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diario:
Factores de virulencia de Clostridium difficile y su papel durante la
infeccin
Claire Janoir
EA 4043 "Unidad de Eficiencia Patgena y Salud" (UBaPS), Univ. Paris-Sud, Universit? Paris-Saclay, 92290 Ch? Atenay-Malabry, Francia

Informacin del artculo

Palabras clave:

Articulo de historia:

Clostridium difficile

Recibido el 31 de julio de 2015

Adhesin

Recibido en forma revisada

Colonizacin

16 de octubre de 2015

Toxinas

Aceptado el 21 de octubre de 2015

Virulencia

Disponible en lnea 24 Octubre 2015

RESUMEN
Clostridium difficile es el principal agente etiolgico de la diarrea asociada a la asistencia
sanitaria. Los sntomas de la enfermedad varan desde diarrea leve hasta colitis
pseudomembranosa que amenaza la vida. El principal factor de riesgo para desarrollar una
infeccin despus de la contaminacin por las esporas resistentes es la interrupcin de la
microbiota intestinal, permitiendo que las esporas germinen. La colonizacin del intestino
es probable que se rija por la resistencia bacteriana a la respuesta del husped y la
adhesin bacteriana a la mucosa. Hasta la fecha, se han identificado varias adhesinas
putativas, la mayora de ellas con funcin MSCRAMM, y los estudios de mutantes de
adhesina han subrayado claramente la caracterstica multifactorial de la adhesin de C.
difficile al husped. Los flagelos tambin han participado en el proceso de colonizacin,
pero su funcin depende de las cepas sometidas a prueba. Los signos clnicos se deben
principalmente a dos grandes toxinas glucosilantes, TcdA y TcdB, que son esenciales para
las manifestaciones de la enfermedad. La importancia de cada toxina difiere segn las
cepas y las condiciones experimentales, pero TcdB parece ser el prominente, como lo
demuestran los estudios mutantes y la aparicin natural de cepas patgenas que no
producen TcdA. El papel de la toxina binaria ribosilante del ADP expresada por algunas
cepas, incluyendo linajes epidmicos, no est claramente establecido, aunque se ha
relacionado con una mayor morbilidad y mortalidad. La produccin de bajo nivel de las
toxinas glucosilantes y de la toxina binaria parece promover la adhesin a las clulas
husped. La expresin de los genes tcdA y tcdB est bajo el control del segundo mensajero
c-di-GMP. Este es tambin el caso de otros factores de virulencia, en particular para
flagelar, pili de tipo IV y algunos genes de adhesina. De hecho, varios estudios que usan
mutantes knock-out sugieren que C. difficile puede experimentar un cambio entre el
fenotipo de adhesin y el fenotipo de motilidad durante el curso de la infeccin, regulado
por el nivel c-di-GMP intracelular. In vivo, esto podra dar lugar a una formacin de biofilm
que, asociada con la persistencia de esporas, podra promover la aparicin de recadas
observadas en al menos el 20% de los pacientes.

1. Introduccin
Clostridium difficile es una bacteria gram-positiva en forma de varilla, esporuladora,
estrictamente anaerbica y la principal causa de diarrea nosocomial en adultos en los
pases occidentales. La contaminacin por las esporas resistentes puede conducir a un
transporte asintomtico o signos clnicos que van desde diarrea leve o severa a la colitis
pseudomembranosa que amenaza la vida (PMC) [1]. El transporte asintomtico de cepas
toxignicas en el ingreso hospitalario es frecuente, alrededor del 8% segn un anlisis
reciente, y el riesgo de desarrollar una infeccin por C. difficile (ICD) para pacientes
colonizados es significativamente mayor en comparacin con pacientes no colonizados [2] .
Los lactantes tambin son comnmente colonizados asintomticamente con cepas
patgenas y podra representar un reservorio potencial para la transmisin de la cepa [3].
El principal factor de riesgo para desarrollar una infeccin despus de la contaminacin es
el desequilibrio de la microbiota, que conduce a la interrupcin de su efecto de barrera.
Esto ocurre principalmente despus del uso de antibiticos de amplio espectro. Hasta la
fecha, el IDC afecta principalmente a ancianos con comorbilidades, pacientes sometidos a
ciruga, pacientes hospitalizados a largo plazo y pacientes inmunocomprometidos. Sin
embargo, las poblaciones recin afectadas incluyen pacientes ambulatorios, en particular
nios y mujeres periparto. A pesar de los tratamientos antibiticos especficos, una de las
caractersticas clave del CDI es la alta tasa de recidiva, observada en el 20% 30% de los
casos [1]. Las recurrencias pueden ser recadas que ocurren con la cepa inicial o ser reinfecciones que ocurren con otra cepa. La epidemiologa del CDI ha evolucionado con el
tiempo. Histricamente, el CDI fue causado por muchas variedades diferentes. La situacin
cambi hace unos diez aos con la aparicin de cepas particulares pertenecientes al
llamado linaje hipervirulento 027 / NAP1 / BI que se extendi de Norteamrica a Europa y se
hizo predominante en varios pases occidentales.
Cepas pertenecientes a este linaje
fueron responsables de una mayor morbilidad y mortalidad y se pens inicialmente a
producir ms toxinas que otras cepas clnicas [4, 5]. En la actualidad el linaje 027 est
disminuyendo y CDI son causados por mltiples cepas [6], incluyendo cepas de nuevos
linajes emergentes, como el 078 PCR-ribotype cepas, se encuentran tanto en los seres
humanos y en los animales [7, 8].
La interrupcin de la microbiota de colon normal permite la germinacin y la proliferacin
de esporas (de origen endgeno o exgeno) en el intestino del husped, y posteriormente
la colonizacin del nicho colnico. Durante este proceso, las clulas vegetativas de C.
difficile evaden la respuesta inmune innata del husped y se multiplican. Las toxinas A y B
se producen concomitantemente, causando manifestaciones clnicas (Fig. 1). El papel del
desequilibrio microbiano y de los factores involucrados en la germinacin de esporas estn
fuera del alcance de este estudio y han sido revisados recientemente [9], as como el papel
de la respuesta inmune adaptativa del husped en el resultado del CDI. Esta revisin se
enfocar en los factores de virulencia involucrados en la colonizacin y los pasos
toxignicos y su interaccin.

2. Superficie y componentes secretados de C. difficile involucrados en las

interacciones del husped
La etapa de colonizacin se define por el desarrollo de las bacterias en el nicho colnico e
involucra varias caractersticas como la evasin bacteriana de las defensas innatas del
husped, la adherencia a la mucosa del epitelio y la multiplicacin de clulas vegetativas, a
menudo mediadas por componentes superficiales. C. difficile muestra en su superficie una
gran variedad de protenas [11], varios de ellos estn involucrados en la interaccin con el
anfitrin.

2.1. Factores relacionados con la resistencia a las defensas innatas del husped

Los patgenos bacterianos que colonizan las superficies mucosas han adquirido resistencia
a los antimicrobianos que son abundantes en estos sitios. La lisozima es un antimicrobiano
secretado en altos niveles por el epitelio. Es una hidrolasa de peptidoglicano que escinde el
enlace b (1e4) entre MurNAc y GlcNAc en el esqueleto de peptidoglicano. Muchos
patgenos bacterianos han evolucionado la resistencia a la lisozima mediante diversos
mecanismos, con el fin de prevenir la hidrlisis del peptidoglicano, siendo la principal una
modificacin directa del peptidoglicano, en particular por la N-desacetilacin de la GlcNAc
[para una revisin, vase [12]].
C. difficile es naturalmente muy resistente a la lisozima in vitro, y esto podra estar
relacionado con la alta tasa de desacetilacin de peptidoglucano [13]. Ho et al. Inform que
la desacetilacin adicional del residuo GlcNAc se induce por concentraciones subinhibidoras de lisozima y contribuye directamente a un nivel adicional de resistencia a la
lisozima. La desacetilacin est mediada por la desacetilasa PdaV (CD630_15560) y est
regulada por la funcin extracitoplsmica (ECF) sigma factor sV [14]. La expresin de sV se
incrementa por la exposicin a la lisozima, as como la expresin de otros dos factores
sigma ECF, pero no por nisina o bacitratina [15] que son pptidos antimicrobianos que
tambin inducen el estrs de la envoltura celular.
Otros antimicrobianos son los pptidos antimicrobianos catinicos (CAMP), cuya carga
positiva facilita la interaccin con las membranas bacterianas cargadas negativamente.
CAMPs de origen bacteriano o animal inhiben el crecimiento bacteriano, proporcionando
una ventaja competitiva al productor en poblaciones bacterianas mixtas, y como un
mecanismo de defensa del husped contra patgenos, respectivamente. Se ha demostrado
que varias catelicidinas y defensinas humanas (como las a-defensinas 1 y 5) inducen la
eliminacin eficaz de clulas vegetativas de C. difficile. Sorprendentemente, las cepas 027
mostraron mayor resistencia a los mamferos catelicidina LL-37 [16], mientras que se
encontr que son ms susceptibles a las defensinas en comparacin con otras cepas [17].
Se han identificado diferentes estrategias de bacterias patgenas para evadir CAMP, una de
ellas es la esterificacin de D-alanilo de cidos teicoicos, resultando en un aumento de
carga positiva de la superficie bacteriana reduciendo la efectividad de CAMPs [18]. Esta
modificacin de la pared celular est mediada por el opern dlt. Recientemente, McBride y
Sonenshein han demostrado que el opern dlt de C. difficile es inducido por la exposicin a
concentraciones subinhibitorias de varios CAMP y que su interrupcin dio como resultado
una susceptibilidad incrementada a mltiples CAMPs. Esto sugiere que la D-alanilacin
puede ser importante para C. difficile para escapar temprana respuesta inmune del
anfitrin [19].
Otro CAMP mecanismo de resistencia est mediada por ABC transportista mediada CAMP
eliminacin [18]. En C. difficile, el transportador CprABC ha evolucionado para reconocer
mltiples sustratos para defenderse contra las toxinas producidas por la microbiota
intestinal [20].

ESPORAS

Antibioticos

CONTAMINACION

Alteracin del efecto barrera de la

microbiota
Alteracin del efecto barrera de la
Germinacin de Esporas

Colonizacin intestinal
Manifestaciones
clnicas
Produccin de toxinas

Produccin de factores de virulencia

-

Carro asintomtico

Factores de resistencia a las defensas del husped

Adhesinas
enzimas proteolticas

Toxinas

Cabe destacar que las catelicidinas y defensinas humanos reducen significativamente el

dao tisular y la inflamacin causada por las toxinas TcdA y TcdB, y reducir la produccin de
citoquinas inflamatorias [21, 22]. De este modo, la resistencia a los CAMP humanos y
microbianos podra estar implicada tanto en la colonizacin como en los pasos toxignicos
del CDI.
2.2. Adhesinas de C. difficile
C. difficile es capaz de adherirse a diferentes lneas celulares tales como clulas Vero,
clulas Hela, clulas Hep-2, clulas Caco-2 similares a enterocitos, HT-29 y clulas HT-29MTX productoras de moco [23e25]. Curiosamente, la unin de C. difficile a las clulas Caco2 es mayor en el polo basolateral de las clulas que en el polo apical [26]. C. difficile
tambin se une a varias protenas de la matriz extracelular (ECM) in vitro: fibronectina,
fibringeno, vitronectina, y tipo I, III, IV y V colgenos [26]. In vivo, C. difficile es capaz de
adherirse a la mucosa del epitelio de modelos animales ampliamente utilizados, como
ratones y hmsters [27e29], pero los datos sobre la adhesin de C. difficile a los tejidos
digestivos humanos son escasos. La primera indicacin de que C. difficile se adhiere al
intestino humano se obtuvo en 1979 despus de su recuperacin de una muestra de
biopsia lavada de un paciente con PMC [30]. Un estudio reciente mostr adherencia de C.
difficile a la mucosa colnica en uno de 20 pacientes no CDI mientras que C. difficile se
recuper de tres heces; Esto sugiere que el desprendimiento de C. difficile en los seres
humanos no siempre se correlaciona con la adhesin a la mucosa digestiva [31].
La adhesin husped-bacteria requiere adhesinas bacterianas que son bsicamente
protenas de superficie. Varias adhesinas de C. difficile han sido caracterizadas ahora
aunque su papel en la patognesis del CDI permanece para algunas de ellas poco claras.
Entre ellos, varios pertenecen a la familia Cwp.

Las protenas de Cwp

Las protenas Cwp son una familia de protenas asociadas a la superficie paralogous que
comprende 29 miembros [32], caracterizado por la presencia de un dominio de unin
conservado (Pfam 04122) demostrado recientemente para anclar las protenas a la
superficie bacteriana a travs del polisacrido II (PSII) [ 33]. Para algunos de ellos, otro
dominio especifica una funcin especfica conocida o putativa. Doce de la codificacin Cwp
genes se encuentran dentro de la "pared clostridial (cwp) grupo de genes" que lleva 18
marcos de lectura abierta (ORF) (Fig. 2]. Diecisiete otros cwp se distribuyen a travs del
cromosoma. Se ha demostrado que dos de estos Cwps, SlpA y CwpV, cuyos genes de
codificacin se encuentran dentro y fuera del cwp clster, respectivamente, son secretados

por el sistema SecA2 [34]. Por lo tanto, puede ser la hiptesis de que esta va se utiliza para
la secrecin de otros Cwps.
Los genes cwp situado dentro del cluster Cwp puede ser muy variable o muy conservado
entre C. difficile cepas, tales como cwp84 [35, 36]. Los genes slpA, cwp66 y secA2 son
particularmente variables y constituyen un casete de 10 kb que es capaz de intercambios
genticos por recombinacin homloga [37]. Esto da lugar a grandes cambios antignicos,
mientras que el resto del genoma permanece sin cambios. En consecuencia, varios de los
genes cwp situado fuera del grupo de Cwp mostrar una alta diversidad gentica, vinculada
a los grupos definidos por ribotypes PCR [38]. Se cree que las variaciones genticas en las
protenas asociadas a la superficie evolucionan bajo presin de inmunidad y contribuyen a
evitar la inmunidad del husped.
Varias protenas Cwp son inmungenas en los pacientes [39e42], lo que sugiere que se
expresan in vivo, ya sea durante transporte asintomtico o infeccin (Tabla 1]. Por lo tanto,
podran desempear un papel en el proceso de colonizacin y / o la patognesis de la
enfermedad.
Su funcin se ha caracterizado para algunos de ellos.
2.2.1. Protenas SLP
Las dos subunidades SLP, a saber, LMW-SLP (protena de capa S de bajo peso molecular) y
HMW-SLP (protena de capa S de alto peso molecular), son los componentes de la capa S
paracristalina de C. difficile [43]. ]. Estas dos subunidades se derivan de la escisin del
precursor SlpA por la cistena proteasa Cwp84 [44, 45] y no covalentemente reasociar
despus de precursor de escisin [46]. El LMW y el HMW-SLPs no parecen ser glicosilados
[47]. Sin embargo, la insercin de un putativo S-capa glicosilacin grupo de genes se ha
descrito en un clado particular, lo que sugiere que la glicosilacin de la capa S puede
ocurrir en algunas cepas C. difficile [37].
Tanto las protenas nativas SLP y SlpA recombinante se unen a las clulas Hep-2 ya los
tejidos gastrointestinales humanos muestreados a partir de muestras de biopsia normales
[48]. Adems, las SLP son tambin importantes contribuyentes a la adherencia bacteriana a
las clulas Caco-2. Merrigan y coll. Mostr que la pre-incubacin de bacterias con
anticuerpos dirigidos contra el LMW o la subunidad HMW reducido C. difficile adhesin a
Caco-2 clulas (cerca del 50%) [49]. Sin embargo, este resultado enfatiza que la adhesin
bacteriana al husped es un proceso multifactorial. Esto tambin fue subrayado por el
estudio de Spigaglia y coll., Que demostr que la capacidad de adherencia de C. difficile
cepas de diferentes orgenes no estn correlacionados con la naturaleza de su capa S [29].
Adems, el HMW-SLP muestra propiedades de unin in vitro a protenas ECM incluyendo
colgeno tipo I, trombospondina y vitronectina [48].
Las subunidades de la capa S son capaces de activar el sistema inmune innato del
husped, a travs de su reconocimiento por los Receptores Toll Like (TLR) 4. Esta
interaccin conduce, a travs de la activacin de las vas de sealizacin, a la maduracin
de las clulas dendrticas y la estimulacin de Macrfagos, una caracterstica clave para el
aclaramiento bacteriano. De hecho, los ratones knock-out de protena adaptadora TLR4 o
MyD88 son ms susceptibles a la infeccin por C. difficile, como lo demuestran los graves
daos del epitelio mucosal de ratones knock-out infectados en comparacin con ratones de
tipo salvaje [50]. La importancia de las protenas de la capa superficial en el aclaramiento
bacteriano tambin se ha evaluado in vitro en macrfagos murinos [51]. Sin embargo, la
actividad inmunomoduladora de las protenas de la capa S no parece estar relacionada con

la virulencia de las cepas ya que no se ha encontrado un patrn inmunomodulador

especfico
Peptido seal
de la funcin especfica

Dominio vinculante a PSII

Dominio variable

Figura 2. El racimo del gene "pared clostridiales (cwp)" que lleva 18 ORFS, entre los cuales 12 codifican protenas con un pptido seal, un d
ominio obligatorio conservado a la superficie bacteriana (situado en la parte de la N o C
terminal de la protena) y un dominio variable entre paralogs responsable de una funcin especfica. El dominio C
terminal de Cwp66 muestra propiedades adhesivas; el dominio N-terminalde Cwp84 muestra propiedades proteolticas.

Funciones de las protenas de superficie clave y la respuesta inmune provocada en los pacientes.

componente de
superficie

Funcin

Referencias

Anticuerpo en suero de
pacientes

Referencias

SLP

La unin a la mucosa intestinal, clulas

Caco-2 y las protenas ECM

48, 49, 50

[39], [42]

44, 45, 59

[41], [42]

60

[40], [41]

62, 66

No determinado

Interaccin con TLR4

Cwp84

La maduracin de S-capa SIpA precursor

La degradacin de las protenas ECM

Cwp66
CwpV

La unin a clulas Vero

Propiedades auto agregativas
Resistencia a los fagos

Fbp68

La unin a fibronectina

68, 69

CbpA

La unin a colgeno

73

No determinado

C-D

La unin a las clulas Caco-2

76

[40]
[39]

para las cepas 027 en comparacin con las cepas clsicas de C. difficile [52,53].
Nuestra comprensin de la funcin de SLPs en CDI se ve obstaculizada por la falta de
obtener un mutante, a pesar de varios intentos. No es sorprendente que un artculo
reciente sugiera que slpA es esencial para el crecimiento de C. difficile [54].
2.2.2. Cwp84 cistena proteasa
El gen que codifica para la cistena proteasa Cwp84 se encuentra dentro del cwp grupo y se
transcribe a partir de su propio promotor [36]. La estructura detallada de Cwp84 se ha
establecido recientemente, gracias a los estudios de cristalizacin [55, 56]. El dominio Nterminal contiene el sitio proteoltico con la cistena activa en la posicin 116. A
continuacin del dominio proteoltico hay un dominio tipo lectina, seguido por el dominio de
unin PSII que ancla la proteasa a la superficie. Cwp84 se localiza principalmente en la capa
S como una forma de 77 kDa, despus de la escisin de su propptido por otra superficie
asociada cistena proteasa (Cwp13) cuyo codificacin del gen tambin pertenece al grupo
Cwp [57]. La forma de 77 kDa es indudablemente responsable de la escisin del precursor
SlpA de la capa S. Esta forma tambin se encuentra en la fraccin extracelular, junto con
una forma acortada de la proteasa de 47 kDa. Esta forma de 47 kDa es capaz de asociarse
nuevamente de manera no covalente a la superficie de C. difficile [58]. Puede ser

responsable de la escisin o la degradacin de las protenas ECM del husped, tales como
fibronectina, vitronectina o laminina. Hasta la fecha, esta actividad proteoltica slo se ha
observado in vitro, pero podra afectar la integridad de los tejidos del husped in vivo, lo
que facilita la propagacin de las bacterias [58, 59]. Sin embargo, el papel de Cwp84 en la
progresin de la enfermedad es probablemente limitado, ya que el mutante cwp84 es tan
virulento como la cepa WT en el modelo de hmster [44].
2.2.3. Cwp66 adhesin
El gen cwp66 se encuentra dentro del grupo de cwp y codifica una protena sobreproducida
en la superficie de la bacteria despus de un heatshock que media la adhesin a las clulas
Vero [60]. Esto es una reminiscencia de estudios previos que demuestran que C. difficile
adhesin a las clulas cultivadas se mejora despus de un choque trmico a 60 C [61]. El
papel de Cwp66 en la adhesin celular se demostr mediante estudios de inhibicin de la
adherencia utilizando anticuerpos y protena recombinante purificada, pero no se ha
probado ningn mutante.
2.2.4. Protena CwpV
CwpV es la protena ms grande de la familia Cwp y su gen de codificacin se encuentra
fuera del grupo de Cwp. El dominio especfico de CwpV est situado en el extremo Cterminal. Se compone de una regin rica en serinaglicina seguida de repeticiones, cuyo
nmero y secuencia varan entre las cepas. Por lo tanto, el dominio especfico de CwpV es
altamente variable en las cepas de C. difficile y los tipos de repeticin cinco definidos son
antignicamente distintos. En cuanto al precursor SlpA, la protena CwpV se procesa en dos
fragmentos que se reasocian de forma no covalente y forman un complejo estable asociado
a la superficie de la bacteria [62]. Esta clivaje post-translacional est mediada por una
autoprotelisis intramolecular [63]. Curiosamente, en condiciones normales de crecimiento
de laboratorio, slo el 5% de las clulas de la poblacin general expresan esta protena. La
variacin de fase de la expresin de CwpV est mediada por la inversin del ADN, un
mecanismo que implica la terminacin de la transcripcin mediante la formacin de una
estructura de bucle del tallo estable seguida de un tracto poli-U, que induce la terminacin
transcripcional en posicin "OFF". De la nota, cwpV pertenece al agr regulon [65].
El dominio C-terminal de CwpV muestra propiedades auto-agregantes [62], pero esta
caracterstica an no est relacionada con la formacin de biofilm. Recientemente se ha
demostrado que el dominio C-terminal de CwpV podra proporcionar una proteccin
antiphage de amplio espectro en C. difficile: esta hiptesis es soportada por la resistencia
de una cepa 027 sobrepuesta genticamente modificada a fagos [66]. La proteccin fue
mayor contra los siffagos que contra los miofagos, y se plante la hiptesis de que podra
originarse a partir de una interaccin con un componente estructural de la cola del fago.
Adems, cwpV est fuertemente regulado en una C. difficile cepa R20291 portador de la
CD38-2 prophage [67]. De hecho, las clulas de C. difficile que activan la expresin de
cwpV pueden producir suficiente protena para obtener una proteccin significativa contra
la infeccin de fagos in vivo.

Otras adhesinas
Muchos patgenos bacterianos exhiben en su superficie protenas redundantes conocidas
como "componentes de la superficie microbiana que reconocen las molculas de la matriz
adhesiva" (MSCRAMMs), que median la adhesin a las superficies husped por unin a
diversas protenas ECM incluyendo fibronectina, laminina, colgeno y proteoglicano. Aparte
del HMW-SLP, se han caracterizado otros dos MSCRAMMS.
2.2.5. Fibronectina-protena de unin Fbp68
La primera caracterizacin de Fbp68 (denominada en otro lugar FbpA) se realiz en nuestro
laboratorio. Esta protena asociada a la superficie, que muestra un 39% de identidad de
aminocidos con FBP54 de Streptococcus pyogenes, es capaz de unirse a la fibronectina

soluble e inmovilizada, ya las clulas Vero pre-incubadas con fibronectina [68]. As, la
fibronectina podra actuar como un puente entre C. difficile y las clulas husped.
Fbp68 muestra un dominio N-terminal de unin al manganeso. La unin al manganeso
induce un cambio de conformacin de la protena, permitiendo su unin a la fibronectina. El
sitio de interaccin entre Fbp68 y fibronectina ha sido asignado a la C terminal de dominio
[69].
Recientemente, los experimentos utilizando mutantes han puesto de manifiesto que, en
general, la ausencia de Fbp68 no tiene impacto en la tasa de C. difficile adhesin a varias
lneas celulares [69, 70]. Por el contrario, en un experimento de ratn dixnico competitivo,
la cepa parental compensa el mutante, que adems se adhiere menos a la mucosa cecal.
Estos resultados sugieren que Fbp68 podra desempear un papel en el proceso de
colonizacin [70]. Es de sealar que el gen que codifica Fbp68 parece ser parte del genoma
del ncleo, lo que sugiere un papel clave de la protena codificada en la patofisiologa de la
bacteria [71]. Adems, Fbp68 es inmunognico en pacientes (Tabla 1).
2.2.6. Protena de unin a colgeno CbpA
Esta gran protena asociada a la superficie tiene un dominio de unin al colgeno Nterminal. Muestra un motivo SPKTG en su dominio C-terminal y por lo tanto puede ser
anclado en superficie gracias a la sortase B [72]. La protena recombinante truncada Nterminal (expresada en Escherichia coli) es capaz de unirse in vitro al colgeno tipo I y V, y
se co-localiza con fibras de colgeno de fibroblastos humanos y de tejidos intestinales
murinos. Adems, la expresin de la protena CbpA C. difficile en Lactococcus lactis mejora
la adhesin de esta especie al colgeno. Por el contrario, una cepa knock-out de C. difficile
cbpA se adhiere al colgeno de forma similar a la cepa parental [73] y un experimento de
ratn dixenic competitivo llevado a cabo en nuestro laboratorio mostr un nivel similar de
colonizacin tanto para las cepas mutantes como parentales. Estos resultados sugieren
que, aunque la CbpA es indudablemente una de las muchas adhesinas de C. difficile, no es
una de las principales, al menos en las condiciones probadas.
Otros genes que codifican putativo fibronectina o protenas de unin a colgeno se
distribuyen en todo el cromosoma [75].
2.2.7. Lipoproteina CD630_08730
Recientemente, se ha identificado una lipoprotena asociada a la superficie que tiene
propiedades adhesivas. El mutante muestra una reduccin significativa en la adherencia a
las clulas Caco-2. Adems, las bacterias de tipo salvaje preincubadas con anticuerpos
especficos se unen significativamente menos a las clulas Caco-2 [76]. Estos resultados
sugieren que el CD630_08730 es una adhesina principal de C. difficile, pero la aptitud de
colonizacin del mutante necesita ser probada in vivo.
2.2.8. Protena de choque trmico GroEL
La protena de choque trmico GroEL se libera en el medio extracelular despus de un
choque trmico y puede reasociarse a la superficie bacteriana por un mecanismo
desconocido. Ambos anticuerpos contra GroEL y la protena purificada inhibieron
parcialmente la adherencia de C. difficile a clulas Vero. Adems, la produccin de la
protena se increment despus del contacto celular [77]. Todos estos resultados
argumentan para un papel de GroEL en la adherencia celular. Recientemente, se demostr
que la inmunizacin utilizando GroEL recombinante reduce la tasa de colonizacin intestinal
de C. difficile en ratones infectados, apoyando un papel de GroEL en el proceso de
colonizacin [78].
2.3. Factores implicados en la propagacin bacteriana: las proteasas
Una proteasa secretada ha sido recientemente identificado por dos estudios independientes
[79, 80]. Esta metaloproteasa de zinc (CD630_28300) denominada Zmp1 es capaz de
escindir varias protenas husped tales como la protena de choque trmico HSP90b,

anticuerpos IgA2, fibringeno o fibronectina. Zmp1 desestabiliza la red de fibronectina

producida por fibroblastos humanos. Los residuos catalticos se han asignado al cido
glutmico 143 y la histidina 146, y la mutacin de ambos residuos perjudica la actividad de
la proteasa sobre la fibronectina y el fibringeno [79]. Zmp1 es tambin capaz de escindir
un putativo colgeno vinculante protena, CD630_28310, situado junto al gen zmp1 en el
genoma. Curiosamente, se han encontrado dos riboswitches funcionales cclicos diguanosil-50 monofosfato (c-di-GMP) opuestos frente a zmp1 y CD630_28310. Los riboswitch
son dominios de mRNA que controlan la expresin gnica en respuesta a las
concentraciones cambiantes de su ligando diana. C-di GMP es una molcula de sealizacin
que desempea un papel clave en la fisiologa bacteriana y la virulencia y se ha
demostrado que controla los cambios de estilo de vida de vida libre de estado mvil a las
comunidades de biofilm en varias especies patgenas. C. difficile codifica un gran nmero
de enzimas involucradas en la sntesis o en la degradacin de c-di-GMP [81], y 16 predicho
c-di-GMP-riboswitches de respuesta se han identificado en C. difficile genoma (12 Tipo I y 4
tipo II c-di-GMP riboswitches activado a niveles bajos y altos de c-di-GMP, respectivamente)
[82,83]. Se encontr un riboswitch tipo I aguas arriba de zmp1 y un riboswitch tipo II aguas
arriba CD630_28310, lo que sugiere que la expresin de zmp1 puede ser regulada
positivamente en presencia de una concentracin baja de c-di-GMP, mientras que la
expresin del gen que codifica la unin al colgeno La protena est regulada en la
presencia de una mayor concentracin de c-di-GMP [83]. A baja concentracin de c-di-GMP,
la proteasa se produce y escinde la baja cantidad de protena de unin al colgeno CD2830,
limitando as la adhesin bacteriana al husped. Por el contrario, a alta concentracin de cdi-GMP, la baja cantidad de proteasa producida no es capaz de escindir eficazmente la
adhesina, por lo tanto, promover la adhesin al husped [80].
Las funciones de las respuestas humorales del husped obtenidas contra los componentes
superficiales bacterianos se resumen en la Tabla 1.
2.4. complejo aparato en la superficie bacteriana

Flagelos
C. difficile es movible gracias a la presencia de un aparato flagelar. Los genes que
gobiernan el montaje de los flagelos de C. difficile se organizan en tres operones [75]. El
locus F3 contiene genes en fase temprana, e incluye el factor sigma FliA (tambin
denominado SigD). FliA controla la expresin de fase tarda flagelar genes de la F1 locus,
como los genes que codifican para la flagelina FliC [84] y la tapa de la protena FliD [85]. El
reguln F2 es responsable de la modificacin postraduccional de flagelos que se ha
demostrado esencial para el montaje de flagelos funcional y la motilidad de C. difficile [86,
87]. Los tres loci son variables entre los linajes de C. difficile [88, 89]. Es de notar que el
locus F3 est ausente del linaje virulento emergente 078, lo que sugiere que los flagelos y
por lo tanto la motilidad son prescindibles para la virulencia de C. difficile.
En otras bacterias patgenas mviles, la expresin de genes flagelares est estrechamente
regulada por las condiciones ambientales [90, 91]. En C. difficile, los genes implicados en la
motilidad se expresan en niveles ms altos durante la fase de crecimiento exponencial y
estn bajo el control negativo de la alternativa sigma factor SigH [92]. En vivo, dos estudios
han reportado resultados discrepantes: en el modelo de ratn monoxnico, no se observ
modulacin de los tres operones de ensamblaje flagelar a lo largo del tiempo de 8 h a 38 h
despus de la infeccin [74], mientras que en el modelo de lazo Los genes flagelar se
mostr a upregulated a las 4 h post-infeccin y downregulated a partir de entonces [93].
Esto sugiere que los genes flagelares se expresan durante la fase de colonizacin muy
temprana y podran estar implicados en el proceso de colonizacin. Adems, la produccin
de anticuerpos anti-flagelina especficos en pacientes indican que los flagelos se expresa
durante el curso de CDI en los seres humanos [41, 42].
Los primeros estudios sobre el papel de los flagelos en el proceso de colonizacin
mostraron que ambas protenas flagelares purificadas FliC y FliD son capaces de unirse al
moco murino. Adems, las cepas naturalmente no flageladas son menos adherentes al
ciego del ratn que las cepas flageladas, pero esto no resulta en una disminucin de la

colonizacin intestinal [94]. Esto sugiere un papel para la flagelina y la tapa flagelar en la
interaccin con el moco husped: las propiedades adhesivas de las protenas flagelares
podran promover la unin de C. difficile al moco siguiendo el cruce del moco gracias a la
motilidad dirigida por flagelos.
Desde entonces, varios estudios sobre los mutantes flagelares generados en diferentes
orgenes genticos han intentado describir con mayor precisin el papel del aparato
flagelar en el proceso de adhesin y colonizacin.
En el contexto 630, tanto las cepas mutantes fliC como fliD han mostrado repetidamente
una mayor adherencia a las clulas Caco-2 (una lnea celular no productora de moco) lo
que sugiere que los flagelos y la motilidad no contribuyen o pueden incluso interferir con la
adherencia a C. difficile A las clulas in vitro. Sin embargo, in vivo, los niveles de
colonizacin de las cepas fliC y fliD mutantes, medidos por el desprendimiento fecal de C.
difficile, fueron constantemente similares a los de la cepa parental, cualquiera que sea el
modelo animal utilizado [87, 95, 96]. ). Curiosamente, el mutante fliC podra inducir una
recada en un modelo de ratn de la infeccin ms rpido que la cepa parental despus del
tratamiento con antibiticos [87].
Por el contrario, en el fondo 027 R20291, la adherencia a las clulas Caco-2 disminuy
significativamente tanto para las cepas mutantes fliC como fliD. El mutante fliC mostr
disminucin de la aptitud de colonizacin en comparacin con la cepa parental en un
modelo dixenic competitivo ratn [96]. Esto puede estar relacionado con la prdida de
propiedades adhesivas de las protenas FliC y FliD o con la regulacin negativa de otras
protenas implicadas en la interaccin con el husped. De hecho, transcriptome anlisis de
la R20291 fliC mutante revel que un gran nmero de genes fueron modulados [97]. Por
ejemplo, el CDR0802, que codifica la lipoprotena descrita anteriormente (CD630_08730)
con propiedades adhesivas, estaba altamente regulado en el mutante fliC. Cabe destacar
que una cepa mutante que presenta un flagelo paralizado se adhiere ms que el mutante
fliC a las clulas Caco-2, aunque se adhiere menos que la cepa parental, lo que sugiere que
la estructura flagelar intacta tiene propiedades adhesivas independientemente de la
motilidad mediada por flagelos [96]. ]. Estos resultados sugieren que los flagelos no son
necesarios para la adherencia y colonizacin en la cepa R20291, pero la motilidad mediada
por flagelos puede contribuir a la aptitud general de las bacterias.
En resumen, el papel de los flagelos en el proceso de colonizacin an no est claro y
puede variar segn la cepa. En particular, el papel de FliC y FliD en la unin a moco y / o
clulas epiteliales y las consecuencias sobre el proceso de colonizacin necesitan ser
desentraados.
Las mutaciones en los operones flagelares afectan sustancialmente la virulencia de C.
difficile, incluso cuando se logran niveles de colonizacin similares. Vamos a discutir en
detalle el mutante fliC, pero otros mutantes, por ejemplo mutante de los genes flagelar de
cuerpo basal o glicosilacin tambin se han estudiado [87, 98]. En el fondo 630, FliC y FliD
mutantes fueron ms virulentos que el Parental. In vitro, estos mutantes produjeron
mayores cantidades de toxina resultando en una mayor citotoxicidad en diferentes lneas
celulares [95]. La mayor citotoxicidad fue confirmada por un estudio independiente y se
relacion con un aumento de la expresin de tcdA, tcdB y tcdR en el mutante fliC. En
contraste, el fliA (sigD) mutante mostr una disminucin de la toxina transcripcin asociada
a una disminucin de la citotoxicidad en las clulas de fibroblastos humanos [98]. La
relacin entre la expresin de operones flagelares y la produccin de toxinas en la cepa 630
se ha analizado ms a fondo: el factor sigma FliA / SigD activa directamente la expresin de
tcdR dirigiendo la enzima ncleo de ARN polimerasa para reconocer el promotor tcdR y
activar su transcripcin. TcdR a su vez activa la transcripcin de tcdA y tcdB [99, 100].
Adems, fliA / sigD est bajo el control del segundo mensajero c-di-GMP. Al igual que en
muchas otras bacterias, C. difficile utiliza un tipo I riboswitch para regular la transcripcin
de la protena flagelar opern para controlar la motilidad en respuesta a c-di-GMP
sealizacin [82,83]. Al sobreproducir una enzima implicada en la sntesis de c-di-GMP,
Purcell y coll. Demostraron que los altos niveles de c-di-GMP intracelular se asociaron con

una disminucin de la transcripcin de los genes flagelares y la motilidad bacteriana

reducida [101].
En el contexto R20291, el mutante fliC conduce a la muerte del 70% de ratones monoasociados de C. difficile, en comparacin con ninguno para la cepa parental, aunque ambas
cepas expresaron cantidad similar de toxinas, tanto in vitro como in vivo [97 ]. Hasta la
fecha, no se ha propuesto ninguna explicacin para la hipervirulencia del mutante fliC
R20291, pero se puede hipotetizar una modulacin del papel proinflamatorio de los flagelos
a travs de su interaccin con el TLR5.
La flagelina de varios patgenos bacterianos es capaz de desencadenar una respuesta
inflamatoria a travs de la interaccin flagelina-TLR5. De hecho, la flagelina de C. difficile
indujo la activacin de NF-kB a travs de la interaccin TLR TLR5 en clulas transfectadas
HEK. La flagelina de C. difficile tambin indujo la activacin de la protena quinasa activada
por mitgeno p38 y promovi la produccin de interleucina-8 y CCL20 en clulas epiteliales
intestinales [102]. El desencadenamiento de la respuesta inmune por flagelos de C. difficile
se evalu tambin mediante la produccin de citoquinas proinflamatorias de la lnea celular
de macrfagos THP-1 despus de la incubacin con flagelos de diferentes cepas; En este
estudio, la produccin de citoquinas pro-inflamatorias fue independiente de la cepa de la
que se derivaron los antgenos, lo que sugiere que los flagelos pueden no estar
relacionados con la variada virulencia de las cepas [53].
Se recomienda acudir a una reciente revisin exhaustiva de los flagelos para ms
informacin [103].

Tipo IV pili
Los pili de tipo IV son apndices de superficie implicados en muchos fenotipos en bacterias
Gram-negativas incluyendo adhesin, agregacin celular y formacin de biofilm.
El genoma de C. difficile muestra un grupo de genes (CD630_35030 a CD630_35130) que
codifican todas las protenas suficientes para la formacin de pilus tipo IV y que parece
estar presente en todas las cepas. El pili tipo IV de C. difficile es probable que se expresen
in vitro y sin duda se expresan in vivo en un modelo de hmster, como lo demuestra el
marcaje inmungeno del componente PilA. El componente PilA1 (CD630_35130) se ha
identificado como la pilina principal y el gen codificador muestra una variabilidad gentica
sustancial que sugiere diversificacin de los eptopos expuestos en respuesta a la presin
inmune del husped. El papel del pili del tipo VI en la fisiopatologa de C. difficile es todava
hipottico. Sin embargo, est involucrado en la autoagregacin bacteriana a altas
concentraciones de c-di-GMP, ya que se ha identificado un riboswitch c-di-GMP de tipo II
antes de los genes pilA1; Por lo tanto, una concentracin intracelular alta de c-di-GMP
induce la transcripcin del opern de longitud completa y la formacin de estructuras de
tipo pilus.

En consecuencia, puede plantearse la hiptesis de que la regulacin inversa de la motilidad

y la autoagregacin promueve la formacin de biofilm.
2.5. Biofilm: un papel en la colonizacin del husped?
C. difficile es capaz de formar un biofilm en superficie abitica, pero su robustez vara entre
cepas (cepas de laboratorio y aislados clnicos). Las bacterias estn embebidas en una
matriz compuesta de ADN, polisacridos y protenas, incluyendo varias Cwps y toxinas,
especialmente la toxina A. La formacin de biofilm de C. difficile ha demostrado ser
modulada por reguladores centrales tales como Spo0A y LuxS y por la superficie
Componentes tales como los flagelos y la cistena proteasa Cwp84. El segundo mensajero
c-di-GMP regula positivamente la formacin de biofilm, y un aumento del nivel de c-di-GMP
intracelular en la cepa 630 resulta en un biofilm ms robusto.
Mientras que se han acumulado fuertes evidencias sobre la capacidad de C. difficile para
formar un biofilm in vitro, la formacin de biofilm por C. difficile in vivo permanece menos
clara. Hasta la fecha, pocas observaciones apoyan esta hiptesis: en un modelo de ratn,
se han observado grupos de C. difficile en estrecha asociacin con tejido daado, lo que
podra sugerir la formacin de microcolonas; Estudios en el hmster y el modelo de ratn
monoxnico inform de agregacin o agrupaciones de clulas C. difficile, respectivamente.
Recientemente, se ha demostrado que C. difficile reside en comunidades multicelulares en
asociacin con la mucosa del husped. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para
definir con mayor precisin el papel de la formacin de biofilm en CDI y sus recurrencias.
De hecho, se ha demostrado que los biofilms aumentan la resistencia de las clulas de C.
difficile a los antibiticos, as como al estrs del oxgeno y promueven la persistencia de la
bacteria como esporas resistentes.
3. Toxinas de Clostridium difficile
3.1. Toxinas A y B
Los principales factores de virulencia de C. difficile son dos toxinas, la toxina A (TcdA) y la
toxina B (TcdB). Estn codificados por los genes tcdA y tcdB, respectivamente, que estn
localizados dentro de una regin conocida como locus de patogenicidad o PaLoc, junto con
otros tres genes: tcdR codifica un factor sigma de RNA polimerasa alternativo que activa
directamente la expresin gnica de la toxina; TcdE codifica un putativo holin implicado en
la liberacin extracelular de la toxina, al menos en altas cepas productoras de toxina; El
papel de la protena codificada por el tercer gen, tcdC, es menos claro. Se ha propuesto
como regulador negativo de la sntesis de TcdA y TcdB, debido a i) la relacin inversa entre
su transcripcin y la de los otros genes PaLoc y ii) la aparicin de linajes hipervirulentos
cuyas cepas producan altos niveles de toxina y Llevaban modificaciones en el gen tcdC.
Sorprendentemente, se ha demostrado recientemente que el PaLoc puede ser transferido
horizontalmente a cepas no patgenas. Tambin debe tenerse en cuenta que la expresin
de las toxinas TcdA y TcdB est regulada con precisin por las condiciones ambientales y los
reguladores globales [revisado en. La expresin de TcdA y TcdB es regulada hasta in vitro al
final de la fase exponencial, y se demostr que Estar bajo el control de la concentracin de
c-di GMP. In vivo, hemos demostrado en un C. difficile-monoasociado ratn modelo, que la
expresin de TcdA y TcdB es up-regulado tarde post-desafo.
La estructura y el mecanismo de accin de TcdA y TcdB han sido revisados en detalle en
otros lugares y estn fuera del alcance de esta revisin. Brevemente, TcdA y TcdB son
protenas de 308 y 270 kDa, respectivamente, con 49% de identidad y 63% de similitud.
Pertenecen a la familia de grandes toxinas clostridiales (LCT) y comparten una estructura
de dominio ABCD similar. El dominio A (para "Actividad") es el dominio N-terminal de la
glucosiltransferasa; El dominio B (para "Binding") est situado en la parte C-terminal de la
protena y muestra oligopptidos repetitivos combinados (CROP); El dominio C (para
"Cutting") consiste en un dominio de proteasa de cistena implicado en el
autoprocesamiento de toxinas y el dominio D (para "Entrega") corresponde a la regin
hidrofbica interna. En consecuencia, la accin de la toxina implica cuatro etapas
principales: 1 - endocitosis mediada por el receptor mediada por el dominio B; 2-

translocacin de un dominio cataltico a travs de la membrana que implicaba el dominio D;

3 - liberacin del resto enzimtico una vez que la toxina se internaliza en clulas husped
por procesamiento autoproteoltico (dominio C) promovido por el hexacisfosfato de inositol
celular [para una revisin, vase [132]]; 4 por glucosilacin de GTPasas de la familia de
protenas Rho (dominio A).
De hecho, los objetivos de la actividad enzimtica de TcdA y TcdB son las GTPasas de la
familia Rho y Ras dentro de las clulas husped, que desempean un papel clave en una
serie de procesos celulares vitales incluyendo la adhesin cellecell y el mantenimiento del
citoesqueleto. TcdA y TcdB inactivar la familia Rho GTPasas Rho, Rac y Cdc42, dando lugar a
la alteracin de la actina citoesqueleto. Las toxinas causan el redondeo de las clulas, la
interrupcin de las uniones estrechas y el deterioro de la funcin de la barrera intestinal, as
como la muerte celular por apoptosis o necrosis. La prdida resultante de la funcin de
barrera del epitelio intestinal conduce a la acumulacin de lquido y dao intestinal severo.
Las toxinas tambin estimulan la liberacin de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, IL1b, TNF-a, IL-8) a partir de clulas epiteliales y clulas inmunes mucosas residentes, que
causan influxo de neutrfilos y conduce a una destruccin adicional del revestimiento
intestinal. Revisin, ver [133] y [134]].
Los dominios de C-terminal CROPs de las dos toxinas merecen consideracin durante
mucho tiempo. Se pens que forman el motivo que se une a los restos de azcar en la
superficie de las clulas husped e induce endocitosis mediada por clatrina de las toxinas.
Adems, los dominios CROPs mostraron la mayor diversidad en secuencia entre TcdA y
TcdB; Especialmente, el dominio CROPs en TcdB es considerablemente ms corto. En
consecuencia, se cree que las toxinas unen receptores diferentes en clulas diana. Se ha
identificado una glicoprotena 96 asociada a la membrana humana (gp96) como un
receptor TcdA putativo en un experimento de reticulacin con colonocitos HT-29, pero no se
ha definido el dominio de interaccin preciso con TcdA. Varios estudios han informado
desde entonces que el dominio de los CROPs de las toxinas es dispensable por su
citotoxicidad de acuerdo con la lnea celular probada. Pueden existir vas alternativas de
internalizacin, que son independientes de la interaccin de los CROPs.
Recientemente, dos receptores para TcdB se han caracterizado por el uso de estrategias de
mutagnesis de seleccin de clones de clulas TcdB resistentes aplicadas a diferentes
lneas celulares. Se ha demostrado que el proteoglucano 4 de sulfato de condrotino, un
antgeno de superficie celular que se cree que est presente en el intestino humano,
interacta con el dominio C-terminal no CROPs. Sorprendentemente, los ratones knock-out
para el gen homlogo (NG2) fueron tan susceptibles a CDI como ratones de tipo salvaje
mientras que los niveles plasmticos de IL-8 aumentaron significativamente ms en ratones
de tipo salvaje que en NG2-nulo. Esto sugiere que la alternativa TcdB clulas de las vas de
interaccin puede existir in vivo. El receptor tipo poliovirus 3 (PVRL3) se ha informado
entonces como un factor celular necesario para la citotoxicidad mediada por TcdB,
unindose tambin fuera del dominio de los CROPs. Por lo tanto, diferentes formas de
captacin celular podran permitir que las toxinas ingresen a un repertorio ms amplio de
tipos celulares que conduce a la patognesis multivariada observada de C. difficile. En
consecuencia, Schorch y coll. Propuso un mecanismo de doble receptor para grandes
toxinas clostridiales mediante las cuales el dominio de las CROFAS permite que la toxina se
atraque sobre la superficie de la clula interactuando con oligosacridos, seguido por la
unin de la toxina a un receptor de alta afinidad.
Adems, la toxina TcdB de las cepas 027 es ms citotxica en varias lneas celulares que la
toxina de cepas histricas debido a variaciones dentro del dominio de unin C-terminal.
Esto se ha relacionado con la capacidad de entrar en las clulas ms rpidamente y con un
autoprocesamiento ms eficiente de TcdB.
Ambas toxinas inducen el redondeo en una amplia gama de tipos celulares. Aunque TcdA y
TcdB tienen el mismo mecanismo general de accin, albergan varias diferencias fenotpicas.
El papel relativo de cada toxina en la fisiopatologa del CDI ha sido desde hace mucho
tiempo un tema de debate. En el modelo de hmster, se ha demostrado que ambas toxinas
actan en concierto para producir sntomas de la enfermedad: TcdB se considera la

citotoxina ms potente, mientras que TcdA es altamente enterotxico. In vitro, el TcdA tiene
un papel importante en la lesin inicial que conduce a la prdida de la funcin de barrera
en clulas de cultivo Caco-2 y favorece la migracin paracelular bacteriana a travs de
enterocitos HT-29. Adems, a concentraciones bajas (relevantes para el fisiolgico al inicio
de la infeccin), TcdA promueve la alteracin del componente de la membrana plasmtica y
la distribucin del receptor que podra mejorar la unin bacteriana a las clulas.
En humanos, la mayora de las cepas que causan el CDI expresan las dos toxinas, pero las
cepas naturales que no pueden producir la toxina A tambin podran ser patgenas [1]. La
disponibilidad de herramientas genticas llev a algunos equipos a realizar estudios con
knock-out mutantes de tcdA y tcdB generados en 630 cepas derivadas, pero mostraron
resultados desafortunadamente en conflicto [151, 152] (Tabla 3]. En los dos primeros
estudios, los mutantes tcdA, que expresan slo TcdB, conservaron virulencia total en el
modelo de hmster. Sin embargo, en un estudio, los mutantes tcdB perdieron
completamente su virulencia, mientras que en el segundo estudio, el mutante tcdB condujo
a la muerte del hmster, aunque con una tasa ms lenta. Esta discrepancia mayor no pudo
explicarse de manera convincente por los mtodos utilizados para generar el mutante de
insercin, ya que el sitio de insercin era bastante equivalente, situado dentro del dominio
cataltico de ambas toxinas en los dos estudios. Tampoco podra el modelo animal, similar
en los dos estudios, explicar plenamente esta diferencia, aunque las caractersticas
particulares sutiles de hmsters debido a diferentes proveedores de animales pueden
explicar los resultados de la infeccin diferentes. Se ha asumido que los resultados
discrepantes podran estar relacionados con las cepas parentales utilizadas. La cepa
parental empleada en ambos estudios fue un derivado susceptible de eritromicina de la
cepa 630, mostrando diferencias fenotpicas, por ejemplo, en motilidad, ejemplificada por
varios SNPs. A continuacin, se realiz el anlisis de los mutantes tcdA, tcdB y cdtA por
separado o en combinacin en el fondo gentico 027 (cepa R20291). Kuehne y coll.
Confirm que el mutante que produce slo la toxina A retiene virulencia, aunque los
hmsters sucumbieron a CDI ms lentamente que cuando se les desafi con cepa o cepa
WT que produce slo TcdB. Debe observarse que todas las cepas ensayadas tenan una
capacidad de colonizacin similar. Por ltimo, un estudio reciente, utilizando tres modelos
animales diferentes, ha confirmado el importante papel de TcdB en CDI y el severo dao de
tripa causado por esta toxina, junto con una respuesta proinflamatoria [154].
3.2. Toxina binaria
La toxina binaria de C. difficile se identific por primera vez en una cepa 027 no epidmica
histrica y pertenece a la familia de toxinas clostridiales ADP-ribosilantes, cuyo modelo es
la toxina iota de Clostridium perfringens. Se compone de dos subunidades, la subunidad
cataltica CDTa que muestra una actividad de ribosiltransferasa ADP especfica de actina y
el componente de unin a CDTb. Los genes cdtA y cdtB que codifican las dos subunidades
se localizan en el locus cdt junto con cdtR que codifica una protena reguladora positiva. El
dominio C-terminal de CDTb muestra un dominio de unin para el receptor de lipoprotena
estimulada por liplisis (LSR), una protena transmembrana de tipo I con un dominio N
terminal extracelular compuesto por una regin no caracterizada en el extremo N seguido
por una V -tipo de dominio. La LSR se expresa principalmente en el hgado, pero tambin en
el intestino y otros tejidos. CDTb interacta con Ig-como el dominio de los aminocidos
757e866 y esta interaccin induce agrupacin de LSR en balsas de lpidos. Los siguientes
pasos que conducen a la captacin de CDTa en las clulas husped y su liberacin en el
citosol celular se proponen de acuerdo con el modelo actual de la absorcin de toxina de C.
perfringens iota: una vez en la clula, la subunidad cataltica CDTa ADP-ribosilatos G actina
En la arginina 177, causando as la inhibicin de la polimerizacin de actina y la destruccin
del citoesqueleto de actina, el redondeo de las clulas y, finalmente, la muerte celular
[revisado en 160]. Sin embargo, a dosis bajas, la toxina binaria induce la formacin de
protuberancias en la superficie de las clulas epiteliales que aumentan la adherencia de C.
difficile in vitro a las clulas Caco-2 e in vivo en un modelo de ratn de infeccin tambin.
La microscopa electrnica de barrido revel que las bacterias estn incrustadas en estas
protrusiones de membrana basadas en microtbulos. Estudios recientes indican que estas
protrusiones inducidas por CDT contienen vesculas de trfico y retculo endoplsmico,

permitiendo el reencaminamiento de vesculas que contienen fibronectina desde la

superficie basal a la superficie apical de las clulas epiteliales intestinales, donde se forman
las protuberancias. La fibronectina liberada mejora la adherencia de las bacterias, y los
experimentos con animales demostraron la relevancia de este mecanismo in vivo.
El papel de la toxina binaria en la virulencia sigue siendo un tema de debate. Se ha
demostrado que las cepas de origen natural que expresan slo CDT no son virulentas en un
modelo de hmster.

La toxina binaria se encuentra en alrededor del 20% de las cepas en situaciones no brote
pero los genes codificantes estn siempre presentes en algunos PCR ribotypotypes
epidmicos, tales como cepas 027 y 078. Hasta la fecha, se supone que la presencia de la
toxina binaria est positivamente correlacionada con los resultados severos de CDI, por lo
que la toxina binaria podra potencializar la toxicidad de TcdA y TcdB y conducir a una
enfermedad ms grave [revisado en.] En apoyo de esta idea, Estudios de la insercin de la
toxina 027 mutante por Kuehne y coll. Mostr que la virulencia completa de un mutante
tcdB se restableci cuando expres la toxina binaria adems de la toxina A (Tabla 3).
Curiosamente, el doble tcdA y tcdB mutante de insercin, expresando slo la toxina binaria,
conserva cierta virulencia en los hmsters: un tercio de los animales sucumbieron a CDI,
aunque los sntomas clnicos no eran tpicos de CDI, afectando ms bien al intestino
delgado.
Adems, cinco casos de CDI probablemente relacionados con TcdA-TcdB CDT cepas se han
descrito recientemente en Francia.
4. Conclusin
El conocimiento creciente sobre los factores de virulencia de C. difficile y su interaccin
permite hacer algunas hiptesis sobre la fisiopatologa del CDI.
Despus de la germinacin de las esporas, probablemente en el lumen intestinal, las
bacterias necesitan para contrarrestar la primera lnea de defensas del husped, como la
produccin de CAMP y lisozima, por la media de la modificacin de la pared celular. Las
bacterias flageladas luego interactan con la capa de moco y pasan por ella. Una vez en
contacto con las clulas del epitelio, por la media de adhesinas tales como protenas SLP u
otros MSCRAMMs, se puede plantear la hiptesis de que los flagelos estn regulados
negativamente, se producen toxinas, incluso en cantidades bajas, y esto puede conducir a

la disrupcin temprana del husped Unin de celdas. Como resultado, C. difficile podra
migrar al polo basolateral de las clulas epiteliales donde se une fuertemente a los
receptores celulares oa las protenas ECM presentes en la membrana basal, como el
colgeno o la fibronectina. La apertura de las uniones estrechas promueve la interaccin de
la flagelina con TLR5. La produccin de enzimas proteolticas a lo largo de la infeccin
puede promover la propagacin bacteriana despus de la degradacin de los componentes
de ECM y la destruccin de la integridad del tejido. Concomitantemente, las bacterias se
multiplican y producen ms factores de virulencia incluyendo las toxinas, dando como
resultado una infeccin creciente.
Datos recientes proporcionan evidencia de que el aumento en la concentracin de una
pequea tiolactona conduce a un aumento de la concentracin de c-di-GMP. Como se ha
descrito anteriormente, el nivel de c-di-GMP regula de forma inversa, por un lado, la
produccin de flagelos y toxinas, y por otro lado, la produccin de varias adhesinas. Por lo
tanto, el momento correcto de expresin de los factores de virulencia de C. difficile, crucial
para el xito de la infeccin, podra estar bajo el control de la deteccin de qurum, como
en muchas otras bacterias patgenas.
Muchas gracias al Dr. S. Jouveshomme y al Dr. T. Candela por su ayuda en la redaccin del
manuscrito.

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