UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Per, DECANA DE AMRICA)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

EAP. FARMACIA Y BIOQUMICA

SNTESIS QUMICA DE LA HIDRAZINA DEL CIDO CITRAZNICO,

CARACTERIZACIN Y DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTI
BACTERIANA IN VITRO.
MONOGRAFA
AUTORES
LINSAY THABYTA GRANADOS CONDE
KATHERINE VERENA CARLOS BUSTILLOS
MA DANNA BAZN MELNDEZ
BRYAN GUILMAR SNCHEZ DE LA CRUZ

ASESOR CSAR MXIMO FUERTES RUITN

Co asesor GUSTAVO PACCO RUIZ

LIMA PERU
2016

I N TR O D UC C I N
La Isoniazida o hidrazina de cido isonicotnico, es una droga antituberculosa
sinttica derivada del cido isonicotnico, constituye la piedra angular del tratamiento
por tener la mayor actividad bactericida. El mecanismo de accin que presenta esta
droga es basa en inhibir la sntesis del cido miclico, constituyente importante de la
pared celular mico bacteriana.
En el Per, en las ltimas dcadas se han

incrementado las enfermedades

bacterianas, una que predomina est siendo

antibacterianos

es

la

tuberculosis;

una

resistente

a los frmacos

enfermedad

infectocontagiosa

granulomatosa crnica producida por el Mycobacterium Tuberculosis o bacilo de

Koch, que se localiza generalmente en el pulmn, aunque puede afectar otros
rganos. Se ha notado que el bacilo tuberculoso puede sufrir mutaciones
espontneas

que

le

confieren

resistencia

los

diferentes

medicamentos

antituberculosos. La resistencia a la ionizada result la ms comn (54,1 %), seguido

por la resistencia a la rifampicina (27,6 %), la estreptomicina (25,5 %), y el etambutol
(12,2 %).
En la actualidad con el avance en la investigacin se ha logrado sintetizar una
variedad de compuestos derivados de la isoniazida. Debido a la resistencia que ha
surgido a este frmaco, esto

se relaciona con las mutaciones en el gen KatG,

codificante de la enzima catalasa. Las cepas de M. tuberculosis con mutaciones de

este gen exhiben poca o ninguna actividad catalasa y son altamente resistentes a la
INH.
Para la sntesis de conjugados de isoniazida, la molcula debe posee un grupo
amino donde existe una gran posibilidad de que estas reaccionen con compuestos
con un grupo carboxilo. Las aminas primarias se condensan con los aldehdos y
cetonas para dar aminas sustituidas (llamadas bases de Schiff).

Justificacin

Si bien, hoy en da con el avance de la medicina, las infecciones son en general de

fcil control; en algunos casos, dependiendo de circunstancias como: virulencia de
los grmenes involucrados, susceptibilidad y estado inmunolgico del hospedero,
calidad tcnica del profesional tratante y honestidad para derivar cuando sobrepase
las capacidades del facultativo; pueden surgir una serie de complicaciones que
hacen que ste proceso adquiera una gravedad importante que puede llegar a ser
letal. Adems nos hemos visto enfrentados en estos ltimos aos a un nuevo
problema de tal gravedad que si no somos cuidadosos, podra resultar en un
retroceso de todo el avance que ha experimentado la medicina en cuanto al control
de

infecciones;

nos

estamos

refiriendo

la

resistencia

que

algunos

microorganismos han desarrollado frente a terapias que antes resultaban eficaces,

las cuales hoy en da, en infecciones producidas por bacterias hasta ahora bien
diferenciados, deben ser modificadas por alternativas ms complejas, costosas e
incluso ms txicas para los pacientes, conocindose casos en que a pesar de los
esfuerzos no se han podido combatir infecciones con ninguno de los mtodos que
disponemos hasta el momento.
Por las razones expuestas anteriormente y en condicin de estudiante se requiere
aprender a manejar mejor la sntesis de frmacos

siendo de vital importancia

redisear los frmacos actuales que no solo inhiban los mecanismos por los cuales
se producen y evolucionan las bacterias; sino que sean de bajo coste, sino que
adems lo hagan a dosis en las que no se generen efectos adversos y/o toxicidad a
las clulas del organismo.

Planteamiento del problema

Las infecciones bacterianas se padecen cuando en el interior del cuerpo se

reproducen bacterias de alguna variedad nociva; estas presentan varios niveles de
gravedad. Entre este tipo de infecciones se encuentran enfermedades letales como
la peste bubnica, la tuberculosis y el clera, pero tanto stas como otras formas de
infeccin bacteriana se pueden prevenir con una buena sanidad y se curan con
antibiticos.
Las bacterias estn en todas partes: en el suelo, el agua, el aire y en cada persona y
animal. Estos microorganismos constituyen una de las formas de vida ms
numerosas de la Tierra.
En los ltimos aos los mecanismos de resistencia adquirida y transmisible (los ms
importantes) consisten fundamentalmente en la produccin de enzimas bacterianas
que inactivan los antibiticos o en la aparicin de modificaciones que impiden la
llegada del frmaco al punto diana o en la alteracin del propio punto diana. Una
cepa bacteriana puede desarrollar varios mecanismos de resistencia frente a uno o
muchos antibiticos y del mismo modo un antibitico puede ser inactivado por
distintos mecanismos por diversas especies bacterianas.
En la actualidad en el mbito extra hospitalario las enfermedades infecciosas deben
tratarse la mayora de las veces de forma emprica por dificultad de acceso a los
estudios microbiolgicos o por la lentitud de los mismos; en estos casos el
tratamiento debe apoyarse en la etiologa ms probable del cuadro clnico, en la
sensibilidad esperada de los patgenos ms frecuentes y en los resultados
previsibles segn los patrones de sensibilidad del entorno.
Adems nuestro estudio busca formular un frmaco con actividad antibacteriana
optimizada; partiendo de la isoniazida, con el fin de desarrollar un compuesto ms
efectivo frente a las infecciones bacterianas.
Antecedentes y fundamentacin cientfica, tcnica o humanstica.

TUBERCULOSIS
La tuberculosis es una enfermedad infectocontagiosa granulomatosa crnica
producida por el Mycobacterium Tuberculosis o bacilo de Koch 1, que se localiza
generalmente en el pulmn, aunque puede afectar otros rganos. Se transmite de
persona a persona por inhalacin de aerosoles contaminados por el bacilo, que han
sido eliminados por los individuos enfermos al toser, hablar o estornudar.2
El Mycobacterium bovis se transmite por la leche de las vacas enfermas, e
inicialmente produce lesiones intestinales y farngeas. 1 Las principales puertas de
entrada son por el sistema respiratorio, el tejido linfoide de la bucofaringe, el intestino
y la piel.2 La va de contagio ms comn es la va respiratoria, le sigue la digestiva y
la cutaneomucosa. No hay contagio materno trasplacentario. 3
Existen otros mecanismos de transmisin como los aerosoles generados por medio
de la deshibridacin o al cambiar las curas de los abscesos cutneos o de los tejidos
blandos infectados por Mycobacterium tuberculosis, que son altamente infecciosos.
Asimismo, las maniobras inadecuadas en la manipulacin de los tejidos durante las
necropsias y la inoculacin directa en los tejidos blandos a travs de instrumentos
contaminados o fragmentos seos, tambin transmiten la enfermedad. 4
El bacilo tuberculoso puede sufrir mutaciones espontneas que le confieren
resistencia a los diferentes medicamentos antituberculosos. Estas mutaciones
ocurren con una frecuencia predecible, por lo general, en orden del 1 en
108 multiplicaciones (replicaciones), y no estn ligadas, lo que ocasiona la resistencia
a un solo medicamento. En los pacientes con tuberculosis cavitaria, la poblacin de
bacilos es tan numerosa que existen unas cuantas micobacterias resistentes a cada
uno de los medicamentos tradicionales. No obstante, puesto que las mutaciones no
son ligadas, la probabilidad de que exista resistencia a 2 o ms medicamentos en un
solo microorganismo es muy baja, por lo que es fundamental de que al principio,
cuando la carga de microorganismos es mayor, se utilicen al menos 2 frmacos
eficaces.5

Hasta 50 millones de personas pueden encontrarse infectadas con tuberculosis

resistente a las drogas. No hay ningn tratamiento al alcance de los recursos
econmicos de los pases en va de desarrollo contra algunas cepas resistentes al
tratamiento con drogas mltiples (RDM), las que se definen como resistente a 2 de
las drogas ms importantes: isoniazida y rifampicina.5
El incremento de casos de tuberculosis en

varios pases y la aparicin de

resistencias, favorecida por el incumplimiento de los tratamientos, han disparado la

alarma acerca de una enfermedad que en los pases desarrollados casi se haba
olvidado. Un tratamiento quimioterpico de corta duracin (de 6 a 8 meses) suele ser
la opcin ms eficaz para erradicarla. Sin embargo, la falta de cumplimiento favorece
la reactivacin e incrementa el riesgo de desarrollar resistencias. 6 La tuberculosis
resistente a las drogas es ms difcil y ms cara de tratar y tiene una mayor
probabilidad de ser fatal.5
Estudios realizados en el Centro de Tuberculosis del Hospital Jamot, Yaounde,
Camern, revela que de los 111 pacientes estudiados con tuberculosis, el 58,2 % de
stos eran resistentes al menos a una droga anti tuberculosis. La resistencia a la
isoniazida result la ms comn (54,1 %), seguido por la resistencia a la rifampicina
(27,6 %), la estreptomicina (25,5 %), y el etambutol (12,2 %). Se observ resistencia
de multidroga en 27,6 % de los casos. 7
Los frmacos que frecuentemente se utiliza para la terapia son

isoniazida y la

rifampicina, la cual destruye a la bacteria de la tuberculosis que se encuentra latente

en el cuerpo. Si el paciente toma la medicina como lo indica su mdico, la terapia
preventiva nunca permitir que ste desarrolle la enfermedad. 8
En aos recientes, un aumento dramtico en la emergencia de cepas MDR
resistentes al menos a la isoniazida y rifampicina han sido observadas. La OMS
estim que anualmente se reportan 300 000 -600 000 casos de TB MDR y que la
prevalencia de TB MDR es tres veces ms alta que la incidencia anual, sobre todo en
pases de bajos y medianos ingresos9.

En contraste, la TB MDR en pases con un buen programa nacional de control de TB,

como Europa, este no es el mayor problema de salud. 10
En los pases industrializados, el tratamiento contra la tuberculosis cuesta alrededor
de $ 2 000 US por paciente, pero este precio aumenta ms de 100 veces hasta
alcanzar un valor de $ 250 000 US por paciente, cuando se trata de una tuberculosis
resistente a frmacos mltiples.5
Las personas con tuberculosis multidrogo-resistentes deben ser atendidas con
frmacos especiales. Estos frmacos suelen ser no tan eficaces como los frmacos
comunes y es posible que los efectos adversos sean mayores.
A pesar de que el diagnstico precoz y el tratamiento adecuado lograra la curacin
en la mayora de los pacientes, con la consiguiente disminucin de las fuentes de
infeccin y el riesgo de contraer la enfermedad en la poblacin, debido a algunos
problemas de funcionamiento del sistema de salud en el manejo de la enfermedad,
como la falta de deteccin de los casos existentes, los abandonos del tratamiento y,
ms recientemente la aparicin de resistencia a los frmacos antituberculosos
tradicionales, la tuberculosis en la actualidad sigue siendo un importante problema de
salud pblica, por el dao que provoca, principalmente, como causa de enfermedad
y, en menor medida, tambin como causa de mortalidad. An en el caso que se
disponga de una adecuada red de diagnstico de la enfermedad y de tratamiento y
seguimiento de los casos, existen otros factores que determinan la ocurrencia de
enfermedad como las condiciones ambientales, sociales, sanitarias e individuales
que son factores predisponentes de la tuberculosis. El hacinamiento, la malnutricin,
el SIDA, el abuso de alcohol y las malas condiciones de vida disminuyen la
inmunidad posibilitando la aparicin de la enfermedad. Tambin ocurre que otros
trastornos que impactan en la inmunidad predisponen a la tuberculosis, como es la
diabetes y otros trastornos respiratorios crnicos. Se calcula que en la actualidad hay
10 millones de nuevos casos de enfermos por ao en todo el mundo y en Argentina,
se notifican aproximadamente 11.000 casos nuevos por ao de esta enfermedad,
mientras que alrededor de ochocientas personas mueren al ao debido a la
tuberculosis.

ISONIAZIDA
La isoniazida se utiliza en el tratamiento de la tuberculosis y debido a su eficacia y
bajo coste se la considera como un frmaco de primera eleccin. La isoniazida es
ms eficaz y menos txica que otros frmacos antituberculosos.
La Isoniazida o hidrazida de cido isonicotnico, es una droga antituberculosa
sinttica derivada del cido nicotnico, constituye la piedra angular del tratamiento por
tener la mayor actividad bactericida, lo que la hace efectiva frente a los bacilos
extracelulares y los que se encuentra dentro de las cavernas 11,13. Es una droga
sinttica derivada del cido nicotnico a partir del ao 1952, el material original de la
sntesis fue el ster metlico del cido isonicotnico y, el producto intermediario fue la
hidrazida del cido mencionado14. El mecanismo de accin es desconocido pero se
ha planteado algunas hiptesis. Se ha sugerido como accin primaria de esta droga
inhibir la sntesis del cido miclico, constituyente importante de la pared celular
micobacteriana15,16, la exposicin llevara a la prdida de la cido resistencia y al
descenso de la cantidad de lpidos. Otros mecanismos que se han propuesto son la
activacin del sistema catalasa- peroxidasa6 y la generacin de radicales de oxgeno
reactivo16. La isoniazida se absorbe con facilidad cuando se administra por va oral.
Su absorcin se modifica si se ingiere con alimentos, en particular carbohidratos, o
anticidos que contienen aluminio. Se difunde por todos los lpidos y clulas
corporales, alcanzando el lquido pleural, asctico y LCR. Alcanza niveles picos
plasmticos al cabo de 1 a 2 horas manteniendo niveles efectivos hasta por 24
horas16. Se excreta por orina alrededor de 24 horas en forma de metabolitos inactivos
proveniente de la acetilacin enzimtica (acetilizoniacida) y la hidrlisis por el mismo
mecanismo11,14,17. La acetilacin se regula de manera gentica; el rasgo acetilador
rpido es dominante de manera autonmica. Existe una distribucin bimodal de los
individuos acetiladores rpidos y lentos, los acetiladores rpidos modifican
rpidamente las concentraciones del frmaco en el plasma.

La resistencia a este frmaco est relacionada a mutaciones en el gen KatG,

codificante de la enzima catalasa. Las cepas de M. tuberculosis con mutaciones de
este gen exhiben poca o ninguna actividad catalasa y son altamente resistentes a la
INH. Estas mutaciones explican aproximadamente el 50% de los casos de aislados
clnicos resistentes a INH6,18.
La principal aplicacin teraputica de esta droga es para tratar todos los tipos de
tuberculosis14. La incidencia de efectos adversos es bastante baja. Salvo a lo que
respecta a la hipersensibilidad, se relaciona con la dosis y la duracin de la
administracin. Estos efectos adversos son: Neurolgicas: Las neuropatas
perifricas constituyen ser las alteraciones ms frecuentes 11,16, estimadas en el 2%
de los pacientes que reciben 5mg/kg de peso y que no reciben conjuntamente
piridoxina. La isoniazida tambin puede desencadenar convulsiones, neuritis ptica y
atrofia, como tambin contracciones musculares, mareos, parestesias, estupor.
Durante el consumo del medicamento se ha observado anormalidades psquicas,
disminucin transitoria de la memoria, prdida del autocontrol

14

. La neurotoxicidad

de la isoniazida se cree que es debida a deficiencia de piridoxina, ya que esta es un

cofactor importante en la produccin de transmisores que actan a nivel de la
sinapsis, como la adrenalina, la noradrenalina, dopamina entre otros 11. Por tal razn
se recomienda como profilaxis 10mg de piridoxina con cada dosis de isoniazida, y en
caso de manifestaciones neurolgicas se recomiendan aumentar las dosis sin
interrumpir la administracin de isoniazida 19. Hepatitis: en pacientes que reciben
isoniazida se ha observado aumento transitorio de las transaminasas sricas y de
bilirrubina. El aumento de las transaminasas se observa en las primeras semanas de
tratamiento20.

DERIVADOS DE LA ISONIAZIDA
En la actualidad con el avance en la investigacin se ha logrado sintetizar una
variedad de compuestos derivados de la isoniazida. Para la sntesis de conjugados

de isoniazida ya que esta posee un grupo amino entonces se debe existe una gran
posibilidad de que etas reaccionen con un compuestos con un grupo carboxilo.
La qumica de las minas est dominada por el par de electrones no compartida del
nitrgeno, el cual imparte a dichos compuestos tanto un carcter bsico como
nucleofilo. Si no se tiene en cuenta los efectos estreos, tanto las aminas primarias
como las secundarias y terciarias tienen todas propiedades nucleofilicas similares. La
diferencia ms importante reside en el hecho de que, a diferencia de las aminas
terciarias, las aminas primarias, y secundarias tiene un protn que puede tenerse
una vez ha tenido lugar la adicin nucleofilica. Por consiguiente, existe una distincin
entre la distincin de las aminas primarias y las aminas secundarias con aspecto a la
terciario. Esta reactividad puede diferenciarse s i tenemos en cuenta que las
primeras experimenta reacciones de adicin - eliminacin (adicin nucleofilica
seguida de prdida de un protn), mientras que las a minas terciarias solo dan
reacciones de adicin
Algunos derivados de las aminas primarias y secundarias: la Benzoilacion de
Schoten Baumann de las aminas, Hidrocloruros de aminas, Aci8lacion de amidas
mediante anhdridos.22
Reacciones con el grupo carbonilo
Las aminas primarias se condensan con los aldehdos y cetonas para dar aminas
sustituidas (llamadas bases de Schiff).
Esta reaccin se sucede tambin en azucares ( aldosas y cetosasa ) y grupos NH2
de aminocidos y protenas , es causa de alteraciones u de prdidas de valor
nutritivo y otros atributos de calidad de los alimentos conservados.
Las aminas secundarias dan enaminas. Las a enaminas tiene un enlace doble C=C
vecino al N y son intermediarios valiosos en la sntesis orgnica. Cuando las aminas
secundarias reaccionan con el cido nitroso produce tambin ruptura del enlace NH.23
OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL:

 Sintetizar la hidrazina del cido citraznico y su derivado polihidroxilado con

actividad anti bacteriana
OBJETIVOS ESPECFICOS:

Sintetizar cido citraznico

Sintetizar hidrazina del cido citraznico.

Sintetizar el derivado polihidroxilado de la hidrazina del cido citraznico.

Elucidar la estructura del producto de la sntesis; mediante la aplicacin de

diferentes tcnicas instrumentales analticas.

Determinar la actividad antibacteriana in vitro del derivado polihidroxilado.

HIPTESIS

H1. La hidrazina del cido citraznico y de su base de Schiff con hidrazina tiene
actividad anti bacteriana.
VI: Producto final (hidrazina del cido citraznico)
VD: Actividad antibacteriana.

MATERIALES REACTIVOS

Materiales

 Balanza analtica
Autoclave
Liofilizador
Evaporador rotatorio
Equipo de Cromatografa Lquida de Alta Performance (HPLC)
Equipo de Bao Mara Digital
Equipos de reflujo
Equipos para Punto de Fusin
Espectrofotmetro Uv-visible
Espectrofotmetro Infrarrojo
Espectrofotmetro Resonancia Magntica Nuclear
Cepas de bacterias (ATCC)

Reactivos
cido ctrico anhidro Q.P.
cido tolueno p-sulfnico Q.P.
Metanol anhidro Q.P.
Sulfato de sodio anhidro
Amoniaco concentrado
Hidrxido de sodio
cido sulfrico98% densidad : 1,8361 g/cm3
cido clorhdrico 36% densidad : 1,179 g/cm3
Hidrazina
Etanol
Acetato de sodio

METODOLOGIA

El estudio

se ha realizado en los laboratorios de la Ctedra de Qumica

Orgnica, y con la colaboracin del Departamento Acadmico de Microbiologa y

Parasitologa Bsica Aplicada, siguiendo las normas regidas por la Universidad
Nacional Mayor de San Marcos. Para el desarrollo del proyecto se obtuvo
los reactivos qumicos de la Compaa Qumica Service.

S n t e s i s d e c i do Ci t r a z n i c o
Se mezcl 57,6 gramos de cido ctrico anhidro, 1.7ml de cido p-tolueno sulfnico
monohidratado y 75 ml de metanol anhidro, se calent bajo reflujo con agitacin
hasta la obtencin de una solucin clarificada, la agitacin fue detenida, pero el
calentamiento continuo cerca de 2 horas, luego mezcla se le aadi 300 ml de
hidrxido de amonio concentrado y se llev a un autoclave a temperatura de 120C
por una hora aproximadamente. Despus a la solucin tibia se le aadi 35 gramos
de hidrxido de sodio. Despus se enfri y filtro la mezcla, se caliento a 80C y se
acidifica a pH = 1 por adicin cuidadosa de aproximadamente 60ml de cido sulfrico
al 75% con agitacin. La suspensin de cido citraznico fue enfriada en hielo, el
producto se separ por filtracin, se lav con agua helada y se sec a una
temperatura de entre 120C- 125C hasta peso constante. 24

Flujo de la sntesis de cido citrazinico

Procedimiento de la sntesis de cido citrazinico

Esterificacin de cido citrazinico

Se mezcl una suspensin de 0,2 gr de cido citrazinico y 13 ml de etanol absoluto

se agit y se enfri mientras se aadi lentamente cido 1.8 gramos de cido
sulfrico concentrado. A continuacin la mezcla se llev a reflujo y se mantuvo una
temperatura de 65C durante 30 minutos.24
Despus de ello se llev a un enfriamiento usando hielo, la mezcla producto del
reflujo se neutralizo con 3.6 gr de carbonato de bario. Seguidamente se realiz la
filtracin de la mezcla.
Para obtener el precipitado de dicha fase liquida producto de la extraccin se llev a
bao mara en beacker con la solucin

por 30 minutos manteniendo una

temperatura de 65,
El producto

2,6-Dihidroxiisonicotnico de etilo fue sometido a calor con la finalidad

de secar el precipitado color amarillo parduzco.

Hidrazina del cido citraznico

Se pes 0.2 gramos de 2,6-dihidroxiisonicotnico de etilo, se aadi en 50 ml. de
etanol absoluto anhidro se agit mientras que 0.11gramos de sulfato de hidrazina se
mezclaba con 15 ml acetato de sodio.24 La solucin fue llevada a reflujo por 30 min.
Despus se enfri, con agitacin vigorosa. El producto de obtuvo por filtracin y se
lav con etanol anhidro frio.

Flujo de la Esterificacin de cido citrazinico

Procedimiento de la Esterificacin de cido citrazinico

Perf i l cromatogrf i co

Una variedad de sistemas de solventes fueron ensayados con la finalidad de

establecer un cromatograma que pueda expresar la mayor eficiencia en la
corrida de los diferentes productos sintetizados. El sistema de solventes
metanol- cloroformo

3:1 v/v fue el que dio resultados ptimos. L a fase

estacionaria de los cromatogramas

estuvo constituida

por cromatofolios

7 x 3 c m y 10x10 cm de aluminio de silicagel 60F254. En cuanto a los

reveladores, en todos los casos, se us la lmpara de luz UV, tambin se
hizo uso de rojo de metilo y vainillina.
Ensayo Microbiolgico25

Resultados
Se obtuvo un producto marrn claro que se trata de cido citrazinico, el
rendimiento de producto obtenido fue de 1,3 gramos. En el cromatograma se
obtuvo un Rf de 0,45.

Discusin
Para la identificacin de cido citrazinico se realiz un cromatograma el cual se
compar con el cido ctrico usado inicialmente en la sntesis; teniendo ambos
distintos Rf. En el cromatograma se obtuvo un Rf de 0.45 perteneciente al cido
citrazinico

lo que se puede aseverar como cido citraznico autntico.26 Con

respecto a l rendimiento se puede se puede sintetizar mediante oxidacin de cido

nicotnico26 que en comparacin se obtiene 75 mg, como se puede evidenciar se
obtuvo un mayor rendimiento con el procedimiento usado. 26

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