CENTRIFUGACIN DE VULOS DE DOS CLULAS

DE RATN: ESTRATIFICACIN DE CITOPLASMA Y

RECUPERACIN
Proyecto realizado por: Vernica Tllez, Ariel Ahumada, Juan Muro*,
Soledad Seplveda y Luis Izquierdo.

1. INTRODUCCION:

El vulo de dos clulas en ratn, observado por inmunofluorescencia,

mostr una regionalizacin de miosina (Sobel 1983a, b), fodrina
(Schatten et al, 1986) y espectrina (Sobel y Alliegro 1985, pero vea
Damjanov et al, 1986) y del estado de 4 clulas en adelante una fostasa
alcalina regionalizada y actividad de la 5 nucleotidasa puede ser
demostrada en la membrana celular (Izquierdo et al. 1980; Izquierdo y
Ebensperger, 1982). No han sido reconocidas distintas regiones antes,
ni en el oocito o en el vulo fertilizado, el cual podra ayudar a
establecer un lineaje celular que conecte blastmeros tempranos con
las clulas diferenciadas de los blastocistos. Adems, embriones
experimentalmente desordenados son capaces de regular y desarrollar
a blastocistos normales (). Estas observaciones, aun as, descartan la
existencia de una estructura espacial consistente que pueda determinar
desarrollo, a pesar de eso tal determinacin puede ser rechazada por la
regulacin embrinica. Aqu analizamos la estructura espacial del vulo
de dos clulas por medios de su centrifugacin y subsecuente cultura in
vitro. Este mtodo no ha sido usado en mamferos, excepto por un
reporte de bsqueda preliminar por Mulnard (1970).

2. MATERIAL Y METODOS:

Para el desarrollo de este proyecto los investigadores desarrollaron una

serie de pasos que comenzaron por la Coleccin de embriones de
ratn, que luego fueron sometidos a un proceso de centrifugacin para
poder ser cultivarlos in Vitro y posteriormente ser observados en
microscopio electrnico y de luz.
Coleccin de los embriones:
vulos de dos clulas fueron colectados en medio Biggers conteniendo
4 mg/ml de suero de albmina bovina (BSA) de ratones superovulados
de la cepa CF de 1 tensin, 36 h despus del presunto tiempo de
ovulacin.
Procedimiento de centrifugacin:
Soluciones de dextrano (MW 40000 Sigma) fueron preparados en
medios Biggers a concentraciones de 17%, 15% y 11% (w/v), separados
con CO2 en aire hasta ajustar el pH a 7.2-7.4 y luego e introduci
secuancialmente en 0.8 ml de tubos de nitrocelulosa. Los embriones
fueron colocados en la parte ms clara del gradiente discontinuo y los

tubos fueron centrifugados por 60 minutos usando un rotor basculante

SW 39 del modelo de centrfuga Beckman L. Las fuerzas centrfugas
aplicadas en el rango de 15000 a 120000 x g. La temperatura del
contenido del tubo variaba entre 13 y 18 C, excepto por experimentos
en el cual la centrifugacin fue realizada a los 4C.
Cultivo in vitro:
Siguiendo la centrifugacin, los vulos fueron enjuagados con medio
Biggers y, o arreglados inmediatamente o cultivados en diferentes
tiempos antes de la fijacin. Los vulos fueron cultivados en microgotas
de medio Biggers con BSA en placas de Petri de plstico (Falcon) en
aceite mineral a 37C en una atmsfera hmeda de CO 2 en aire, pH 7.27.4. El nmero de clulas fue determinado por el mtodo de Tarkowski
(Tarkowski, 1966). Antes y durante la centrifugacin los vulos fueron
expuestos a temperatura controlada y atmosfrica; los tubos control
fueron tratados similarmente.

Microscopio electrnico y de luz:

Luego de la centrifugacin y el cultivo in vitro, los vulos fueron

procesados por microscopios electrnicos y de luz as como los
reportados anteriormente (Lois e Izquierdo 1984; Izquierdo et al. 1984)
sin agregar cido tnico. La microscopa fue realizada en grandes
cantidades
de
glicerol.
En
algunas
series
experimentales,
inmediatamente luego de la centrifugacin los vulos fueron lavados en
buffer de estabilizacin (Sobel 1983 a), permeabilizados con 0.5% de
Triton X-100 en buffer de estabilizacin por 1 minuto a 37C y lavados
en el mismo buffer por 30 s antes de la fijacin.

Tcnicas citoqumicas:

La demostracin no especfica de lpidos fue lograda por Red Oil, Sudan

Negro (Casselman 1959) y por su osmofilia. La fosfatasa cida fue
demostrada en grandes vulos de acuerdo al mtodo Gomori
modificado por Weissenfels (PEarse 1968). El ADN fue demostrado por
un test de Feulgen modificado en vulos que haban sido arreglados en
alcohol formaldehdo actico (Pearse 1968).

Inhibidores del citoesqueletos:

En estas series de inhibidores fueron agregados al medio de cultivo y al

gradiente de dextrano. Algunos experimentos fueron empezados con
una mezcla de 0.5 ug/ml de colcemida (Sigma) y 0.5 ug/ml de
citocalasina D (Sigma), otros fueron empezados con colcemida (2
ug/ml) o con citocalasina (0.5 ug/ml); finalmente, algunos experimentos
fueron completados a 4C. Los vulos fueron cultivados en medios que
contenan inhibidores por 1 h antes, durante y despus de la
centrifugacin. Los inhibidores fueron preparados en dimetilsulfoxido

(DMSO) (Izquierdo et al. 1984)

controles con o sin DMSO.

no se observaron diferencias entre

Figura 01. Embrin fijado despus de centrifugacin a 90000x g (fig.

1) o en 70000X g (fig. 2-5). 1-2 zona de lpidos (L), zona de vesculas
y membranas (VM), zona homognea (H); plana cisternas (flecha),
zona pelcida (ZP). Bares. Figura 1, 2 um; Fig. 2, 1um; Fig. 2, 1um, 3
Zona de las mitocondrias (m) un material fibrilar (f). Golgi sustancia
(g); cuerpos multivesiculares (mb). Microvellosidades (mv) en el
espacio interblastomerico Bar, 1um. 4 Zona de cuerpos cristaloides
(cb). Seccin tangencial revela corteza (Co) y microvellosidades (MV).
Material fibrilar (f). Bar, 0,5 um, 5 de contraste de fase de vulo
entero; tapa lpidos (L), capa hialina (H) y la capa granular (G). Bar,
10um

3. RESULTADOS:
Estratificacin: observaciones de microscopio de luz
Luego de la centrifugacin, los vulos se encontraron en capas
correspondiendo de 13% a 15% de dextrano. Las fuerzas centrfugas
mayores que 30000 x g inducidas a estratificacin visible y

reproducible del citoplasma. Algunos vulos empezaron a romperse a

120 000 x g.
El embrin 71 fijado arreglados despus de la centrifugacin
a 70 000 x g o 90 000 x g mostraron, mediante un microscopio de luz,
una ligera elongacin de sus blastmeros en el sentido de las fuerzas
de centrifugacin y algunas veces un estrechamiento. Los vulos
usualmente se orientan a s mismos en tal forma que el estrato
estaba en un ngulo de 90 en un plano separando ambos
blastmeros. El cuerpo polar ha sido observado mas frecuentemente
que en el polo centrfugo.
Una capa de material lpido, fuertemente manchados con
Sudan Negro o Aceite Rojo o Tetraxido de Osmio, se hallaron al polo
centrpeto de cada blastmero (). Bajo la capa del lpido, fue hallada
una cubierta de hialina, la cual en su margen centrpeto fue marcado
ligeramente con actividad de fosfatasa cida. Bajo la cubierta de
hialina, una capa granulada extendida en la parte baja en el polo
centrpeto. En esta capa, el ncleo pudo ser visto abarcando desde el
centro del blastmero hasta el polo centrpeto, como si fuera jalado
en esa direccin por el denso
ncleo (Fig.7). El test de Feulgen
revel que no haba presencia de
cromatina
fuera
del
ncleo
elongado.
El 33 que fue extrado con Triton X100
antes de la fijacin y la
observacin a microscopa de luz
mostr estratificacin similar a la
de los no extrados. Incluyendo las
tapas de lpidos. Sin embargo, la
capa
de
hialina
apareci
parcialmente
extrada
y
se
observ una reduccin general en
el volumen de los blastmeros de
alrededor de 50%.(Fig. 8).
Estratificacin. Observaciones
al microscopio electrnico
En 62 embriones, que se observaron por microscopa electrnica, las
capas descritas por microscopa de luz pueden ser subdivididas en
zonas. La tapa de lpidos corresponde a la zona de lpidos y la capa
hialina se subdivide en una zona centrpeta llena de vesculas y
membranas, y una zona centrfuga homognea.

L= zona lipdica

VM = zona de vesculas y membranas. (zona hialina)

N = zona homognea. (Zona hialina)
La capa granular est subdividida en una zona centrpeta que se
caracteriza por el material de las mitocondrias y material fibrilar y
una zona de centrfuga que muestra cuerpos cristaloides.

M = zona de mitocondrias

f = material fibrilar
cb = cuerpos cristaloides
La zona de lpidos contiene innumerables gotitas y entre ellas,
vesculas
y
vesiculadas
mitocondrias
eran
ocasionalmente
reconocidas. La zona de vesculas y membranas contiene vesculas de
diferente tamao, aisladas o asociadas y una plana y membranosa
cisterna. Las vesculas junto a la zona de lpidos probablemente
corresponden a los lisosomas ya que su localizacin coincide con la
actividad de la fosfatasa cida demostrada en los embriones en

conjunto y las membranas pueden corresponder a suavizar el retculo

endoplsmico. La zona homognea contiene material fino granular
uniformemente distribuido y sin orgnulos.
La zona caracterizada por el material de las mitocondrias y fibrilar
tambin contiene la sustancia de Golgi, cuerpos multivesiculares y las
vesculas que son ms pequeas que las que se encuentran en la
zona de vesculas y membranas. La zona de cuerpos cristaloides no
se detecta cuando los embriones han sido centrifugados a menos de
70.000 x g; a esta o fuerzas superiores esta zona parece llena de
material fibrilar y cuerpos cristaloides. El cortex de laclula es claro y
muestra una malla fina carecente de orgnulos. Parece ser afectado
por centrifugacin y no cambia apreciablemente de acuerdo a la
fuerza centrfuga aplicada.
En 25 embriones los cuales fueron extrados con detergente
inmediatamente despus de la centrifugacin y antes de la fijacin
para microscopa electrnica, la capa lipdica persiste pero parece algo
extrado y numerosas gotitas de lpido se agregan en unas pocas
gotas grandes. Todas la citomembranas en sta y las otras capas han
desaparecido, quedando fragmentos de materia amorfa.
El material fibrilar se conserva y componentes del citoesqueleto se
vuelven distintos con el tratamiento con detergente. Particularmente
evidente se muestran la corteza celular densa, la red interna de
microfilamentos de actina (7nm) y los microtbulos (21 nm)
observados en diversas ubicaciones, especialmente prxima al
ncleo.

= material fibrilar
microfilamentos sealados con la
flecha
co = corteza de la zona centrfuga

Relaciones espaciales cercanas fueron observadas entre los

microtbulos y las indentaciones en el polo centripetal del ncleo, y
microfilamentos son encontrados alrededor del ncleo.

La cabeza de la flecha seala los microfilamentes y la flecha muestra

los microtbulos cercanos al ncleo (N)

El ncleo, ya sea visualizado en preparados de extraccin con

detergente o no, no se desubica por centrifugacin, de su insercin
en la zona de material mitocondrial y fibrilar y se muestra elongado
hacia polo centrifugo del blastmero. La parte centrpeta final del
ncleo nos muestra indentaciones profundas y el extremo centrfugo
contiene los nucleolos, fusionados en uno o dos.

Ncleo elongado hacia la zona centrfuga,

con el nucleolo (Nu), con indentaciones
en la zona centrpeda

Restablecimiento
de
embriones
estratificados:
Observaciones
al
microscopio ptico
Un nmero embriones (66) se fija 30 mm a 4 h despus de ser
centrifugada a 70.000 o 90.000 x g y se observaron al microscopio
ptico. Dentro de 30 a 40 minutos despus de centrifugacin, los
ncleos y nuclolos se encuentran de nuevo en el centro de la clula
y la estratificacin del citoplasma ya ha desaparecido, pero las tapas
de lpidos persistir en los polos centrpetos de ambos blastmeros.
En embriones en los que se permiti seguir con su desarrollo, la
segunda divisin por lo general divide a las tapas y conforme se da
escisin, las gotas de lpidos son redistribuidas entre los blastmeros.
La centrifugacin no impide el desarrollo a blastocitos normales
con cerca de 30 clulas, aunque la blastulasion es algo retrasada. El
porcentaje de blastulacin en embriones centrifugados es de
aproximadamente 20% menos que en los embriones no centrifugada
y tratados en condiciones similares: sin embargo, un aumento en la
fuerza centrfuga de 50.000 x g a 90.000 x g no cambia el porcentaje
de blastulacin significativamente. El porcentaje blastulacin sobre
los controles en experimentos de centrifugacin es aproximadamente
73% que es considerablemente ms bajo que el 91-92% observado
en nuestros cultivos estndares. sta diferencia puede atribuirse a
bajas temperaturas y a la alcalinizacin de los medios, cuando los
embriones estn fuera de la incubadora (ver Materiales y mtodos).

Efecto de los inhibidores del citoesqueleto: observaciones al

microscopio ptico y electrnico

Las observaciones por microscopa de luz en 180 embriones que

fueron tanto centrifugados como cultivados en un medio que
contena una mezcla de colcemid (0,5 ug / ml) y citocalasina D (. 0.5
ug/ ml) revelan que los embriones tratados con esta mezcla de
mineral de drogas son frgiles: a 70.000 x g. 30% de ellos se
rompieron entre la capa hialina y granular, y en 90.000 x g. Esto se
observa en el 60% de los embriones. Slo el 10% de los embriones no
tratados se rompieron a 130.000 x g. La estratificacin de los vulos
tratada y no tratada es bastante similar, pero los embriones tratados
a 30.000 x g muestran el efecto producido por 5,000 x g en los vulos
sin tratar.
Los vulos que se centrifugaron y cultivaron en medios que contienen
colcemid o citocalasina D se repusieron de la estratificacin mucho
ms lento que vulos de control, y su desarrollo normal se detuvo.
Nosotros comparamos el efecto de estas medicinas registrando el
tiempo que pas despus de la centrifugacin hasta que el nuclolo
recobrara una posicin central en blastmeros, que revela la
recuperacin de forma y la posicin de los ncleos. La observacin de
144 vulos tratados con colcemid muestra que en el 93% de ellos el
nuclolo recuper su posicin central 180 minutos despus de la
centrifugacin, mientras esta situacin se recuper despus de 240
minutos en el 95% de 236 vulos tratados con citocalasina D.
La morfologa de los 98 vulos centrifugados tratados con colcemid o
citocalasina D, que se extrajeron del detergente despus de la
centrifugacin, es diferente de la descrita anteriormente para los
vulos sin tratar. Bajo el microscopio ptico la diferencia destacable
es el contorno liso o el polo centrpeto nuclear en vulos tratados con
frmacos, en comparacin con las hendiduras observadas en los
vulos sin tratar.
Los embriones que fueron tratados con colcemid o en frio el ncleo
permanece en la capa granular, mientras que el tratamiento con
citocalasina D causa una separacin del ncleo dejando un espacio
entre el material fibrilar y la membrana nuclear colapsada. El
citoplasma de los embriones tratados con colcemid carece de perfiles
de micro tbulos y los embriones tratados con citocalasina D
demuestran una corteza discontinua y una red interior relajada
(suelta floja) del material fibrilar.

4. CONCLUSIONES:
Estratificacin de los componentes celulares:
La estratificacin del citoplasma ha demostrado que al menos dos
tipos de (o estados) de los cuerpos vesiculares pueda ser reconocido

por su densidad: vesculas de luz que se encuentran debajo de la tapa

de lpidos, que incluyen elementos que muestran la actividad
fosfatasa cida y las vesculas pesados que se encuentran en la capa
granular mezclan con el material de las mitocondrias y fibrilar
nuestras observaciones sugieren que este material fibrilar, en virtud
de la fuerza de las pilas centrfugas hasta la formacin de cuerpos
cristaloides.
El alargamiento de los ncleos y la muesca en su fuerza centrpeta
postes pueden atribuirse a un discontinuo de la membrana nuclear en
el citoesqueleto. De hecho, el detergente de vulos extrados revelan
los microtbulos y microfilamentos asociado a la hendiduras
nucleares y estas desaparecen de vulos que han sido tratados con
colcemida o denominado citocalasina o fro en l no se ha estudiado
los otros componentes del citoesqueleto que han sido identificadas en
embriones de preimplantacin, alfa-actinina, citoqueratina, miosina,
fodrina y espectrina.
Recuperacin por estratificacin
La recuperacin pasiva de acuerdo a la densidad relativa
probablemente requerira de un periodo ms largo que el tiempo de
recuperacin que nosotros hemos encontrado y no explicara por qu
las gotas de lpidos permanecen coleccionadas en los polos
centrpetos. Sin embargo, esto no es posible para descartar el rol de
una matriz viscosa no estructurada con comportamiento elstico
(Crick y Hughes 1950) en la recuperacin del OVA despus de la
centrifugacin. El rol del citoesqueleto es sugerido por el retraso
observado en la recuperacin cuando los rectritores son usados
especialmente con cytocalasina D. Aunque estas drogas en las
concentraciones usadas aqu, previenen la divisin celular y el
desarrollo normal (mirar Izquierdo et. at. 1984), el citoesqueleto no es
desmantelado y la recuperacin desde la estratificacin quiz an sea
atribuida para un armazn resiliente que est conectado para
diversas citomembranas y de este modo mantenerlos o restaurarlos
en una orden especial.
El desarrollo despus de la recuperacin
En todos los experimentos de centrifugacin, la hendidura y el
desarrollo
del
blastocisto
parcialmente
son
perjudicados
probablemente porque los embriones son observados bajo el
microscopio simple durante la hendidura, la consolidacin o la
formacin del blastocisto, parece que la centrifugacin no causa
ningn desorden de organizacin de clula fundamental. Asumiendo

que el desarrollo posterior es completamente normal, al menos dos

interpretaciones generales de los resultados es posible. Primero, la
existencia de estructura preestablecida que se opone a la
centrifugacin o fcilmente nuevas ensenadas de ello, que retira los
componentes de clula complicados en morfognesis a su lugar
apropiado. Segundo, la ausencia en esta etapa de cualquier
estructura de morfognesis espacial. Nuestros resultados aqu apoyan
la primera interpretacin pero no podemos ser ms asertivos porque
la recuperacin de la estratificacin puede ser un proceso pasivo, o
an uno activo que es sin relaciones a morfognesis del blastocisto; y
ms lejos, porque las anormalidades del desarrollo que pueden
aparecer posteriores no han sido excluidas. Estas publicaciones estn
todava abiertas para el debate.

5. REFERENCIAS:
1. Biggers JD, Whiten WK, Whittingham DG (1971) The culture of
mouse embryos in vitro. In: Daniel JC (ed) Methods in
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pp 99-118.
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7. Sobel S (1983) Localization of myosin in te preimplantattion
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