Libro de referencia para Gentica Humana

Alelos, Recombinacin, y Ligamiento

a). Loci genticos y alelos
b). Mitosis y meiosis
c). Recombinacin
i). Recombinacin Meitica
ii). Efectos de recombinacin en cromosomas
iii). Modelos Holliday de recombinacin
d). Ligamiento
i). Comportamiento de los alelos durante la meiosis
ii). Ligamiento depende de la distancia
iii). Ligamiento de un marcador cromosmico
con NF1

Loci Genticos y alelos

Definiciones
Locus gentico: una posicin o localizacin especfica en un
cromosoma
alelo: cada una de las versiones alternativas de una secuencia de
nucleotidos del DNA que puede estar en una determinada localizacin
cromosomica
materno chr. 1
b
A

a
locus A

HUMAN MOLECULAR GENETICS (4 EDICION).

Tom Strachan & Andrew P. Read. Bios Scientific
Publishers. John Wiley & Sons (2004)

Mitosis

diploide: que tiene cromosomas homologos uno del padre y otro de la

madre
haploide: que tiene uno solo de los cromosomas homologos
homozigotos: tiene los mismos alelos en un determinado locus gentico
heterozigotos: tiene diferentes alelos en un determinado locus gentico
dominante: fenotipo que se expresa en heterozigotos
recesivo: fenotipo que se expresa solamente en homozigotos (o en
heterozigotos compuestos con dos alelos mutados distintos)

Maternal
y paternal
cromosomas
homologos

2N (diploide)

Anafase
Telofase
y divisin celular

Cuatro gametos (1N) haploides

Sinapsis
cromosomas homologos
se alinean en pares
1N

4N
Materno
y paterno
cromosomas
homologos

Metafase

4N

Meiosis II

Meiosis I

Cromatidas hermanas
Centromero

Paterno chr. 1

locus B

Profase

1N

1N

1N

Metafase I

2N
2N

2N
2N

Meiosis II

2N
Metaphase II

Recombinacin gentica y sobrecruzamiento meitico

sobrecruzamiento entre regiones homlogas de cromosomas homlogos
intercambio de informacin gentica

4 gametos haploides (1N)

Durante la sinapsis
ocurre el sobrecruzamiento
entre homlogos

1N

Metafase I
4 gametos diferentes

1N

1N

1N

Cromosomas recombinantes
presentes en tres gametos en este caso

Sobrecruzamientos

Cromosomas despues del

sobrecruzamiento

Recombinacin homloga o general

depende de identidad de secuencia (o similaridad)

recombinacin es reciproca
Modelo Holliday de recombinacin genetica :

a)

f)

e)

1
2

b)

g)
4

f)

c)

d)

Smbolos utilizados en la representacin de pedigries

1
2

h)

Varn

i)

corte

Mujer
3

j)

portadores

k)
Intercambio Localizado de DNA

Afectados

Sexo desconocido

corte
4

No afectados

Cosanguineo
Cromosomas Recombinantes

Gemelos

Ligamiento
Tendencia de loci prximos en el mismo cromosoma a
ser transmitidos juntos durante la meiosis
comportamiento meitico de alelos en dos loci:

efectos de
recombinacion
en cromosomas
en una familia

Parental:

loci ligados (cercanos o distantes)

loci No ligados

prximos mismo
cromosoma

En cromosomas distintos

distantes mismo
cromosoma

A a

A a
B b

A a

B b
B b
nieto hereda regiones
cromosomicas de los cuatro
cromosomas de los abuelos

recombinantes

Gametos:
hermanos heredan diferentes regiones
cromosomicas de los padres

B
25

b
:

25

B
:

A
B

25

a
b

b
:

25

50 : 50

no-recombinantes

Ligamiento de gen NF1 (neurofibromatosis) al locus 2 y no al locus 1

(locus 1 esta demasiado lejos en el mismo cromosomma
para presentar ligamiento)
El grado de ligamiento despende de la distancia
distancia gentica
una unidad de recombinacion es un Morgan
Un Morgan es la distancia gentica sobre la cual se da un
fenmeno recombinatorio por meiosis
un centiMorgan (cM) es igual a 1% frequencia de recombinacion
distancia fsica
un cM = ~106 pares de bases de DNA (en humanos)
Como media se dan 1-3 recombinaciones por
cromosoma por meiosis

Locus 1

NF1
Locus 2

B
C

b (tipo silvestre)
c

B
C

B
C

b
c

b
c

b
c

(solo se muestran los cromosomas paternos)

Polimorfismos y RFLPs
a). Alelos polimorficos
i). Definiciones
alelo
polimorfismo
ii). Genes Polimorficos
antigenos Hematies
galactosa-1-phosfato uridil transferasa
b). Restriction fragment length polymorphisms (RFLPs)
i). Polimorfismos detectados cambios en sitios de corte
ii). Variable numbers of tandem repeats (VNTRs)
Nmero variable de repeticiones en tandem

Alelos Polimorficos
definiciones
alelo cada una de las versiones alternativas de una secuencia
de nucleotidos del DNA que puede estar en una determinada
localizacin cromosomica
polimorfismo variacin de la secuencia nucleotidos en sitios alelicos
causado por

mutacin puntual, delecin, o insercin

Decimos que un locus es polimorfismo cuando existe en la poblacin
dos o ms genotipos alternativos -- un sitio es polimorfico si
hay dos o mas alelos en al menos el 2% de la poblacin
Hay un polimorfismo en este cromosoma en el mismo locus alelos A y B.

A
B

c) Significado de los polimorfismos

 puede haber mas de dos alelos por locus en la poblacin, i.e.,

A,B,C,D or A,B,O or G,g,C,D,LA or 1,2,3,4,5,6, etc., etc.
haplotipo es la constitucin alelica de multiples loci en un cromosoma,
i.e., A2, B1, C3, etc. Para los loci A,B,C,D y 1,2,3,4,5,6 alelos

Individuo #1

Genes Polimrficos
frecuencia en el genoma humano
el numero de polimorfismos existentes es de ~ 1 por cada 500 bp
3 x 10 9 bp genoma haploide
~5.8 millones de diferencias
alelos mutantes son los polimorfismos mas obvios: normal vs. anormal
variantes raros son alelos que estan presentes en la poblacin con
una frecuencia <1% - la mayor parte de las mutaciones deletereas
que dan lugar a enfermedades genticas son variantes raras
heterogeneidad allica
son alelos mutantes en el mismo locus, cada uno capaz de producir
un fenotipo anormal
mutaciones silentes son polimorfismos que no dan fenotipo

Individuo #2

Loci cromosmicos con mltiples alelos

Antgenos de hematies
Sistemas

Antigenos

ABO
Lewis
MN
Ss
Rh

oligosaccharides
oligosaccharides
amino acid sequences
amino acid sequences
amino acid sequences
S

glycosphingolipids

glycophorin A
glycophorin B

ABO
Enzymas

Enzima

A-transferasa

Carbohydrates having the

A, B, and H (type O) antigens

L
E

biosintesis de los antigenos ABO

Substratos

H-transferasa

H
Precursor
substrato

B-transferasa

no transferasa

outside

glycophorin-A

fucosa

glycophorin-B

N-acetylgalactosamina (GalNAc) transferasa

N-acetylglucosamina (GlcNAc)
galactosa

ceramida

B
H (type O)

genetica de los antgenos ABO

los antgenos ABO resultan de tres alelos en un nico locus
El gen codifica dos variantes de glicosiltransferasas, y un tercer alelo
del mismo gen produce una proteina no functional
alelos A y B difieren en cuatro pares de bases
A utiliza N-acetylgalactosamina
B utiliza galactosa
alelo O se deriva de alelo A en una deleccin de un par de bases:
ABO

B-transferasa

Galactosa transferasa

alelo Leu-Val-Val-Thr-Pro
CTC CTG GTG ACC CCT T
un par de bases
deleccion
CTC GTG GT- ACC CCT T

ABO

H (type O)

glycosphingolipids

A-transferasa

galactosa

Antigenos

Deleccion de un par de bases

en el locus ABO, que
codifica una glycosyltransferas,
convierte A en O

alelo CTC GTG GTA CCC CTT

Leu-Val-Val-Pro-Leu
cambio pauta de lectura

no functiona proteina

 gene encodes galactose-1-phosphate uridyltransferase (GALT)

recessive mutation results in inability to metabolize galactose
causes mental retardation and death
some protection afforded by complete removal of milk from the diet
variant alleles exist in addition to several galactosemia (g) alleles
spectrum of enzymatic activities indicates that normal individuals
do not all have the same enzymatic activity levels
Genotipo

Frecuencia

G/G
G/D
G/LA
G/g
D/D
D/LA
LA/LA
D/g
LA/g
g/g

87.4%
7.5
3.7
0.9
0.16
0.16
0.04
0.04
0.02
0.0025

Enzima
Actividad
100
75
120
50
50
95
140
25
70
<5

Population distribution of normal GALT activities

Fenotipo
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Borderline
Normal
Galactosemia

g/g

Relative number of individuals

Genetic variation at the galactosemia locus

G/G

G/g

20

G/LA

G/D

40

60

80

100

120

140

160

Relative GALT enzyme activity

Restriction fragment length polymorphisms (RFLPs)

Restriction fragment length polymorphism (RFLP)
Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de
restriccin

Definiciones
polimorfismo variacin de la secuencia nucleotidos en sitios alelicos
causado por

mutacin puntual, delecin, o insercin

RFLP

un tipo de polimorfismo til para:

mapeo de genes (marcadores genticos)
prediccin de riesgo de padecer una enfermedad
aislamiento de genes por clonaje posicional

EcoRI

A
EcoRI

Southern blotting procedure

DNA genomico humano (aislado de

muchas clulas, i.e. linfocitos, fibroblastos)

Electroforesis en gel de agarosa

de los fragmentos de DNA
separacin de fragmentos de DNA
enzimas de restriccion
por tamao
digestion

polimorfismo que puede detectarse como un cambio

en el modelo de fragmentos de restriction
-- los alelos se definen por los tamaos de las bandas
obtenidas por Southern blot
EcoRI
GAGTTC
EcoRI
GAATTC

Fragmentos detectados por Southern blotting

DNA, digestin por enzimas restriccin. Separacin electroforesis.
Transferencia (Southern)
hibridar con sonda marcada.
sonda marcada detecta uno o dos fragmentos de restriccin
dependiendo de la relaccin entre la sonda utilizada y los sitios de corte

DNA
+
desnaturalizar
DNA a
cadenasencilla
transferir
DNA a
membrana de nitrocelulosa

32P

exponer membrana a pelcula de rayos X

revelar pelcula y visualizar bandas de DNA

sonda marcada A
fragmentos de restriccin
detectados por hibridizacion
con sonda A

millones de
fragmentos DNA

hibridar membrana con

sonda de DNA marcada
con 32P
sonda aparea con las cadenas
complementarias de DNA

Dos alelos A y a que difieran

por la ausencia
EcoRI o presencia de un sitio de corte
por un enzima de restriction
en el DNA del cromosoma

32P

sonda marcada B
fragmentos de restriccin
detectados por hibridizacin
con sonda B

Restriction fragment length polymorphisms (RFLPs)

RFLP
polimorfismo que puede detectarse como un cambio
en el modelo de fragmentos de restriction
-- los alelos se definen por los tamaos de las bandas
obtenidas por Southern blot
Polimorfismo debido a la ausencia o presencia de un nico sitio de corte:
A y a son los dos alelos
en este polimorfismo
RFLP
32P

sonda

AA

Aa

aa

Polimorfismo debido a variable number of tandem repeats (VNTR):

RFLP
sonda

A, B, y C son los alelos

32P

AA

AB

BC

A
B
C
Polimorfismo detectado por
Polimorfismo causado por
Southern con la sonda marcada
deleccin / insercin de un nmero
variable de repeticiones entre
dos sitios de corte por un enzima de restriccin

sitio polimorfico causado por

creacin / eliminacin de un sitio de
corte por un enzima de restriccin

Polimorfismo detectado por

Southern con la sonda marcada

VNTRs son tiles porque frecuentemente son altamente polimorficos -hay mas de dos alelos, i.e., A,B,C,D,E

Herencia de polimorfismos hipervariables

Significacin de los polimorfismos
Variacin considerable en la poblacin general
Miles de polmorfismos existentes que se heredan
independientemente
Son posibles un enorme nmero de combinaciones de genotipos
Cada individuo tiene una nica composicin qumica, secuencia
nica de bases de su genoma, determinada genticamente.

Significacin mdica de los polimorfismos

Southern blot usando una sonda para VNTR hipervariablse
Cada individuo de este pedigree es heterozigoto en este locus

Cada persona responder de forma diferente al medio, a la dieta,

y a los tratamientos farmacolgicos

De Thompson & Thompson, Genetics in Medicine

Clonaje Posicional y Mapeo de genes

a). Estrategias generales de mapeo
i). Mapeo gentico
ii). Mapeo fsico
b). Anlisis de ligamiento por RFLPs
i). RFLPs ligados a genes enfermos
ii). Valor predictivo de los RFLPs ligados
c). Aislamiento de gen responsable por RFLPs ligados
i). Paseo Cromosmico
ii). Criterios de identificacin del gen enfermo
d). Mapa fsico de un gen
i). Anlisis Citogentico
ii). Fluorescence in situ hybridization (FISH)
iii) Secuenciacin completa del genoma

Estrategias generales de mapeo

Mapeo gentico
definicion: ordenamiento de genes en cromosomas
de acuerdo a la frecuencia de recombinacin
el mapeo gentico puede requerirse antes de que se
encuentren sondas tiles para mapeo fsico
Mapeo fsico
definicion: determinacin de las distancias fsicas
entre genes (en pares bases de DNA) utilizando
tcnicas citogenticas y moleculares
El mapeo fsico se usa en ltimo trmino para aislar
el gen de inters

RFLP anlisis de ligamiento

RFLPs proporcionan marcadores para todos los cromosomas humanos
Genes de enfermedades pueden ser mapeados busacando ligamiento
entre un RFLP determinado y el fenotipo enfermo
RFLP
sonda
A
a

Si se conoce en que cromosoma (y donde se encuentra en

ese cromosona) el RFLP, el gen enfermo puede ser determinado

Gen enfermo

Este proceso mapea el gen

Gen normal

Adems establecer ligamiento ente un RFLP y el fenotipo

enfermo permitir

el polimorfismo A/a est ligado al gen causante de la enfermedad

AA

Aa

aa

AA
Aa
aa

prediccin de aquellos individuos con riesgo para enfermar

aislamiento del gen responsable por clonaje posicional

homozigoto para A
heterozigoto
homozigoto para a

En enfermedades dominantes, AA and Aa,

estarn afectados
En enfermedades recesivas, AA estaran
afectados y Aa sera un portador

RFLP
sonda

El polimorfismo A/a est ligado al gen que causa la enfermedad gentica

Aunque el gen no haya sido identificado o aislado, el ligamiento
establecido puede tener valor predicitivo
1, determinar que alelo cosegrega con el fenotipo enfermo

dentro de la familia en estudio -- puesto que puede haber

recombinacin es posible que el alelo A o el a est ligado
al gen enfermo. Adms puede haber familias en que sea el alelo A est
ligado al gen enfermo, y en otras familias est ligado al alelo a.
2, testar al probando (e.g., prenatal o presintomtico) para determinar
su genotipo. La predicin solo sirve para la familia concreta en estudio

recombinacin?

El probando tiene el mismo genotipo

que su hermano y por tanto puede
predecirse que padecer la enfermedad
la predicin tiene que ser cualificada,
sin embargo, existe la posibilidad
de recombiancin entre los
marcadores polimrficos
y el gen enfermo
Aa
la frecuencia de recombinacin y
por tanto la fiabilidad del
marcador depende
de la distancia entre el RFLP
y el gen enfermo

Gen enfermo

proband

Gen enfermo

affected child

Gen normal

Gen normal

mother

RFLP
sonda

father

Ligamiento permite hacer prediciones

Aa

aa

aa

Anlisis de ligamiento para neurofibromatosis (NF1)

= NF1 Banda superior en Southern blot est ligada al gen NF1

Como se aisla un gen de una enfermedad hereditaria?

Hay tres opciones:
Empezar con una protena candidata
DNA
protena

Southern blot

A
a

Banda superior es diagnostica

Banda inferior es diagnostica

Empezar con un mRNA candidato

DNA
mRNA
Clonaje posicional directo
DNA

= recombinante

 digestiones parciales con enzimas de restriccin permiten aislar

clones solapantes

Aislamiento de genes con sondas RFLP ligadas

(clonaje posicional)

Puede estar a larga distancia (varios cM)

1 aislamiento de un clon genmico usando como sonda el fragmento de

DNA que detecta el RFLP.
2 aislamiento del gen que se encuentra ms abajo en el cromosoma
por paseo cromosmico

starting
point

RFLP
Sonda

gen

(RFLP)
Nueva sonda
Nueva sonda
Nueva sonda
3

gen normal

gen enfermo

Gen a aislar
Nueva sonda
Nueva sonda
etc.
6

aislamiento de un clon genmico utilizando la sonda de

RFLP en el screening de una genoteca genmica

el paseo cromosmico implica

aislamiento de un clon genmico
aislamiento del fragmento extremo del clon genmico
usar este fragmento para screening de una genoteca genmica
aislamiento de clones solapantes que vayan hacia abajo
repetir el proceso varias veces hasta encontrar el gen buscado
el paseo cromosmico se acelera utilizando genotecas clonadas
en cosmidos o YAC que contienen insertos grandes de DNA

Criterios para la identificacin positiva de un gen enfermo

Presencia de una mutacin
comparacin de individuos normales y afectados
multiples miembros normales y afectados deben ser examinados
la mutacin candidata solo debe de encontrarse en los afectados
La mutacin interrumpe la funcin del gen
mutacin detectada debe ser capaz de impedir la expresin gnica
debe distinguir entre polimorfismos benignos y mutaciones
este tipo de mutaciones pueden incluir: grandes delecciones,
mutaciones en la pauta de lectura, mutaciones en los sitios de
splicing, mutaciones sin sentido (aparicin de codones de parada)
La funcin anmala del gen candidato explica la patognesis
el gen debe de expresarse en los tejidos afectados en la enfermedad
Expresin analizada por:
Northern blot - mRNA
Western blot - proteina
la funcin del gen es consistente con la patologa
que se observa en la enfermedad (e.g., CFTR, distrofina)

Criterios de identificacin positiva

Correlacin de genotipo con fenotipo
diferentes mutacioness dan lugar a diferente severidad en sntomas
comparacin entre diferentes familias (mutacin-severidad)
Complementacin gnica y Reproduccin de la enfermedad en animales
Clulas aisladas de los pacientes recuperarn la funcin al transferir
el gen normal.
Modelo en ratn de la enfermedad: interrupcin de la funcin
del gen homlogo de ratn reproduce la enfermedad en ratones
Correccin del defecto, cura la enfermedad:
Terapia gnica
Este es el ltimo criterio de que el gen responsable ha sido identificado

Anlisis citogentico
Qu otras cosas se puede hacer con un gen aislado por clonaje posicional?
Mapear el gen a su regin cromosmica y determinar
si se correlaciona con un sitio donde se conozca que exista
una anormalidad citogentica

mapeo de delecin: varias deleciones dan el mismo fenotipo

1
2
3

Anlisis citogenticos
Hibridacin in situ contra cromosomas (FISH)
Estudiar las anormalidades del gen en diferentes casos de la misma
enfermedad y disear estrategia diagnostica para deteccin de,
mutaciones en otros individuos, mediante las siguientes tcnicas
digestin con enzimas de restriccin y Southern blot
Secuenciacin directa
Anlisis con oligonuclotidos especficos de alelo (ASO)
Anlisis por PCR

4
5
6

deleciones 1-6 que dan lugar a una

enfermedad en particular, mapean el
locus responsable a una regin ms estrecha entre
extremo derecho de del4 y extremo izqdo. de del5

nalisis de los puntos de ruptura y translocaciones

los puntos de ruptura que dan lugar a una determinada

enfermedad pueden explicarse si se
encuentra un gen en esa regin (y rompen la funcin)

Fluorescence in situ hybridization (FISH)

sonda de DNA marcada con fluorescencia se hibrida con
cromosomas metafsicos (resoluccin 1-2 million bases)
se usa para determinar
si hay material gnico que falta (delecin) o duplicacin

FISH

STS

translocacin tras ruptura

Sonda del punto
de ruptura del
Chr. 19

Derivado Chr.11
5

Chr. 19 normal

la sonda hibrida con el cromosoma normal, pero no

con los cromosomas delecionados, indicando que el gen
se localiza en la pequea regin comn entre las delecciones 4 & 5

localizacin cromosmica de genes

la sonda hibrida a ambos puntos de ruptura de los cromosomas

indicando que el punto de ruptura est dentro del gen

Deteccin de F508 en fibrosis qustica por ASO

Derivado Chr 19

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

1). Cebadores diseados para flanquear la region a amplificar
2). Cebadores (primers) se anillan con el DNA desnaturalizado
3). DNA se sintetiza con Taq polimerasa (de Thermus aquaticus)
4). Cebadores anillan de nuevo y el proceso se repite 20 o 30 ciclos,
amplificndose la secuencia diana de inters
5). DNA resultante se analiza por electroforesis en gel
1).

Normal alelo
2).

CF alelo
3).

4).

Deteccin de deleciones en Lesch-Nyhan por multiplex PCR

exones en el gen HGPRT (HPRT)

Deteccin de Lesch-Nyhan deleciones por Multiplex PCR

productos PCR resultantes del uso de cebadores multiples -cada producto est flanquado por sus correspondientes
cebadores de izda. y derecha
ejemplos para exones 1 y 2:

Cebadores

2
PCR productos

1) delecin de exon 2
2) delecin total del gen
3) delecin de exones 6-9
4) delecin de exon 9
5) normal

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