CROMATOGRAFIA LIQUIDA

DE ALTA PERFORMANCE

Material de: ELECTROMEDICA PERUANA S.A.

Representante en Per de SHIMADZU

GILBERT RODRIGUEZ PAUCAR

 CAPITULO 1:

INTRODUCCION
 INTRODUCCIN
CROMATOGRAFIA (chroma-color y graphein-escribir)

Separar molculas: protenas

pptidos
aminocidos Mikhail Tswett
1906
lpidos
ADN/ARN, etc.

... en funcin de su diferente distribucin en dos FASES (siempre!):

F. MVIL: lquido
A gas

F. ESTACIONARIA: slida
B (SOPORTE) lquida
FASE FASE
MVIL ESTACIONARIA
 VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA

1. Cromatografa de capa fina (TLC)

2. Cromatografa de capa fina de alta performance
(HPTLC)
3. Cromatografa de Columna.
4. Cromatografa de Gases (GC)
5. Cromatografa Liq. de Alta Performance (HPLC)
6. Cromatografa de Fluidos Supercriticos (SFC)
7. Electroforesis Capilar (CE)
 VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA
1. TLC -- usado como instrumento cualitativo para la
separacion de mezclas simples donde la
velocidad, bajo costo y la simplicidad son
requeridas.

2. HPTLC -- para el analisis cuantitativo con alta carga

de muestra.

Equipo : Placas revestidas de varios tamaos dependiendo

de la aplicacin.
Tanque de desarrollo.
Accesorios Opcionales para deteccin.
 CROMATOGRAFA EN SUPERFICIE PLANA
CMARA
F. ESTACIONARIA
CROMATOGRFICA
(polar)

FLUJO
propiciado por
MUESTRA
CAPILARIDAD

FASE MVIL
FRENTE de avance del solvente (apolar)

distancia avanzada por la molcula

hidrofbica Rf=
distancia avanzada por el frente

Rf es caracterstico para cada soluto para

hidroflica una composicin dada de fase mvil y un
determinado tipo de superficie
 CROMATOGRAFA EN PAPEL
CLASE: Reparto
PROPIEDAD: Solubilidad
NOMBRE: Fase Normal

SOPORTE celulosa de papel de filtro

F. ESTACIONARIA (LQUIDA) H2O absorbida en la

celulosa.
F. MVIL (LQUIDA) Disolvente orgnico

H2O H2O
H2O H2O
H2O H- H2O
H-
H 2O H- H2O
H2O
H2O H2O

Molec. Hidroflica LENTA Molec. Hidrofbica RPIDA

Retenida por f.estacionaria Disuelta en f. mvil
 CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC)
CLASE: Interaccin
PROPIEDAD: Hidrofbica
NOMBRE: Interaccin Hidrofbica

SOPORTE plancha de metal o vidrio

F. ESTACIONARIA (SLIDA) slido pulverizado sobre

plancha de metal o vidrio. El ms usado es el gel de slica.

F. MVIL (LQUIDA) Disolvente orgnico

-Si-OH H-
-Si-OH
-Si-OH H-
-Si-OH
-Si-OH H-
-Si-OH
-Si-OH -Si-OH
-Si-OH -Si-OH

Molec. Hidroflica LENTA Molec. Hidrofbica RPIDA

Retenida por f.estacionaria Disuelta en f. mvil
 VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA
3. Cromatografa de Columna
-- normalmente se corre muestras que eluyen
bajo gravedad.
-- proceso lento que requiere grandes cantidades de
solventes.
-- Tiempo y esfuerzo se gasta para empacar la
columna.
packing

cotton wool/sintered glass

 CROMATOGRAFA EN COLUMNA
EMPAQUETADO APLICACIN
ELUCIN Y RECOGIDA DE FRACCIONES
COLUMNA MUESTRA

RESERVORIO
f. mvil
LECHO
CROMATOGRFICO
f. estacionaria

COLUMNA MUESTRA

FLUJO
gravedad

DIFUSIN
llave

SEPARACIN
 CROMATOGRAFA EN COLUMNA

PERFIL DE ELUCIN

FRACCIONES Molc. distribuida

en f.mvil
Molc. distribuida
en f.estacionaria

respuesta del detector

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ANLISIS DEL
CONTENIDO DE LAS
FRACCIONES

Espectrofotomtrico

Abs 280nm Protenas

Otras Abs - Colorantes 1 2 3 4 5 6 7 8 9

fraccin
 CROMATOGRAFA DE GEL FILTRACIN
CLASE: Reparto
PROPIEDAD: Tamao (y forma)
NOMBRE: Exclusin

SOPORTE Resina de micropartculas esfricas formadas por

polmeros hidroflicos (dextrano, agarosa poliacrilamida o
FASE MVIL
mezcla de ellos).

Tamaos de poro intrvalo o rango de fraccionamiento.

P.e. Sephadex G25: 1000 5000 Da

Sephadex G200: 5000 250000 Da
F. ESTACIONARIA
F. ESTACIONARIA (LQUIDA) solvente acuoso (el mismo
que el de la fase mvil) que se encuentra dentro de MICROPARTCULAS
micropartculas.

F. MVIL (LQUIDA) solvente acuoso que atraviesa la

columna por los espacios intersticiales (entre las
micropartculas).
 CROMATOGRAFA DE GEL FILTRACIN
Molec. GRANDES RPIDAS

* Avanzan con mayor velocidad a travs de los

espacios intersticiales (con F. mvil)

Molec. PEQUEAS LENTAS

* Son retenidas por las fibras de las

micropartculas y avanzan con menos velocidad
(con F. estacionaria).

PERFIL DE ELUCIN
APLICACIN grande
MUESTRA pequea
respuesta del detector
ELUCIN

1 2 3 4 5 6 7 8 9
fraccin
 CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO
CLASE: Interaccin
PROPIEDAD: Electrosttica
NOMBRE: Intercambio inico (aninico o catinico)

SOPORTE Resina de micropartculas formadas por

polmeros sintticos (poliestireno entrecruzado con
divinilbenceno o DowexR) o matrices de polmeros naturales
(dextranos, celulosas, agarosa). FASE MVIL

F. ESTACIONARIA (SLIDA) Grupos con cargas inicas

unidos al soporte.

Carga positiva (+) intercambiadores de aniones (-).

Carga negativa (-) intercambiadores de cationes (+).
F. ESTACIONARIA

F. MOVIL (LQUIDA) Solvente que anula la interaccin MICROPARTCULAS

electrosttica.

2 posibilidades: Gradientes de pH cambio de carga

de las molculas de la muestra.
Gradientes inicos competencia por
grupos electrfilos.
 CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO
Gradiente de pH
Gradiente salino Molec. MENOR CARGA (+) RPIDAS

* Son desplazadas ms fcilmente por la

f.mvil.

Molec. MAYOR CARGA (+) LENTAS

* Son retenidas por los grupos cargados

inicamente de la f. estacionaria.

PERFIL DE ELUCIN
q+
APLICACIN Q+
MUESTRA
respuesta del detector
+

Na+
ELUCIN

-
1 2 3 4 5 6 7 8 9
fraccin
 CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
CLASE: Interaccin
PROPIEDAD: Interacciones especficas entre dos molculas
P.e. hormona-receptor
protena-metal o cofactores como ATP
antgeno-anticuerpo
NOMBRE: Afinidad biolgica
FASE MVIL
SOPORTE Matriz de micropartculas hidroflicas sin carga,
con rigidez, inerte y estable (agarosa, acrlica).

F. ESTACIONARIA (SLIDA) Ligando especfico unido a

la matriz.

-- Comerciales: Concavalina A une glicoprotenas

Protena A une IgG (anticuerpos)
F. ESTACIONARIA
-- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz
MICROPARTCULAS
F. MVIL (LQUIDA) Solucin que anula o disminuye la
afinidad con el ligando de la fase estacionaria.

-- Solucin con el propio ligando Molcula + ligando libre

-- Solucin con algo que interacciona con el ligando - Molcula
 CROMATOGRAFA
DE AFINIDAD
Molec. NO INTERACCIN RPIDAS

* No se unen al ligando de la fase estacionaria.

Molec. INTERACCIN LENTAS

* Se unen al ligando de la f. estacionaria.

Elucin especfica.

PERFIL DE ELUCIN
ELUCIN
LAVADO ESPECFICA

molcula
respuesta del detector

APLICACIN
MUESTRA

LAVADO
ELUCIN 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ESPECFICA fraccin
 VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA
4. Cromatografa de Gases
-- Usado para compuestos voltiles o aquellos
que pueden ser vaporizados sin
descomposicin.
-- Fase Mvil es gaseosa (normalmente helio).
 VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA
5. Cromatografa Liquida de Alta Performance
 VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA
6. Cromatografa de Fluidos Supercriticos (SFC)
-- Usa un fluido supercrtico como eluyente.
-- La fase mvil mas comn es dixido de carb
-- La gradiente de elucion es controlada por
cambio de presion de la fase movil.

Area sombreada :
solid Rango Supercritico.
liquid

gas

Diagrama de Fase de un compuesto puro

 VENTAJAS DE LA
CROMATOGRAFIA

1. Anlisis simultaneo

2. Alta resolucion

3. Alta sensibilidad (ppm - ppb)

4. Volumen de inyeccion pequeo (1- 100ml)

 CAPITULO 2:

INSTRUMENTAL
HPLC
INSTRUMENTATION
 INSTRUMENTACION

Tres tipos de configuracion son posible :

SISTEMA ISOCRATICO

SISTEMA GRADIENTE BAJA PRESION

SISTEMA GRADIENTE ALTA PRESION

 SISTEMA ISOCRATICO

detector

columna
inyector
bomba horno

Sistema simple con 1 bomba y un

reservorio de 1 solvente. data
processor
Si mas de un solvente es usado, los solventes
son premezclados.
 SISTEMA ISOCRATICO

Sin embargo, el sistema isocratico alguna veces no da una

buena separacion y en estos casos, los sistemas de
gradientes son requeridos.
MeOH / H2O = 6 / 4 Long Analysis Time

Bad Separation
MeOH / H2O = 8 / 2

( column : ODS type )

 SISTEMA DE GRADIENTE
Sistema Isocratico
Razon de Mezclado Fijo (no cambia) durante
el analisis
Sistema de Gradiente
Razon de Mezclado Cambiante durante el
analisis
HPGE (Gradiente Alta Presion)
LPGE (Gradiente Baja Presion)
 Objetivo de la Gradiente
- Problemas en modo
isocratico-
En modo isocratico

Metanol / agua = 6 / 4
Largo tiempo analisis

Metanol / agua = 8 / 2
Pobre separacion

(Columna : tipo ODS)

 OBJETIVO DE LA GRADIENTE
- SOLUCION -

Cambio Gradual de la razon de mezclado durante

el analisis
95%

Concentracion de Metanol
en fase movil

30%
Corto tiempo analisis
&
Excelente separacion
 SISTEMA GRADIENTE
DE BAJA PRESION

Valvula de gradiente
Baja presion detector

columna
inyector
bomba Horno

Una bomba es usada

para controlar 4
reservorios; mezclado Procesador
es hecho antes de la De datos
bomba.
MODULO GRADIENTE LPGE
 SISTEMA GRADIENTE
DE ALTA PRESION
Procesador
datos

bomba
mezclador

columna detector
bomba inyector
horno

bomba
 COMPARACION ENTRE SISTEMAS
GRADIENTE DE BAJA Y ALTA

SISTEMA DE BAJA PRESION

Es el mas sencillo, solo una bomba es requerida
Desgasificador en-linea es obligatorio.

SISTEMA DE ALTA PRESION

Excelente precision de la gradiente
Sistema complicado (dos o tres bombas
requeridas) -- una bomba por solvente es usada.
Dependiendo de la sensibilidad requerida y el
detector usado, desgasificador en-linea puede no
ser un factor critico.
 DIAGRAMA DE UN HPLC

Inyector Horno
Detector
Columna
Degasificador

Bomba

Reservorio Waste
Procesador de
Datos
 PARTES DE UN SISTEMA HPLC

1. RESERVORIO DE SOLVENTE
Compuesto de:
Recipiente para solvente.
Filtro de succion para enviar el solvente a la bomba.
Los filtros de succion son de acero inoxidable,
material ceramico o de Teflon.
Una linea extra para desgasificacion si se usa desga-
Sificador de helio en linea.
PARTES DE UN SISTEMA HPLC

2. SISTEMA DE ENTREGA DE SOLVENTE

Performance deseable de una bomba :

Resistencia a Alta Presion

Fluctuacion de Baja Presion
Flujo Preciso
 PARTES DE UN SISTEMA HPLC

A. BOMBA JERINGA

Rellenar el solvente
Volumen
aprox. 1 L.
motor gearing

solvente
Sello
 PARTES DE UNS SISTEMA HPLC

Ventajas
No existe fluctuacion de presion
Libre de Mantenimiento

Desventaja
Debe detener el analisis para rellenar el
solvente
Muy dificil de reemplazar con otro
solvente
 PARTES DE UN SISTEMA HPLC

B. BOMBA DE EMBOLO RECIPROCANTE

motor cabeza

Valvulas
Check
embolo
Sello de embolo 10-100uL
PARTES DE UN SISTEMA HPLC

Ventajas
Fluctuaciones de Baja presion
Muy facil de reemplazar con otro
solvente.
Desventaja
Cambio de los sellos del embolo
 PARTES DE UN SISTEMA HPLC

LC-10AD
Sistema cabezal de doble micro embolo
Valvula check Volumen de golpe de embolo
: 10 uL
Volumen de valvula check
: 2 uL

Fluctuacion de Presion es
Cabeza de embolo causada por lenta
respuesta de la valvula
check.
 PARTES DE UN SISTEMA HPLC

LC-10AT / LC-10Ai
Doble embolo con flujo tandem
Sub embolo esta
trabajando como
mejoramiento de la
respuesta de valvula
check compensando la
caida de presion
Sub embolo (25uL)
Embolo principal (50uL)
 PARTES DE UN SISTEMA HPLC

Fluctuacion de baja presion

Nuevos diseos de valvula check
Sisstema Sub embolo
Alta durabilidad y mayor vida de sello
Velocidad de embolo adecuada
Pocos problemas por burbujas
Flujo Tandem
Mejorade la precision en el flujo de
gradiente de baja presion
BOMBA LC-10 AT
 Desgasificador
Los problemas causados por el aire disuelto en
la fase movil
Entrega de flujo inestable
Ruido y gran desviacion de linea base en la celda del
detector

Para evitar estos problemas, la fase movil debe

ser desgasificada.
 Desgasificador En linea
(DGU-10B / DGU-12A / DGU-14A)
Regulador Camara de Vacio

Helio

A Bomba
A Bomba

Valvula de Drenaje

Tipo purga de Helio Tipo Camara de Vacio

(tipo membrana)
Fase Movil

DGU-10B DGU-12A / DGU-14A

MODULO DESGASIFICADOR
DGU 14 A
INYECTOR MANUAL

Rheodyne Manual Injector

 INYECTOR MANUAL

Bomba Bomba

Columna
Columna

[INYECTAR] [CARGA]
 Horno de Columna
(CTO-10AVP / CTO-10ACVP / CTO-10ASVP)

Tipos de Horno de Columna:

Calentamiento con Circulacion de Aire
Bloque de Calentamiento
Bloque calentador deAluminio
Chaqueta de Calentamiento
 PARTES DE UN SISTEMA HPLC
HORNO DE COLUMNA - CTO-10A / CTO-10AC

Caracteristicas Basicas :

Rango de Temperatura : 4 a 80oC

Precision de Control Temperatura: 0.1oC
Se puede fijar un limite superior de temperatura
como un nivel de seguridad.
Sensor de fugas automaticalmente apaga el horno
cuando vapor de organicos son detectados.
Modulo de Horno de Columna
 Detectores
Detector Ultravioleta / Visible (UV/VIS)
Detector de Arreglo de Diodos (PDA)
Detector de Fluorescencia (RF)
Detector de Conductividad (CDD)
Detector de Indice de Refraccion (RID)
Detector Electroquimico (ECD)
Detector Espectrometro de Masas
Detector Evaporative Light Scattering
 UV/UV-VIS detector
(SPD-10AVP / SPD-10AVVP)
Celda C : Concentracion

Ein Eout

D2 / W Lamps
l

A
A = eCl = log (Eout / Ein)
(A : Absorbancia)
C
 DETECTOR UV VISIBLE

Celda de Muestra
Grating
l Ein Eout Fotodiodo

Ein Ein Fotodiodo

Celda de Referencia
Lampara D2 / W
 BAJO NIVEL RUIDO

4 2
dA=0.021AU
A1=-log(2/(4+0.1))=0.311
A=-log(2/4)=0.3 A2=-log(2/(4-0.1))=0.290
dA=A1-A2=0.021

2 1 dA=0.044AU

A1=-log(1/(2+0.1))=0.322
A2=-log(1/(2-0.1))=0.278
A=-log(1/2)=0.3
dA=A1-A2=0.044
 DETECTOR UV VISIBLE

A= eCl = - log (Eout / Ein)

Absorbancia

Rango lineal
1

Concentracion
 DETECTOR UV VISIBLE

Seleccion de longitud de onda

275 nm
208 nm

275 nm
208 nm
 Detector PDA (SPD-M10AVP)

Celda
Grating

D2 / W Lamparas
1 nm / elemento

512 fotodiodos
 Detector PDA (SPD-M10AVP)

Detetcor de Arreglo de Diodos: Especificaciones

Fuente de Luz : Deuterio y tungsteno

Rango de Long. Onda : 190 - 800 nm.
Capacidad de celda: 10 ml, longitud: 10 mm
Max. Presion de celda : 50 kgf/cm2
Reemplazo de lampara y celda por la parte frontal
Monitorea a tiempo real y cuantificacion hasta en
8 longitudes de onda.
 Datos obtenidos PDA

Espectro

Cromatograma
Absorbancia

Tiempo de Retencion
 Detector PDA (SPD-M10AVP)

Detector de Arreglo de Diodos

El pico puede ser identificado usando el espectro UV.
El chequeo de pureza de pico puede ser hecho.
-- superposicion de 3 espectros
-- ratio cromatogramas
-- comparasion del threshold y el indice de
similaridad.
Detector de Arreglo de
Diodos
Detector Fluorescencia (RF-
10AXL)
Long. De Onda de Excitacion

+ hn 1 *

* hn 2 +
Long. De Onda de Emision
Estado Excitado

Estado de Quasi-excitacion
hn 1
hn 2
Fluorescencia
Ground state
 Detector Fluorescencia (RF-10AXL)

Reactivos de Derivatizacion
OPA reactivo para aminas primarias
A
CHO
+ R-NH2 N-R
CHO A
o-phthalaldhyde
(OPA)
ADAM reactivo para acidos grasos
+ R-COOH
CHN2 CH2OCOR
9-anthryldiazomethane
(ADAM)
 Detector Fluorescencia (RF-10AXL)

ALGUNAS ESPECIFICACIONES DE RF-10AXL

Lampara : Xenon
Volumen de Celda: 12 ml
Max. Presion de tolerancia : 20 kgf/cm2
Monitorea la vida de lampara y la energia.
Rango long. de onda : 200 - 650 nm(std)
expandible a 750 o 900 nm con fotomultiplicador
opcional.
Detector Indice Refraccion
(RID-10A)

Fotodiodo
Referencia

Lampara W
Muestra
 Detector Indice Refraccion
(RID-10A)

Sistema Optico
 Detector Indice Refraccion
(RID-10A)

ALGUNAS ESPECIFICACIONES DE RID-10A

Fuente Luz: lampara tungsteno (20,000 h vida)

Flujo Max. seteable 20 ml/min
(150 ml/min con opcion)
Max presion: celda (20 kgf/cm2), valvula (4 kgf/cm2)
Temperatura Celda : 30-60oC
 Detector Indice Refraccion
(RID-10A)

Chromatograma de azucares
Condiciones Analiticas
Columna : Shim-pack CLC-
NH2
Fase Movil: Acetonitrilo /
agua = 7 / 3
Flujo : 1.0 mL/min
Temperatura : Ambiente
Picos
1. Glycerol
2. Xylose
3. Fructose
4. Glucose
5. Sucrose
6. Manose
7. Lactose
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD

Detector de Conductividad
V K (conductividad) = I [A] / E [V]
I =A [cm2] / L [cm] * k
(k : conductividad especifica)

A A k= (I/E)*(L/A)
L electrodo
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD

Detector de Conductividad
La conductividad es afectada por temperatura.
La celda debe tener un dispositivo control
temperatura.
 DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD

ESPECIFICACIONES DE CDD-6A

Volumen Celda: 0.25 ml

Tolerancia presion de Celda: 30 kgf/cm2
Temperatura settings : 33, 38, 43, 48
Temperatura del Horno debe ser ajustada a 3oC menos
que la temperatura de celda CDD.
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD

Cromatograma de Aniones en brine

Condiciones Analiticas
Columna : Shim-pack IC-A3
Fase Movil :
8.0 mM p-hydroxybenzoic acid
3.2 mM Bis-Tris *
Flujo : 1.5 mL/min
Temperatura : 40 C
Volumen de inyeccion: 100 uL
Picos
1. F (1.4 ppm)
2. Cl (10200 ppm)
3. NO2 (10 ppm)
4. Br (43 ppm)
5. NO3 (44 ppm)
6. SO4 (431 ppm)
Bis-Tris : bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane
 DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD

Chromatograma de Cationes en Agua Potable

Condiciones Analyticas
Columna: Shim-pack IC-C3
Fase Movil : 2.0 mM Oxalic
Acid
Flujo : 1.0 mL/min
Temperatura : 40 C
Volumen de Inyeccion: 100
uL
Picos
1. Na (8.25 ppm)
2. NH4 (0.01 ppm)
3. K (1.66 ppm)
4. Mg (2.22 ppm)
5. Ca (11.85 ppm)
 DETECTOR ELECTROQUIMICO

Electrodo
de trabajo
Electrodo
referencia

Electrodo AUX
 DETECTOR ELECTROQUIMICO

Cromatograma de Catecolaminas
Condiciones Analiticas:
Columna : Shim-pack CLC-ODS
Fase Movil :
80 mM phosphate buffer (pH=2.7)
100 mM NaNO3, 200 mg/l SOS
5 mg/l EDTA, 4 % acetonitrile
Flujo : 1.0 mL/min
Potencial Aplicada : + 0.8 V
Temperatura : 40 C
Volumen de Inyeccion : 10 uL
Picos
1. Noradrenalin ( 5 ppb)
2. Adrenalin (5 ppb)
3. Dopamine (5 ppb)
 COLECTOR DE FRACCIONES

COLECTOR DE FRACCIONES -- FRC-10A

Sistema de Fraccionamiento: con o sin valvula solenoide

Flujo Maximo : 150 ml / min
Cooler de muestra : disponible
Coleccin Automatica por ajuste de slope y/o nivel
Viales diferenciados por tamao para coleccion de
muestra
COLECTOR DE FRACCIONES
Sistema de Procesamiento de Datos
 CAPITULO 3:

BASE DE LA
SEPARACION
 PIEDRAS EN EL RIO

Piedra ligera Flujo de agua

Piedra pesada

base
Columna

Cromatgrafo Detector
 EL CROMATOGRAMA
Y SUS USOS

Los compuestos eluidos pasan a traves de los

detectores donde ellos son registrados como picos
y todo eso se llama cromatograma.
Compuesto 1 Compuesto 2
Seal
tR2
tR1

t0

w1 w2
tR1
Inyeccion de Muestra tR2
COMO MEJORAR LA SEPARACION
EN CROMATOGRAFIA

Dos fases estan involucradas en un proceso

cromatografico :

Fase Estacionaria
-- solido, poroso, material surperficie-activa en
en forma de particula pequea o una soporte
solido con una pelicula de liquido delgado.

Fase Movil -- gas o liquido.

 COMO MEJORAR LA SEPARACION
EN CROMATOGRAFIA
m = fase movil
s = fase estacionaria

Ref. V.R. Meyer

Practical High-
Performance Liquid
Chromatography

Representacion de una separacion cromatografica

COMO MEJORAR LA SEPARACION
EN CROMATOGRAFIA

-- La separacion es mejorada como resultado de las

diferencias de las interacciones entre las diferentes
compuestos con la fase estacionaria.

-- Para una buena forma de pico, un numero de

factores deben ser controlados, de otra manera,
un ensanchamiento de la banda podria ocurrir.
 Nomenclatura

Factor de Capacidad
Selectividad
Numero de Platos Teoricos
Altura Equivalente de Platos Teoricos
Selectividad
Resolucion
FACTORES DE CAPACIDAD (k)

Vr - V0
Vr k' =
V0
V0 Vr = volumen de retencion de un
pico de soluto
V0 = volumen muerto
pico solvente (pico no retenido)
Tiempos de Retencion
pueden ser usados en vez de
volumen.
FACTORES DE CAPACIDAD (k)

El tiempo de retencion es dependiente del flujo

y las dimensiones de la columna, por lo tanto no
es adecuado comparar los cromatogramas.

Factores de Capacidad es independiente de estos

factores y por lo tanto es preferido.

Valores de k entre 1 y 5 son preferidos.

FACTORES DE CAPACIDAD (k)

4.6 mmID x 250 mmL. (1.2 mL/min)

6 min (t1) k' = 2

2 min (t0)

4.6 mmID x 250 mmL. (0.6 mL/min)

12 min (t1) k' = 2

4 min (t0)
FACTORES DE CAPACIDAD (k)

6.0 mmID x 150 mmL. (1 mL/min)

6 min (t1) k' = 2

2 min (t0)

6.0 mmID x 300 mmL. (1 mL/min)

12 min (t1) k' = 2

4 min (t0)
FACTORES DE CAPACIDAD (k)

6.0 mmID x 150 mmL. (1.0 mL/min)

10 min (t1)
k' = 4
2 min (t0)

4.6 mmID x 250 mmL. (0.6 mL/min)

12 min (t1) k' = 2
4 min (t0)
 SELECTIVIDAD, a

La Selectividad es una
V indicacion del grado de
0
V1 separacion entre dos
V2 picos.

k'2 V2 - V0
Selectivity= =
k'1 V1 - V0
 SELECTIVIDAD, a

Dos compuestos no pueden ser separados si k

es exactamente el mismo.
Debe existir diferencia de selectividad, sino
ninguna separacion es posible (a =1).
Es afectada por la seleccin fase estacionaria y
fase movil.
 NUMERO DE PLATOS
TEORICOS, N

Rt Ecuacion :
N = 16 x ( Rt / W )2

Area Ecuacion Modificada para

mediciones actuales :
H N = 5.54 x ( Rt / W 1/2 )2
W1/2
H1/2 Ecuacion Modificada para
integrador :
W
N = 6.28 x (Rt x H / Area)2
 NUMERO DE PLATOS
TEORICOS, N

Las tres ecuaciones son adecuadas solo si el

pico es de forma Gaussiana.
Para picos asimetricos :
(tR/W0.1)2
N = 41.7 T + 1.25

donde W0.1 = ancho de pico a 10% de altura

y T = factor de cola
 NUMERO DE PLATOS
TEORICOS, N

N indica eficiencia de columna.

N=15000 N=3000

Columna con buena eficiencia Columna con mala eficiencia

 ALTURA EQUIVALENTE A
PLATO TEORICO, HETP

HETP = Longitud de Columna / N

Ecuacion de Van Deemter
HETP

Flujo optimo Cada columna tiene

Un flujo optimo.

Velocidad Lineal
 ALTURA EQUIVALENTE A
PLATO TEORICO, HETP

Paraobtener una buena eficiencia de

columna,
Estos ajustes son preferibles :

4.0 mmID 0.6 mL/min

4.6 mmID 0.8 mL/min
6.0 mmID 1.0 mL/min
 RESOLUCION

La calidad de una separacion es medida por la resolucion :

 RESOLUCION

Cuando los picos se superponen, la determinacion del

ancho de la base no es facil, por lo que la ecuacion se
modifica usando el ancho de pico a la mitad de altura :

(w2)1/2 H1/2
(w1)1/2 H

v2-v1
Rs = 1.18
(w1)1/2 +(w2)1/2
 RESOLUCION

a - k'
1
R = 4
a
1
N
k '-1

N : promedio de N1 y N2
k' : promedio de k'1 y k'2
 RESOLUCION

La resolucion minima requerida para

cuantificacion es 1.25.
Separacion de linea base es mejorada con Rs = 1.5.
1:1 1:4 1:16 razon Pico-altura

R = 0.8

R = 1.0

R = 1.25
 RESOLUCION

es una funcion de
Selectividad
Eficiencia de Columna
Factor de Capacidad
RESOLUCION
 RESOLUCION

Rs = 0.8 Rs = 1.0?? Rs = 1.25

Si los picos son triangulos, entonces pueden separarse a una Rs= 1.
Pero son de forma de distribucion Gauseana.
 RESOLUCION

Relacion Pico area

Rs 1:1 1:3 1:10 1:30 1:100

0.8 5.9% 5.0% (*)% (*)% (*)%

1.0 2.3 2.6 22.7 2.9 (*)
1.2 0.83 1.1 1.4 1.6 1.8
1.4 0.26 0.41 0.49 0.71 0.92
1.6 0.069 0.1 0.16 0.22 0.33
1.8 0.016 0.022 0.032 0.050 0.086
2.0 0.003 0.005 0.009 0.013 0.021
2.2 0.001 0.001 0.001 0.003 0.003
(*) un pequeo pico aparede solo como un hombro
 RESOLUCION

Initial
Uso de una columna mas
larga o de mejor performance
aumento N
Disminuir contenido de sol-
Vente organico para columna
aumento k*
ODS column.
Cambiar contenido organico,
pH, temperatura de la
cambio a
columna.
 RESOLUCION

Una mejora en resolucion puede ser realizado

ajustando el nivel optimo de flujo;

O por ajuste de temperatura pero acorta la vida

de la columna.
 FACTORES QUE CAUSAN
ENSANCHAMIENTO DE BANDA
1. Difusion de Eddy
-- causa ensanchamiento de
banda.
2. Distribucion de Flujo
-- el flujo es mas rapido en el canal
Difusion de Eddy
central que en el area de la
particula.

Para reducir el ensanchamiento de

Banda estos dos factores, empaque
Distribucion de Flujo en lecho
de columna,debe tener una estrecha cromatografico
distribucion como sea posible.
 FACTORES QUE CAUSAN
ENSANCHAMIENTO DE BANDA

3. Difusion Molecular de la Muestra en la Fase Movil

Es importante si :
a. Fase estacionaria pequea ( < 10 mm)
b. Velocidad lenta de la fase movil

-- La velocidad de flujo de la fase movil debe ser

seleccionado de forma que la difusion longitudinal
sea evitado.
 FACTORES QUE CAUSAN
ENSANCHAMIENTO DE BANDA

Esto ocurre cuando u > 2Dm/dp

donde u = velocidad lineal

dp = diametro de particula

Dm = coeficiente de difusion
= 7.4 x 10-12 YM T
h x Vs 0.6
 FACTORES QUE CAUSAN
ENSANCHAMIENTO DE BANDA
4. Transferencia de Masa entre la fase movil, movil
estancado y la fase estacionaria
-- Para prevenir esto,
a. Particulas pequeas o estas con la pelicula, superficie porosa
debe ser usada como fase estacionaria.
b. Solventes de baja-viscosidad deben ser usados.
c. Alta velocidad de analisis se mejora a expensa de la resolucion
y vice-versa.

Estructura de Poro de
una particula de fase estacionaria
 CAPITULO 4:

MODOS DE
TRABAJO EN HPLC
 MODOS DE HPLC

Modo Fase Normal

Modo Fase Reversa
Modo Fase Reversa Apariamiento
Ionico
Modo Intercambio Ionico
Modo SEC ( GPC / GFC )
Modo separacion Quiral
MODO FASE NORMAL

Eter Petroleo Cromatograma

Clorofila Color

CaCO3

Desarrollado por
M.S. Tswett.
 MODO FASE NORMAL

Se uso la primera vez

CaCO3 para Columna de Separacion
Eter de Petroleo como Solvente

Esta combinacion se define como

Modo Fase Normal
Columna : propiedad polar
Solvente : propiedad no polar
 COLUMNAS DE HPLC
DE FASE NORMAL

Tipo Silica gel : uso general

Tipo Ciano : uso general
Tipo Amino : analisis de azucar
Tipo Diol : analisis de proteina
-Si-CH2CH2CH2CN
-Si-CH2CH2CH2NH2
Si -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
Si
Silica gel Si Modificado
 QUE INTERACCION?

Enlace Hidrogeno
No-polar

Silica gel (polar)

 ENLACE PUENTE HIDROGENO

Si la muestra tiene
-COOH : grupo carboxyl
-NH2 : grupo Amino
-OH : grupo Hidroxyl
Enlace puente hidrogeno llega ser fuerte.

Si la muestra tiene grupos voluminosos,

debido a impedimento esterico
Enlace puente hidrogeno llega ser debil.
 TIEMPO DE RETENCION Y
ENLACE PUENTE HIDROGENO

Fuerte
HO
SiOH
SiOH

Debil

OH
 AUMENTO DE
POLARIDAD DEL SOLVENTE

0% 2% 5% / MeOH

1 : Dioctyl phthalate
2 : Dibutyl phthalate Solvente:Hexano
3 : Diethyl phthalate
4 : Dimethyl phthalate
 COLUMNAS HPLC
DE FASE REVERSA

Tipo C18 (ODS)

Tipo C8 (octyl) Propiedad No-polar
Tipo C4 (butyl)
-Si-C18H35
Tipo Fenil
Tipo TMS Si
Tipo Ciano
 MODO FASE REVERSA

Columna : Propiedad No-polar

Solvente : Propiedad Polar

Agua / Metanol / Acetonitrilo

 QUE INTERACCION?

Interaccion
Hidrofobica Solvente polar

No-polar
 HIDROFOBICIDAD

Si la muestra tiene
CH3CH2CH2--- : Cadena carbonada Hidrofobicidad
: Grupo Aromatico
es fuerte.

Si la muestra tiene
-COOH : grupo Carboxyl
-NH2 : grupo Amino Hidrofobicidad
-OH : grupo Hydroxyl es debil.
TIEMPO DE RETENCION Y
HIDROFOBICIDAD
OH

C18 (ODS)
Weak

Strong
OH
 AUMENTANDO LA
POLARIDAD DEL SOLVENTE

20 % 30 % 40% / H2O

1 : p-Hydoxymethylbenzoate
2 : p-Hydoxyethylbenzoate Solvente : MeOH
3 : p-Hydoxypropylbenzoate
4 : p-Hydoxybutylbenzoate
 EFECTO DE LA
FASE ESTACIONARIA

C8

Mediana
C18 (ODS)
muestra
Fuerte
C4
muestra
Debil
muestra
 EFECTO DE LA
FASE ESTACIONARIA
Condiciones analiticas
ODS C8 TMS Columna : Shim-pack CLC-ODS
Fase mobil : MeOH : H2O = 7 :3
Flujo : 1.0 mL/min
Temperatura : 40 C
Volumen de Injeccion : 10 uL
Deteccion : UV-254 nm
Picos
1. Methyl benzoate
2. Ethyl benzoate
3. n-Propyl benzoate
4. n- Butyl benzoate
 FASE NORMAL VS REVERSA

Param etro Fase Norm al Fase R eversa

Polaridad de Colum na Alta Baja

Polaridad de Solvente Baja Alta

Secuencia de Elucion 1ero baja polaridad 1ero alta polaridad

Aum ento Polaridad Solvente Elucion rapida Elucion lenta

 FASE NORMAL VS REVERSA

Fase Normal
Buena separacion de estereo isomeros
(Vitamina E etc..)
Tiempo de retencion cambiante

Fase Reversa
Buena repetibilidad del tiempo retencion
Fase estacionaria robusta
CROMAT. DE FASE REVERSA
DE APAREAMIENTO IONICO

Ion-Pair Reagent
 REACTIVOS DE
APAREAMIENTO IONICO

Compuestos Anionicos
Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA)
Compuestos Cationicos
Butanesulfonic acid sodium salt (C4)
Pentanesulfonic acid sodium salt (C5)
Hexanesulfonic acid sodium salt (C6)
Heptanesulfonic acid sodium salt (C7)
Octanesulfonic acid sodium salt (C8)
Decanesulfonic acid sodium salt (C10)
 SEPARACION POR APAREAMIENTO
IONICO DE ACIDOS CARBOXILICOS

Column: Bonded C18

Mobile Phase: H2O/MeOH
1:1 with Tetrabutyl-
Ammonium Hydroxide
SEPARACION POR APAREAMIENTO
IONICO DE AMINO COMPUESTOS

Condiciones Analiticas
Columna : Shim-pack CLC-ODS
Peaks Fase Mobil phase : [A] : [B] = 9 : 1
1. Nicotinic acid 6. Thiamine [A]
2. Nicotinamide 7. Caffeine
3. Pantothenate 8. Folic acid 100 mM phosphate buffer (pH=2.1)
4. Pyridoxine 9. Biotin 0.8 mM sodium octane sulfonate
5. Riboflavin 10. Riboflavin [B] acetonitrilo
Phosphate
Flujo : 1.5 mL/min
Temperatura : 40 C
Volumen de Injeccion : 10 uL
 CONSIDERACIONES IMPORTANTES DE
APAREAMIENTO DE IONES

Tipo de reactivos Ion-Pair

Concentracion de reactivos Ion-Pair
Solvente de pH
R-COOH RCOO- + H+
(pKa=4.5)
R-NH2 + H+ R-NH3+
(pKa=6.0)
 TIPO DE REACTIVOS ION-PAIR

Sulfonato de Hexano Sulfonato de Pentano

Mobile Phase: H2O/MeOH

1:1,with 0.005M ion pairing
reagent and 1% HOAc

1 Maleic Acid
2 Phenylephrine
3 Phenylpropanolamine
4 Naphazoline
5 Phenacetin
6 Pyrilamine
CONCENTRACION DE
REACTIVOS ION-PAIR
MODO INTERCAMBIO IONICO

Fuerza de Atraccion Ionica

R
N+ R Muestra
R

+ + + + +
- +
SO3 Muestra +
+
+ + + + +
 MODO INTERCAMBIO IONICO

Campo Biologico
(analisis de proteina, peptidos, aminoacidos)
Cromatografia Ionica
Intercambiadores Cationicos
Intercamb Cationico Fuerte(SCX) (R-SO3 )
-
Intercamb Cationico Debil(WCX) (R-COO-)
Intercambiadores Anionicos
Intercamb Anionico Fuerte(SAX) (R4N+)
Intercamb Anionico Debil (WAX)
(DEAE)
ANALISIS DE PROTEINAS
USANDO COLUMNA WCX
Condiciones Analiticas
Columna : Shim-pack WCX-1
Fase Movil :
[A] 20 mM phosphate buffer (pH=6.0)
[B] A+0.25M sulfato de sodio
[A] - [B] 30 min gradiente lineal
Flujo : 1.0 mL/min
Temperatura : ambiente
Detector : UV-280 nm
Volumen de Injeccion : 10 uL
Picos
1. albumin
2. myoglobin
3. a -chymotrypsinogen A
4. liponuclease A
5. lisozyme
 CONSIDERACIONES IMPORTANTES
DE INTERCAMBIO DE IONES

pH de la solucion Buffer
Concentracion de la solucion Buffer
Metodo de Elucion
Isocratico
Gradiente pH
Gradiente aumento de fuerza ionico
 QUE ES SEC ?

Size Exclusion Chromatography

(SEC)
GPC (Cromatografia de Permeacion Gel)
En el campo polimeros
GFC (Cromatografia de Filtracion Gel)
En el campo biologico
 PRINCIPIO DE SEC

Ninguna Fuerza de Interaccion

Diferencia de Tiempo de Viaje
 RELACION ENTRE MW Y RT

Limite de Exclusion
Peso Molecular (LogMW)

Limite Permeacion
GPC
Columna

Tiempo
PRINCIPALES TIPOS DE
COLUMNAS DE GPC
 PROPOSITO DE GPC / GFC

GPC
Peso Molecular:medicion de
polimeros.
GFC
Separation de proteina.
COMO MEDIR EL PESO MOLECULAR
DE UN POLIMERO

Metodo Absoluto
Presion osmotica (for Mn)
Dispersion (for Mw)
Viscosidad (for Mw)
Super centrifuga (for Mz)
Metodo Relativo
GPC (para Mn, Mw and Mz)
 QUE SON MN, MW AND MZ ?

Mn : numero promedio de peso molecular

Esfuerzo de tension, resistencia impacto
Mw : peso promedio de peso molecular
brittleness
Mz : promedio Z de peso molecular
flexibilidad

Mn < Mw < Mz
 CURVA DE CALIBRACION

Inyectar las muestras estandars de los

polimeros una por una para conocer la relacion
entre peso molecular y tiempo de retencion.

No. time(min) mol. wet.

1 22.0 5500000
2 22.6 1800000
3 23.4 860000
4 25.0 400000
5 27.4 160000
6 31.0 50000
7 33.8 20000
8 38.4 4000
9 39.8 2000
10 42.8 600
11 46.8 80
 INYECCION DE MUESTRA
ACTUAL

Para calcular el MW, software GPC es

requirida.
SEPARACION DE PROTEINAS
USANDO COLUMNA GFC
Condiciones Analiticas
Columna : Asahipak GFA-50
Fase Movil :
0.1 M sodium phosphate
0.1 M NaCl (pH=7.0)
Flujo : 0.5 mL/min
Temperatura : ambient
Detector : UV-280 nm
Volumen de Inyeccion : 10 uL
Picos
1. glutamate dehydrogenase
2. lactate dehydrogenase
3. enolase
4. adenylate kinase
5. cytochrome C
 CAPITULO 5:

CUANTIFICACION
 METODOS CALIBRACION

Calibracion con Estandar Externo

Calibracion con Estandar Interno
Adicion Estandar
Normalizacion Corregida
 CALIBRACION CON ESTANDAR
EXTERNO

Compuestos

Dilucion Dilucion Dilucion Dilucion

CALIBRACION CON ESTANDAR
EXTERNO
CALIBRACION CON ESTANDAR
EXTERNO
 CALCULO CON METODO DE ESTANDAR
EXTERNO
[Concentraction]

Y = aX + b
a : Pendiente
125 ppm b : Y intercepto

2500 2500
[Area de Pico]
 CALIBRACION CON ESTANDAR
INTERNO
PREPARACION DE ESTANDARES

Estandar
Compuestos Interno

Dilucion Dilucion Dilucion Dilucion

CALIBRACION ESTANDAR INTERNO
ANALISIS DE VAINILLA
CALIBRACION ESTANDAR INTERNO
ANALISIS DE VAINILLA
 CALIBRACION DE ESTANDAR INTERNO
CALCULO DE RESULTADOS
[Conc. Comp. / Conc. EI]

Y = aX + b
a : Pendiente
1.67 b : Y intercepto

5.0 C 2500
500
[Area Comp / Area EI] ES
Y = Conc.Comp. / Conc. EI
1.67 = Conc. Comp./ 100 ppm
Conc. Comp. = 167 ppm
 VENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR EXTERNO
Solo los compuestos a analizar son
separados.

Target Target
 DESVENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR EXTERNO
Los errores en la inyeccion de muestra influyen
directamente en el analisis cuantitativo.

Inyeccion de 10 uL Inyeccion de 11 uL

100 ppm 110 ppm

 VENTAJA DE LA
CALIBRACION DE ESTANDAR
INTERNO
Los erroes de inyeccion pueden ser eliminados.

Inyeccion de 10 uL Inyeccion de 11 uL
1100 2200
1000 2000
IS T
IS T

2000 / 1000 = 2 2200 / 1100 = 2

 VENTAJA DE LA
CALIBRACION DE ESTANDAR
INTERNO
La recuperacion en el proceso de pretratamiento
puede ser estimado.
Adicion de EI (100 ppm)
Estandar I (100 ppm) a la muestra
IS T
IS T
1000
950

Recuperacion = (950/1000)x100 = 95%

 DESVENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR INTERNO

La separation es ligeramente dificil.

IS
T IS T

T
IS
 DESVENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR INTERNO

Es dificil obtener compuesto EI.

La estructura quimica de EI es similar al
del compuesto a analizar.
En la muestra no debe existir el
compuesto que se utiliza como estandar
interno.
 METODOS DE CALIBRACION
Estandar Externo
La separation no es dificil
Los errores de inyeccion influyen en el resultado
cuantitativo
Estandar Interno
Los errores de inyeccion pueden ser eliminados
La recuperacion en proceso de pretratamientpo
puede ser estimado
La separacion es ligeramente mas dificil
Dificil encontrar compuestos como Estandar Interno.
 PRECISION EN LA CUANTIFICACION
RANGO SELECCIONABLE DE
TRABAJO
[ Respuesta del Detector ]

[ Concentracion del soluto ]

CASO
 HPLC

solvent

pump

injector

column

detector
HPLC Columna
HPLC Bomba
HPLC Automuestreador e inyector
HPLC Detector
UV/Visible
HPLC Deshechos
 Procedure
Use a 10 mL volumetric pipet to add 10.00 mL
of soft drink to 10.00 mL of deionized water.
Mix thoroughly and half fill a HPLC vial with
your sample. Label the vial with your name and
the name of the soft drink.
 Analysis of Results

Use the four caffeine standards to prepare a

calibration curve (graph) that plots peak area
vs. concentration.
Draw a best fit straight line on your graph.
Use your calibration curve to determine the
concentration of caffeine in the sample you
prepared.
Use the concentration of caffeine in your
sample, along with the dilution equation, to
determine the concentration of caffeine in the
soft drink you used.
HPLC Chromatogram of Standard 1

0.500 x 10-4 M caffeine

HPLC Chromatogram of Standard 2

1.00 x 10-4 M caffeine

 Calculations
Remember, the original soft drink was diluted to prepare your HPLC
sample. The concentration (M) of caffeine in the original soft drink can be
calculated by using the dilution equation:

M1V1 = M2V2

M1V1
M2 =
V2

The concentration (mg caffeine / 500 mL soda) of caffeine in a full can of

your soft drink can be determine using the following equation:

M2 x 194.2 g caffeine x 1000 mg x 0.500 L = mg caffeine

mol caffeine g in bottle