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1 1) C. Columna Tradicional
Cromatografía
Líquida 2) C. Capa delgada (TLC) o Papel
2) HPLC
2 1) C. Columna abierta
Cromatografía
en columna 2) HPLC
2) Cromatografía gaseosa
La diferencia entre HPLC y columna abierta, papel y TLC radica en el mejoramiento de los
equipos, materiales y técnicas, logrando así ventajas en los resultados, tales como mayor rapidez,
precisión y posibilidad de separación de mezclas complejas.
En HPLC, por el contrario, la muestra no está limitada por su volatilidad o estabilidad térmica,
y se puede aplicar, por lo tanto a cualquier tipo de compuesto orgánico: extractos vegetales,
productos naturales lábiles, macromoléculas, productos farmacéuticos y a una enorme variedad de
compuestos de alto peso molecular como: proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, pigmentos,
metabolitos vegetales o animales, etc.
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I.- Esquema del aparato. Recorrido de la Fase Móvil:
Pump: Bomba
Vacuum Degasser: Degasificador de la FM
Mobile Phase Mixing: mezclador de la FM
Waste: Desecho
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Las válvulas de inyección de volumen fijo permiten cuantificar por el método del standard
externo.
Si en el inyector hay muestra, la Fase Móvil la arrastra hacia la columna.
Al atravesar la columna, se produce la separación de las sustancias según su afinidad con el
sistema y finalmente la Fase Móvil llega al detector.
Una vez detectadas las sustancias que pudiera haber en la Fase móvil, ésta pasa por una
válvula que permite su colectado o su descarga.
Tipos de F.E.:
1.- Adsorción:
a) Sílica: Tiene la desventaja que adsorbe agua de los solventes orgánicos que pasan por la
columna, los cuales tienen muchas veces trazas de agua que fueron retenidas por ellos del
medio ambiente.
Este es el factor limitante que tiene la sílica en HPLC, pues las columnas no pueden
“activarse”, como se hace en las columnas convencionales.
Usos: isómeros en Fase Normal
a) C8, C18: Son las más utilizadas. Son de baja polaridad, lipofílicas, funcionan en Fase
Reversa con Fases Móviles que contengan agua. Se debe respetar el ph de estabilidad para
la unión éster de las fases estacionarias (entre 2 y 8,5).
Fases Móviles: Se usan mezclas de agua (o soluciones buffers), con solventes
orgánicos (acetonitrilo, metanol y en menor escala: isopropanol, tetrahidrofurano)
Usos: para casi todos los compuestos con excepción de los muy hidrofílicos
(azúcares, aminoácidos), y de los muy lipofílicos (grasas, terpenos).
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b) CN, NH2: Son fases estacionarias de polaridad intermedia, son hidrofílicas y actúan de
distinta manera:
CN: es de mediana polaridad. Puede actuar tanto en Fase Normal (con Fase Móvil de
solventes orgánicos, sin agua) o Fase Reversa (con Fases Móviles que contengan agua).
NH2: es un poco más polar: Puede actuar en Fase Normal o Reversa.
Siempre el tipo de Fase Móvil depende de la muestra que se va a analizar, por ejemplo:
Si la muestra es una mezcla de azúcares, la FM puede ser una mezcla de agua y
acetonitrilo.(Fase Reversa)
Si se utiliza para separar por ej: vitaminas oleosolubles; la FM sería una mezcla de
solventes de baja polaridad (hexano, isopropanol, acetato de etilo, etc) (Fase Normal).
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c) Diol: Es sumamente polar, reemplaza a la sílica y se usa en Fase Normal, con solventes
orgánicos sin agua
e) Exclusión:
Cromatografía de permeación por geles (GPC): son resinas de PV-DVB. Sirve para
separar polímeros insolubles en agua.
Las Fases Móviles usadas son solventes de baja polaridad (decalina, tolueno).
Cromatografía de filtración por geles (GFC): se utiliza un tipo de sílica recubierta o
derivados del dextrano (Sephadex), son hidrofílicas.
Sirve para compuestos tipo proteínas, enzimas, y las Fases Móviles deben ser acuosas.
Este tipo de cromatografía se usa para compuestos de PM superior a 2000.
III Columnas
Las Fases Estacionarias están contenidas en columnas que son en general de acero inoxidable,
para evitar fenómenos de corrosión por los solventes y soportar la presión a la que trabajan.
Tienen tamaños variables (por ej. 25 a 30 cm y entre 2 y 4mm de diámetro interno)
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También están las columnas High Speed LC, que son de 3 a 5 cm de largo y partículas de 3µ , o
las columnas Micro Bore LC, que tienen de 40 a 50 cm de largo por 1 a 2 mm de diámetro interno.
Para HPLC preparativa: se usan columnas de 30cm por 1 a 3 cm de diámetro interno.
IV Detectores
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t0: es el tiempo muerto, el tiempo que tarda la FM ( o alguna sustancia que no es retenida por la
FE) en llegar al detector.
tr: es el tiempo de retención de las diferentes sustancias que eluyen de la columna, se mide en la
altura del pico.
t’r: tiempo de retención corregido, descontando el tiempo muerto
Resolución (Rs) es la capacidad del sistema cromatográfico para lograr la separación adecuada de
los componentes de una muestra dada:
Rs = t2 - t1______
½ ( w1 +w2)
Es decir, se define como la relación entre la diferencia de los tr de dos bandas contiguas y el
promedio del ancho de las mismas. La resolución debe tener una valor de 1 o más para que el
sistema se pueda considerar adecuado.
Para mejorar la resolución de un sistema en la práctica, existen tres factores básicos a tener en
cuenta:
1.- K: capacidad
2.- α : selectividad
3.- N: eficiencia
k = tr - t0______ = ____t’r______
t0 t0
¿Cómo se modifica k? Es fácil concluir que para modificarlo debemos cambiar la fuerza de la FM,
si aumentamos la fuerza de la FM vamos a disminuir el k, y si la disminuimos, aumentamos el k.
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El k se analiza con un parámetro que equivale al Rf en TLC, y es el tr o tiempo de retención de una
sustancia en un sistema cromatográfico, (en este caso, en la columna).
Se relaciona con el k de la siguiente manera:
A > tr significa que el tiempo de retención es alto y que la sustancia está muy retenida en la
columna ⇒ el k es también alto.
A< tr significa que el tiempo de retención es bajo, y que la sustancia casi no interactuó con
la columna y sale rápidamente de la misma ⇒ el k es también bajo.
2.- Selectividad ( α )
Es la capacidad que tiene el sistema de discernir entre dos sustancias con un tr muy próximo.
t’1 tr1 - t0
Es un cociente entre el tiempo de retención de las sustancias a separar.
Cuanto mayor sea el valor de este cociente, mayor va a ser la separación de las sustancias y
representa, por lo tanto, una medida de la selectividad de la columna para las mismas.
Es evidente que si dos sustancias tienen el mismo tr, se superponen, α es igual a 1, y no existe
separación entre ambas.
2 2
N = 16 tr____ N = 5, 54 t’r___
W W1/2
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En la cual tr es el tiempo de retención de la sustancia, W es el ancho del pico en su base, obtenido
al extrapolar los lados del pico con la línea de base y t’r es la diferencia entre el tiempo de
retención de la sustancia y el tiempo de elución de una sustancia que no es retenida (tiempo
muerto).
El ancho máximo a media altura, W1/2, es obtenido directamente por integradores electrónicos.
N= L___
H
Los factores que inciden sobre la eficiencia de un sistema determinado son:
a.- Tamaño de la partícula de la FE: cuanto menor sea, mayor será la eficiencia.
b.- Velocidad lineal de la FM (flujo): Existe un flujo ideal para cada tipo de columna (longitud,
diámetro y tamaño de partícula) con el cual se logra el máximo de eficiencia.
c.- Viscosidad de la FM: a menor viscosidad, mayor difusión de la muestra y por consiguiente
menor la altura del plato teórico.
Inicial
Varía k
Aumenta N
Aumenta α
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Bibliografía:
Farmacopea Argentina VII Ed, Vol I, 2003
“Cromatografía Instrumental” Secretaría de apuntes CEFyB, U.B.A.
MTS, Mourne Training Services, “A Brief Guide to HPLC Instruments”
“Cromatografía en papel y en capa delgada”, X.A.Dominguez. Editado por la Secretaría
General de la Organización de los Estados Americanos, Washington 1975.
“Introducción a la Cromatografía”, David Abbott y R.S.Andrews, 2ª Ed., Editorial
Alhambra, S.A., Madrid 1970.
“Thin layer chromatography”, E.Stahl. Springer Verlag, Berlín, 1969.