DISEO DE PRIMERS PARA PCR

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una tcnica que ha

revolucionado el modo de manipular, clonar y detectar fragmentos de ADN, lo que
le ha valido a su descubridor K. B. Mullis el Premio Nobel. Despus de su
descubrimiento en 1983, se ha convertido en una de las tcnicas bsicas de
Biologa Molecular, ampliamente utilizada debido a su rapidez, especificidad,
flexibilidad y aplicabilidad. Entre sus aplicaciones generales encontramos la
generacin de sondas, clonacin, secuenciacin, diagnstico clnico y tipificacin
de individuos y microorganismos, siendo entonces muy utilizada en medicina
forense y en estudios filogenticos.
Un ciclo de PCR comienza con un calentamiento inicial que desnaturaliza el ADN
blanco a 94-95 C o ms. Este primer paso del ciclo dura en promedio 90 s a 3
minutos. En el siguiente paso del ciclo, la temperatura se reduce a un valor que
oscila en el rango de los 40 C a los 60 C. La sntesis de ADN se inicia cuando la
temperatura de la reaccin llega al valor ptimo para la actividad de la polimerasa.
Para la mayora de las polimerasas esta temperatura se encuentra en,
aproximadamente los 72 C. Luego se permite la sntesis durante 30 s a 2 min.
Este paso completa un ciclo y el siguiente ciclo se inicia con el retorno a los 9495C para la desnaturalizacin.
Todas estas aplicaciones dependen del empleo de parejas de cebadores o
primers, oligonucletidos que sirven de puntos de arranque de la actividad
polimerasa. En concreto, la extensin de los cebadores se da en su extremo 3'.
Por estas razones es deseable que los cebadores usados en una PCR cumplan
ciertas condiciones, todas ellas calculables desde su secuencia:

Deben tener longitudes de entre 19 y 25 nucletidos.

Deben ser ricos en contenido en GC.
El contenido en GC de los cebadores de la misma reaccin debe ser similar

Deben ser complementarios a las regiones deseadas, aunque admiten

degeneraciones.
Las temperaturas de fusin de los primers usados en la misma reaccin

deben ser similares, normalmente T_{m} > 58C.

Es requisito que las secuencias de los cebadores no formen horquillas
(hairpins) internas ni sean complementarias entre s.

Los primers se aaden en un vasto exceso comparado con el ADN blanco a ser
amplificado. Estos se hibridizan a las cadenas opuestas del blanco y se orientan
enfrentndose con sus respectivos terminales 3, de manera tal que la sntesis
llevada a cabo por la ADN polimerasa se extiende a travs de todo el segmento
del ADN blanco situado entre ellos. Recordemos que la enzima ADN polimerasa
cataliza el crecimiento de cadenas de ADN nuevas en la direccin 5 > 3 (Figura
1).

Figura 1. Funcionamiento general de los primers.

Durante el servicio social se estuvo trabajando en la estandarizacin de varios
juegos de primers que amplifican diversos genes, entre los cuales se encuentran

el Factor de Creciemiento Endotelial Vascular (VEGF), Factor Neurotrfico

Derivado del Cerebro (BDNF), Metaloprtoteasas de Matriz extracelular en
especifico la 2 (MMP-2). Esta estandarizacin consiste en variar las etapas de
alineacin y de extensin del ADN as como la concentracin de primers con el fin
de evitar la formacin de productos secundarios, al final se hace la PCR y se corre
una electroforesis en gel de agarosa al 2% para ver el resultado final de dicha
estandarizacin (Figura 2).

Figura 2. Estandarizacin del BDNF, temperatura de alineamiento de 56-64 C y

una concentracin de Primers tanto Forward como Reverse de 0.10, 0.15, 0.25,
0,35, 0.50 nM. .
En general en esto consiste la estandarizacin y el diseo de primers para la
tcnica molecular de la PCR.
Para disear y analizar un par de primers para ser usados en una reaccin de
PCR contamos con varios programas entre los cuales se encuentran el Primer
Blast de NCBI, el DNA Club, Primer 3, entre otros.
Estos softwarers permiten especificar un gran nmero de variables y obtener
primers segn las indicaciones solicitadas. Adems permite agregar el nmero de
acceso de la secuencia, que se halla en las bases de datos internacionales.

Tambin permite discriminar las regiones de la secuencia que se deben incluir, las
que se deben excluir y el rango de tamaos del producto. Por otra parte, el
software incluye la posibilidad de especificar las caractersticas mnimas de los
primers deseados, como Tm, porcentaje de GC, mxima autocomplementariedad,
y otros parmetros. Tambin presenta las mismas facilidades si se est buscando
y analizando una sonda, por ejemplo, para utilizarse en trabajos de hibridacin.

REFERENCIAS

Rose,
T.,
Henikoff,
J.
&
Henikoff,
S.
(2003).CODEHOP
(COnsensusDEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer) PCR primer
design. Nucleic Acids Res., 31(13):3763-3766.
Centro de Ciencias Genmicas/UNAM, Mxico 2006, texto en PDF
disponible en : http://www.ccg.unam.mx/~contrera/bioinfo/node71.html.
Human
Genome
Maping
Project. Primer
Desing (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/MANUAL/faq/faq-primers.html).
Integrated
DNA
Technologies. Calculation
of
Tm
for
Oligonucleotides(http://www.idtdna.com/html/tech/tmcalc.html).