DNA double brin)

33

50

Lanalyse et la manipulation du DNA exigent gnralement des prparation

dassez bonne qualit. La puret des prparations peut tre estime par la
dtermination du rapport dabsorption 260 et 280 nm.
Rapport A260 /A280 = 1,8
Si rapport > 1,8 : prparation contamine par RNA
Si rapport < 1,8 : prparation contamine par protines
- 25 -

4- SOLUBILITE, PRECIPITATION ET EFFET DU pH

Le DNA est un acide qui peut former des sels en prsence de cations monovalents
tel que le sodium. Les sels de sodium dun DNA sont solubles dans leau en
donnant des solutions trs visqueuses.
Les groupements phosphate secondaires, fortement polaires, ont un pKa assez bas
et sont totalement ioniss au dessus de pH 4. Par consquent, le DNA se comporte
comme un polyacide fort. Les groupements phosphate, placs la priphrie de
la double hlice, sont totalement exposs leau ambiante. Les DNA lient
fortement les cations tels que Mg2+ et Ca2+ ainsi que des polyamines telles que la
spermine et la spermidine (Figure 32). La fixation des polyamines dans le sillon
des DNA bicatnaires neutralise leurs charges ngatives et rend la macromolcule
plus flexible.
Spermidine

FIGURE 32
Spermine

Les DNA (sels) sont prcipitables par lthanol ce qui permet en pratique de
concentrer les solutions de DNA en les solubilisant par la suite dans un volume
aqueux plus petit que celui davant.
La capacit des diffrentes bases tablir entre elles des liaisons hydrogne
dpend de leur forme ionique variable suivant le pH. Il en rsulte que la stabilit
de lappariement des bases dans la double hlice des DNA dpend elle aussi du
pH. Les appariements de bases ont une stabilit maximum entre pH 4,0 et pH
10,0.
A un pH situ entre 3 et 4, les liaisons osidiques associes aux bases puriques
sont hydrolyses. Lacide nuclique (DNA ou RNA) devient apurinique.
Dans un acide fort et des tempratures leves (acide perchlorique HClO4 plus
de 100 C), les acides nucliques (DNA ou RNA) sont compltement hydrolyss
en leurs constituants (bases, ose et phosphate).
A un pH physiologique, les bases azotes prdominent dans la forme cto.
Leffet du pH alcalin est de changer ltat tautomre des bases du DNA.
Laugmentation du pH produit un revirement la forme nol. Ceci affecte les
liaisons hydrognes entre les paires de base complmentaires en dissociant la
structure bicatnaire du DNA. Il sagit dune dnaturation alcaline. Elle aboutit
la sparation des deux brins complmentaires du DNA.

- 26 -

5- DENSITE DE FLOTTABILITE
Figure 33 : Lanalyse et lpuration des DNA peuvent tre faites selon sa densit
(). Dans une solution de chlorure de csium CsCl 8,0 M ( =1,7 g/cm3), le
DNA prsente en moyenne une densit similaire au volume de la solution (environ
1,7 g/cm3). Si la solution est centrifuge une trs grande vitesse (champ de
gravitation compris entre 100 000 et 200 000 g), le sel de csium tend migrer au
fond du tube en crant un gradient de densit croissant. Le DNA, mlang de
faon homogne au dpart se retrouve en fin de centrifugation une position
correspondant sa propre densit de flottabilit dans le gradient.

FIGURE 33
CsCl (8M)
+
DNA + protines + RNA

Rotor de type swing

( angle libre)

1,5 g / cm3
Protines
DNA
RNA

1,7 g / cm3
1,8 g / cm3

Cette technique sappelle centrifugation isopycnique ou centrifugation du

gradient de densit lquilibre . Elle peut servir purifier les prparations de
DNA des contaminants (RNA au fond et protines la surface), sparer le DNA
plasmidique du DNA chromosomique bactrien. Cest galement une technique
analytique puisque la densit de flottabilit du DNA est une fonction linaire de
son contenu en G+C (figure 34).

FIGURE 34
= 1,66 + 0,0098 % (G+C)

- 27 -

6- DENATURATION, RENATURATION, HYBRIDATION

Figure 35 (tape 1) : La dnaturation du DNA sobtient par la dstabilisation
des liaisons hydrognes entre les bases azotes. Ceci provoque la dissociation de
la structure en double hlice et la sparation des deux brins complmentaires.
Cette dstabilisation peut tre provoque par laugmentation de la temprature
(fusion) ou bien sous laction du pH alcalin (dnaturation alcaline) ou encore
sous leffet dagents chimiques tels que lure (H2NCONH2) ou le formamide
(HCONH2).
Figure 35 (tape 2a) : Cest un mcanisme qui peut tre rversible dans une
certaine mesure. On parle de renaturation quand les deux brins rassocis sont
ceux l mme qui ont t spars par dnaturation. On parle dhybridation
lorsque les deux brins rassocis sont de sources ou dorigine diffrentes.
Aprs suppression du facteur dnaturant, le refroidissement lent (ou bien
lincubation une temprature favorable la renaturation) laisse suffisamment de
temps aux deux brins complmentaires pour se retrouver et se rassocier en
double hlice.

FIGURE 35

Figure 36 : La dnaturation est accompagne dune augmentation de 40 % de

labsorption en lumire UV : on parle deffet hyperchrome. Cette augmentation
ne se fait pas de manire linaire progressive (voir figures 37 et 38).
Absorbance

FIGURE 36

DNA dnatur

Effet hyperchrome

DNA natif

Longueur donde

- 28 -

La fusion du DNA double brin est dite cooprative car la fusion partielle des
extrmits de la molcule et des rgions riches en (A=T) va dstabiliser les
rgions adjacentes de la double hlice, ce qui dclenche une fusion concerte de
toute la structure.

FIGURE 37

Absorbance 260 nm

Figure 37 : Le point dinflexion correspond la temprature de fusion ou Tm

(en anglais : melting temperature). Elle reprsente la temprature laquelle 50%
des liaisons hydrogne sont dstabilises : on parle de DNA demi-dnatur.

Refroidissement

Figure 37-bis : La valeur de la Tm dpend du contenu (GC) du DNA. Plus un

DNA double brin est riche en (% GC), plus la Tm sera leve.

FIGURE 37-bis
S. pneumonae
86, 38%
Poly-d (A-T)
65, 0%

E. coli
90, 52%

S. marcescens
94, 58%

97, 66%

- 29 -

Figure 38 : Dans des conditions fixes de pH et de force ionique, la dtermination

du point de fusion dun chantillon de DNA permet une estimation
remarquablement prcise de sa composition en bases: Tm = a + b . (% G+C)
(fonction linaire).

% G+C

FIGURE 38

Tm en C

Le graphique montre les rsultats correspondant 40

chantillons de DNA bicatnaires de diffrentes
origines : vgtale, animale ou virale. Les mesures sont
effectues dans des conditions identiques (NaCl 150
mM ; citrate de sodium 15 mM). Le pourcentage en
G+C et la Tm de chaque chantillon de DNA ont t
exprimentalement dtermins. Lanalyse du graphique
permet dtablir une relation linaire entre ces deux
variables :

Tm = 69,3 + 0,41 (% G+C)

- 30 -

STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES

CHAPITRE 4
PROPRIETES TOPOLOGIQUES DU DNA
A- SURENROULEMENT DU DNA
Figure 39 : Les topoisomrases sont des enzymes qui modifient le nombre
denlacement. Elles sont capables dintroduire ou dliminer des supertours dans
une double hlice de DNA. Deux types de topisomrses sont essentiellement
dcrits :
1- Les topoisomrases I : Cest des enzymes qui suppriment les supertours.
Elles procdent une seule coupure transitoire. LOH en 3 est
momentanment libr, le phosphate en 5 estrifie une tyrosine du site actif
de lenzyme. Il y a rotation libre du brin de DNA coup puis ressoudure du
brin de DNA. Cest donc des enzymes relchantes. Elles ne ncessitent pas
dapport en ATP.
2- Les topoisomrases II : Elles coupent de manire transitoire, introduisent des
supertours ngatifs puis ressoudent les deux brins du DNA (environ 1
supertour pour 200 paires de bases). Elles sont dimriques, chaque brin du
DNA est coup par lune des deux sous-units. Ces oprations sont couples
avec lhydrolyse de molcules dATP.

FIGURE 39

ATP

Liaison
phosphotyrosine

topoisomrase II

topoisomrase I
Liaison
phosphotyrosine

- 31 -

Dfinition : Soit deux molcules de DNA circulaires ayant exactement la mme

squence nuclotidique. Ces deux molcules sont des topoisomres si elles
prsentent un nombre diffrent denlacement ou de supertours (c'est--dire le
nombre de tours que fait lun des deux brins autour du brin complmentaire selon
laxe de la double hlice).
Les DNA bicatnaires circulaires (de virus, bactries, mitochondries), isols avec
prcaution sous une forme native, prsentent souvent une structure torsade. Cette
structure est observe gnralement parce que le DNA en question est dsenroul
(moins de 10 nuclotides par tour dhlice. En consquence, la structure entire du
DNA circulaire compense ou dissipe les contraintes dues aux forces de torsion en
sentrecroisant dans le sens oppos jusqu revenir 10 nuclotides par tour
dhlice.
Figure 40 : Deux formes de surenroulement sont possibles par rapport la forme
relche dun DNA :
1- Surenroulement ngatif : Cest le cas de la grande majorit des molcules de
DNA rencontres dans la nature. le nombre denlacements a t diminu, la
tension produite par dsenroulement conduit la formation dune superhlice
ngative avec des supertours droite.
2- Surenoulement positif : Trs rares dans la nature, il existe chez les bactries
thermophiles. Le nombre denlacement a t augment, laxe de la double
hlice senroule selon une superhlice gauche .

FIGURE 40

13 supertours
droite

1 supertour
droite

DNA
relch

1 supertour
gauche

Un DNA linaire ou circulaire est dans tat relch lorsquil nest soumis aucune
tension de surenroulement. Cest le cas des DNA linaires extraits et purifis.
Un DNA linaire peut tre galement sous forme surenroule et montrer des
topoisomres condition que les deux extrmits aient un point dancrage. Ce qui
est en fait le cas dans les cellules eucaryotes (DNA retenu en grosses boucles par
linteraction avec les protines de la matrice nuclaire : Figure 41).
fibre 30 nm

FIGURE 41

fibre 300 nm

Matrice nuclaire

- 32 -

Figure 42 : Le DNA dsenroule (= surenroul ngativement) est une

conformation qui facilite le droulement de lhlice, permet aux deux brins de
scarter localement et autorise ainsi le droulement de processus tels que la
rplication et la transcription.
DNA surenroul
ngativement

Sparation des deux brins

complmentaires

FIGURE 42

Intrt biochimique et rles biologiques des topoisomrases :

1- En gnral, lintroduction des supertours dans le DNA lui permet dadopter
une configuration vrille compacte. Ceci permet et facilite lempaquetage
dune trs longue molcule sous un petit volume.
2- En outre, les topoisomrases sont essentielles en facilitant la rplication, la
transcription et la rparation du DNA. Plusieurs processus physiologiques
biologiques propres aux DNA ne peuvent commencer que si le DNA est
surenroul ngativement. Le rle des enzymes relchants serait dajuster le
bon degr de surenroulement du DNA. Il existe donc une sorte dquilibre que
laction simultane des deux types de topoisomrases doit conserver.
3- De plus, les topisomrases II ont galement un rle de dmleur qui permet de
dfaire les nuds et les enchevtrements des filaments de DNA (Figure 43).

FIGURE 43

4- Dans le cas des archobactries et eubactries thermophiles, organismes

vivants dans les sources deaux chaudes 80C, le DNA est protg dans ces
conditions extrmes de la dnaturation par laction dune topoisomrase
particulire qui introduit, en prsence dATP, des supertours positifs.

- 33 -

B- NIVEAUX SUPERIEURS DE CONDENSATION DES

MACROMOLECULES DE DNA

1- STRUCTURE DU CHROMOSOME PROCARYOTE

Le composant principal du gnome bactrien est une molcule de DNA
bicatnaire de forme circulaire appele chromosome bactrien bien quelle
diffre grandement des chromosomes des eucaryotes.
Dans le cas de la bactrie intestinale commune E. coli (environ 3 000 gnes), le
chromosome comprend 4,6 millions paires de bases reprsentant seulement un
millime de la quantit qui se trouve dans une cellule eucaryote moyenne.
Malgr tout, cette quantit reprsente beaucoup de DNA emballer dans un
volume aussi petit. Le DNA dploy dune cellule de E. coli mesure environ 1,5
millimtres de longueur, soit une longueur 500 fois suprieures la logueur de la
cellule elle-mme.
Figure 44 : En fait, le chromosome bactrien forme une structure compacte trs
pelotonne dans une rgion de la cellule appele nuclode. Il est rparti entre 50
100 boucles ou domaines de 50 100 kpb de longueur. Ces domaines sont tous
ancrs sur une protine membranaire complexe.
nuclode

Boucles ou domaines
surenrouls

FIGURE 44
Cur dune protine
membranaire

En gnral, le gnome bactrien est surenroul ngativement. Les diffrents

domaines sont topologiquement indpendants, ce qui signifie quils sont capables
de supporter des niveaux diffrents de surenroulement.
Les domaines de DNA sont compacts en senroulant autour de protines lie au
DNA de faon non spcifique (spcificit en terme de squence nuclotidique).
Ces protines sont dcrites comme analogues aux histones des eucaryotes. Les
plus rpandues sont :
1- Protines HU : une petite protine dimrique basique et charge
positivement. Elle se lie au DNA par le bobinage de celui-ci autour de la
protine.
2- Protines H-NS : protine monomrique neutre.
- 34 -

2- STRUCTURE DU GENOME CHEZ LES EUCARYOTES

Les chromosomes deucaryotes renferment une quantit considrable de DNA par
rapport leur taille. Chaque chromosome comprend une seule macromolcule
ininterrompue de DNA. Chez lHomme par exemple, un chromosome contient
environ 2.108 paires de nuclotides. Droule, une telle molcule de DNA aurait
une longueur denviron 6 cm, soit des milliers de fois le diamtre dun noyau
cellulaire. Tout ce DNA et aussi celui des 45 autres chromosomes humains
peuvent prendre place dans le noyau grce son organisation.
Chez les eucaryotes, la chromatine comporte du DNA associ de faon prcise
de grandes quantits de protines. Pendant linterphase, les fibres de chromatine
stirent et semmlent considrablement et apparaissent, aprs coloration, comme
masse diffuse. Cependant lorsque la cellule se prpare la mitose, la chromatine
senroule et se replie pour se condenser en un ensemble de chromosome courts et
pais qui deviennent parfaitement visibles au microscope photonique.

I. NUCLEOSOME
De petites protines appeles histones assurent le premier niveau de condensation
du DNA dans la chromatine. En fait, la chromatine est compose d peu prs
autant dhistones que de DNA.
Les histones contiennent une forte proportion dacides amins basiques (lysine et
arginine) de charge positive dans les conditions de pH cellulaire. Les histones se
lient solidement au DNA qui porte des charges ngatives et forment ainsi la
chromatine. On trouve chez les eucaryotes 5 types dhistones : H1 ; H2A ; H2B ;
H3 et H4.
Figure 45 : Chaque nuclosome est constitu dun segment de DNA de 145
paires de nuclotides et de Huit molcules dhistones (H2A ; H2B ; H3 et H4) x 2.
Octamre dhistones
2 x (H2A ; H2B ; H3 et H4)

OCTAMERE DHISTONES
(H 2A+H 2B+H 3+H 4) x 2

10 nm

Ruban de DNA

FIGURE 45

- 35 -

II. FIBRE DE CHROMATINE ET NIVEAUX SUPERIEURS DE

CONDENSATION
Figure 46 : La chromatine droule ressemble un collier de perles (fibre de
chromatine 11 nm). Chacune des perles correspond en fait un nuclosome,
c'est--dire lunit de base de condensation du DNA eucaryote. Les nuclosomes
sont relis par des brins minces de DNA : le DNA linker dune taille moyenne de
55 paires de nuclotides.
Grce lhistone H1 (Une par nuclosome), le collier de perle subit son tour un
repliement dordre suprieur. La fibre de 11 nm senroule sur elle-mme pour
former une structure hlicodale de 30 nm de diamtre : structure dite en
solnode. Environ six nuclosomes par tour de solnode. Elle forme une grande
partie la chromatine dite compacte o le DNA nest pas accessible.
Collier de perles ou fibre 11 nm

Solnode ou fibre 30 nm

FIGURE 46

- 36 -

Figure 47 : La fibre de chromatine 30 nm dcrit son tour des domaines en

boucle (Fibre 300 nm) et dans un chromosome en mitose, les domaines en
boucles senroulent et se replient sur eux mme, de sorte que la chromatine
devient encore plus compacte (fibre 700 nm de diamtre) et confre aux
chromosomes leur aspect caractristique en mtaphase.

FIGURE 47

Fibre 11 nm

Bras de chromosome
(700 nm)

Solnode (30 nm)

DNA (2 nm)

Domaines en boucles
(300 nm)

Matrice protique

- 37 -

STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES

CHAPITRE 5
ACIDES RIBONUCLEIQUES (RNA)
A- LES DIFFERENTS GROUPES DE RNA
Tableau VII : Les cellules contiennent 4 groupes de RNA :
RNA
rRNA
tRNA
mRNA
snRNA

Composition moyenne
dans une cellule
82 %
16 %
2%
Moins de 1%

1234-

rRNA (RNA ribosomaux)

tRNA (RNA de transfert)
mRNA (RNA messager)
snRNA (small nuclear RNA)

Les RNA constituent galement le support de linformation gntique de certains

bactriophages (R17,Q), des virions et de beaucoup de virus :
1- RNA simple brin (mosaque du tabac, poliomylite, grippe, herps, variole)
2- RNA double brin en double hlice (rotavirus)

B- CARACTERISTIQUES GENERALES DU RNA

1- LOSE : RIBOSE
2- BASES : A, C, G ET U A LA PLACE DE T.
3- APPARIEMENT DES BASES :
Figure 48 : En rgle gnrale : (GC) et (A=U).

A A C G

Parfois (G=U) lorsque la tige dappariement est assez longue.

FIGURE 48

C
G
C
U

U U G C
G
C
G tige
A

Tige

Boucle

boucle

- 38 -

4- SPECTRE DABSORPTION, QUANTIFICATION :

Figure 49 : spectres dabsorption en UV de solutions de RNA monocatnaire et
de DNA bicatnaire une concentration gale.

FIGURE 49

RNA

40

5- EFFET DU pH ALACALIN :
Figure 50 : La prsence du groupement 2-OH dans le RNA entrane, aux pH
alcalins levs, le clivage du squelette du RNA par une attaque intramolculaire
sur le phosphate de la liaison phosphodiester. Les produits sont un 5OH libre et
un phosphodiester cyclique 2-3 qui est plus tard hydrolys en monophosphate 2
ou 3.
(Mme en cas de pH neutre, les RNA sont plus susceptibles de shydrolyser que les
DNA. Leur extraction et leur manipulation exigent beaucoup plus de prcautions).
5

FIGURE 50
3

- 39 -

6- DENATURATION THERMIQUE :
Figure. 51 : Si la temprature est leve, labsorption dun chantillon de RNA
augmente progressivement et irrgulirement tant que lempilement des bases
dans les rgions double brin est rduit.

FIGURE 51

7- DIVERSITE ET SYNTHESE DES RNA

Les RNA sont tous, des degrs divers, impliqus dans la transmission de
linformation entre le DNA et les protines. A la diffrence du DNA dont il existe
une varit restreinte de types (et parfois une seule molcule par cellule comme
cest le cas chez les procaryotes), il existe plusieurs types de RNA diffrant par
leur taille, leur fonction et leur localisation cellulaire.
Figure 52 : Les RNA cellulaires sont tous produits, dans le processus appel
transcription, par complmentarit partir du DNA des gnes correspondants.
Lenzyme responsable de la synthse des RNA est une RNA polymrase DNA
dpendante .

FIGURE 52

- 40 -

Chez les procaryotes, E.coli par exemple, une seule RNA polymrase est
responsable de la synthse de tous les RNA.
Chez les eucaryotes, trois RNA polymrases (I, II et III) transcrivent les
diffrents jeux de gnes :

I)

RNA polymrase I @ rRNA (18S, 28S et 5,8S)

Les ribosomes sont de petits organites cellulaires prsents dans le cytoplasme et

servant la synthse des protines. Les mitochondries et les chloroplastes
possdent leurs propres ribosomes. Chaque ribosome est constitu de deux sous
units qualifies de petite et de grande sous units.
Les ribosomes sont constitus par lassociation de plusieurs molcules de rRNA et
de nombreuses r-protines. Les RNA ribosomaux sont synthtiss sous la forme
de grosses molcules monocatnaires de RNA prcurseurs qui sont ensuite
remanis et clives en rRNA qui se combinent avec des protines spcifiques pour
former les ribosomes.

II)

RNA polymrase II @ pr-mRNA et certains snRNA (U1, U2)

Comme tous les autres RNA cellulaires, les mRNA sont forms dune seule
chane de ribonuclotides. Cette chane est ensuite utilise pour diriger
lincorporation des acides amins au cours du processus de synthse protique ou
traduction.
Le mRNA fait ainsi passer le message contenu dans le DNA du gne par des
codons dont chacun est constitu par la squence de trois bases dtermines dans
le code gntique.

III) RNA polymrase III @ tRNA, rRNA 5S et snRNA U6

Les tRNA sont ainsi appels car ils vont transfrer, vhiculer, les acides amins
qui se trouvent dans le cytoplasme jusquau ribosome, lieu de synthse protique.
Figure 53 : La squence en bases des tRNA fait apparatre la possibilit de
complmentarit de bases dans 4 zones diffrentes, de telle sorte quon reconstruit
artificiellement la squence des tRNA selon une forme de croix ou de feuille
detrfle (figure 53 : exemple de tRNA spcifique de la phnylalanine).
Les tRNA sont de petite taille (70 100 nuclotides).

- 41 -

Figure 53 : En fait, la structure secondaire en trfle des tRNA se replie sur ellemme dans lespace pour donner une structure tridimensionnelle en forme de L.
Cette structure est maintenue par des liaisons hydrognes tablies entre les bases
non apparies des boucles et par les OH 2 des riboses.

FIGURE 53

fixation de lacide am in
3
5
boucle T

boucle T
boucle D
boucle D

boucle variable
boucle variable

boucle de
lanticodon

boucle de lanticodon

tRNAPhe

Lanticodon est form de trois bases complmentaires de celles du codon port par
le mRNA. Lors de la synthse protique, le tRNA-aa viendra sadapter exactement
sur le codon correspondant grce cette complmentarit.
Figure 54 : Les tRNA contiennent des bases atypiques, inhabituelles qui ne sont
dailleurs pas incorpores telles quelles au moment de la synthse (transcription)
des tRNA. Elles sont formes secondairement par modification posttranscriptionelle : (thymine/TMP, hypoxanthine/IMP et pseudo-uridine/MP).

FIGURE 54

Inosine
(avec base = hypoxanthine)

- 42 -

Pseudo-uridine ou ()

STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES

CHAPITRE 6
INTRODUCTION AUX TECHNIQUES
DANALYSE DES ACIDES NUCLEIQUES

A- ENDONUCLEASE DE RESTRICTION
Dfinition : Les endonuclases de restriction sont de vritables enzymes-outils
pour couper le DNA au laboratoire. La coupure se fait en un site de restriction
particulier (en gnral 4 8 paires de bases), reconnu spcifiquement par
lenzyme.
Il existe plus dune centaine denzymes de restriction. Ils sont isols de
microorganismes, bactries le plus souvent. En effet, les bactries peuvent tre
parasites par des virus DNA. Pour se dfendre, les bactries synthtisent des
enzymes de restriction qui coupent le DNA viral tranger. Ces microorganismes
ont dvelopp en parallle un systme enzymatique spcifique afin que leur propre
DNA ne soit pas hydrolys (des mthylases spcifiques qui reconnaissent et
mthylent les bases C ou A des sites concerns). Les sites sont mthyls de telle
manire quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction correspondante.
Les sites de restriction sont des palindromes o la mme squence nuclotidique
se lit sur le brin complmentaire dans le sens complmentaire 5 vers 3.
Figure55 : Les extrmits obtenues aprs coupure dun DNA par une
endonuclase de restriction peuvent tre de deux sortes :
1) bouts cohsifs
ou
2) bouts francs.
Les extrmits cohsives peuvent prsenter un surplomb 5 ou bien 3.

Eco RI
Extrmits cohsives
Surplomb 5

FIGURE 55
Pst I
Extrmits cohsives
Surplomb 3

Sma I
Extrmits non cohsives
Bouts francs

- 43 -

Une carte de restriction dune molcule de DNA est une reprsentation prcise,
indiquant les positions des sites de restriction et la taille des fragments sparant
ces mmes sites. La carte peut tre linaire ou circulaire en fonction de la nature
de la molcule tudie. Elle peut montrer les positions des sites dun seulou de
plusieurs enzymes de restriction.

B- SYNTHESE DUNE SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE

La copie enzymatique dune chane dacide nuclique, quil sagisse de synthtiser
une chane de DNA ou de RNA, seffectue toujours de manire complmentaire et
antiparallle. Laddition des nouveaux nuclotides se faisant toujours dans le sens
5 phosphate vers le 3 OH. Elle ncessite la prsence de nuclotides triphosphates
(NTP) ou de dsoxynuclotides triphosphates (dNTP).
Figure 56 : Exemple denzymes recopiant un DNA en DNA : Ce sont des DNA
polymrases DNA dpendantes. Elles ne sont pas capables de synthtiser le brin
nouveau de DNA sans la prsence dune squence de DNA matrice, dune
amorce dacides nucliques. Lamorce doit galement possder une extrmit
3OH libre. Ils catalysent la raction gnrale suivante :
(dNMP)n + (dNTP) (dNMP)n+1 + (PPi)
Avec (N = A, C, T ou G) et (PPi = groupe pyrophosphate).
Brin de DNA matrice

Amorce = (dNMP)n
(dNTP)

FIGURE 56
dTTP en cours
dinsertion
3 Exemples denzymes :

DNA polymrase I de E. coli.

Taq polymrase.
Rtrotranscriptase
- 44 -

1- APPLICATION N1 : CONFECTION DUNE SONDE

Une sonde est une chane nuclotidique marque. On distingue le marquage dit
chaud utilisant des isotopes radioactifs (phosphore 32 ou 32P, Soufre 35 ou
35
S) et les marquages dits froids qui utilisent des molcules aux proprits
colorimtriques (exemple : biotine / streptavidine peroxydase), fluorescentes
(fixation de fluorochromes) ou chimio-luminescentes.
On distingue plusieurs mthodes selon la localisation du marquage (extrmits ou
interne la molcule) et selon la nature de la squence marque (simple ou double
brin.
Figure 57 : Marquage au hasard ou random printing : Trs employ dans les
laboratoires, il permet dobtenir des activits spcifiques leves.

FIGURE 57

Les deux brins du DNA de la sonde

sont pralablement spars par chauffage
suivi dun refroidissement brutal.
On ajoute ensuite un mlange
doligonuclotides (hexanuclotides de
synthse) correspondant toutes les
combinaisons statistiquement possibles
(soit 46 = 4096).
Ces oligonuclotides vont shybrider de
faon alatoire sue la squence matrice.
Ils vont ensuite, en prsence de
dsoxynuclosides triphosphates marqus,
servir damorces au fragment de Klenow
pour reconstituer lintgrit des deux
fragments.

- 45 -

2- APPLICATION N 2 : CONFECTION DUN cDNA

La rtrotranscriptase (RT) ou transcriptase inverse est surtout prsente dans les
rtrovirus (virus RNA). Elle permet de fabriquer un cDNA (DNA
complmentaire) partir dun RNA. Cest donc une DNA polymrase RNA
dpendante.
Figure 58 : La technique classique pour prparer un cDNA partir dun mRNA
consiste fournir une amorce la RT. Cette amorce peut tre une squence
oligo(dT) capable de shybrider avec lextrmit poly(A) du mRNA. A partir de
cette amorce, la RT synthtise un DNA complmentaire au mRNA. De plus, la
fin de la copie, le mRNA tant dtruit (RNase H ou traitement alcalin), elle
provoque le retournement de lextrmit 3 du DNA copi et elle peut ainsi
recopier son propre travail en crant une pingle cheveu de 10 20 pb. Cest
ensuite une DNA polymrase DNA dpendante qui est ajoute pour raliser une
copie du DNA simple brin en DNA double brin. La nuclase S1 peut ensuite
liminer lextrmit de lpingle cheveu. Dautres techniques existent pour
prparer du cDNA (copie entire) partir du mRNA : voir Figure 58.

FIGURE 58

Synthse de cDNA copies entires par

la technique queux simples (ou tailing)

La technique originelle de s ynthse

de cDNA partir de mRNA

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C- ELECTROPHORESE
Cest une technique qui permet de sparer des molcules charges en fonction de
leur taille, leur forme et leur charge. En utilisant un courant lectrique continu
dans un milieu glifi (gels dagarose ou de polyacrylamide essentiellement), on
peut ainsi sparer, analyser et purifier des molcules charges tels que les
protines, les DNA et les RNA.
Lorsquun champ lectrique est appliqu au gel en prsence dune solution
tampon conduisant llectricit, les fragments de DNA migreront vers llectrode
positive (Le DNA est hautement charg ngativement) une vitesse qui dpend
principalement de sa taille et accessoirement de sa forme (linaire / circulaire,
relche / surenroule).
Les petits fragments se dplaceront plus rapidement que les gros fragments qui
sont retards par lemmlement avec le rseau des fibres formant le gel.
Figure 59 : La dtermination prcise des tailles des fragments spars par
lectrophorse est effectue en faisant migrer des marqueurs de poids
molculaire (M) en parallle avec lchantillon analyser (E).

FIGURE 59

CATHODE
Paires de
bases
4000
3000
900
700
600

Puit de dpt
du DNA

PM (chelle logarithmique)

300
200
_

ANODE

Migration en mm par rapport au puit

La dtection des acides nucliques sur ce type de gel est gnralement ralise par
exposition aux rayons UV aprs coloration avec du bromure dthidium.
Llectrophorse peut tre ralise dans des conditions non dnaturantes dans le
cas o lanalyse concerne du DNA double brin (fragments de restriction par
exemple, fragments de DNA amplifis par PCR) ou bien dautres acides
nucliques analyss dans leur tat natif.
Elle peut galement tre mene dans des conditions dnaturantes (en prsence
dure par exemple) lorsque lexprience ncessite le maintien des acides
nucliques sous forme de simple brin (RNA, produits des ractions de
squenage).
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D- TRANSFERT SUR MEMBRANE HYBRIDATION

Aprs sparation par lectrophorse et visualisation, les acides nucliques peuvent
tre prlevs et purifis en dcoupant la bande de gel qui les contient : lution .
Figure 60 : Lensemble du gel peut galement tre soumis un traitement adquat
et les acides nucliques spars sur le gel sont dnaturs et peuvent alors tre
transfrs et fixs sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon. Les acides
nucliques fixs peuvent par la suite shybrider avec une sonde marque sils
possdent en commun une squence nuclotidique homologue : expriences de
type Southern ou Northern .
Electrophorse

FIGURE 60

Ralisation de lexprience de Southern

DNA spar par lectrophorse

5
3

3
5

Dnaturation alcaline

5
Transfert sur membrane

5 3

Membrane
Hybridation avec
sonde marque *

5 Sonde* 3
5 3
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E- PCR et RT-PCR
Les diffrentes tapes de cette technique sont dcrites sur la Figure 61. La PCR
(Polymerase Chain Reaction) ncessite trs peu de DNA au dpart de la raction
(environ 20 ng). Elle permet damplifier spcifiquement et de faon exponentielle
un ou plusieurs segments du DNA analys. Ces segments se situent entre deux
amorces oligonuclotidiques (longs de 20 30 nuclotides) servant de point de
dpart pour la synthse de DNA.
De faon thorique, en partant de deux brins de DNA complmentaires initiaux,
on obtient 4 segments d'ADN la fin du premier cycle, 8 la fin du second, 16
la fin du troisime et jusqu' 2 la puissance n aprs n cycles ...etc. soit plus d'un
million de copies en une vingtaine de cycles (Figure 61).
La RT- PCR : Se droule en deux phases : Une premire phase correspond la
copie d'ARN messager en DNA complmentaire (cDNA) et une seconde phase
correspond une raction PCR classique sur le cDNA synthtis, etc.

FIGURE 61

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F- SEQUENAGE METHODE DE SANGER

Il existe essentiellement deux mthodes de squenage du DNA (Une mthode
chimique Maxam et Gilbert ou enzymatique Sanger). Les deux techniques
impliquent la production dun ensemble de molcules de tailles squentiellement
diffrentes ayant toutes la mme extrmit. Ces molcules sont ensuite spares par
lectrophorse (PAGE) en conditions dnaturantes pour la lecture de la squence.
Pour une squence nuclotidique donne, 4 ractions diffrentes sont ralises et
analyses simultanment.

FIGURE 62
METHODE ENZYMATIQUE : SANGER

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