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NDICE
Pg.
I. OBJETIVOS 2
Objetivo general 2
Objetivos especficos2
V. REFERENCIAS BIBILIOGRFICAS 34
VI. ANEXOS 35
I. OBJETIVOS:
1.1 OBJETIVOS GENERALES:
- Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en
matraces, empleando una cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124,
evalundose el efecto de la fuente de carbono y la velocidad de
agitacin en la cintica de crecimiento y la produccin de etanol.
1
- Determinar la cintica de crecimiento de la biomasa
- Determinar la cintica de consumo de la fuente de carbono
- Determinar la cintica de generacin de etanol
- Determinacin del M, qs y los rendimientos del nutriente limitante
en clulas y en etanol, adems de las respectivas productividades en
clulas y etanol.
- Evaluar el valor del pH al inicio y al final de la cintica.
Macronutrientes C, N, Mg, K y P
2
Micronutrientes: Concentracin
Nutriente Zn, Ca, Fe, Cu, Co Peso
y (g)
(g/L) Mn
Extracto de levadura
Estado 3
Medio lquido 0.15
Peptona de casena 5 0.25
Agar 20 1
Extracto de malta 3 0.15
Xf =2 g/l
Condiciones de cultivo:
Temperatura : 30C
Velocidad de agitacin(Shaker) : 120 rpm
3
TABLA 02: Concentracin de Nutrientes para el medio de
activacin (30 mL)
Concentracin Peso
Nutriente
(g/l) (g)
Glucosa 10 0.3
xilosa 10 0.3
Extracto de
3 0.09
levadura
Extracto de malta 5 0.15
0.15
Solucin de sales 5 ml/L
ml
T: 30C, N: 120 rpm
% en % en Yx/s So S'o
Elemen
Nutriente P.M. Nutrien
to Clula (g/g) (g/l) (g/l)
te
C C5H10O5 150 46.57 48 0.52 3.49 3.49
C C6H12O6 180 46.57 40 0.43 4.19 8.38
N (NH4)2SO4 132 9.24 21.21 2.30 0.78 1.57
S (NH4)2SO4 132 0.55 24.24 44.07 0.04 0.08
K KH2PO4 136 2.75 28.68 10.43 0.17 0.35
4
P KH2PO4 136 2.5 22.78 9.11 0.20 0.40
(MgSO4.7H
Mg 246 0.3 9.87 32.90 0.05 0.11
2O)
(MgSO4.7H
S 246 0.55 12.99 23.62 0.08 0.15
2O)
Max =0.301
2 PREPARACIN DE MEDIOS:
5
formacin de productos y adems suministrar energa para la sntesis
de metabolitos y para el mantenimiento celular.
Diagrama 01
Matraz
-Nombre de
ROTULAR
cepa.
-Fecha.
Mechero bunsen Nombre del
ENCENDER Previamente desinfectado el
rea de trabajo con alcohol
de 96
6
Si los matraces tienen un
Los Matraces SOSTENER tapn de algodn, aflojar un
poco de manera que no est
muy apretado
Inculo
SEMBRAR Matraz estril
Inculo
Matraces en el caldo
MEZCLAR
sembrado
Diagrama 02
Agua destilada
MEDIR En una matraz de
250 ml.
PREPARAR
CALENTAR
AGREGAR
COLOCAR
ENFRIAR
AGITAR
En un Mechero Bunsen
(lograr una coloracin
celeste),
Constantemente con un
varilla por un minuto
(aparicin de la primera
burbuja).
6-7 ml de la mezcla en
caliente a cada tubo de
ensayo, con pipeta de 10
ml.
En un vaso precipitado, y
llevarlos a la olla a presin
(auto clave).
121 C / 20 min
Diagrama 03
Componentes para el medio
PESAR
de la tabla N02
Por separado.
- Extracto de levadura en una
ESTERELIZAR matraz.
- Glucosa en un matraz de
125 ml.
- Las sales en un tubo de
8
ALISTAR El volumen de las sales
minerales.
EL pH a 7 de la solucin
AJUSTAR que contiene glucosa y
xilosa.
ESTERELIZAR 121C 15
MEZCLAR
Diagrama 04
SOMETER
El Asa Bacteriolgica al fuego del mechero hasta el rojo vivo.
2.2 CULTIVO DEL M.O, MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL,
ETC.
ENFRIAR
2.2.1 Resiembra celular (Solido - slido Por
) unos segundos
a Materiales y equipos:
Aza bacteriolgica
EXTRAER
Una Tubo
dedel
azada ensayo conEnsayo
Tubo de medio que
slido donde se
contena lasencuentra el M.O.
clulas desarrolladas en medio s
Mechero Bunsen, trpode y rejilla.
b Procedimiento:
RESEMBRAR
En tubos de ensayo preparados con medio slido (Agar)
b Procedimiento:
TOMAR
Una azada de la cepa incubada en medio slido Pichia stipitis NRRL Y-712
TAPAR
El Matraz con un tapn de gasa y algodn.
Hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado por
el incremento en la turbidez del medio.
LLEVAR Al Shaker a 120rpm, T = 35 C y un t = 24
11
2.2.3 Determinacin de la cintica de crecimiento de la biomasa
(ESPECTOFOTOMETRO)
a Materiales y equipos
Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentacin
Espectrofotmetro
pH metro
Gasa y algodn
Centrifuga
INOCULAR
30ml de caldode(medio
Tubos ensayorico + biomasa) a un matraz de 1L contenido 270ml de medio
Capachos de papel aluminio
A partir de este paso se determinar la cintica de crecimiento de la biomasa.
b Procedimiento:
EXTRAER Una muestra de 5ml del caldo.
VERTER Y GUARDAR
El sobrenadante
12 en viales y ponerlos en refrigerador
b Reactivos:
Muestra del medio.
Agua destilada.
c Procedimiento:
TOMAR Volumen
conocido
RESUSPENSE Sobrenadante
ELIMINAR Sobrenadante
REDISOLVER Precipitado
SECAR Estufa: 80 C
hasta peso
constante
2.2.5 Determinacin de azcares reductores: mtodo del DNS (cido
dinitrosaliclico)
a Materiales y equipos:
Espectrofotmetro.
Agitador magntico.
Mechero bunsen.
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Balanza analtica
Esptula.
Papel aluminio capachitos.
2 Vasos de precipitado de 1 litro
Matraz de aforo de 1 litro.
Pipeta.
Gradilla.
b Reactivos:
c Procedimiento:
Agua ENFRIAR
destilada
10
volmenes
AADIR
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Absorbancia a 540
LEER nm blanco: agua
destilada
CINTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES
Plan de Muestreos y Registro de Datos
Grupo: A3
Da de la experiencia:
Micro-organismo:
Fuente Carbono: ..pH T
C.. N rpm
TIEMPO Absorbancia Nombre del
N HORA Observaciones
(horas) (640 nm) alumno
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III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:
III.1. PREPARACIN DE MEDIO SLIDO DE
MANTENCIN
a. Materiales y Equipos:
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Mechero Bunsen: Se utiliza para
calentar, fundir o evaporar
sustancias. La llama del mechero
que arde correctamente es
transparente y tiene un matiz
azulado.
b. Reactivos y nutrientes:
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Extracto de levadura:
Es un excelente estimulador del
crecimiento de bacterias, es utilizado en
la preparacin de medios de cultivo
microbiolgicos. Extracto de Levadura es
la parte soluble en agua
de autolisis levadura que es
cuidadosamente controlada para
Extracto de malta
Peptona
a. Materiales y Equipos:
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Varilla de vidrio, pipeta y
Estufa: La estufa de secado es esptula
un equipo que se utiliza para
secar y esterilizar recipientes
de vidrio y metal en el
laboratorio. Se identifica
tambin con el nombre Horno
b. Reactivos y nutrientes:
Glucosa: es un Extracto de
azcar que est levadura: Es un
presente de excelente estimula
manera natural en dor del crecimiento
elementos tales de bacterias,
como las frutas o20 es utilizado en la
la miel. Las frutas preparacin
tambin poseen de medios de
otro tipo de azcar
cultivo
natural que se
Solucin de sales
a. Materiales y Equipos:
21
2 matraces de 125 ml
Matraz 1L.
b. Reactivos y nutrientes:
22
Extracto de levadura Agua destilada
EQUIPO DESCRIPCIN
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BALANZA ANALTICA
Marca: Adventurer
CENTRFUGA
Marca: P-Selecta
ESPECTROFOTMETRO
Marca: Sigma
Modelo: 2-16PK
Un espectrofotmetro es un instrumento
usado en el anlisis qumico que sirve
para medir, en funcin de la longitud de
onda, la relacin entre valores de una
misma magnitud fotomtrica relativos a
dos haces de radiaciones y
la concentracin o reacciones qumicas
que se miden en una muestra. Tambin
es utilizado en los laboratorios de
qumica para
la cuantificacin de sustancias y microor
ganismos.
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PHMETRO
Marca: Inolab
AGITADOR MAGNTICO
Marca: Thermolyne
Modelo: Maxi-mix II
- Fermentador:
Marca: Sartoriustedin
Capacidad: 2 litros
Partes: software, CPU, reactor.
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Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente
biolgicamente activo. En algunos casos, un biorreactor es un
recipiente en el que se lleva a cabo un proceso qumico que involucra
organismos o sustancias bioqumicamente activas derivadas de
dichos organismos. Este proceso puede ser aerbico o anaerbio.
Estos biorreactores son comnmente cilndricos, variando en tamao
desde algunos mililitros hasta metros cbicos y son usualmente
fabricados en acero inoxidable. Un biorreactor puede ser tambin un
dispositivo o sistema empleado para hacer crecer clulas o tejidos en
operaciones de cultivo celular. Estos dispositivos se encuentran en
desarrollo para su uso en ingeniera de tejidos.
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- OLLA A PRESIN (AUTOCLAVE)
27
MENU DE LLAVE DE
MANOMETRO
CONTROL SEGURIDAD
- REFRIGERADORA DOMESTICA
MARCA: PHILLIPS
DESCRIPCION: La funcin de una mquina de
refrigeracin es tomar el calor de un ambiente a
baja temperatura (en este caso un armario cerrado y
aislado trmicamente) y cederlo en el ambiente
exterior (para el refrigerador domstico sera la
cocina), empleando una fuente de energa externa
para mantener el proceso. Un refrigerador es una
bomba de calor (como las de agua, bombea calor de
un lugar a bajo nivel trmico a otro de mayor
nivel), impulsada generalmente por un motor elctrico. Es asimismo posible
emplear sales eutcticas o absorcin.
- ESTUFA ELECTRICA:
MARCA: P-SELECTA
MODELO: 209
DESCRIPCION: Equipo de 75 litros de capacidad,
con una cavidad de 500 x 400 x 400 mm, que
permite el secado de muestras en un rango de
temperatura til comprendido entre 0 y 200 C.
La estufa de secado se emplea para esterilizar o
secar el material de vidrio y metal utilizado en
los exmenes o pruebas, que realiza el laboratorio y que proviene de la
seccin de lavado, donde se enva luego de ser usado en algn
procedimiento. La esterilizacin que se efecta en la estufa se denomina de
calor seco y se realiza a 180 C durante 2 horas; la cristalera, al ser
calentada por aire a alta temperatura, absorbe la humedad y elimina la
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posibilidad de que se mantenga cualquier actividad biolgica debido a las
elevadas temperaturas y a los tiempos utilizados.
- INCUBADORA ELECTRICA
MARCA: P-SELECTA
MODELO: 206
DESCRIPCION: una incubadora es un dispositivo que
sirve para mantener y hacer crecer cultivos
microbiolgicos o cultivos celulares. La incubadora
mantiene la temperatura, la humedad y otras
condiciones en grado ptimo, tales como el contenido
de dixido de carbono (CO2) y de oxgeno en su
atmsfera interior. Las incubadoras son esenciales
para una gran cantidad de trabajos experimentales
en biologa celular, la microbiologa y en biologa
molecular y se utilizan para cultivos celulares, tanto
bacterianos como de clulas eucariotas.
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MEDIO NUTRIENTE
Solido de Extracto de levadura
Peptona de casena
mantencin
Agar
(PGY- Agar) Extracto de malta
Extracto de peptona
Peptona de casena
Activacin
K2HPO4
Glucosa
Glucosa
Xilosa
Fermentacin (NH4)2SO4 CUADRO
DE KH2PO4
MgSO4-7H2O
Solucin de sales
RESUMEN: REACTIVOS QUE UTILIZAREMOS
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31
I CRONOGRAMA DE ACTIVIDAFES Y/O TAREAS:
32
II REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
33
CH1,79 O0,6 N0,17
Peso % por
Cantida
ELEMENTO molecul Peso (g) element
d
ar o
C 12 1 12 46.57
H 1 1.79 1.79 6.95
O 16 0.6 9.6 37.25
N 14 0.17 2.38 9.24
TOTAL(g) 25.77
HALLANDO EL % EN NUTRIENTE:
PM del componentecantidad
%NUTRIENTE= X 100
PM del compuesto
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HALLANDO EL % S0:
Biomasa
So=
Y x /s
Dato:
C0= 10%Cf= 10% (2) =0.2
Cf-Co= biomasa=2-0.20=1.8
X
ln ( )
Xo
= Maxt
ln ( 0.22 )=0.301t
t=7.6 horas=7 horas ,36 min
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