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UNIDAD 3. TÉCNICAS MOLECULARES

3.1 Extracción de ácidos nucleicos

Se

cuenta con tres métodos establecidos para extracción de ADN de muestras vegetales

y

productos procesados, DNAzol modificado, Phytopure modificado y Urea

modificado.

De

los tres métodos evaluados para la extracción de ADN tanto en muestras vegetales

así

como en productos procesados, el DNAzol modificado fue el que produjo mejores

resultados.

A continuación se esquematizan los tres métodos de extracción de ADN (Figura 9):

Buffer de DNAzol Phytopure Urea Buffer de Buffer de Extracciòn a base de urea A
Buffer de
DNAzol
Phytopure
Urea
Buffer de
Buffer de
Extracciòn a
base de urea A
Buffer de
Extracciò
extracciòn
n
Fenol e
Fenol e
incuba
incubar
Fenol e incuba.
Diferentes
tiempos yT°s.
Centrifug
Centrifug
aciòn
aciòn
Resina
2 lavado
2 lavado
Centrifug
ación
Obtenciò
Obtenciòn de
n de
ADN
ADN
2° lavado

Figura 9. Métodos de extracción de ADN.

“Extracción de ADN Maxipred” (Sambrook y Rusell, 2001).

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Considerando que la lisis alcalina, en combinación con el detergente SDS, ha sido usado por más de 20 años para aislar ADN plasmídico de E. coli. Se observa que durante la lisis, proteínas bacteriales, rompen las células y desnaturalizan el ADN cromosomal, empieza a engranar en grandes complejos que son cubiertos de sulfato dodecil de sodio. Estos complejos son eficientemente precipitados de solución, cuando los iones de sodio son remplazados por iones de potasio. Después, el material desnaturalizante es removido por centrifugación, el ADN plasmídico puede ser recogido del sobrenadante.

La lisis alcalina en presencia de SDS es una técnica flexible que trabaja bien con células de cepas de E. coli y con cultivos de bacterias en un rango de 1 a > 500 ml.

1. Inocular 100 ml de ETB + 11 ml de sales ETB + antibiótico, con la cepa de interés. Incubar a 37 °C en agitación toda la noche.

2. Al día siguiente, vaciar el cultivo en botellas de centrífuga y centrifugar 10 min a 4500 rpm en rotor GSA.

3. Decantar el sobrenadante y añadir a cada paquete celular 5 ml de solución Birnboim I, resuspender las células con una pipeta pasteur o agitar en vortex.

4. Agregar a cada botella 10 ml de solución Birnboim II recién preparada, agitar lentamente e Incubar de 3 a 5 min.

5. Agregar 7.5 ml de sol. Birnboim III, agitar lentamente hasta que la solución sea clara y se ha formado el agregado blanco.

6. Incubar 30 min en hielo.

7. Centrifugar en rotor GSA 10 min a 4500 rpm.

8. Filtrar el sobrenadante a través de cubrebocas estériles y recuperar el filtrado en tubos de 50 ml.

9. Agregar 0.6% volúmenes de isopropanol frío (-20 °C).

10. Agitar y precipitar a - 20 °C durante 30 min.

11. Centrifugar 10 min a 10 000 rpm en rotor SS34.

12. Decantar el sobrenadante y resuspender la pastilla en 3 ml de H 2 O y añadir 3 ml de LiCl 5 M (- 20 °C). Incubar 5 min a temperatura ambiente.

13. Centrifugar 10 min a 10 000 rpm en rotor SS34.

14. Colectar el sobrenadante en un tubo corex y agregar 6 ml de isopropanol - 20 °C.

15. Precipitar 1 hr o toda la noche.

16. Centrifugar 10 min a 10 000 rpm.

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18. Agregar 500 µ l de NaCl 1.6 N + PEG 13%. Incubar 10 min.

19. Agitar y centrifugar a 4 °C a 12 000 rpm durante 5 min.

20. Resuspender en 400 µ l de TE o H 2 O y hacer una extracción de fenol, otra de fenol- cloroformo y otra con cloroformo-alcohol isoamílico.

21. Precipitar con 2.5 volúmenes de etanol absoluto (- 20 °C) + 100 µ l de acetato de amonio 10 M.

22. Incubar 10 min a temperatura ambiente y centrifugar a 12 000 rpm por 5 min a temperatura ambiente.

23. Lavar la pastilla con 200 µ l de etanol al 70% frío y centrifugar 2 min.

24. Resuspender en 100 a 500 µ l de TE o H 2 O.

3.1.1. Precipitación

Técnica utilizada para purificar los ácidos nucleicos a partir de oligonucleótidos, nucleótidos, sales y otras impurezas, usando alcohol (por ejemplo: etanol, isopropanol, butanol) y altas concentraciones de sal (por ejemplo: 0.2 a 0.6 M de NaCl), bajo estas condiciones los polímeros de los ácidos nucleicos se agregan y precipitan, mientras que los componentes de bajo peso molecular se mantienen solubles. El ácido nucleico puede colectarse por centrifugación (Valadez y Kahl, 2000).

Estos mismos autores mencionan que detergentes como el deodecil sulfato de sodio (SDS) son utilizados para inhibir las enzimas nucleasas, disocian proteínas de ADN y lo hacen más accesibles a la degradación por proteinasas usadas durante la técnica del aislamiento. La polivinilpirrolidona (PVP) al 1% inhiben la acción de los compuestos fenólicos; el bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB), se pega fuertemente al ADN, desplaza las proteínas y previene la degradación. El CTAB se remueve mediante extracciones con cloroformo, y el ADN permanece en fase acuosa listo para ser precipitado con etanol. Los agentes como ADTA, EGTA y fenantrolina, son usados en diferentes concentraciones tanto en especies vegetales como animales.

3.1.2. Purificación

La purificación de ADN implica el rompimiento de la estructura que lo contiene y la eliminación de cualquier sustancia contaminante o molécula unida a el cómo son las proteínas, membranas, minerales. Los métodos más comunes involucran diferentes pasos de clarificación con disolventes para eliminar las fracciones gruesas (membranas

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y proteínas) y precipitaciones del ADN para la eliminación de impurezas más pequeñas

(Cuadro 2).

Cuadro 2. Metodología para la purificación del ADN.

Pasos

Objetivos

Métodos

1. Lisis

Liberar

los

1.

Detergentes

fuertes

y

componentes

internos

desnaturalizantes

para

lisar

la

de la célula

célula:

 
 

a)

Detergente iónico.

 

b)

Sales de guanidinio.

 

c)

Altas temperaturas.

d)

Mezcla de fenol/cloroformo.

2.

Métodos para separar el núcleo

del citoplasma en eucariotas:

 

a)

Detergentes suaves, no iónicos

en presencia de Mg.

 

b)

Centrifugación

2. Separación

Remover

los

3.

Precipitación

de

ácidos

inicial

contaminantes

nucleicos:

 

mayoritarios.

a)

Neutralización

de

las

cargas

 

negativas con sales.

b)

Reducción de la solubilidad del

ácido nucleico con alcohol frío.

 

4.

Tratamiento

con enzimas

específicas:

 

a)

proteasas y RNAsas

 

3. Purificación

Remover

5.

Extracción:

contaminantes

 

a)

Mezcla de fenol/cloroformo.

 
 

b)

Centrifugación.

 

4. Purificación

Remover

6.

Métodos específicos:

 

final

contaminantes

 

a)

Extracciones sucesivas.

residuales

b)

Unión

por

afinidad

a

 

compuestos.

 

c)

Extracción con fenol.

 

d)

Centrifugación en gradiente.

5. Confirmación

Determinar

pureza

y

7.

Espectroscopia con luz UV.

concentración

Fuente: Balbás, 2002.

3.1.3 Análisis espectrofotométrica

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Uno de los métodos más simples y utilizado con mayor extensión para determinar la cantidad de proteína o de ácidos nucleicos presentes en una solución determinada es medir la cantidad de luz de una longitud de onda específica absorbida por la solución a través del espectofotómetro. Para absorber luz de una longitud de onda particular, una molécula debe de absorber un quantum entero de luz, o sea, la energía que impulsa un electrón desde un orbital más bajo a uno más elevado.

La energía de la luz debe equilibrar exactamente la diferencia de energía del electrón entre las dos posiciones. Si se conocen las características de absorbancia de un tipo de molécula, entonces la cantidad de luz de longitud de onda apropiada absorbida por una solución de dicha molécula suministra una medida sensible de su concentración (Karp,

1998).

Para cuantificar la cantidad de ADN/ARN, la lectura debe hacerse a longitudes de onda de 260 nm, lo cual permite el cálculo de la concentración de los ácidos nucleicos en la muestra. Una DO = 1 corresponde aproximadamente a 50 µ g ml -1 de ADN de doble cadena, 40 µ g ml -1 de ADN de cadena sencilla y de ARN y 20 µ g ml -1 de oligonucleicos de cadena sencilla.

La relación entre la lectura de absorbencia a 260 y 280 nm (DO 260/280 ) aporta una estimación de la pureza de los ácidos nucleicos; las preparaciones puras del ADN y del ARN tienen valores que van desde 1.8 a 2.0 a DO 260/280 respectivamente. Si hay contaminación con proteínas o fenol, el valor obtenido en esta relación, puede ser significativamente diferente para los valores antes citados y no será posible la cuantificación correcta de las moléculas (Sambrook et al., 1989 citados por Valadez y Kahl, 2000). Además de estimar la relación D 260/280 es conveniente realizar otra medición a 230 nm ya que ésta puede proporcionar información valiosa acerca de la pureza de la muestra debido a que:

a) A 230 nm se localiza la absorbancia mínima de ácidos nucleicos y nucleótidos, se localiza la absorbancia máxima de enlaces peptídicos, además de que cualquier absorción a 230 nm es indicativo de contaminación de proteínas.

b) La absorbencia a 230 nm puede indicar la presencia de compuestos orgánicos (tales como solventes y antibióticos). Por ejemplo, una relación A 260 /A 230 de una

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muestra de ARN debe ser > de 2.0. Si la relación es menor, la contaminación puede deberse, por ejemplo a la presencia de tiocinato de guanidina. c) La absorbencia a 230 nm también puede indicar la contaminación con amortiguador, ya que el tris o EDTA, así como otras sales, absorben a esta longitud de onda.

Protocolo

1. Agregar 20 µ L de la muestra patrón de ADN a un tubo que contenga 1980 µ L de amortiguador TE o agua bidestilada estéril, mezclar perfectamente y leer la absorbencia (DO) en el espectofotómetro a 260 y 280 nm.

2. Calcular la concentración de ADN en solución de acuerdo con la siguiente fórmula: Concentración de ADN (µg/µL) = [DO 260 X 100 (factor de dilución) X 50 µ g/ml]/1000 (Valadez y Kahl, 2000).

3.2 Electroforesis

Para estimar la longitud de los fragmentos de ADN producidos por el corte de las enzimas de restricción, es necesario utilizar una matriz inerte y semisólida. Esta matriz o soporte puede ser de agarosa o poliacrilamida y dependiendo de la longitud esperada de los fragmentos se opta por usar alguno de los dos (Valadez y Kahl, 2000).

Migración de las moléculas de ADN en el gel Las moléculas de ADN de diferente tamaño pueden ser separadas por electroforesis, un proceso en donde un campo eléctrico es usado en donde se mueven las moléculas de ADN cargadas negativamente a través de poros de gel de agarosa (Figura 10).

Las moléculas del mismo tamaño se mueven a la misma velocidad, es decir las moléculas de ADN pequeñas se mueven más rápido en relación con las de mayor tamaño y se empiezan a separar en bandas. Las bandas sobre este gel contienen moléculas de tamaño que va desde 500 pb hasta 12,000 pb, aunque las bandas de más de 4000 pb no están lo suficientemente separadas una de otra para distinguirse. El ADN es teñido con bromuro de etidio, que no es más que una molécula fluorescente cuando es iluminada con luz UV (Watson et al., 1998).

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40 Figura 10. Separación de los fragmentos de ADN por electroforesis en gel de agarosa. Gel

Figura 10. Separación de los fragmentos de ADN por electroforesis en gel de agarosa.

Gel de agarosa. Los fragmentos de ADN que se han generado por digestión con una enzima de restricción y pueden separarse uno del otro por medio de electroforesis en gel de agarosa. El gel se hace con agarosa, una forma pura del polisacárido que se utiliza para elaborar las placas de agar en donde crecen las bacterias. El gel se sumerge en un amortiguador (buffer) y los fragmentos de ADN se cargan en un pozo de uno de los extremos del gel y se permite que se muevan a través del gel por aplicación de una corriente eléctrica (Figura 11).

gel por aplicación de una corriente eléctrica (Figura 11). Figura 11. Gel de agarosa que muestra

Figura 11. Gel de agarosa que muestra los fragmentos de ADN. Esta técnica se utiliza para purificar fragmentos específicos antes de clonarlos, la porción del gel que contiene el fragmento deseado se corta y se recupera el ADN

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eluyendo el amortiguador del gel o sometiendo el gel a electroforesis para sacarlo (Smith y Wood, 1998).

En la figura 11, el ADN es producido por digestión del ADN del bacteriófago (virus) I con varias enzimas de restricción. Pista 1: BamHI; pista 2: EcoRI; pista 3: PstI; pista 4:

HindIII. Los fragmentos más pequeños de la pista 3 tienen 1.09 kb y el más grande de la pista 2 es de 21 kb.

Gel de poliacrilamida. La técnica in vitro de mARN purificado muestra cuáles proteínas puede sintetizar a partir de los diferentes mARN, entre estas se encuentra la proteína del gen de interés, que puede identificarse con facilidad en un gel de pilacrilamida (pista 1 de la Figura 12).

en un gel de pilacrilamida (pista 1 de la Figura 12). Figura 12. Separación de ADN

Figura 12. Separación de ADN en gel de poliacrilamida por medio de electroforesis.

Si el mARN se mezcla con ADN purificado del plásmido de uno de los clones de cADN, entonces el cADN se hibridizará (apareará con bases) con el mRNA a partir del cual se sintetizó (el cADN se copió del mARN, de modo que tiene que tener una secuencia de bases complementaria), el ADN del plásmido solo se hibridizará a un tipo de mARN porque provino de un clon, si se purifica el cADN del mARN restante, el mARN hibridizado a él puede traducirse únicamente in vitro. Esto significa que solo

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aparecerá una de las proteínas en el gel de poliacrilamida, si esta proteína es la que codifica el gen deseado, entonces el ADN del plásmido utilizado debe ser un clon de ese gen. Las pistas 3 a 10 de la figura 12 identifican los clones de cADN al menos para tres proteínas diferentes. La pista 2 es una mezcla estándar de proteínas con M r conocida (Smith y Wood, 1998).

3.3 PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite la amplificación específica de segmentos de ADN que se encuentran en baja frecuencia en una mezcla compleja de otras secuencias de ADN. En un PCR estándar, una enzima ADN polimerasa (Por ejemplo taq polimerasa) y dos pares de iniciadores son usados. El iniciador 1° en sentido 5’ a 3’ y el 2° en sentido reverso 3’ a 5’. Esos iniciadores son diseñados para hibridar en cadenas opuestas de la secuencia de interés. Una vez apareado, el iniciador es reconocido por la polimerasa, iniciando la síntesis de la cadena complementaria. A través de una serie de ciclos repetidos de 2 ó 3 pasos de diferente temperatura, los iniciadores dirigirán la amplificación de la secuencia millones de veces (Figura 13).

Gen blanco Ciclo 1 2 3 4
Gen blanco
Ciclo 1
2
3
4
millones de veces (Figura 13). Gen blanco Ciclo 1 2 3 4 ADN templado Figura 13.

ADN templado

Figura 13. Amplificación por PCR de un segmento de ADN.

El segmento amplificado puede ser visto en geles de agarosa y comparado contra marcadores de peso molecular conocidos. Se han utilizado otro tipo de métodos de

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separación tales como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y electroforesis capilar (CE). Diferentes cultivos han sido analizados por PCR, como trigo, canola, papa, arroz, maíz, jitomate. Un paso crucial y limitante para la PCR es la extracción y purificación del ADN. Los límites de detección están en un rango de 20 pg a 10 ng de ADN blanco y 0.0001 a 1% de la fracción en masa de OGMs.

Diferentes métodos pueden ser empleados para confirmar la amplificación por PCR: (1) corte específico del producto amplificado con enzimas de restricción específicas, (2) hibridación con una sonda específica para la secuencia blanco, (3) Secuenciación directa del producto de PCR y (4) PCR anidado, en la cual dos juegos de iniciadores ligan específicamente a la secuencia de interés, iniciando con el más externo y luego otro más interno en la secu encia.

3.3.1 Variantes de PCR

Las metodologías con base a la PCR permiten identificar variaciones en la secuencia de

nucleótidos dentro del fragmento de ADN amplificado, así como en las secuencias

aledañas o flancos que se utilizan para la amplificación vía PCR; de manera general, es

factible clasificar a las metodologías basadas en la PCR en tres tipos;

1. E n el primero de ellos, se encuentran las que requieren secuencias conocidas

de amplificación específica como: los sitios de secuencia marcada (STS),

repeticiones de secuencia simple (SSR), amplicón alelo - específico (ASA), y las

regiones de amplificación de secuencia caracterizada (SCAR).

2. En el segundo grupo se encuentran aquellas que con base en la amplificación

aleatoria de secuencias como son: el ADN polimórfico amplificado al azar

(RAPD), PCR por hibridación arbitraria (AP- PCR), amplificación de huellas

genéticas de ADN (DAF), y las inter- secuencias de repetición simple (ISSR).

3. En el tercer grupo se encuentran las técnicas que exigen amplificación selectiva

como: los polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP) y los

poliformismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP) (Guillén -

Andrade, 2004).

3. 5 Elisa

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Las proteínas se pueden detectar y cuantificar mediante un ensayo de inmunoabsorción asociada a enzimas. Los anticuerpos se pueden usar como reactivos analíticos específicos para la determinación de la cantidad de u na proteína u otro antígeno; la técnica es el ensayo de inmunoabsorción asociada a enzima (ELISA). Este método, se utiliza un enzima que reacciona con un sustrato in coloro de forma que p roduce un producto coloreado; la enzima se une covalentemente a un anticuerpo especifico que reconoce a un antígeno diana. Sí el antígeno esta presente, el complejo enzima- anticuerpo se unirá a él, y el componente enzimático del complejo enzima- anticuerpo catalizará la reacción que generará el producto coloreado, así la presencia del producto coloreado indica la presencia del antígeno. Este ensayo de inmunoabsorción asociada a enzima que es rápida e idónea puede detectar menos de un nan ogramo (10 - 9 g) de una proteína. El ELISA se puede efectuar con anticuerpos policlonales o monoclonales, pero el uso de anticuerpos monoclonales da resultados más fiables.

El ELISA indirecto se utiliza para detectar la presencia de anticuerpo y es la base de la prueba para la infección de HIV, por ejemplo. La prueba HIV detecta la presencia de anticuerpos que reconocen las proteínas del núcleo vírico, el antígeno; la proteína del n úcleo del virus, se absorben en el fondo de un pocillo. Los anticuerpos del paciente se añaden a este pocillo revestido; solamente los pacientes infectados por el HIV tendrán anticuerpos que se puedan unir al antígeno; finalmente anticuerpos unidos a enzima contra anticuerpos humanos (por ejemplo, anticuerpos de cabra que recono cen anticuerpos humanos) pueden reaccionar en el pocillo de forma que los anticuerpos no unidos se liberan por lavado, se añade el sustrato. Una reacción enzimática sugiere que los anticuerpos asociados a enzima estaban unidos a los anticuerpos humanos, lo que implica que el paciente tenía anticuerpo contra el antígeno vírico (Berg et al .,

2009).

3.6 Microarreglos

C onjunto ordenado de genes en una pequeña superficie (10,000 muestras por cm 2 ).

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Los microarreglos de DNA son una nueva herramienta de la biología molecular y las ciencias genómicas. Posiblemente es una de las aplicaciones más importantes para la información obtenida de la secuenciación sistemática de los genomas completos.

Bibliotecas genómicas.

Con la secuenciación sistemática de los genomas completos y los avances en la síntesis artificial de DNA, ya sea por la reacción en cadena de la polimerasa o la síntesis química de desoxioligonucleotidos, actualmente es posible obtener en el laboratorio el genoma completo de un organismo, generando cada uno de los marcos de lectura abierta (ORF) completos o fragmentos de cada uno de ellos.

Actualmente se pueden adquirir las colecciones completas de los genes de varios organismos como: Humano, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae y E. coli , por mencionar algunas.

Por lo general estas bibliotecas se depositan en microplacas de 384 pozos, en donde podemos conocer la ubicación exacta de cada uno de los genes. La información sobre los genomas completos y las bibliotecas comerciales, se puede consultar en Internet, (por ejemplo: http://www.yeastgenome.org/ ).

Los impresores de contacto, son los más económicos; su uso es relativamente sencillo y no se requiere una gran infraestructura para fabricar microarreglos de DNA con estos equipos. Básicamente se trata de un brazo robótico con movimiento en los ejes X, Y y Z y su característica más importante es poderse desplazar en cualquiera de estas direcciones con una resolución de una décima de mm. Existen dos tipos de estos robots: los primeros y más senc illos en los que una superficie conteniendo las laminillas sobre las que se va a imprimir, se desplaza en los ejes (X, Y) y la cabeza con los aplicadores sube y baja en el eje Z depositando la muestra sobre la laminilla (Figura

14).

Para la impresión de lo s microarreglos es importante tomar en cuenta los siguientes aspectos: de la biblioteca genómica que se desea imprimir se debe tener la mayor cantidad de información de cada gen y esta información tiene que estar ordenada en

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una base de datos; el ADN que s e va a imprimir, debe tener la misma calidad que se requiere cuando se va a secuenciar; la cantidad de ADN de cada muestra debe ser la misma y en una solución con un contenido especifico de sales. También se deben controlar la humedad y la temperatura.

Una vez impresas las laminillas, el ADN debe ser fijado a la superficie. Esto se puede lograr horneando los microarreglos a 80°C por cuatro horas o con un entrecruzador de luz ultravioleta. Adicionalmente se delimita la región donde se encuentra el microarreglo y se identifica cada laminilla, ya sea con un código de barras o un numero se serie.

Z Z d d c c b b a a Y Y
Z Z
d d
c c
b b
a a
Y Y

X X

Figura 14. Diagrama de un impresor de microarreglos de contacto.

Obtención de RNA

E l aislamiento del RNA para su utilización en microarreglos, se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: obtenerlo lo más concentrado posible; que la banda ribosomal grande sea al menos dos veces mas que la banda pequeña (esta relación permite tener una idea de la integridad del mRNA); se requieren al menos 30 μg de RNA total p ara realizar un experimento; no se requiere aislar el RNAm y puede no ser importante la presencia de DNA genómico. En cuanto a los métodos para purificar RNA es recomendable utilizar kits comerciales. En la Figura 15 se muestra un ejemplo de RNA total de l evadura con las características mencionadas.

47 DNA GENOMICO RNA RIBOSOMAL 28S RNA RIBOSOMAL 18S RNA TRANSFERENCIA Figura 15. Fotografía de

47

DNA GENOMICO RNA RIBOSOMAL 28S RNA RIBOSOMAL 18S

RNA TRANSFERENCIA

Figura 15. Fotografía de RNA de levadura, corrido en un gel desnaturalizante de agarosa al 1%.

Marcado del RNA

Para el marcado del RNA (sonda) se utiliza la síntesis in vitro de cDNA de cadena sencilla. En los métodos más comunes; se coloca el RNA total junto con un deoxioligonucleótido poli T y un conjunto de hexámeros al azar, permitiendo que reconozcan sus sitios en el RNA mensajero. Posteriormente se agregan los des oxinucleótidos A, C, G y T, mas una proporción de des oxinucleótido T marcado con una molécula fluorescente (comercialmente se pueden obtener dUTP- Cy3, dUTP - Cy5, dUTP- alexa3 y dUTP- alexa5; también se pueden obtener los mismos fluoróforos unidos a dCTP). A la mezcla se agrega transcriptasa inversa q ue sintetiza el cDNA a partir del mRNA, incorporando el des oxinucleótido T marcado en dos reacciones estándar. Finalmente el cDNA marcado se purifica para eliminar el des oxinucleótido fluorescente no incorporado al cDNA y se tiene la sonda marcada, lista p ara probarla en un microarreglo. En la Figura 16 se muestra un gel de electroforesis en el que se corrieron RNA total y RNA mensajero, marcados con los fluoróforos descritos.

La hibridización de un microarreglo no difiere significativamente de las condiciones que comúnmente se utilizan para un experimento tipo Southern o Northern, dependiendo del experimento, se fijará la temperatura y la astringencia de la solución de hibridización. Las diferencias más importantes entre una hibridización tipo South ern o Northern y una en microarreglos son: que el volumen de hibridización no

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es mayor a 50 μl, no se requiere agitación y en un microarreglo se prueban dos

condiciones o sondas simultáneamente, es decir se compara la condición control,

contra la experimen tal en el mismo experimento (Flores et al ., 2003) .

1 2 3 4 5
1
2
3
4
5

RNAtotal

mRNA

{

{

1 Marcado con Cy3

2 Marcado con Cy5

3 Vacio

4 Marcado con Cy3

5 Marcado con Cy5

Figura 16. Imagen de fluorescencia de las sondas marcadas con los fluoróforos Cy3 rojo y Cy5 verde, corridas en un gel desnaturalizante de poliacrilamida de 12.5%.

3.7 Marcadores genéticos (RFLPs, RAPDs, AFLPs)

En años recientes, con el progreso de la biología molecular, principalmente con el

desarrollo de la PCR, se han desarrollado poderosas herramientas que pueden ser

utilizadas para el análisis, caracterización y evaluación de la diversidad genética; una

gran variedad de técnicas puede ser utilizada para detectar polimorfismos en el nivel

de ADN, de hecho, la desconcertante similitud de la colección de las técnicas

disponibles, es uno de los primeros problemas a encarar por los usuarios,

considerando las aplicaciones de estas técnicas para su propio sistema. Esta colección

de técnicas está dentro de dos categorías con respecto a la estrategia básica: a)

Técnicas no basadas en PCR, y b) Técnicas basadas en PCR. En el primer caso, el análisis

del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs), fue la primera

tecnología desarrollada que posibilitó la detección de polimorfismos en el nivel de

secuencia.

El polimorfismo detectado por este tipo de marcadores, se interpreta como la

variación en la longitud de los fragmentos de ADN cortado por las enzimas de

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restricción y en la hibridación específica de la sonda. Estos marcadores son considerados clásicos por lo ampliamente utilizados y por la consistencia que han mostrado en diferentes especies vegetales.

RAPDs. Éste método consiste en detectar fragmentos de ADN y lo hace directamente después de separar los fragmentos de ADN amplificados en un gel de agarosa, utilizando un compuesto que hace fluorecer al ADN bajo la luz ultravioleta.

AFLP´s. Este método involucra una amplificación de ADN genómico, pero en este caso las secuencias analizadas no son al azar, sino dirigidas a los sitios de corte de enzimas de restricción. Primero se corta el ADN con dos de estas enzimas y en seguida se une a adaptadores especiales. Los iniciadores utilizados en la reacción de amplificación tienen homología y se unen específicamente a estos adaptadores; de nuevo se lleva a cabo la reacción de PCR, amplificando muchas regiones del genoma. El iniciador está marcado radioactivamente y se detectan los fragmentos amplificados por autorradiografía, después de haberlos separado en un gel de poliacrilamida.

3.8 Clonación

El término clona, del griego kov (klon), significa retoño o vástago; se acuñó para hacer referencia a la multiplicación de una planta mediante el podado y plantado de una rama, (propagación asexual sin intercambio de material genético. Mediante la clonación se obtienen de plantas “hijas” con la misma herencia que la planta progenitora, de aquí cuando se obtienen organismos genéticamente idénticos, se dice que son clonas idénticas. Se han desarrollado varios procesos de clonación en diversos organismos, y popularmente, el término clonación molecular de ADN implica la manipulación dirigida del material genético por recombinación de ADN in vitro , y su multiplicación dentro de una célula hospedera donde se sintetizan copias idénticas (Balbás, 2002).

Hay tres etapas en el proceso de clonación de genes:

50

llamado ADN complementario o cADN; la selección depende del problema en particular que se va tratar. Si un aminoácido de la secuencia de la proteína es interesante, esta información puede ser obtenida más fácilmente de la secuencia de nucleótidos de un cADN clonado ; si es interesante un gene que regula la expresión o la secuenciación de genes no contienen l a información en el mARN; entonces esta información puede ser obtenida solamente de genes clonados de ADN cromosomal.

2. La segunda etapa es para producir una colección de fragmentos de ADN que puede ser insertado dentro de vectores apropiados. Esos fragmento s de ADN cromosomal usando una endonucleasa de restricción de mARN usando la enzima transcriptasa reversa para producir moléculas de cADN; cada molécula de cADN es una copia de uno solo mARN, los vectores con los fragmentos insertados son introducidos dentro de poblaciones de bacterias que pueden crecer en cajas Petri con agar debido a que las bacterias llevan genes resistentes a antibióticos, solo que esas bacterias contienen plásmidos que crecerán cuando el medio de cultivo contienen el antibiótico; cada célula de la bacteria resistente crecerá en forma de colonias. De tal forma que una colección de fragmentos de ADN clonado de bacterias propagadas es llamado biblioteca. Idealmente esta biblioteca genómica puede contener todas las secuencias representativas de ADN cromosomal o de moléculas de cADN de todo s lo s diferentes mARN.

3. Esta biblioteca es una biblioteca fuera de un catálogo para decir cuál clon contiene una secuencia particular y se maneja como una pantalla de todas las colonias bacterianas para la secuenciación de interés. Se puede directamente en la pantalla conocer la secuenciación usando una sonda complementaria de ácidos nucleicos. Parte de esa secuencia puede ser conocida de forma inmediata o puede ser deducido de la secuencia de aminoácidos de la proteína purificada; alternativamente se puede monitorear para la proteína producida por un gene clonado usando antibióticos para la proteína o usando un ensayo para la función de la proteína (Watson et al ., 1998).

3.9 Southern, Western y Nothern blot

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El método Southern. Este tipo de análisis representa una de las más poderosas herramientas disponibles para la caracterización de plantas transgénicas. La información que se obtiene con esta técnica depende de algunos factores como los que se puede mencionar los siguientes: Complejidad de la inserción del transgen, el número de copias presentes del transgen, el estado de integración y el número de los sitios cromosómicos en donde el transgen se ha insertado.

Para determinar el número de copias del transgen se utiliza la siguiente fórmula:

Tamaño del plásmido (pb) =

ADN equivalente a una copia del transgen en la planta.

Tamaño del genoma veg. (pb) Cantidad de ADN vegetal usado en la reconstrucción

S e basa en cort ar el ADN genómico del organismo y se separa en un gel de agarosa , el ADN se desnaturaliza y se transfiere a una membrana de nylon para facilitar su manipulación. Por otra parte, se prepara una sonda específica para la secuencia de interés y se marca con radioactividad o con métodos no radioactivos. La sonda se incuba con la membrana y debido a la propiedad del ADN de aparearse con su secuencia homóloga, la sonda se queda adherida a la membrana en el lugar en donde se encuentran los fragmentos homólogos del genoma de la planta. Las regiones de apareamiento se detectan como bandas cuando la membrana se expone a una parte de rayos X. Las bandas forman huellas características. La electricidad causa que la molécula se mueva a través del gel a velocidad inversamente proporcional a su tamaño; después de ser fraccionado los segmentos separados son pasados a una nueva membrana de nylon manteniendo en la misma posición que en el gel.

Ejemplo:

TAGGCATC

en la misma posición que en el gel. Ejemplo: TAGGCATC ACTAATCCATAGCTTA Sonda Fragmento de ADN genómico.

ACTAATCCATAGCTTA

posición que en el gel. Ejemplo: TAGGCATC ACTAATCCATAGCTTA Sonda Fragmento de ADN genómico. El análisis Southern

Sonda

Fragmento de ADN genómico.

El análisis Southern puede ser utilizado para proporcionar evidencia de la integración

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del transgen aunque se debe tener cuidado al evaluar los resultados. El análisis es muy simple cuando el material que está siendo evaluado fue producido utilizando Agrobacterium ya que el ADN- T del borde derecho proporciona un empalme definido entre el vector y el ADN de la planta. En este caso la presencia de bandas múltiples también puede resultar de un rearreglo del transgen (Guillén - Andrade, 2004).

Western blot . La prueba para una proteína específica, se realiza con anticuerpos debido a que estos contienen una especie de combinación llave- cerradura con el antígeno. La mezcla de proteína es pasado por electroforesis y posteriormente transferida a una membrana. La posición de una proteína específica sobre la membrana es revelada mediante la inmersión de la membrana en una solución de anticuerpo obtenida de un conejo por ejemplo, en el cual la proteína se ha inyectado; la posición de la proteína es revelada por la posición de la marca que porta el antígeno.

Northern blot. Con esta técnica, el ARN es inmovilizado sobre una membrana de nylon y es detectada a través del uso de sondas marcadas de ARN o ADN; las modificaciones hechas de Southern a Nothern blotting, incluyen las diferencias en las propiedades físicas del ADN y ARN, las más importantes de estas es que las moléculas de ARN son cadenas sencillas más que de doble cadena, esto resulta en:

a) El apareamiento de bases entre regiones cortas de secuencias complementarias causa que la molécula de ARN plegada en un gel de agarosa, dependerá no solamente de su longitud sino también de lo extenso del plegamiento; la molécula más compacta migrará con mayor velocidad. b) El apareamiento intermolecular de bases entre secuencias complementarias de diferentes moléculas de ARN, causará agregación del ARN.

Diferencias entre ADN y ARN.

1. Las moléculas de ARN deberán de estar completamente desplegadas durante la electroforesis mediante la adición de agentes desnaturalizantes apropiados.

2. Una segunda diferencia entre el ADN y el ARN, es que el ARN es mucho más propenso a la degradación por enziams; un acomplicación adicional es que las ribonucleasas (ARNasas), que son las enzimas que degradan el ARN, son

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extraordinariamente estables y se deben de tener cuidados para evitar la contaminación con estas enzimas en cualquier estado del proceso. 3. Un a tercera diferencia entre el ADN y el ARN es que el ARN es mucho más sensitivo a la hidrólisis por ácidos o álcalis. Esto es particularmente importante para usar soluciones adecuadas con capacidad de amortiguamiento cuando se maneja el ARN.

Los análisis d e Nothern blotting permite ver si los ARNm específicos están presentes en la supuesta planta transgénica como también nos da una indicación de su abundancia y permite la estimación del tamaño del ARNm. Este tipo de análisis proporciona una medida de los ni veles de ARNm especifico, en una célula en particular o en un tipo de tejido. Estos niveles son determinados por la tasa de transcripción y por la tasa de degradación del ADN; de esta forma, si el análisis revela que una especie de ARN es 10 veces más abun dante en una planta trensgénica que en otra, esto indicaría cualquiera de los siguientes puntos:

El gene correspondiente es transcrito más eficientemente en la primera planta transgénica.

Las especies de ARN son más estables en la primera planta transgénica.

Que ambos incrementos, la transcripción y la estabilidad actúan para incrementar los niveles de ARN en el primer tipo de célula (Guillén- Andrade, 2004).

3.10 Secuenciación

Hoy en día existe una gama amplia de métodos para determinar la secuencia nucleotídica de los genes. En los últimos 5 años ha habido una gran explosión de plataformas tecnológicas de secuenciación. Estas permiten secuenciar genomas completos en una sola corrida. A continuación presentamos algunos de los métodos clásicos y explicamos los principios en que se basan las tecnologías modernas.

Método Sanger El método Sanger moderno se basa en la separación por electroforesis capilar de una sola reacción de PCR con nucleótidos dideox marcados con fluoróforos. Con el tiempo

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se mejoró la técnica al usar nucleótidos marcados con cuatro fluoróforos que pueden ser distinguidos por el uso de laser con diferentes longitudes de excitación y la detección con varios filtros de emisión. De esta forma, se puede correr la reacción en un solo tubo ca pilar, mejorando mucho la resolución y la economía del método (Figura

17).

la resolución y la economía del método (Figura 17 ). Figura 17 . Secuenciación por Sanger
la resolución y la economía del método (Figura 17 ). Figura 17 . Secuenciación por Sanger

Figura 17. Secuenciación por Sanger con nucleótidos fluorescentes.

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1. Precursor . Una cadena de ADN puede ser secuenciada poniéndola en un tubo con una enzima para activar la síntesis de ADN y los cuatro trifosfatos precursores (de color negro, A, T, C y G); también se añaden pequeñas cantidades de químicos similares para cada uno de los trifosfatos precursores para el crecimiento de la cadena, pero no puede enlazarse en el siguiente precursor, cada uno de los cuatro tipos de precursores anormales están marcados con colores diferentes fluorescentes como: rojo la A, verde T, azul C y naranja G.

2. Síntes is de ADN . La síntesis de A DN es procesado cuando un precursor normal de color negro es agragado al template y la cadena se mantiene en crecimiento, cuando por azar un precursor anormal se agrega en su lugar, la síntesis de la cadena se detiene, dejando un a cadena corta para que la cadena empiece a secuenciar. Cada cadena es un nucleotido largo o corto en relación a los demás; cada secuencia corta se marca la molécula al final con fluorescencia.

3. Electroforesis . Los segmentos pueden ser separados por tamaños usando electrophoresis, el tiempo que ocurre depende del fragment que consiste en el cebador además de un solo nucleotide (A rojo), podría viajar más lejos. Los fragmentos compu estos por el cebador más dos nucleótidos (A negro más T verde) podrían no emigar tan lejos.

4. Lectura de la secuenciación. Un detector fluorescente lee cada banda de gel detectando el color de la banda marcada (Tiesen, 2009).