BIOFSICO-QUIMICA

2016

GUIA QUE COMPRENDE:

-PROGRAMA ASIGNATURA
-BIBLIOGRAFA
-CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
-TRABAJOS PRACTICOS

Profesor Titular: Dr. Gerardo Fidelio

Profesor Adjunto: Dra. Laura Fanani
Docente Coordinador : Dr. Ernesto Ambroggio

DEPARTAMENTO DE QUMICA BIOLGICA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE CRDOBA
 BIOFSICO-QUMICA

Programa Terico de Biofsico-Qumica

1 Biofsico-Qumica General
1.1 Introduccin. Origen y relacin de la Biofisico-qumica con otras ciencias. Intercambio de
energa. Revisin de conceptos termodinmicos fundamentales. Potenciales termodinmicos.
Interpretacin molecular de cantidades termodinmicas. Sistemas en equilibrio y sistemas
disipativos. Elementos bsicos de termodinmica de procesos irreversibles. Autoorganizacin.
Azar y orden. Fluctuaciones. Velocidad de produccin de entropa. Flujo biolgico de energa.
Intermediarios. Potencial de transferencia de grupo.

1.2 Intercambio de materia. Principios bsicos de termodinmica de soluciones. Potencial

qumico. Soluciones de macromolculas. Equilibrio osmtico. Potencial electroqumico.
Equilibrio Donnan. Flujos entre compartimientos. Fuerzas propulsoras. Difusin simple.
Primera y segunda ley de Fick. Principio de continuidad. Flujos interactuantes. Coeficiente de
difusin y coeficiente de friccin. Difusin inica. Coeficiente de Permeabilidad. Ecuacin de
transporte pasivo. Difusin facilitada. Cotransporte. Contratransporte. Transporte activo.

1.3 Interaccin ligando-receptor. Equilibrio mltiple. Sitios independientes. Ecuacin de Adair.

Grfico de Scatchard. Sitios interactuantes. Interaccin cooperativa.

1.4 Equilibrios y desequilibrios difusionales y osmticos. Volumen crtico. Desequilibrios

electroqumicos. Fenmenos transitorios. Potencial de reposo. Potenciales locales.
Depolarizacin. Hiperpolarizacin. Potencial de accin.

1.5 Cromatografa de Filtracin molecular. Intercambio inico. Cromatografa de afinidad.

Selectividad.

1.6 Principios bsicos de algunos mtodos fsicos para el estudio de interacciones y

conformaciones moleculares. Sedimentacin. Movimiento de molculas en campos elctricos,
potencial de doble capa; potencial de flujo; electro-smosis; electroforesis. Gel de
poliacrilamida. Modelos artificiales de membranas; liposomas, capas bimoleculares planas,
capas monomoleculares. Espectrofotometra de infrarrojo, visible y ultravioleta.
Fluorescencia. Calorimetra diferencial de barrido. Mtodos de resonancia magntica.
Difraccin de rayos X. Dicrosmo circular y dispersin ptica rotatoria.

1.7 Interfases. Energa libre de superficie y tensin superficial. Compuestos tensioactivos.

Concentracin de superficie y tensin superficial. Ecuacin de adsorcin de Gibbs.
Detergencia. Concentracin micelar crtica. Termodinmica del proceso de micelizacin.

1
 2 Biofsico-Qumica Molecular

2.1 Fuerzas intermoleculares. Interaccin por puente hidrgeno. Interacciones hidroflicas.

Interacciones electrostticas. Fuerzas de polarizacin. Fuerzas de dispersin. Interaccin
hidrofbica. Energa de la interaccin y distancias intermoleculares.

2.2 Propiedades estructurales de sustancias lipdicas. Agregados multimoleculares. Estados

mesomorfos y mesofases. Mesomorfismo termotrpico y liotrpico. Fase cristalina. Cristales
lquidos. Fases esmcticas y nemticas. Fase isotrpica. Temperatura de transicin de fase.

2.3 Conformacin de protenas. Niveles de organizacin. Tipos de interacciones involucradas.

-hlice y

sobre la estructura general e interacciones de asociacin en la molcula de protena. Hlices

anfipticas.

2.4 Interacciones protena-protena. Desnaturalizacin. Cooperatividad. Interacciones lpido-

protena. Protenas hidroflicas. Protenas hidrofbicas. Penetracin de protenas en una fase
lipdica. Lipoprotenas. Caractersticas estructurales e interacciones.

2.5 Estructura y composicin de membranas biolgicas. Capa bimolecular lipdica. Fundamentos

temodinmicos. Modelos. Protenas intrnsecas. Protenas extrnsecas. Asimetra. Protenas
unidas a membrana por lpidos. Dinamismo de la estructura. Fluidez. Separacin lateral de
fases. Movimiento lateral y transversal de componentes de componentes de membranas.
Restricciones topogrficas. Citoesqueleto. Mecanismos de transduccin. Fases no-bicapas.

2.6 Tipos de membranas biolgicas. Sntesis y recambio. Membranas plasmticas. Membranas

internas. Membranas mitocondriales. Membranas transductoras de luz. Interacciones entre
membranas. Fusin de membranas. Endo y exocitsis. Membranas de linfocitos. Agregacin y
polarizacin de receptores de superficie. Uniones e interacciones entre clulas.

2.7 DNA. Estructura primaria, secundaria y terciaria. Estabilidad. Propiedades fsico-qumicas en

solucin. Superenrrollamiento. Topoisomerasas.

2
 Bibliografa

1. Introduccin a la Biofisico-Qumica (1987-1988) Bruno Maggio. Ed. Gonzalez-Truccone.

Crdoba.
2. Biological Interfaces. An Introduction to the surface and Colloid Science of Biochemical
and Biological Systems. (1975) M. Jones. Elsevier Sci. Publishers.
3. An introduction to the principles of surface chemistry. R. Aveyard and D.A. Haydon. (1973)
University Press. Cambridge.
4. Transporte a travs de la membrana celular. Garrahan, P.J. y Rega A.F. Monografa N 18
Serie Biologa. Programa Regional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico. O.E.A. 1977.
5. Biophysical Chemistry. Cantor and Schimmel (1980) Freeman & Co. San Francisco.
6. Fsico-Qumica. Moore, W.L. Prentice Hall.
7. Fsico-Qumica. Atkins, P.W. Oxford University Press.
8. Bioqumica. L. Stryer - Freeman and Co., 1975.
9. Bioqumica - Lehninger, A. - Omega - 1972 y sucesivas eds
10. Physical Biochemistry - Kensal E. van Holde - Prentice Hall, 1974.
11. Molecular Cell Biology. Darnell, J., Lodish and H. Baltimore, D. 1990, Freeman Books
12. Introduction to protein structure, Brandsen C. and Tooze, J. 1991, Garland publishing
13. Anlisis estructural y functional de Macromolculas. Betina Crsico; Lisandro J. Falomir
Lockhart; Gisela R. Franchini; Natalia Scaglia 2013. Universidad Nacional de La Plata
Editorial de la Universidad de La Plata (ISBN 978-950-34-1057-8).
14. Vida una cuestin de grasas? Una perspectiva desde la biofsica de membranas. Luis
Bagatolli y Ole Mourtisen. 2015 Yachay, Ecuador (ISBN 978-9942-07-694-6).
15. Atkins, P.; Paula, J. De. Physical Chemistry for the Life Sciences; 2011.

3
 BIOFISICO-QUIMICA 2016-CRONOGRAMA ACTIVIDADES
PRCTICAS Y SEMINARIOS

IMPORTANTE:

IMPORTANTE:
Cada comisin puede tener un MAXIMO DE 12 alumnos inscriptos.
En el caso que TODAS las comisiones resulten cubiertas con 12 alumnos, se habilitarn nuevas
comisiones. En este caso, por favor contactarse con el profesor de la materia. No hay restriccin en
el nmero de alumnos vocacionales. Los Tericos comienzan el Lunes 29 de febrero de 2016.
Aula en complejo Bateras B (a definir probablemente B3 B5). Horarios de Tericos es
Lunes y Mircoles a las 15 hs., (despus de Biologa Molecular y Celular).

1ra. SEMANA
Com. Dia Horaa, b, c TP1 TP2 TP3 TP4 TP5 Seminario TP6 Seminario
1 2
1y2 Mar Maana 8/3 22/3 5/4 19/4 17/5 24/5 31/5 7/6

3N y 4N Mar Nocturna 8/3 22/3 5/4 19/4 17/5 24/5 31/5 7/6
Comisiones
nocturnas para
alumnos que
trabajan

5y6 Mie Maana 9/3 23/3 6/4 20/4 18/5 25/5 1/6 8/6
Fer Nac
Recup.
7y8 Jue Maana 10/3 24/3 7/4 21/4 19/5 26/5 2/6 9/6
Fer Nac
Recup.
9 y 10 Jue Tarde 10/3 24/3 7/4 21/4 19/5 26/5 2/6 9/6
Fer Nac
Recup.

2da. SEMANA
Com. Dia Horaa, b, c TP1 TP2 TP3 TP4 Seminario 1 TP5 Seminario TP6
2
11 y 12 Mar Maana 15/3 29/3 12/4 10/5 17/5 24/5 31/5 7/6

13 y 14 Mar Tarde 15/3 29/3 12/4 10/5 17/5 24/5 31/5 7/6

15 y 16 Mie Maana 16/3 30/3 13/4 11/5 18/5 25/5 1/6 8/6
Fer Nac
Recup.
17 y 18 Jue Maana 17/3 31/3 14/4 12/5 19/5 26/5 2/6 9/6

19 y 20 Jue Tarde 17/3 31/3 14/4 12/5 19/5 26/5 2/6 9/6

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 a) Horarios de TP: Maana de 8.30 a 13.00 (Comisiones 1, 2, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 14, 15, 16 ,
17 y 18).
b) Horarios de TP: Tarde de 14.00 a 18.30 (Comisiones 9, 10, 13, 14, 19 y 20)
c) Horarios de TP de Comisiones Nocturnas exclusivas para alumnos que trabajan: 3N y
4N de 17.30 a 21.30 hs.

SEMINARIOS
Los dos Seminarios (seminario 1 y seminario 2) se hacen en simultneo con el TP N 5 y TP N
6 pero de distintas semanas, fijarse en el cronograma adjunto. Las Aulas de Seminario es en
Baterias B a confirmar.

RECUPERATORIOS
Recuperacin Feriado 24/03: Comisin 7 y 8 recupera lunes 28/03 en horario de maana
(8.30 a 13.00).
Recuperacin Feriado 24/03: Comisin 9 y 10 recupera lunes 28/3 en horario de la tarde
(14.00 a 18.30).
Recuperacin Feriado 25/05: Comisiones 15 y 16 recupera viernes 27/05 en horario de
maana (8.30 a 13.00).
Por causas de enfermedad o fuerza mayor el alumno puede recuperar en cualquier horrio
de comisin disponible en 1ra o 2da semana previa coordinacin por la Secretara del
Departamento y con presentacin de certificado.
1er Parcial Semana del 23/04/16 al 07/05/16 (En gris claro TPs para 1 Parcial)
2do Parcial Semana 18/06/16 al 30/06/16. (En gris oscuro TPs para 2 Parcial)

REGULARIDAD: se requerir haber aprobado 7 de las 8 actividades obligatorias con una nota no
inferior a cuatro. Se promediarn las mejores 7 notas de las actividades obligatorias para la
promocin.

PROMOCIN: se requerir haber aprobado con nota igual o mayor a 6 cada examen parcial
(mximo un recuperatorio de parcial) y tener la condicin de regular. Nota de Promocin ponderada
de acuerdo a: (P1 x 0.33)+(P2 x 0.33)+(TP x 0.33)

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 TRABAJO PRCTICO N1

Presin Osmtica. Termodinmica de Soluciones de

Macromolculas

Introduccin

Presin Osmtica, Volumen Crtico y Hemlisis.

En una solucin ideal los potenciales qumicos () de los componentes son
menores que los potenciales qumicos de esos mismos componentes con
respecto a cuando estn puros. Esto se debe a que la entropa del sistema es
mayor en las mezclas (mayor cantidad de conformaciones posibles, mayor
desorden) que en la suma de los dos componentes por separado. As por
ejemplo, el del agua en una solucin de NaCl es menor que el en agua
pura y el del NaCl en la solucin es menor que en un cristal de NaCl. El valor
de de un componente depende de la concentracin de ese componente.

= [ ]
,,

= + ( )
Una consecuencia de este hecho es que las propiedades coligativas del
solvente cambian cuando variamos la concentracin del soluto. Se observa, por
ejemplo, descenso del punto crioscpico, aumento del punto de ebullicin
disminucin de la presin de vapor del solvente cuando aumentamos la
concentracin de soluto.
Suponga que ponemos en contacto, suavemente y sin mezclar
enrgicamente, dos soluciones de sacarosa de diferente concentracin.
Inicialmente el correspondiente al agua y a la sacarosa sern distintos. Este
sistema, que inicialmente no est en equilibrio termodinmico, lo alcanzar
cuando el de cada componente sea constante a lo largo de todo el sistema,
es decir cuando la solucin sea homognea.

tA tB
A B A B
Solucin de Agua pura Solucion de Agua pura
sacarosa sacarosa
100mM 100mM

Figura 1 Figura 2

6
 En las Figuras 1 y 2 se muestra un sistema de dos compartimentos de
paredes rgidas separados por una membrana semipermeable, permeable al
solvente agua pero impermeable a la sacarosa (figura 1). Imagine que a tiempo
cero hay una solucin de sacarosa en el compartimento A y agua pura en el B.
Est en equilibrio el sistema?. La fraccin molar del agua en el lado A es
menor y por lo tanto su es menor que en el lado B. El sistema entonces no
est en equilibrio. Cmo evolucionara hacia el equilibrio? De alguna manera
el del agua del lado A aumentar hasta igualar el del agua del lado B. Una
manera de aumentar el del lado A es aumentar la presin dentro de este
compartimiento. A esta presin se la denomina presin osmtica . Si se le
permite al sistema de la fig. 1 estar en contacto con la presin atmosfrica a
travs de capilares abiertos (cuyo volumen es despreciable) se podr observar
un aumento del nivel de lquido en el compartimento A sin un cambio
significativo de la concentracin de solutos (figura 2). Esta diferencia de altura
es proporcional a la diferencia de presin ejercida sobre ambos
compartimentos, es decir a .
puede calcularse segn:

=[ ] ( )

Note que en el caso de una solucin ideal, la depende de la fraccin molar
del solvente y no de la naturaleza del soluto (propiedad coligativa). Realizando
algunas aproximaciones vlidas para soluciones ideales diluidas se obtiene la
relacin de Van't Hoff:
=
donde C es la concentracin molar de solutos osmticamente activos, tambin
llamada Osmolaridad (osM). En una solucin de NaCl 1 mM, la concentracin
de solutos osmoticamente activo es 2 mM, correspondientes a 1 mM de Na + y
1 mM de Cl-. Esto es equivalente a decir que la solucin 1 mM de NaCl es 2
mosM. Una solucin de sacarosa 1 mM es 1 mosM.

Objetivos

Realizar un experimento que permita evidenciar la existencia de una

presin osmtica.
Calcular la mxima diferencia de presin que puede soportar la
membrana de un eritrocito.
Observar la desviacin del comportamiento ideal de diferentes solutos.

7
Fundamento

La membrana del glbulo rojo (eritrocito) es permeable al agua e

impermeable a iones Cl-, Na+ y a muchos componentes del citoplasma. El
del agua del citoplasma de un eritrocito es equivalente al de una solucin de
NaCl 0.15 M (0.9 %p/v).Qu diferencia de presin sentir la membrana de un
eritrocito si se resuspende en agua? Qu diferencia sentir si se resuspende
en 0.15 M NaCl? Qu suceder si se resuspende en soluciones de dilucin
creciente de NaCl? Es relativamente sencillo conocer a qu valor de
concentracin de NaCl externo se produce la hemlisis dado que se puede
evidenciar la salida de hemoglobina citoplasmtica mediante centrifugacin y
lectura en el espectrofotmetro. El volumen mximo que puede alcanzar el
eritrocito antes del estallido hemoltico se lo denomina volumen crtico.
El efecto de la exposicin de los eritrocitos a soluciones no isotnicas
ser evidenciado mediante dos mtodos: % de hematocrito y % de hemlisis.
En el % de hematocrito se determina el volumen de glbulos rojos sanos
respecto al volumen total de sangre. Para ello, luego de la centrifugacin de
una alcuota de sangre en un tubo capilar, se miden las alturas de los
volmenes correspondientes a los glbulos rojos sanos (h GR) y a la sangre total
(hT) como se indica en la Figura 2. El hematocrito ser entonces:

% = . 100

Figura 3. Capilar para hematocrito

despus de la centrifugacin. hT es la
altura total de la sangre y hGR es la altura
de los glbulos rojos sanos
hT

hGR

En el % de hemlisis se determina la absorbancia a 530 nm del sobrenadante

de una muestra de sangre previamente centrifugada. A esta longitud de onda
absorbe la hemoglobina que se ha liberado al romperse el glbulo rojo. Se
considera 100% de hemlisis a la absorbancia del sobrenadante de una
muestra de sangre expuesta a agua pura.
La no idealidad de las soluciones puede analizarse a travs del

8
coeficiente osmtico (). Este coeficiente es el factor de proporcionalidad que
existe entre la osmolaridad real de una solucin, y el valor de osmolaridad que
tendra la solucin si se comportara idealmente.

=

Cunto vale para una solucin ideal? Durante el trabajo practico se

comparar el volumen de GR luego de incubarlos con soluciones de NaCl
0.15M, sacarosa 0.3M y MgCl2 0.1M. Conociendo los coeficientes osmticos de
estos tres compuestos Ud. debera ser capaz de predecir que relacin existira
entre el % de hematocrito de glbulos rojos suspendidos en soluciones de igual
osmolaridad ideal.

Cuestionario de Orientacin

1) Cul es la osmolaridad de una solucin de NaCl 0.5 M?. Cul ser la de

esta solucin si se la conserva en una botella cerrada en el laboratorio a
25C y cul ser la si se abre la botella y se la deja en contacto con la
presin atmosfrica?

2) Si se conectara un manmetro en los compartimentos A y B de la Figura 2.

En qu lado la presin hidrosttica ser ms alta?

3) Considerando el aparato de la Figura 1:

a) Cmo evolucionara el sistema al equilibrio si la membrana
semipermeable pudiera desplazarse como un mbolo?
b) Cmo evolucionara el sistema al equilibrio si la membrana fuera
permeable tanto al agua como a la sacarosa?

4) Si el sistema ilustrado en la Figura 2, donde los compartimentos A y B estn

en contacto con el aire a travs de tubos lo suficientemente pequeos como
para que cualquier cambio de volumen de solucin dentro de ellos no
produzca cambios apreciables de concentracin de sacarosa.
a) Cuando se llegue el equilibrio, en cul de los tubos el lquido
alcanzar una mayor altura?
b) Cul ser la concentracin de osmolitos a tiempo=0 (antes de llegar al
equilibrio) y cual cuando el sistema alcance el equilibrio?
c) Como ser el de solvente en los compartimientos A y B a tiempo=0
y cuando lleguen al equilibrio?

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5) Considerando un sistema similar al de la Figura 2 pero conteniendo NaCl
0.15M en el compartimiento A y MgCl2 0.15M en el compartimiento B,
calcule:
a) Cul es la en ambas soluciones?
b) Cul ser la diferencia de presin hidrosttica que se podra medir
entre ambos compartimientos?.

6) En un proceso de smosis ocurre flujo de solvente a travs de una

membrana slo permeable al solvente, desde:
a) Una solucin ms concentrada en soluto hacia una ms diluida.
b) Una solucin de mayor hacia una menor presin osmtica.
c) Una solucin de menor Osmolaridad hacia una de mayor
Osmolaridad.
d) Una solucin de baja fraccin molar hacia una de alta fraccin molar
de solvente.

Parte Prctica

Aislamiento de glbulos rojos:

Cada muestra de sangre de 10 mL con anticoagulante se procesar de la
siguiente manera:
a) Centrifugar en tubo plstico 5 minutos a 3.000 rpm.
b) Aspirar el plasma y la capa de glbulos blancos utilizando una pipeta
Pasteur.
c) Agregar 5 mL de una solucin isotnica de NaCl 0,15 M (0.9 %) mezclar
suavemente por inversin.
d) Centrifugar de la misma manera que en punto a) y aspirar el
sobrenadante.

Determinacin del % de Hematocrito

Colocar en 12 tubos de Kahn 0.5 mL de las soluciones de NaCl de tonicidad
creciente (ver Tabla 1). Agregar 0.15 mL de la suspensin de glbulos a cada
tubo de Kahn. Homogeneizar suavemente por inversin y dejar reposar 15
minutos. Suspender los glbulos por inversin suave y tomar una muestra de
cada tubo dentro de un capilar. Centrifugar los capilares y determinar las
alturas correspondientes (Figura 3). Graficar % de hematocrito en funcin de la
concentracin de NaCl.

10
Hemlisis
Preparar una dilucin al 8% de la suspensin de glbulos rojos (slo una por
comisin: a 0.4 mL de GR agregar 4.6 mL de NaCl 0.9% y agitar suavemente).
Colocar 2.5 mL de soluciones hipotnicas en 11 tubos de centrifugacin segn
lo indicado en Tabla 2. Agregar 100 l de la dilucin de glbulos rojos.
Homogeneizar suavemente por inversin y dejar reposar 15 minutos.
Centrifugar, separar el sobrenadante y medir su absorbancia a 530 nm el
espectrofotmetro Graficar % de hemlisis en funcin de la concentracin de
NaCl. El % de hemlisis se calcula en relacin al valor de absorbancia del tubo
1 (hemlisis total en agua destilada = 100 %).

Tabla 1_Hematocrito Tabla 2_Hemlisis

[NaCl] % [NaCl] %
Tubo hT hGR Tubo A530
%p/v Hematocrito %p/v Hemlisis

1 0.30 1 agua
2 0.40 2 0.20
3 0.45 3 0.30
4 0.50 4 0.40
5 0.55 5 0.45
6 0.60 6 0.50
7 0.65 7 0.55
8 0.70 8 0.60
9 0.80 9 0.65
10 0.90 10 0.70
11 1.00 11 0.80
12 1.10

Coeficiente osmtico
Colocar en tubos de Kahn 0.5 mL de NaCl 0,150 M (0.9 %), 0.5 mL de MgCl 2 ,
0.100 M y 0.5 mL de sacarosa 0.3 M, respectivamente. Estas 3 soluciones son
idealmente isotnicas. Agregar 0.15 mL de glbulos y tomar 2 muestras de
cada uno de ellos para hematocrito. Analizar los resultados justificando
claramente las eventuales diferencias entre ellos.

11
 Tabla 3
Conc Osmolaridad Osmolaridad Hematocrito
Tubo 1 Solucin
(M) ideal (mosM) real (mosM) %

1.00 NaCl 0.15 300 279 0.93

2.00 MgCl2 0.10 300 258 0.86

3.00 Sacarosa 0.30 300 307 1.02

% Hematocrito y % Hemlisis en funcin de la Concentracin de sal

Problemas de aplicacin

1) Grafique C en funcin de C (concentracin). Considere los casos para

una solucin ideal y para una solucin real.

2) Discuta los motivos por los que una solucin de protena puede desviarse
del comportamiento ideal. Qu informacin puede obtenerse a partir de
medidas de en funcin de la concentracin de protena?

3) Considere un sistema formado por dos compartimientos idnticos A y B

12
 separados por una membrana rgida permeable al agua. El compartimiento
A contiene una solucin 0,1 M de NaCl mientras que el B tiene una solucin
0,5 M de NaCl. Indique
(a) Cul es la relacin (mayor, menor o igual) entre los potenciales
qumicos del agua de ambos compartimientos en el estado inicial y en el
equilibrio termodinmico?
(b) En cul compartimiento se medira mayor presin osmtica?
(c) Prediga el flujo de solvente cuando el sistema tiende al equilibrio.

4) Dado un sistema de dos compartimientos, indique que cantidad y en cul de

ellos es necesario agregar NaCl para no observar flujo neto de solvente
entre ambos. El compartimiento A contiene 100 mL de una solucin de NaCl
200 mM y el compartimiento B 100 mL de una solucin de NaCl 100 mM y
150 mM de MgCl2

5) Suponiendo que la desviacin del comportamiento ideal se debe solamente

a una disociacin incompleta de la sal, calcule la concentracin de partculas
osmticamente activas de 1000 mL de NaCl 1 M si el coeficiente osmtico
es 0.84.

13
 TRABAJO PRCTICO No2

Influencia del efecto hidrofbico en la formacin de micelas.

Introduccin

Sustancias anfipticas son aquellas que poseen dos zonas con diferente
solubilidad en medio acuoso y orientadas asimtricamente. Cuando en un
sistema acuoso se incrementa la concentracin de una sustancia anfiptica,
varias propiedades como la presin osmtica (), la conductividad (C) y la
tensin superficial () varan con la concentracin de anfifilo segn lo indicado
en la Figura 1.
En soluciones diluidas de sustancia anfiptica estos parmetros (, , C)
varan en funcin de la concentracin segn lo indicado en la Figura1 de
manera similar a soluciones de electrolitos simples, pero existe un valor de
concentracin en el cual las pendientes de estos parmetros cambian
bruscamente. Este valor de concentracin en la cual ocurre el fenmeno se
denomina concentracin micelar crtica (CMC). La explicacin del fenmeno a
nivel molecular se puede resumir diciendo que en la zona de la CMC aparece
una nueva estructura multimolecular denominada micela, como resultado del
agregado de varias molculas de anfifilo (Figura 1).

monmero/micela

micela
Concentracin

monmero
C

CMC CMC

Concentracin total de anfifilo Concentracin total de anfifilo

Figura 1

Una micela es una estructura que satisface lo mejor posible las

interacciones hidroflicas y el efecto hidrofbico, reduciendo el rea de contacto
de las zonas no polares del anfifilo con la fase acuosa y manteniendo

14
solvatados los grupos hidroflicos al mismo tiempo. La Figura 1 muestra que la
concentracin de monmero aumenta hasta alcanzar un valor mximo y al
agregar ms molculas anfipticas comienza a formarse la fase micelar. La
concentracin mxima de monmero en solucin que permanece en equilibrio
con la fase micelar corresponde a la CMC.
Conociendo la CMC se puede calcular la energa libre standard Go del
proceso mediante:
= () (1)
donde la CMC se expresa en fraccin molar, asumiendo que la concentracin
del agua se mantiene en 55 M. Conociendo la variacin de la CMC con la
temperatura se puede calcular la entalpa standard Ho del proceso mediante:
ln()
= (2)
(1 )
Con Go calculado por (1) y Ho por (2) se puede estimar la entropa del
proceso
So mediante:
= (3)

Objetivo

Medir la CMC de dos detergentes y su variacin con la temperatura y

determinar los valores de las constantes termodinmicas H, TS, y G
del proceso de micelizacin.
Comprender el efecto hidrofbico desde un punto de vista
termodinmico.

Fundamentos

La fluorescencia involucra dos procesos: la absorcin de un fotn, lo cual

promueve un electrn a un mayor nivel de energa y la subsecuente emisin de
un fotn de menor energa que el adsorbido debido a la prdida de energa
vibracionales. Por lo tanto el fotn emitido se presenta a mayores longitudes de
onda que el incidente. Por esta razn la medicin de fluorescencia es ms
sensible que mediciones de absorbancia de luz ya que a la longitud de onda de
deteccin no hay luz contaminante de la fuente de excitacin.
La vida media del fluorforo en el estado excitado es de nanosegundos,
esto es suficientemente larga para interactuar con su entorno. La interaccin
del fluorforo con las molculas del solvente pueden afectar los parmetros de
fluorescencia de modo que un solvente polar en general reduce la intensidad

15
de fluorescencia y provoca corrimiento batocrmico.
El 1-anilino-8-naphthalene sulfonato (ANS) es un fluorforo
extremadamente sensible a la polaridad del solvente. Los espectros de
excitacin (fluorescencia medida a un mximo de emisin de em=475nm y
excitada a diferentes longitudes de onda) y de emisin (fluorescencia medida a
diferentes longitudes de onda cuando excito a exc=370nm) para ANS en etanol
se muestran en la fig. 2. Debido a que prcticamente no fluorece en agua pero
si en un entorno apolar como el corazn hidrofbico de una micela es utilizado
para monitorear la formacin de micelas de detergente en medio acuoso.
Cuando en la solucin no exista una fase micelar, los valores de florescencia
sern bajos y constantes. Los valores de fluorescencia aumentarn
significativamente cuando en la solucin se forme la fase micelar ya que el
ANS particiona en la regin no polar de la micela.

Figura 2. Espectros de emisin (fluorescencia medida a diferentes longitudes

de onda cuando se excit a exc=370nm) de ANS (20M) en agua pura (a) y
mezclas con etanol: 50% (b), 75% (c), 90% (d) y 100% (e).

En este trabajo prctico analizaremos la CMC de dos detergentes: el

Triton X100 y el cido clico (Fig. 3). El primero es un detergente no inico
ampliamente usado en la industria y en protocolos de investigacin y el
segundo es un producto de oxidacin del colesterol que pertenece al grupo de
los cidos biliares secretados por el hgado hacia el tracto intestinal, los cuales
tienen una importante funcin en la digestin de grasas dietarias.

Cuestionario de orientacin:

1) Con respecto a la Figura 1, explique:

(a) Por qu la presin osmtica () y la tensin superficial () graficadas en
funcin de la concentracin total de detergente, presentan cambios de

16
 pendiente en la zona correspondiente a la CMC.
(b) Como vara la pendiente de con el aumento del nmero de monmeros
que conforman una micela por encima del valor de CMC? Considere la
importancia del nmero de agregacin.

2) Respecto de la relacin entre la CMC y las caractersticas moleculares,

responda:
(a) Dados dos lpidos con idntico grupo polar y diferente longitud de
cadena hidrocarbonada: lpido A con un grupo hidrofbico de 16 tomos
de carbono y el lpido B con 10 tomos de carbono, infiera si la CMC son
iguales o diferentes, J.S.R.
(b) Suponga ahora que ambos lpidos tienen igual cadena hidrocarbonada
pero el lpido B tiene una mayor rea molecular. Analice en forma
conceptual como se alteran los parmetros de micelizacin (CMC,
nmero de agregacin).

3) Dados tres recipientes A, B y C de 1 litro cada uno. Al recipiente A se le

agregan 0.2x10-3 moles, al recipiente B 0.31x10-3 moles, y al recipiente C
0.6x10-3 moles de un mismo detergente cuya CMC= 0.3 mM.
(a) Cual ser la concentracin de monmero en cada recipiente?
(b) Si el nmero de agregacin de estas micelas es 100, exprese la
concentracin de micelas (fraccin molar) en cada recipiente.

4) Dado un lpido monocido que est ionizado a pH neutro y forma micelas.

(a) Calcule el Ho, So y Go del proceso de micelizacin sabiendo que
este compuesto a 25C tiene una CMC de 1 x 10-10 M y a 50C es 1.1 x
10-10 M.

5) Teniendo en cuenta los fundamentos del TP, indique si las siguientes

afirmaciones son verdaderas o falsas. J.S.R.
(a) El tubo que contiene solamente agua y fluorforo tendr una
fluorescencia menor que un tubo que contiene fluorforo y detergente a
una concentracin menor que la CMC.
(b) Los tubos con fluorforo y concentraciones crecientes de detergente por
debajo de CMC deberan dar valores constantes de fluorescencia.
(c) A medida que se comienza a formar la fase micelar los valores de
fluorescencia comienzan a incrementarse.
(d) Por encima de CMC los valores de fluorescencia en los tubos con
fluorforo y cantidades crecientes de detergente sern constantes.

17
Parte Prctica

Materiales (ver fig. 3)

ANS 1,4mM en etanol absoluto (PM 316,4).
Detergentes:
Triton X-100 al 0.04 % P/V o 0.622 mM (Detergente no inico; PM=643).

cido clico 30mM en buffer Tris pH 8,5 (Detergente aninico;

PM=408,5).

Triton X-100
(alquilfeniletoxilato)

cido Clico (3,7,12-trihidroxi-

5-cido colnico)

ANS (1-anilino-8-naphthalene sulfonato)

Figura 3: estructura qumica de las molculas a utilizar.

Procedimiento

Se preparan las soluciones indicadas en las tablas de abajo. Los

reactivos se agregan en el siguiente orden: agua, detergente, y fluorescente.
Una vez agregados todos los reactivos, los tubos se dejan 5 minutos a
temperatura ambiente y se mide la fluorescencia a em=475nm, excitando a
exc=370nm. IMPORTANTE: no lave la cubeta plstica con etanol, slo con
agua. Luego se calientan a 50 oC por 15 minutos y se lee nuevamente la
fluorescencia del mismo modo.
Los valores de fluorescencia a cada temperatura se grafican en funcin

18
de la concentracin de detergente y del punto de quiebre de la curva se
obtienen las CMC a cada temperatura. Utilizando la ecuacin (1) se calcula
G0. El H0 se obtiene aplicando la ecuacin (2), mientras que el trmino TS0
se obtiene de con la ecuacin (3). Importante: Las concentraciones se debern
expresar en fraccin molar.

TRITON

Tubo Triton ANS Agua Conc. RFU RFU

0.622 mM 1.4mM

N mL mL mL Fracc. mol T. amb. 50 C

Blanco 0.00 0.3 2.70
1 0.15 0.3 2.55
2 0.30 0.3 2.40
3 0.50 0.3 2.20
4 0.75 0.3 1.95
5 1.00 0.3 1.70
6 1.25 0.3 1.45
7 1.35 0.3 1.35
8 1.50 0.3 1.20
9 1.75 0.3 0.95
10 2.00 0.3 0.70
11 2.25 0.3 0.45

CIDO CLICO

Tubo cido clico ANS agua Conc. RFU RFU

30mM 1.4mM
N mL mL mL Fracc. mol T. amb. 50C
Blanco 0.00 0.3 2.7
1 0.20 0.3 2.5
2 0.40 0.3 2.3
3 0.60 0.3 2.1
4 0.80 0.3 1.9
5 1.00 0.3 1.7
6 1.25 0.3 1.45
7 1.50 0.3 1.20
8 1.75 0.3 0.95
9 2.00 0.3 0.7
10 2.25 0.3 0.45

19
20
21
 TRABAJO PRCTICO N3

Determinacin de la constante dielctrica en interfaces lipdicas

Introduccin
Los fosfolpidos son constituyentes mayoritarios de las membranas
celulares. Son molculas anfipticas que se auto-organizan espontneamente
cuando se dispersan en soluciones acuosas formando vesculas. Estas
estructuras multimoleculares estn conformadas por una doble capa (o bicapa)
de anfifilos organizadas, por efecto hidrofbico, con su seccin apolar hacia el
interior de la membrana y su regin polar (cabeza polar) en contacto con el
agua. Estas vesculas, tambin llamadas liposomas, tienen la caracterstica de
contener un espacio acuoso interno separado (o incluso con diferente
contenido) del espacio extravesicular.
Mientras que el proceso de auto-agregacin de fosfolpidos esta
mediado principalmente por un efecto entrpico (efecto hidrofbico), las
caractersticas del agregado dependern de las interacciones entlpicas entre
anfifilos y de parmetros geomtricos. Los anfifilos con cabeza polar
voluminosas en comparacin con su parte apolar (con forma de cono) se
agregarn ms favorablemente en forma de micelas, mientras que los anfifilo
con forma relativamente cilndrica tendern a auto-organizarse en bicapas
planas (liposomas). Las interacciones intermoleculares de estos anfifilos puede
interpretarse como la sumatoria de interacciones tipo van der Waals y de
interacciones electrostticas. Podemos estimar la energa de dispersin de van
der Waals entre cadenas hidrocarbonadas segn:
1340 (.5 . 1 ) 2
= (1)
5
donde nch2 es el nmero de metilenos en la cadena y R es la separacin entre
cadenas vecinas). Es importante notar que como las interacciones de van der
Waals decaen con 1/r5, una pequea separacin entre cadenas resulta en una
disminucin importante de las interacciones de este tipo. Esto se evidencia en
la mayor interaccin encontrada experimentalmente entre cadenas
hidrocarbonadas saturadas con respecto a aquellas que presentan
insaturaciones, debido a su mayor capacidad de empaquetarse de forma
compacta.
Las interacciones electrostticas entre los grupos polares puede
estimarse segn la ley de Coulomb como:

22
 1 2 331.9 (..1 ) 1 2
= (2) = (3)
40
En la ecuacin (3) n son el nmero de electrones en exceso o defecto de la
especie qumica y D es la constante dielctrica del medio. ste ltimo es un
parmetro fsico-qumico macroscpico que tiene un papel importante en las
interacciones electrostticas. Es la relacin entre el campo elctrico generado
por una carga en el vaco con respecto al campo generado por la misma carga
en un medio dielctrico (4). Los medios de alta polaridad tienen alta constante
dielctrica, y actan disminuyendo la magnitud de las interacciones
electrostticas entre cargas presentes en esos medios, tal como lo describe la
ec. (2) y (3).

= (4)

El agua, con una constante dielctrica de 80, es un buen solvente de

sales porque debilita las interacciones coulmbicas entre iones, impidiendo su
agregacin en forma de cristal. Por ello, a partir de ste parmetro se puede
predecir el efecto del medio sobre las fuerzas de atraccin o repulsin entre
molculas. La distribucin de cargas y las interacciones electrostticas son
factores importantes en el control de las propiedades de las membranas
lipdicas tales como permeabilidad, reactividad qumica, mantenimiento de
gradientes de potencial electroqumico, movilidad de las cadenas
hidrocarbonadas, arreglos geomtricos de los lpidos en la membrana, etc.
Existen dos motivos por los cuales el campo elctrico es menor en el
medio material. En otras palabras, existen dos contribuciones que determinan
el valor de D. Por un lado, las molculas de este medio presentarn en general
dipolos permanentes que apantallarn la carga al reorientarse a su alrededor.
Por otra parte, aunque las molculas de este medio no posean dipolos
permanentes, sus nubes electrnicas ms externas son relativamente mviles
y pueden generarse dipolos inducidos por la interaccin con la carga. En este
caso, son los dipolos inducidos los que apantallarn la carga disminuyendo el
potencial elctrico.
Hay una amplia evidencia que indica que la fase acuosa adyacente a la
interfase entre una membrana y el medio acuoso presenta propiedades de
organizacin muy diferentes a las del agua libre y una constante dielctrica
diferente que determina cambios en las propiedades electrostticas del sistema
y en las fuerzas de atraccin-repulsin entre grupos cargados. Por ello, para
estimar la magnitud de cualquier fenmeno electrosttico que tenga lugar en la

23
interfase de una membrana es necesario conocer el valor de la constante
dielctrica en esa regin.

Objetivos
Estimar la constante dielctrica en la interfase de una membrana de
fosfolpidos y en micelas de detergente.
Discutir las diferencias entre las estructuras auto-organizadas que
pueden adoptar diferentes anfifilos: micelas y liposomas.
Discutir cmo afectan solventes de diferente constante dielctrica los
procesos de auto-agregacin de anfifilos y otros sistemas biolgicos.

Fundamento
Para la medicin de la constante dielctrica en interfases lipdicas se
utilizarn liposomas de fosfolpidos y micelas de un detergente neutro (Triton
X100) y uno con carga neta negativa a pH7 (dodecilsulfato de sodio, SDS).
Tambin utilizaremos una sonda solvatocrmica denominada merocianina 540
(MRC540, Figura 1). Colorantes del tipo de las merocianinas poseen curvas
espectrales que muestran corrimientos ante cambios en la polaridad del medio,
constituyendo as sondas tiles para estimar constantes dielctricas.

Figura 1. Estructura de la
merocianina 540

Estos compuestos dimerizan en medios de alta polaridad mostrando dos

picos mximos de absorcin a 535 nm (monmero) y a 505 nm (dmero). La
disminucin de la constante dielctrica del solvente produce un incremento en
el pico de absorcin correspondiente al monmero, junto con un corrimiento del
mismo hacia mayores longitudes de onda (corrimiento batocrmico, ver fig. 2).
En presencia de interfases lipdicas, MRC540 particiona segn el siguiente
esquema
M + M Dim Fase Acuosa
---------------- ----------------------------------------------------
M + M Dim Fase Membrana
donde M representa al monmero y Dim al dmero.

24
 Figura 2. Curvas de absorcin
de merocianina 540 en
diferentes medios.

Para poder realizar una correcta estimacin de la D en la interfase lipdica,

debe asegurarse un desplazamiento de este equilibrio hacia la fase membrana.
La constante dielctrica en la interfase lipdica se podr estimar por
comparacin de los max de absorcin de la MRC540 en presencia de las
muestras (liposomas de fosfatidilcolina, micelas de triton X-100 y de SDS, ver
figura 3) con los max de absorcin en mezclas de solventes de distinta
polaridad y de constante dielctrica conocidas (curva de calibracin).

Fosfatidil-colina

SDS

Triton X-100

Figura 3: estructura molecular de las sustancias a utilizar

25
Cuestionario de orientacin
1) Defina constante dielctrica.

2) El efecto de apantallamiento ocasionado sobre el campo elctrico generado

por una carga puntual q en tres dielctricos de distinta polaridad cuyas D son
las siguientes: D1=3; D2=30 y D3= 90 ser.
(a) Igual en las tres situaciones.
(b) Mayor en D2 ya que no hay repulsiones electrostticas.
(c) Menor en D1 ya que la alta polaridad potencia el campo generado por la
carga q
(d) Mayor en D3 ya que la alta polaridad disminuye el campo generado por
la carga q

3) El colorante merocianina MRC540 tiene propiedades solvatocrmicas ya que

su mximo de absorcin cambia en medios de diferente polaridad. Prediga
cualitativamente el desplazamiento en diferentes medios de acuerdo a su
criterio de polaridad sabiendo que mientras ms polar es el medio mayor es
el desplazamiento a zonas de mayor energa del espectro (corrimiento
hipsocrmico). Ordnelos tomando como referencia el Heptano (D= 1.92):
agua; cloroformo; etanol; heptano.

4) Con respecto a la pregunta anterior cmo esperara observar el espectro

de MRC540 en un interfase de lpidos aninicos con respecto a una interfase
de fosfolpidos neutros, suponiendo que la MRC540 se ubica en la zona
polar de la membrana? Esquematice las curvas espectrales.

Parte Prctica

Obtencin de la curva de trabajo max vs. D.

Tomar el blanco colocando 1 mL de solvente indicado en la tabla y
barriendo en el intervalo 485-585 nm.
Agregarle 7 L de MRC540 de solucin stock 500 M.
Realizar la curva espectral en el intervalo 485-585 nm.
Determinar el mximo de absorcin del monmero.
Completar la tabla y realizar el grfico.
Graficar max vs D en la grilla de abajo

26
 D max
Solvente
Cl3CH 4.8
Cl3CH:EtOH (12.5%) 9.0
ButOH 17.5
EtOH 24.5
agua:dioxano (55%) 27.0
agua:dioxano (45%) 36.0
agua:dioxano (35%) 46.0
agua:dioxano (25%) 57.0
agua:dioxano (15%) 69.0
agua:dioxano (5%) 78.0
agua 80.0

Estimacin de la constante dielctrica en liposomas de fosfatidilcolina

(PC).
Agregar a una cubeta espectrofotomtrica 800 L de buffer fosfato 10
mM pH=7.
Agregar 200 L de una solucin stock de liposomas de PC de huevo 1
mM en buffer fosfato 10 mM pH=7 a ambos tubos (concentracin final de
PC 0.2 mM).
Realizar el blanco para todo el intervalo de .
Agregar 7 L de MRC540 500 M a la cubeta.
Realizar la curva espectral y determinar el mximo de absorcin del
monmero.
Estimar la constante dielctrica a partir de la curva de calibracin.

La solucin stock de liposomas ser previamente preparada por los docentes

siguiendo el siguiente protocolo:
Colocar en un tubo la cantidad deseada de fosfolpidos a partir de una

solucin madre de concentracin conocida en cloroformo:metanol (2:1).

Evaporar el solvente bajo corriente de nitrgeno y campana de vaco

durante 1h.
Resuspender los fosfolpidos en buffer fosfato 10 mM pH=7.

Hidratar los fosfolpidos mediante shock trmico (alternando 90C/-

195C) durante 10 ciclos.
Enfrentarlos a 2 ciclos de sonicacin de 10 minutos cada uno con pausa

27
 de 5 min.
Conservar a 4C hasta uso.

Estimacin de la constante dielctrica en micelas de SDS y Triton X-100.

Agregar 1 mL de una solucin de micelas de SDS al 0.5% o Triton X-100

al 1% a dos cubetas espectrofotomtrica.

Realizar el blanco para todo el intervalo de en cada caso.
Agregar 7 L de MRC540 500 M a cada muestra.
Realizar la curva espectral y determinar el mximo de absorcin del
monmero.
Estimar la constante dielctrica de ambas muestras a partir de la curva
de calibracin.

28
Problemas de aplicacin

1. En cuanto estimara la energa de interaccin electrosttica entre dos

molculas de SDS adyacentes que tiene lugar en la interfase, en una micela
de composicin similar a la empleada en el prctico, conociendo que su
rea molecular es 23.7 2 y que la D es aproximadamente 33.

2. Un lpido monocido (pKa=3) con dos cadenas hidrocarbonadas de 16

carbonos cada una, tiene un rea molecular de 100 2 a 37C, y su
estructura de agregacin a pH=7 es una mesofase esmctica vesicular
(liposoma). Si la D=30, calcule:
(a) la energa de interaccin electrosttica carga-carga.
(b) la energa de dispersin de Van der Waals intermolecular
(c) la energa total de cohesin intermolecular
(d) qu ocurrira si se acidifica el medio (ajuste a pH 2)
(e) discuta si se podra modificar el rea molecular del lpido por un cambio
en el pH de la fase acuosa.

3. Un ion en solucin acuosa se encuentra estabilizado por interacciones con

los dipolos del agua. Removerlo de la solucin y trasladarlo a un medio de
baja constante dielctrica es muy desfavorable energticamente debido a la
prdida de esta energa de hidratacin. El modelo de Born permite calcular
la energa libre requerida (GB) para trasladar un ion de carga n y radio r
desde un medio de constante dielctrica D2 a otro de constante dielctrica
D1 con la expresin:
166 (.1 .) 2 1 1
= ( )( ) (5)
1 2
(a) Calcule la energa necesaria para introducir un ion inorgnico
monovalente de 2 de radio en el interior de la membrana lipdica.
Considere un valor de constante dielctrica para el agua y para el medio
lipdico de 80 y 2 respectivamente.
(b) Suponga que un pequeo pptido sin carga elctrica se une al ion
inorgnico formando un complejo esfrico de 20 de radio. Cunta
energa se requiere para introducir este complejo en la membrana?
(c) Considerando la distribucin de Boltzman (ecuacin 6) calcule el
cociente entre la concentracin de iones en la fase membrana y la
concentracin de iones en la fase acuosa a 25C. Haga este clculo para
el caso (a) y el caso (b). Discuta, dentro de este contexto, la
permeabilidad de iones a travs de membranas lipdicas.

29
 []
[]2
= (6)

Dato: R= 1.9872 x 10-3 kcal.mol-1.K-1

4. Cuando una protena se pliega, puede ocurrir que un residuo cargado que
en el estado desplegado est en contacto con el solvente, pase a ubicarse
en el interior de la protena donde la constante dielctrica es menor. Para
calcular el cambio de energa libre electrosttica que tiene lugar al mover un
residuo cargado desde el estado desplegado al estado nativo, realizamos el
ciclo de la Figura 3. Asumiendo un radio de 2 para la carga del
aminocido y de 30 para el radio de la protena,
(a) Calcule, utilizando la ecuacin de Born, la energa electrosttica de
cada paso.
(b) Mediante la ley distribucin de Boltzman, calcule la relacin entre
protenas en el estado A y D a 37 C.
(c) En base al resultado anterior discuta cuan probable es la existencia de
cargas aisladas en el interior de una protena.
Figura 3. En el cuadro A la
A B
+ + protena est desplegada y
al a. cargado lo rodea un
medio homogneo de D=80.
D=80 D=20 En el cuadro B la protena
desplegada est ahora en
un medio de D=20. En el
cuadro C la protena
D C plegada con su constante
D=20 D=20 dielctrica interior D=20 est
+ +
en un medio de D=20. En D
la protena plegada pasa a
D=80 D=20
un medio de D=80.

5. Cuando se induce un aumento de la temperatura a una suspensin acuosa

del lpido zwiterinico dipalmitoylfosfatidilcolina, ste sufre un cambio de
estado de fase de gel a lquido desordenado o L . Este cambio implica un
aumento del rea que ocupa en promedio cada molcula de 40 (fase gel) a
65 2/molcula (fase L).
(a) Calcule la energa involucrada en este cabio de fase considerando que su
principal componente est relacionado con un cambio en la energa
intermolecular de van der Waals.
(b) Discuta qu otros factores termodinmicos pueden estar involucrados en el
cambio de fase de dicho lpido.

30
31
 TRABAJO PRCTICO N4

Estructura del ADN y estabilidad de la doble hebra.

Introduccin

El cido desoxirribonucleico (ADN) es un polmero largo compuesto

por monmeros denominados nucletidos. Los nucletidos son molculas
orgnicas formadas por la unin covalente de un monosacrido de cinco
carbonos pentosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato, los cuales se
encuentran unidos alternativamente entre s mediante enlaces tipo ster (Fig
1). El ADN no suele existir como una molcula individual, sino como dmero.
Las dos cadenas complementarias de ADN se enrollan sobre s mismas
formando una doble hlice.

Figura 1: Enlace fosfodiester. El

grupo fosfto une al carbono 5 del
azcar de un nuclesido con el
carbono 3 del siguiente.

Al igual que en protenas, en la estructura tridimensional del ADN, se pueden

distinguir tres niveles:

Estructura primaria: Secuencia de nucletidos encadenados.

Estructura secundaria: Se refiere a la estructura en doble hlice. Ambas

cadenas son antiparalelas, pues el extremo 3 de una se enfrenta al extremo 5
de la otra. Las unin entre las dos hebras se encuentran estabilizadas por las
uniones puente hidrgeno entre las bases complementarias y por interacciones
hidrofbicas y de tipo van der Waals entre bases adyacentes de la misma
hebra. El ADN existe en muchas conformaciones, sin embargo, en organismos
vivos slo se han observado las conformaciones ADN-A, ADN-B y ADN-Z (Fig.
32
2). De las tres conformaciones, la forma "B" es la ms abundante en las
condiciones existentes en las clulas y es la descubierta por Watson y Crick.
Las dos dobles hlices alternativas del ADN difieren en su geometra y
dimensiones. La forma "A" es una espiral que gira hacia la derecha, como la
B, pero formando hlices ms amplias. En la forma "Z" las hebras giran
alrededor del eje de la hlice hacia la izquierda.

Fig. 2. De izquierda a derecha, las estructuras de ADN A, B y Z

Estructura terciaria: Se refiere a como se almacena el ADN en un espacio

reducido. Vara segn se trate de organismos procariotas o eucariotas.

Hibridizacin del DNA:

El proceso por el cual se combinan las dos cadenas de cidos nucleicos

antiparalelas y con secuencia de bases complementarias, para formar una
nica molcula de doble cadena se denomina hibridacin o renaturalizacin.

La doble hlice de ADN se mantiene estable mediante la formacin de

puentes hidrgeno entre las bases asociadas a cada una de las dos hebras.
Para ello, una de las bases debe presentar un " dador o donor" de hidrgenos
con un tomo de hidrgeno con carga parcial positiva (-NH2 o -NH) y la otra
base debe presentar un grupo "aceptor" de hidrgenos con un tomo cargado
electronegativamente (C=O o N). Los nucletidos de cada una de las dos
cadenas que forman el ADN establecen una asociacin especfica mediante
puentes de hidrgeno con los correspondientes de la otra cadena. Cada tipo de
base en una hebra forma un enlace nicamente con un tipo de base en la otra
hebra, por lo que se denominan hebras complementarias. Es decir, las purinas
forman enlaces con las pirimidinas, con lo que Adenina se enlaza slo con
Timina, y Citosina slo con Guanina.

33
 Los dos tipos de pares de bases forman un nmero diferente de pares
de hidrgeno: AT forman dos puentes de hidrgeno, y GC forman tres puentes
de hidrgeno (ver Fig. 3). El par de bases GC interacciona por tanto ms
fuertemente que el par de bases AT. Como consecuencia, tanto el porcentaje
de pares de bases GC como la longitud total de la doble hlice de ADN
determinan la fuerza de la asociacin entre las dos hebras de ADN. Dobles
hlices largas de ADN con alto contenido en GC tienen hebras que
interaccionan ms fuertemente que dobles hlices cortas con alto contenido en
AT.

Como los puentes hidrgeno no son enlaces covalentes, pueden

romperse y formarse de nuevo de forma relativamente sencilla. Por ejemplo,
pueden separarse por fuerza mecnica, alta temperatura o condiciones de pH
extremos. La temperatura en la cual el 50% del ADN se encuentra
desnaturalizado (Tm), es una medida de la fuerza de interaccin que mantiene
unida la doble hebra.

Figura 3. Un par de bases GC con tres puentes hidrgeno (izquierda) y

un par AT con dos puentes de hidrgeno (derecha). Los puentes de
hidrgeno se muestran como lneas discontinuas.

El proceso de hibridacin y desnaturalizacin puede seguirse

experimentalmente a travs de espectrofotometra UV ya que la absorbancia
de la solucin de ADN a 260 nm aumenta cuando las bases se desaparean.
Este aumento en absorbancia o corrimiento hipercromtico es debido a que la
absorbancia UV de las bases es una consecuencia de transiciones de
electrones , los cuales interaccionan cuando el ADN se encuentra hibridado.
La absorbancia de una mezcla de ADN doble y simple hebra se puede describir
mediante la siguiente expresin:

Abs Abs1 Abs2 (1 )

34
A1 es la absorbancia de la simple hebra y A2 es a absorbancia de la doble
hebra, y es la fraccin de bases desapareadas.

Factores que influyen en la estabilidad de la doble hebra:

Temperatura: Si se calienta una doble hebra de ADN, mientras se mide la

absorbancia a 260nm, puede observarse un aumento en la absorbancia que
coincide con la separacin de la doble hebra (Fig. 4). A temperaturas por
debajo y por encima de la hibridacin, ocurre un aumento de la absorbancia
que se debe a la dependencia del coeficiente de extincin del monmero y del
dmero con la temperatura. Las pendientes de estas regiones de la curva
generan la lnea de base (todo doble hebra / todo simple hebra) y pueden
extrapolarse a la zona media de la transicin (lneas punteadas en Fig. 4). La
temperatura a la cual la absorbancia alcanza el valor medio entre las
absorbancias de las especies dimricas y monomricas es la Tm (Fig. 4). En la
Tm la mitad de las hebras, en promedio, han hibridado.

0.48
Abs 260 nm

0.46

0.44

0.42

20 25 30 Tm 35 40 45
T / C

Figura 4. Curva de absorbancia en funcin de la temperatura.

Secuencia: como se dijo anteriormente, a medida que aumenta el porcentaje

de GC en la secuencia primaria, aumenta la estabilidad del duplex. Por ello, a
medida que el porcentaje de GC aumenta, tambin aumenta la Tm. Lo mismo
ocurre al aumentar el largo de la cadena del ADN.

35
Fuerza inica: Los grupos fosfato de cada hebra se encuentran cargados
negativamente por lo que se repelen en el ADN hibridado. En medios de alta
fuerza inica, esta repulsin se ve debilitada por apantallamiento de las cargas.
Por ello, a medida que aumenta la concentracin de sales del medio, la T m
tambin aumenta.

pH: A pH mayores de 11 las bases se deprotonan, rompiendo los puentes

hidrgeno que mantienen unido al duplex. De forma similar, a pH menores a 2
la protonacin de las bases perturba los enlaces de hidrgeno.

Viscosidad: La velocidad de hibridacin del DNA en solucin disminuye

cuando se incrementa la viscosidad del solvente. La naturaleza exacta del
efecto de la viscosidad en la velocidad de hibridacin no ha sido establecida,
pero, sin embargo la orientacin de dos bases y la subsecuente hibridacin y
formacin de puente hidrogeno debe ser una proceso limitado por difusin. El
efecto de la viscosidad se estudia agregando sucrosa, glicerol o etilenglicol,
debido a que estos no produce un cambio significativo en la Tm del DNA.

Parte Prctica:

Objetivo
Observar experimentalmente la dependencia de la energa libre de
hibridizacin del DNA con la fuerza inica del medio.

Fundamentos del Trabajo Prctico

En el presente trabajo prctico se analizar el porcentaje de

desnaturalizacin en funcin de la fuerza inica del medio para dos
oligonucletidos de ADN complementarios de 9 bases de largo. La secuencia
de cada oligonucletido a utilizar es:

A: 5 CTGAAGTCA 3
B: 5 TGACTTCAG 3

Para estos oligonucletidos, la temperatura de hibridacin (Tm) vara

desde 5 a 50C a medida que la concentracin de iones aumenta, partiendo de
agua pura. Es esperable entonces que a medida que aumente la concentracin
de sales del medio, el porcentaje de ADN hibridado a una temperatura fija
tambin aumente. Durante este trabajo prctico se determinar el porcentaje

36
de ADN hibridado en medios con diferentes concentraciones de NaCl, y a partir
de ese valor se obtendr la constante de equilibrio (K) de la reaccin de
hibridacin y el cambio de energa libre (G), para cada condicin.
Para ello se medir la absorbancia a 260 nm de soluciones de ambos
oligonucletidos por separado (simple hebra) y de muestras que contengan una
mezcla de ambos monmeros. En las muestras mezcla habr un equilibrio
entre las especies monmerica y dimrica, que depender de la concentracin
de sales en el medio.

Conociendo los valores de absorbancia de los monmeros de ADN (A1)

y la absorbancia del dmero (A2), puede calcularse la fraccin de bases
desapareadas ( ) segn:

2
= (1)
1 2

Para estimar A1 , se tomar como referencia la absorbancia de la soluciones de

cada monmero, y para estimar A2 la absorbancia de la mezcla de monmeros
en 1M NaCl (donde todo el ADN est en forma de doble hebra).

La constante de equilibrio para el equilibrio entre el dmero (AB) y los

monmeros (A y B) de ADN es:

[]
= [][] (2)

Si denominamos Ct a la concentracin molar total de monmeros ([A] +[B]) en

una mezcla equimolar de oligonucletidos complementarios, entonces:

1 1
[] = [] = (3) y [] = (1 ) (4)
2 2

entonces se puede obtener la siguiente expresin para K en funcin de nuestro

valor experimental :

2(1)
= (5)
2

Los valores de G correspondientes a cada valor de K, pueden

obtenerse mediante la ecuacin termodinmica general:

37
G RT ln K (6)

Cuestionario de orientacin

1) Defina efecto hipercrmico del DNA.

2) Qu porcentaje de bases estn desapareadas en la Tm?
3) Dado tres pares complementarios de oligonucletidos de DNA 1: 8pb Tm:
34.3C, DNA2: 16pb Tm: 64.1C, DNA3: 24pb Tm: 74.2C. Todos con el
mismo porcentaje de G+C. Indique verdadero o falso y justifique su
respuesta.
a) El H de hibridizacin es en valor absoluto mayor a medida que la
longitud del DNA aumenta.
b) A 37C y con fuerza inica NaCl 0.5M la fraccin de bases
desapareadas es mayor a medida que la longitud del DNA es mayor.
c) A pH 11 la fraccin de bases desapareadas es mayor que a pH
fisiolgico para los tres DNA.

4) Indicar los parmetros que estabilizan la estructura secundaria del ADN.

Procedimiento

Para observar la dependencia de la reaccin de hibridacin con la

concentracin de sales, en el prctico va a disponer de soluciones con distintas
concentraciones de NaCl y la misma concentracin del oligonucletido A y B.

Para cada concentracin de NaCl, medir la absorbancia a 260 nm de

500 L de la solucin de oligonucletido A. Luego medir la absorbancia de
soluciones formadas por una mezcla (realizada directamente en la cubeta) de
250 L de cada una de las soluciones de oligonucletidos A y B. Asegrese de
mezclar bien las soluciones con la pipeta antes de medir. Recuerde antes de
medir las muestras deben estar a temperatura ambiente.

A partir de los valores de absorbancia, calcular , K y G, segn

ecuaciones 1, 5 y 6. Para realizar sus clculos considere Ct = 6 M y R= 1,986
x 10-3 kcal/K.mol.

38
[NaCl] / Absorbancia Absorbancia K G
mM Oligo A Mezcla

100

250

350

500

1000

39
Problemas de aplicacin:

1) Se determin la Tm de molculas de ADN largas que contiene diferente

porcentaje de G+C en 0,2 M de NaCl y se encontr la siguiente relacin:
Tm C 69,3 0, 41 %G C
poner %(G+C)

110

100
Tm / C

90

80

70
0 20 40 60 80 100

Contenido relativo de G+C

a) El ADN de ratn y de rata tienen respectivamente 44% y 40% de (G+C).

Calcule la Tm en 0,2 M de NaCl.
b) Si desconoce si el ADN de la muestra es de rata o de ratn, de que
forma los podra identificar?
c) De que otra forma, adems de calor, se podra desnaturalizar la
muestra de ADN?

2) La Tm de un oligonucletido de ADN se calcula generalmente utilizando la

siguiente frmula emprica:
Tm (C) = 2(T+A) + 4(G+C)
Cual es la Tm para los siguientes oligonucletidos, A y B? Discuta la relacin
que existe entre el largo de la molcula de ADN y la Tm calculada.

Oligo A 5AAGTCTTAGTTCGTAGTA 3
Oligo B 5 GCGATCCGTAGGCGC 3

3) Grafique tres curvas de % de ADN hibridado en funcin de T (C) a pH = 2 a

pH = 7 y a pH = 12.

40
41
 TRABAJO PRCTICO N5

Estado nativo y desplegado de protenas.

Introduccin.

Las protenas se pueden encontrar fundamentalmente en dos estados, el

nativo y el desplegado. En el estado nativo, la protena tiene su cadena
peptdica organizada y se puede distinguir claramente en ella tanto estructuras
secundarias como una estructura terciaria. Estas estructuras no son rgidas,
sino que fluctan alrededor de una estructura promedio, que es la que se
observa con la mayora de las metodologas experimentales. Esta estructura
promediada es a la que nos referimos cuando hablamos de la estructura de la
protena. En el estado desplegado la cadena polipeptdica est desorganizada
y por lo tanto no tiene una estructura terciaria definida. Tampoco se observ
cantidades detectables de estructura secundaria en la gran mayora de las
protenas estudiadas con algunas excepciones. El gran cambio de organizacin
de la cadena peptdica hace que el volumen de la protena en el estado
desplegado sea mucho ms grande que en el nativo. Otra diferencia a notar
entre los dos estados es que en el nativo slo una fraccin de las cadenas
laterales y de las uniones peptdicas se encuentran en contacto con el solvente,
mientras que en el desplegado el solvente interacciona con la gran mayora de
ellas.
En una solucin de una dada protena, encontramos un equilibrio entre
su forma nativa y desplegada. Como todo equilibrio est caracterizado por una
energa libre de reaccin y su constante de equilibrio Keq asociada (ec. 1). En
condiciones fisiolgicas (37 C, pH 7), el estado nativo es el que predomina. La
energa libre de desnaturalizacin, que es la energa libre para el proceso de
desplegar el estado nativo, tpicamente toma valores de entre 5 y 10 Kcal/mol.
Estos valores son relativamente bajos comparados con otros procesos
bioqumicos, pero son lo suficientemente altos como para hacer que en
condiciones fisiolgicas la concentracin de protena en el estado desplegado
sea despreciable (problema 1).
[]
N D = [] = (1)

Desde el punto de vista termodinmico, el equilibrio entre el estado

nativo y el desplegado se asemeja a un equilibrio entre un slido y un lquido o
entre dos fases en general. Modificando las condiciones externas, por ejemplo

42
aumentando la temperatura, siempre hay un estado que predomina sobre el
otro, hasta que llega un punto en que se produce una inversin, y la
concentracin del estado que dominaba pasa a ser despreciable. En realidad
esta inversin no se produce en un punto, sino en un intervalo estrecho de
condiciones. Este tipo de comportamiento similar a todo o nada se llama
cooperativo.
La posicin del equilibrio se puede modificar variando las condiciones
del medio como ser la temperatura, la concentracin de ligandos especficos,
de cosolutos, cosolventes, o por cambios en el pH. Cambios en estas variables
pueden hacer tanto que el estado nativo se estabilice como que se
desestabilice. El principio de Le Chatelier ayuda a comprender los
desplazamientos del equilibrio producido por cambios en las condiciones del
medio. A continuacin se explican algunos casos. A temperatura fisiolgica
(37 C) la reaccin de desplegamiento es endotrmica (H positivo) para la
gran mayora de las protenas. Por lo tanto, un aumento en la temperatura
producir un desplazamiento del equilibrio hacia la derecha, estabilizando el
estado desplegado.
Existir entonces una temperatura a la que coexistan el estado nativo y
el desplegado en iguales concentraciones. Esta temperatura es la llamada
temperatura de transicin o de desnaturalizacin de la protena. Para
comprender el efecto del cambio de concentracin de las especies en el medio
es mejor enfocarnos en los equilibrios de las Figuras 1 y 2. Si una especie L
aadida al equilibrio entre N y D puede unirse a alguno de estos estados de la
protena, el estado en donde se produzca la unin resultar estabilizado frente
al otro, y el equilibrio se desplazar hacia el lado donde se produjo la unin.
Este desplazamiento ser ms pronunciado con un aumento tanto de la
concentracin de L como de su constante de afinidad (K L). Los ligandos
especficos de una protena actan siguiendo el esquema de la Figura 1, y
pueden producir efectos marcados en la estabilidad de la protena a
concentraciones muy bajas (micro o picomolar).

Keq
N D Figura 1: Sistema de equilibrios acoplados
+ cuando un ligando (L) se une al estado
L nativo (N) formando NL. En este caso, el
equilibrio se desplaza hacia la izquierda y la
KL
concentracin de protena en el estado
desplegado (D) disminuye
NL

43
 Existen ligandos que se pueden unir tanto al estado nativo como al
desplegado (Figura 2). Aqu el equilibrio se va a desplazar dependiendo de la
diferencia de afinidad y del nmero de sitios de unin del ligando a cada
estado. El cloruro de guanidinio y la urea son dos solutos que se unen con baja
afinidad a la cadena peptdica. Dado que en el estado desplegado el nmero
de uniones peptdicas expuestas al solvente son ms numerosas, existen ms
sitios de unin para estos solutos en el estado desplegado que en el nativo. Por
tanto una protena disuelta en una solucin de alta concentracin de urea o
cloruro de guanidinio se va a desplegar. Dependiendo de la protena, la
concentracin de urea o cloruro de guanidinio necesaria para desplazar el
equilibrio completamente al estado desplegado es de entre 3 y 8 M. En este
caso hablamos de la desnaturalizacin qumica de la protena.

Figura 2: Sistema de equilibrios acoplados

N D para el caso general cuando un ligando (L)
+ +
mL nL se une tanto al estado nativo (N) como al
desnaturalizado (D).

NLm DLn

El protn es otra especie que se puede unir a ambos estados de las

protenas. En este caso los sitios de interaccin son principalmente los
aminocidos bsicos (lisina, arginina, e histidina) y los cidos (asprtico y
glutmico). Para comprender la desnaturalizacin por disminucin del pH
realizamos el siguiente anlisis (Figura 3). Como ya se mencion, en el estado
desplegado las cadenas laterales se encuentran totalmente expuestas al
solvente, mientras que en el estado nativo muchos residuos estn ocultos del
agua. En este ambiente de baja constante dielctrica los aminocidos cargados
se encuentran en un estado de alta energa debido al gran trabajo elctrico que
hay que realizar para moverlos desde el seno de la solucin, donde
interaccionan fuertemente con el agua (ver problema de aplicacin 4 del TP3).
La alta energa de los residuos cargados en el interior de la protena hace que
su ocurrencia sea muy improbable. Por tanto podemos ignorar los sitios de
unin del protn a residuos que se encuentren en el interior de la protena. Esta
situacin es anloga a pensar que en el estado desplegado existen ms sitios
de unin al protn que en el estado nativo, por lo que un aumento en la
concentracin de protones provocar un desplazamiento del equilibrio hacia el
estado desplegado.

44
 + +
+ H+
+
Figura 3: El residuo en el interior de la protena (zona gris) no es fcilmente
protonable porque se encuentra en un medio de baja constante dielctrica
(izquierda). Al desplegarse la protena, el residuo se expone al solvente y su
protonacin es energticamente posible (derecha).

Objetivo

El objetivo de este trabajo pctico es caracterizar el cambio de volumen

molecular que sufre una protena al desplegarse. La protena a estudiar es la
Mioglobina, de peso molecular 17 kD. A pH 7 la Mioglobina se encuentra en su
conformacin nativa, mientras que a pH menores a 2.7 la especie que
predomina es la desplegada. El cambio de volumen se evidenciar por el
distinto comportamiento de la solucin de protena en una columna de
cromatografa de exclusin molecular equilibrada a los pH mencionados.

Fundamentos

Cromatografa de exclusin molecular en geles de dextrano.

Este tipo de tcnica cromatogrfica se utiliza para separar molculas por

sus diferentes tamaos moleculares. La columna se empaca con microesferas
de 10 a 300 m de dimetro de un polmero constituido por el entrecruzamiento
de molculas de dextrano. Estas partculas tienen gran afinidad por el agua y al
hidratarse forman un gel. En la cromatografa por exclusin, o de filtracin
molecular, la separacin se consigue a travs de la capacidad de las molculas
para ingresar a los poros de las microesferas del gel. En dichos poros, la
solucin tiene una menor velocidad de flujo y las molculas que ingresan en su
interior se retrasarn respecto de las que no pueden ingresar y fluyen por entre
las partculas del gel. La irregularidad en el dimetro de los poros hace que la
probabilidad de ingresar a stos dependa del tamao de la molcula. Las
pequeas pueden ingresar libremente a todos los poros, mientras las
molculas de tamao superior al dimetro mximo de los poros no lo hacen.

45
 Por analoga a otras tcnicas cromatogrficas, identificamos a la fase
estacionaria como el volumen de solucin encerrado en los poros del gel (Vs), y
a la fase mvil con el volumen de solucin que queda por fuera de las
partculas del ge (Vo o volumen de exclusin). Otros volmenes que se pueden
medir son el volumen acuoso total (Vaq), que es la suma de los dos anteriores,
y el volumen total de la columna, que es el volumen interior de la columna de
vidrio (Figura 4).

Figura 4: Definicin
de los volmenes
en una columna de
exclusin molecular.

Volumen de Volumen acuoso Volumen acuoso

exclusion Vo estacionario Vs total Vaq

Una dada protena cuyo tamao le permita ingresar en algunos de los

poros del gel, pasar parte del tiempo viajando lentamente en el interior los
poros, y parte viajando rpidamente por entre las partculas. El volumen de
solucin que deberemos gastar para eluirla de la columna se llama volumen de
elucin (Ve), y ser mayor al Vo, pero menor al Vaq. Para medir el Vo usamos el
azul de dextrano, que es una molcula polimrica coloreada de alto peso
molecular que no ingresa en ninguno de los poros. Para medir el Vaq usamos el
CoCl2 que puede ingresar libremente a todos los compartimientos acuosos en
el gel. El volumen estacionario es entonces Vs = Vaq Vo.
El valor de todos estos volmenes dependen no solo de las
caractersticas del gel sino tambin de las dimensiones de la columna que lo
contenga. Para estandarizar una medida que dependa slo de cunto se retuvo
nuestra molcula de inters en un dado gel, definimos la Kav (k average) como:
( )
= (2)
( )

Para protenas globulares en estado nativo existe una relacin

proporcional entre su volumen y su peso molecular, por tanto esta tcnica

46
cromatogrfica se emplea comnmente para separar protenas de acuerdo a su
peso molecular. En la fig. 5 se muestra la curva de calibracin para varios tipos
de matrices marca Sephadex segn su fabricante, que correlaciona el Kav y el
PM para protenas en su estado nativo.

Figura 5: Relacin entre Kav y el peso molecular de protenas nativas

globulares para geles de distinto tamao de poros.

En el proceso de desnaturalizacin de protenas, el cambio de volumen

que sufre la molcula hace que la protena desplegada pueda ingresar a un
menor nmero de poros del gel y por lo tanto su volumen de elusin sea menor
que el de la protena nativa, aunque su peso molecular sea el mismo.

Cuestionario de orientacin.
1. Cul es el porcentaje de protena en el estado desplegado que se
encuentra en equilibrio con el estado nativo a 37C, si el G de
desnaturalizacin es de 5 kcal/mol?

2. Con respecto a la cromatografa por filtracin molecular, defina: principio de

separacin, fase mvil, fase estacionaria, concepto de K average (K av),
volumen de elucin, volumen de exclusin (V0) y volumen vcuoso total (Vaq).
Cules de estos parmetros dependen de las caractersticas de la
columna cromatogrfica y cules no?

3. Cul es el valor mnimo y mximo que puede tomar K av? Qu relacin

existe entre el peso molecular y la Kav?

47
4. Para separar una mezcla de las siguientes protenas se utiliz una matriz de
Sephadex G-100, que excluye molculas con PM mayor a 100 kDa. J.S.R
(a) Qu protenas se separarn?
(b) En que orden eluirn las protenas de la columna?
Hemoglobina, PM=66 kDa.
Inmunoglobulina G, PM=150 kDa.

Quimiotripsingeno, PM=23 kDa.

G fosforilasa, PM=370 kDa.

5. Cul de las siguientes matrices para filtracin molecular elegira para

separar los componentes de la mezcla del problema 4?:
Sephadex G 50 (excluye molculas de PM mayor de 50 kDa)
Sephacril S 200 (excluye molculas de PM mayor de 200 kDa)
Sepharosa 6B (excluye molculas de PM mayor de 500 kDa).

Parte Prctica

Tcnica
Se dispone de columnas de geles de dextrano (Sephadex G-100) de 0.8 cm de
dimetro x 25 cm de alto. Estas han sido previamente equilibradas con NaCl
0.9% a pH 2.7 o pH 7, mediante el pasaje de 30 mL de esta solucin. Usando
el buffer de corrida, se debe regular el goteo de la columna a 1 gota/8-10 seg.
Importante: La columna no debe dejarse secar en ningn momento.

Determinacin de V0 y Vs.
Sembrar (colocar cuidadosamente en la superficie superior del gel) aprox. 0.3
mL de una solucin de la mezcla de Azul de Dextrano y CoCl 2. Recolectar los
primeros 2 mL en tubo graduado y luego colectar fracciones de 0.5 mL (una
gota = 0.05 mL). El volumen recolectado desde el momento de la siembra
hasta el tubo con mxima concentracin de azul de Dextrano (tubo con mayor
intensidad de color azul) es el volumen de exclusin Vo de la columna. El
volumen recolectado desde el momento de la siembra hasta el tubo con
mxima concentracin de CoCl2 (tubo con mayor intensidad de color rosa) es el
volumen total de fase acuosa Vaq de la columna. Vs, el volumen acuoso
dentro de las esferas de dextrano se calcula como Vs = Vaq - Vo.

Determinacin del volumen de elucin Ve de mioglobina a distintos pH.

Sembrar 0.2 mL de la solucin de protena. Desde el momento de la siembra,

48
recolectar 2 mL en tubo graduado y luego colectar fracciones de 0.5 mL en
tubos de Kahn. El volumen recolectado desde la siembra hasta que se eluy la
mxima concentracin de la protena es el V e. La Mioglobina a pH 7 se sigue
por su coloracin marrn, mientras que se evidenciar la presencia de
protenas desplegadas en las muestras a pH 2.7 por absorcin UV (registrar el
valor del pico de absorbancia entre 250-400 nm vs. nmero de tubo de elusin
y determinar el tubo en el cual hay mayor concentracin de protenas).

Determinacin de Kav y PM para mioglobina a pH 7.

Se determinar y compararn los valores de Kav segn la ecuacin (2) para las
muestras a pH 7 y 2.7. Discuta la variacin de los valores de Kav y de los
volmenes Vo y Ve entre los diferentes grupos de su clase. A qu se deben?

Problemas de aplicacin

1. El equilibrio entre el estado nativo y desplegada de cierta protena se

encuentra muy desplazado hacia el estado desplegado a temperaturas
mayores a la fisiolgica, de forma tal que la constante de equilibrio Kd es

igual a 102. Un ligando L se une al estado nativo con una muy alta afinidad
(constante de equilibrio KL igual a 1020). Los equilibrios generados son los
siguientes
N D Kd= 102
N+L NL KL= 1020

(a) Calcule la concentracin de especie nativa y desplegada en ausencia de

ligando, siendo la concentracin inicial de protena de 1 mM.
(b) Calcule la concentracin de especie nativa y desplegada para igual
concentracin inicial de protena si la concentracin de ligando es de 0,8
mM. Considere la concentracin de ligando libre despreciable y justifique
esta aproximacin con clculos.
(c) Explique a travs del principio de Le Chatelier las diferencias en los
valores de concentraciones encontrados en el item (b) respecto al (a).

2. En condiciones fisiolgicas, para esta misma protena se establece una

constante de equilibrio Kd igual a 10-4. En estas nuevas condiciones otro
ligando L se une al estado desplegado, estabilizndolo. Los equilibrios
generados son los siguientes
N D Kd= 10-4

49
 D+L DL KL= 106

(a) Calcule la concentracin de especie nativa y desplegada en ausencia de

ligando, siendo la concentracin inicial de protena de 1 mM.
(b) Calcule la concentracin de especie nativa y desplegada para igual
concentracin inicial de protena si la concentracin de ligando es de 0,1
M. De emplearlas, justifique las aproximaciones realizadas.
(c) Explique a travs del principio de Le Chatelier las diferencias en los
valores de concentraciones encontrados en el item (b) respecto al (a).

50
51
 TRABAJO PRCTICO N6

Interaccin Ligando-Receptor

Introduccin

En este trabajo prctico profundizaremos los conceptos relacionados a la

interaccin de ligandos con una macromolcula. Muchos de los procesos que
ocurren en la clula estn mediados por interacciones de molculas pequeas
(Ligandos) con macromolculas complejas como protenas, o cidos nucleicos
(Receptores). Generalmente se hace referencia a una interaccin ligando-
receptor. Ejemplos:

sustratos y cofactores con enzimas.

hormonas con sus receptores (estos pueden ser solubles o de

membranas).
molculas pequeas y sus transportadores.
iones con protenas, con nucletidos o cidos nuclicos.
O2 con hemoglobina.
unin del antgeno con un anticuerpo.

Los receptores hormonales son dispositivos sensores que traducen

seales extracelulares en eventos intracelulares. Como consecuencia de la
interaccin hormona-receptor las clulas proliferan, se diferencian o inclusive
mueren. Cuando la hormona se une al receptor se inicia una cascada de
eventos intracelulares destinados a llevar el mensaje hormonal. El efecto de
una hormona o droga (ligando) en una clula depende no slo de los niveles de
sta en sangre sino tambin de la presencia y caractersticas de sus
receptores, los cuales varan segn el tipo celular y una variedad de
condiciones. En el caso de una droga que se une a un sitio de unin de algn
ligando natural (hormona, etc.) desplazando al ligando, si sta induce una
respuesta fisiolgica similar se lo define como un agonista. Por el contrario, si
el anlogo se une al receptor desplazando al ligando natural pero sin inducir
una respuesta fisiolgica, estamos en presencia de un antagonista. Esto es
importante por ejemplo cuando se evala la administracin de una terapia.

Durante el presente trabajo prctico se discutirn equilibrios qumicos en

los que participan un ligando (L) y un receptor (R), para formar un complejo

52
ligando-receptor (LR) de acuerdo a: k on
L+R LR (1)
k off
Como en toda reaccin elemental, las velocidades de formacin y
desaparicin de LR se pueden escribir como
von k on LR
voff k off LR
En el equilibrio:
von voff
LRk on LRk off k on

LR K
k off LR
as

donde Kas es la constante de asociacin para la reaccin descrita en (1).

Tambin se puede definir la constante de equilibrio para la reaccin inversa, la
constante de disociacin:

K dis
1

LR 2
K as LR
La tendencia termodinmica para que la reaccin ocurra est dada por la
energa libre G:
LR
G G RT ln
L R
y G RT ln K as
Usualmente la constante de disociacin Kdis es ms utilizada. Una Kdis grande
significa que el receptor tiene una afinidad muy baja mientras que una Kdis
pequea significa una gran afinidad.
Definiremos ahora la ocupancia fraccional como la fraccin de receptores
ocupados con respecto al total:

LR 3
Rtotal

Actividad N1

Utilizando el balance de masa para R total y las ecuaciones (2) y (3)

demostrar que:

L 4
L K dis
Cuando la concentracin de ligando libre [L] es cero, = 0. Cuando [L] es
grande (muchas veces el valor de Kdis), =1. Cuando [L] = Kdis, = 0,5.

53
Estrictamente, no podemos llegar a la situacin en que el 100% de los sitios
estn ocupados por ligandos, pero en general decimos que los receptores
estn "saturados" cuando hay un gran exceso de ligando libre y la ocupacin
fraccional tiende a uno.
Combinando las ecuaciones (3) y (4) obtenemos que:

LR Rtotal Rtotal L 5
L K dis

1 Figura 1. Ocupancia fraccional en

funcin de la concentracin de ligando
libre.

0
[L]

Otra nomenclatura usada para [R]total y [LR] es: Bmax = [R]total y [b] = [LR].
En el caso de que el ligando se una a mas de un receptor, [b] incluye a todas
las especies acomplejadas por el ligando. Esta es la nomenclatura que
utilizaremos de ahora en ms en esta gua. Por lo tanto la eq. (5) se convierte
en:

Bmax L
b 6
L K dis
El modelo que estamos usando para describir la interaccin Ligando-Receptor
asume que:

Todos los receptores son igualmente accesibles al ligando

Todos los receptores estn libres o unidos. El modelo ignora cualquier
estado de unin parcial.
Ni el receptor ni el ligando son alterados por la interaccin.
La interaccin es reversible. Esto significa que un determinado ligando
puede ser desplazado del sitio de unin por el mismo ligando marcado
con un istopo radiactivo o por un anlogo de similar o mayor afinidad.

Las ecuaciones (4) y (6) tienen la forma de una hiprbola, como muestra la
figura 1 para , y se pueden linealizar de diversas formas. La ms empleada es

54
la llamada grfica de Scatchard, en donde se grafica el cociente entre las
concentraciones de complejo [b] y ligando libre [L] como funcin de la
concentracin de [b].

Actividad N2
Demuestre que [b] / [L] depende de [b] como indica la ecuacin (7) e indique el
significado fsico de la pendiente y de la ordenada al origen de la figura 2
(grfico de Scatchard).

Ligando unido b B K bK 7
Ligando libre L max as as

0 ,8
Figura 2. Grafico de Scatchard.
0 ,7

0 ,6
[L R ]/[L ]

0 ,5

0 ,4

0 ,3

0 ,2
0 ,5 1 ,0 1 ,5 2 ,0 2 ,5 3 ,0 3 ,5 4 ,0
[L R ]

Todo lo descrito anteriormente supone un receptor que posee sitios

idnticos e independientes, es decir que la interaccin de un ligando con su
sitio no influye en la interaccin de otro ligando por otro sitio. Existen muchas
condiciones en las que estas suposiciones no se cumplen y se encuentra
experimentalmente que el grfico de Scatchard no es una lnea recta. Por
ejemplo, puede existir ms de un receptor de diferente afinidad. En este caso
se pueden plantear los siguientes equilibrios:

L + R1 LR1 Kas1

L + R2 LR2 Kas2

En las Figuras 3 y 4 se muestra un sistema que posee dos receptores en igual

concentracin total pero uno posee una constante de afinidad 10 veces mayor
a la otra.

55
 [L] [b]

Figuras 3 y 4. Concentracin de ligando unido vs. Ligando libre y grfica

de Scatchard para un sistema con dos receptores de diferente afinidad.

Actividad N3
Para un sistema con un ligando L y dos receptores R1 y R2 de diferente afinidad
por L, considerando [b] = [LR1] + [LR2], Bmax1 = [R1]total y Bmax2 = [R2]total
demuestre que:

Bmax1 L L
b B
max 2 8
K dis1 L K dis2 L
Cuando en el sistema experimental hay agonistas o antagonistas, es
decir otro ligando que se une al receptor, existe una competencia entre ambos
por el mismo receptor. En este caso, se deben considerar los siguientes
equilibrios:
L+R LR KasL

M+R MR KasM

En donde L y M son dos ligandos que compiten por el receptor R con

constantes de disociacin KdisL y KdisM respectivamente. En la figura 5 se
observa la variacin de las ocupancia fraccional con [L] para dos ligandos de
diferente constante de disociacin.

56
 1.0

0.8

0.6

L
0.4
kL=0.2mM
kM=1mM
0.2 M= 0.01mM
M=5mM

0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

L
Figura 5. Ocupacin fraccional del receptor R con el ligando
L en presencia del segundo ligando M

Actividad N4
Deduzca la dependencia de las ocupancias fraccionales de cada ligando M y L
con la concentracin de ligando libre (ecuaciones (9) y (10)). Plantee el
balance de masa para receptor y escriba las concentraciones de los complejos
en funcin de receptor libre a partir de las Kdis.

L
L 9
L M 1
K disL
K disL K disM

M
M 10

K dis M
M L
1
K disM K disL
Por otro lado, cuando un receptor posee ms de un sitio de unin estos suelen
no ser independientes. Es decir que la unin de un ligando a uno de los sitios
influye la afinidad de un nuevo ligando por otro sitio del mismo receptor. A esto
se le llama cooperatividad. Supongamos un receptor con 4 sitios de unin,
como es el caso del sistema Hemoglobina-oxgeno. En un caso extremo de
cooperatividad podemos pensar que el receptor slo existe libre o con los 4
ligandos unidos; es decir que si un ligando se une al receptor, inmediatamente
se unen los otros tres o que los 4 ligandos se unen simultneamente. En este
caso la reaccin qumica a considerar es:
L+R LR
L + LR L2R
L + L2R L3R

57
 L + L3R L4R

Si los ltimos tres equilibrios son estn muy desplazados hacia los respectivos
complejos, entonces es equivalente a considerar 4L + R L4R

Por lo tanto la constante de disociacin es:

[]4 []
=
[4 ]
Con lo cual, la ocupancia fraccional es:
[]4
= []4 (11)
+

En la figura 6 (curva n=4), se muestra la variacin de con [L] segn la

ecuacin (11). Note que cuando [L] es baja cambia poco con [L] ya que el
receptor tiene baja afinidad por el ligando en estas condiciones. Por el
contrario, a mayores [L], la pendiente de vs. [L] aumenta. Esto es porque la
unin de un ligando en un sitio de unin del receptor aumenta la afinidad de
otros ligandos en los sitios vacantes del mismo receptor. Este fenmeno se
denomina cooperatividad.
Experimentalmente se observa que el comportamiento real de receptores
cooperativos no es tan extremo como el antes citado sino intermedio entre este
y el otro caso extremo de sitios completamente independientes. Para
generalizar la ecuacin (11) reemplazamos el 4 por un nmero n llamado
coeficiente de Hill (en honor a Archibald Hill), como muestra la ecuacin (12).
Este coeficiente se determina experimentalmente. Como ejemplo, para el
sistema Hemoglobina-oxgeno antes mencionado se ecuentra un valor de n de
2,8, el cual demuestra un comportamiento intermedio entre los dos casos
extremos de n = 1 o 4.

= []
[]
(12)

+

Figura 6. Variacin de la ocupancia

fraccional con la concentracin de
ligando libre para diferentes coeficientes
[L]
de Hill.

58
 Para estudiar la afinidad de un ligando por un receptor (Kdis) o evaluar la
cantidad de receptor en una muestra ([B].max), necesitamos obtener
informacin sobre la cantidad de ligando unido ([b]) y ligando libre ([L). Esto se
consigue incubando la muestra que contiene al receptor con el ligando
generalmente manteniendo constante la cantidad de receptor y variando la
cantidad de ligando total. Para ello disponemos de una gran cantidad de
estrategias experimentales que se adaptan a las caractersticas de cada
sistema particular en estudio. Un mtodo de eleccin es provocar la
sedimentacin del complejo LR (y tambin de R) y analizar la cantidad de
ligando en el precipitado [b]. En todos estos casos debemos contar con algn
mtodo analtico para medir la cantidad de ligando presente. En algunos casos
el ligando tiene alguna propiedad espectroscpica distintiva que facilita la
medicin de su concentracin. En otros casos se lo puede marcar
agregndole una pequea proporcin de molculas anlogas (con la misma
afinidad por el receptor) pero que contenga un grupo fluorescente o radiactivo.

Problemas de aplicacin
1. La concentracin de 17 -estradiol (lo llamaremos L) en plasma de una
-11
mujer en edad reproductiva es de aproximadamente [L]= 6,5x10 M.
L -13
Sabiendo que la Kd del receptor de estrgenos R es 5x10 M calcule la
L
fraccin de receptores ocupados ( ).
2. Si una mujer joven consume anablicos esteroideos (lo llamaremos ligando
M -12
M) que tienen una Kd = 1x10 M por el receptor de estrgenos R y el nivel
-10
en plasma promedio es [M]= 5x10 M Cul es la fraccin de receptores
M
estrognicos ocupados por el anablico considerando la presencia de L
L
segn el punto anterior?. Calcule tambien en presencia de M.
3. La albmina srica es la protena ms abundante del plasma humano y
transporta muchos compuestos endgenos (como la bilirrubina) y exgenos
(como el diazepam y la aspirina). Las molculas de drogas que no estn
unidas a la albmina son las que ejercen la accin farmacolgica y las que
son txicas.
(a)Una concentracin en plasma de aspirina libre mayor que 100 mg/l
indican una intoxicacin aguda y se recomienda hemodilisis. Cul es la
concentracin de sitios libres conociendo que la concentracin de
albmina en sangre es 35 g/l y su peso molecular Mr 66.000, que el peso
molecular de la aspirina es 180, que la interaccin albmina-aspirina tiene

59
 una estequiometra uno a uno y una Kd= 5x10-6M?.
(b)Que fraccin de albmina tiene unida bilirrubina en condiciones
fisiolgicas? Datos: peso molecular de la bilirrubina 585, Ka= 1,4x108 M-1
estequiometra uno a uno, concentracin normal de bilirrubina es menor
de 7,5 mg/l (haga el clculo para 5 mg/l de ligando libre).

Parte Prctica:

Objetivos
Calcular los parmetros que describen el equilibrio correspondiente a la unin
del ligando 1-anilino-8-naphthalene sulfonato (ANS) con albumina srica bovina
(ASB) y estimar cuantos tipos de sitios de unin presentan y cul es su
estequiometra.

Fundamento.
En este trabajo prctico utilizaremos un ligando fluorescente, el 1-anilino-
8-naphthalene sulfonato (ANS) y estudiaremos su unin a albumina srica
bovina (ASB). Como se estudi en el TP2, el ANS es un fluorforo
extremadamente sensible a la polaridad de su entorno y su fluorescencia sufre
un corrimiento batocrmico.
Debido a que prcticamente no fluorece en agua pero si en un entorno
apolar es utilizado para monitorear unin de ligandos a superficies hidrofbicas
de protenas. La ASB es una protena cuya funcin in vivo es el transporte de
metabolitos hidrofbicos a los diferentes tejidos, por lo tanto el estudio de la
unin de pequeos ligandos a ASB provee informacin sobre la funcionalidad
de esta protena. Por lo tanto estudiaremos la unin de ANS a ASB, descrita
como:
ASB + n ANS ASB-ANSn

Llamaremos [ANS]L a la concentracin de ANS libre y [ANS]U a n veces

[ASB-ANSn] es decir la cantidad de ANS unido a ASB. Cuando ANS se une a
un sitio hidrofbico en la superficie de ASB su eficiencia de fluorescencia
aumenta significativamente, por lo tanto la fluorescencia observada proviene
principalmente del ANS unido. En la figura 7 se muestran los espectros de
excitacin y emisin de la fluorescencia intrnseca de ASB. Como se puede
observar los mximos de emisin y excitacin de la protena ocurren a menores
longitudes de onda y no afectan la medicin de fluorescencia de ANS.
Existe una relacin lineal entre la intensidad de la fluorescencia (F ) y la
concentracin del fluorforo (C) en soluciones diluidas segn:

60
 F=aC (13)
donde a es un factor de proporcionalidad experimental. Esta relacin ser
utilizada en el trabajo prctico para calcular [ANS]U.

Figura 7. Espectros de excitacin (lnea continua) y emisin (lnea

punteada) de ANS en etanol; exc=370 y em=475. Como
comparacin se grafican los espectros de excitacin y emisin de
ASB (*); exc=280 y em=340.

Materiales y Mtodos.
Se utilizara una solucin stock de ASB 15 M (PM 66 KDa, SIGMA
6793) conservada a 4 C y una solucin stock de ligando ANS de 1 mM (PM
299 Da; sal de amonio SIGMA 10417). Tanto ASB como ANS se encuentran
solubilizados en NaCl 0.2 M, pH7. Para la cuantificacin de ANS se mide
absorbancia a 372nm en metanol, = 7.8 x 103 M-1.

Determinacin de la concentracin de ANS libre y unido a partir de

mediciones de fluorescencia.
Para la cuantificacin de [ANS]U realizaremos una curva de RFU vs
ANStotal en condiciones de exceso de ASB. En estas condiciones la
concentracin de ANS ser mucho menor a la Kdis y asumiremos que todo el
ANS se encuentra unido a la protena. Por lo tanto utilizaremos la intensidad de
fluorescencia medida en estas condiciones como curva se calibracin y
calcularemos el factor de proporcionalidad a correspondiente a la ec. 13.
Realice las diluciones indicadas en la tabla 1. Mida la intensidad de
fluorescencia (RFU) en cada tubo a em=475nm y excitando a exc=370nm.
Grafique RFU vs ANStota y obtenga el factor a.

61
Tabla 1
Tubo Solucin
ASB (L) salina (L) ANS (L) RFU [ANS]total

No (15 M) (NaCl 0.2M) (1 mM) 475 nm (M)

1 250 2250 0.0

2 250 2250 2.0
3 250 2245 3.5
4 250 2245 5.0

Realice las diluciones indicadas en la tabla 2 y mida RFU para obtener la

cantidad de [ANS]U en funcin de la concentracin de [ANS]L.

Tabla 2
Solucin []
[]

ASB salina ANS
RFU [ANS]total [ANS]U [ANS]L
Tubo (L) (L) (L)

(M) (M) (M)

No (15 M) (NaCl 0.2M) (1 mM) 475 nm
1 250 2250 0
2 250 2250 6
3 250 2240 9
4 250 2240 12
5 250 2220 20
6 250 2210 35
7 250 2200 50
8 250 2150 100
9 250 2100 150

Calcule la concentracin de [ANS]U utilizando el factor a obtenido

previamente y la concentracin de ANS libre segn: [ANS]L =
[ANS]TOTAL - [ANS]U.
Grafique [ANS]U vs. [ANS]L y mediante regresin no lineal obtenga los
valores de Kas y Bmax segn la ecuacin (6).
Compare la concentracin de ASB en sus tubos con la Bmax e indique
cuantos sitios de unin tendra cada molcula de ASB.
Grafique [ANS]U/[ANS]L vs. [ANS]U (Grafico de Scatchard) e interprete
si ASB posee slo uno o ms de un tipo de sitios de unin para ANS.

62
63
 Terico Prctico de Biofsico-Qumica
Seminario de Ejercicios No 1
Aulas: B7 y B12. Horario y da: ver cronograma. Material necesario: gua de Trabajos Prcticos
(TP1-TP6) y calculadora

Problema 1: Potencial de Lennard-Jones, radio y rea de equilibrio y

nmero de agregacin en vesculas.

El potencial de Lennard-Jones describe la variacin del potencial de

interaccin con la separacin entre una molcula con las molculas adyacentes,
como por ejemplo molculas anfiflicas organizadas en una membrana. Se
describe como:

U ( r ) A / r 6 B / r12 (ec. 1)

donde A y B son coeficientes obtenidos empricamente y r es la distancia de

separacin entre las molculas.
a) Encuentre la expresin analtica para r = re donde la energa se encuentra
en su mnimo valor (equilibrio) Umin.
b) Calcule numricamente la separacin de equilibrio re sabiendo que para la
interaccin entre estos anfifilos se conocen los siguientes valores de
A=2,047x10-21 Jnm6 y B = 1,690x10-23 Jnm12

c) Calcule la energa de interaccin Umin en dicho punto.

d) Calcule las poblaciones relativas de monmeros y agregados asumiendo
la distribucin de Boltzmann a partir del valor de Umin a 25C. Considere que
la diferencia de energa se debe solo a la contribucin de Lennard-Jones
asumiendo que a r= U=0. kB = 1,38 x 10-23JK-1

e) Explicar esto la agregacin del anfifilo cuando se suspende en agua?

El siguiente es un grfico de la distribucin de radios de vesculas de este anfifilo,

obtenido a partir de dispersin de luz.

64
 Figura 1: distribucin de
tamaos de vesculas
Frecuencia unilamelares de anfifilo medido
por dispersin dinmica de luz.

Radio (nm)

f) Conociendo el radio vesicular (rv) y el radio de separacin entre las

molculas (re), calcule el nmero de agregacin para una vescula
promedio. Modelice la vescula como una esfera y la molcula como un
cilindro.

g) Si estas vesculas a una concentracin total de anfifilos de 5 mM son

incubadas con una protena, esta muestra una unin a las vesculas con
saturacin a una concentracin de 20 M. Cul es el rea libre promedio
que necesita una molcula de protena para unirse a la superficie de la
vescula?Cuntas protenas se unirn a cada vescula?

Problema 2: Interaccin entre ADN y protenas

Algunas estructuras tridimensionales se repiten en distintas protenas y

son responsables de su interaccin con secuencias especficas de ADN. A estas
estructuras se las denomina "motivos estructurales". Los principales motivos
responsables de la interaccin con el ADN son: Hlice-giro-hlice, Hlice-bucle-
hlice y Dedo de zinc.
Todos ellos tienen la propiedad de interactuar con el ADN a travs de tres
tipos de interacciones bsicas:
1. Mediante interaccin electrosttica atractiva de largo alcance entre los
aminocidos bsicos (arginina, lisina e histidina) con la superficie con carga
negativa del ADN (debido a sus grupos fosfatos) e interacciones repulsivas de
corto alcance.
2. Interacciones de corto alcance entre los anillos aromticos de los
aminocidos tirosina, triptfano y fenilalanina con los anillos de las bases pricas
y pirimdicas cuando stos se orientan paralelos.

3. Por formacin de puentes H entre las bases y las cadenas laterales de

los aminocidos.

65
 El interior de la doble hlice de ADN es accesible a travs de los dos
surcos caractersticos de su conformacin B. Esto permite un reconocimiento
directo de los pares de bases y por ende de la secuencia de ADN.

Surco mayor

A A D A D A D

A D A A D A

Surco menor

Figura 2. Donores (D) y aceptores (A) de puente H expuestos en el surco mayor y

menor de los pares de base GC (izquierda) y AT (derecha) en la estructura B del ADN.
En base a donores y aceptores, se pueden discriminar los cuatro pares (AT, TA, CG y
GC) nicamente en el surco mayor.

Los tomos disponibles en las bases pueden ser donores (D) o aceptores
(A) de protones, de modo que cada par de bases se puede traducir a una
secuencia de Ds y As de forma perpendicular al surco. Hay cuatro diferentes
posiciones de tomos A o D en las bases en el surco mayor y tres en el surco
menor, como muestra la Fig. 2 y Tabla 1.

Pares de Surco mayor Surco menor

bases
(1) (2) (3) (4) (1) (2) (3)

AT A (N7) D (N6) A (O4) D (C5) A (N3) D (C2) A (O2)

TA D (C5) A (O4) D (N6) A (N7) A (O2) D (C2) A (N3)

GC A (N7) A (O6) D (N4) A (N3) D (N2) A (O2)

CG D (N4) A (O6) A (N7) A (O2) D (N2) A (N3)

Tabla 1: Detalle de dadores (D) y aceptores (A) de puente H que exponen los
distintos pares de bases de forma perpendicular a los surcos mayores y menores
del ADN conformacin B. Entre parntesis se detalla el tomo de cada base
responsable de esta interaccin.

66
 Como se desprende del anlisis de la Tabla 1, el surco menor no puede
ser la regin donde ocurra la discriminacin entre los cuatro pares de bases
dentro de la secuencia de ADN ya que todos los pares tienen la secuencia ADA.
Por otro lado, el surco mayor s muestra diferencia de posibles dadores y
aceptores de protones entre los cuatro pares de bases, dando la posibilidad de
que una protena se una especficamente a una secuencia dada por optimizacin
de estos enlace H en el surco mayor.

De modo elemental, la especificidad de la unin protena-ADN puede ser

cuantificada por el mnimo numero de nucletidos (n) necesario para definir un
sitio nico en el genoma (S). Si asumimos igual probabilidad de encontrar cada
una de las cuatro bases, la probabilidad de encontrar a una determinada base
en cada lugar de la secuencia del sitio es 1/4, y la probabilidad de encontrar la
secuencia correcta o especfica de un sitio que consta de n nucletidos es (1/4)n.
Para un genoma de N pares de bases (donde Nn), un sitio de n pares de bases
1
aparece con una frecuencia (fS) definida por: = (4) (ec. 2)

Para que este grupo de n nucletidos con una secuencia especfica (que
es nuestra regin de interaccin) sea nico entre todo el genoma (N), entonces
1 ln
1 = (4) (ec. 3) y = (ec. 4).
ln 4

a) Calcule el largo de la secuencia de nucletidos (n) necesaria para

codificar un nico sitio de reconocimiento de protenas en el genoma de E. coli
que contiene 4x106 pares de bases.

b) Calcule la frecuencia con la cual aparecer un sitio especfico de 8 pb,

en el genoma de E. coli.

Consideremos que una protena se puede unir, principalmente mediante

interacciones electrostticas, a cualquier parte del genoma con un G1. La
probabilidad de que estos sitios no especficos estn ocupados es:
1
() ( )
1 = (ec. 5)

Adems, la protena puede unirse a los sitios especficos con un G2. Por
lo tanto la probabilidad de que los sitios especficos estn ocupados ser:

2
( )
2 = (ec. 6)

67
 La probabilidad de encontrar protena unida a los sitios no especficos, en
presencia de sitios especficos, est dada por:
1
= (ec. 7)
1 +2

La ocupacin preferencial de los sitios especficos en presencia de los no

especficos estar determinada por la magnitud de la diferencia de energa libre
entre ambos sitios, es decir: G =G2-G1 0. Si nN, la ec. 7 puede escribirse
como:

1 ( )
=1+ (ec. 8)

c) Encuentre una expresin para G en funcin de N y n.

d) Calcule el G a 250C que sera necesario para que la secuencia

especfica de copia nica y largo n (obtenido en el punto a) tenga una ocupacin
100 veces mayor que el resto del genoma (P=10-2). R=1,987 cal /mol.K.
e) Suponiendo que la protena optimiza los 4 puentes H con los tomos
correspondientes expuestos en el surco mayor (Tabla 1), deduzca cuntos
puentes H se perdern entre la protena y el ADN si en el sitio de interaccin
especfico ocurre una mutacin de modo que el par TA es reemplazado por GC.

f) Si cada puente H equivale a una energa de interaccin de 1.5 kcal/mol,

calcule la energa de interaccin de la protena con la secuencia mutada
planteada en (e).
g) Calcule la probabilidad (P) de que los sitios no especficos estn
ocupados con la protena en el genoma de E. coli mutado en el sitio de
interaccin especfica.

68
69
 Terico Prctico de Biofsico-Qumica
Seminario de Ejercicios No 2
Material necesario: gua de Trabajos Prcticos (TP1-TP6) y calculadora

Problema 1: estabilidad de protenas

Determinar la estabilidad conformacional de una protena requiere
calcular el trabajo necesario para alterar la estructura del estado nativo (N), el
cual est dado por la energa libre de desnaturalizacin (GD ). El desplegamiento
puede considerarse como una transicin orden-desorden cooperativa, donde
solo dos estados estn significativamente poblados: el estado Nativo (N) y el
desplegado (D):
KD [D]
N D KD = (ec. 1)
[N]

GD = RTlnK D = HD TSD (ec. 2)

donde , , y son la constante de equilibrio, la energa libre, la

entalpa y la entropa de desnaturalizacin, respectivamente.

a) Sabiendo que la temperatura de desnaturalizacin ( ) es la T de

equilibrio donde la fraccin de molculas en el estado D iguala a la del
estado N indique cunto vale y a esa temperatura.

b) Encuentre la expresin analtica para .

Se estudi la desnaturalizacin trmica de ribonucleasa T1 (RNAsaT1,

endonucleasa de hongo que cliva ARN de simple hebra en el extremo 3 de
residuos guanina) mediante un mtodo espectroscpico, en donde la observable
Y es sensible al estado conformacional de la protena. En la figura 1 se muestran
los valores de la observable correspondientes al equilibrio de desnaturalizacin
en el intervalo de temperatura estudiado.

c) Seale en dicho grfico la e indique que estado conformacional

predomina en cada regin.

70
 YD

Yx =

YN

Figura 1: Curva de desnaturalizacin trmica de RNAsaT1.

A partir de dicha curva se calcul la fraccin de protena en estado D ( ) a cada

temperatura, los cuales se incluyen en la siguiente tabla.

T (oC) fD KD GD (cal/mol)
45,4 0,197

46,3 0,277

47,2 0,371

48,1 0,472

49,0 0,575

49,9 0,673

50,8 0,757

51,7 0,828

d) Calcule y . R=1,987 cal /mol.K

e) Cmo es la dependencia de G vs. temperatura?cul es el significado de

esta dependencia?. Calcule , y

f) Calcule y a 25 oC.

Una caracterstica de la desnaturalizacin de protenas es que la exposicin de

residuos hidrofbicos al solvente debido al desplegamiento de la cadena produce
un incremento de la capacidad calorfica (Cp ). De manera que la variacin de

71
GD tiene una dependencia ms compleja con la temperatura que la considerada
en la ec. 2, de acuerdo a:
T
GD = Hm + Cp (T Tm ) T [Sm + Cp ln(T )] (ec. 3)
m

donde Tm se ha tomado como temperatura de referencia y Hm y Sm son los

valores de entalpa y entropa a esa temperatura.

Cp puede estimarse a partir de la secuencia primaria de la protena segn

la siguiente ecuacin:

Cp (172 + 17,6N 164 SS) cal/mol.K (ec. 4)

donde N es el nmero de aminocidos y SS es el nmero de puentes disulfuros.

g) Sabiendo que RNAsaT1 contiene 104 residuos y 2 puentes disulfuro, calcule
a 25 oC.

Problema 2: estabilidad de protenas inducida por ligandos

Muchos procesos celulares dependen de la interaccin transciente entre
una protena y un ligando de bajo peso molecular. Esta interaccin tiene
consecuencias inmediatas en la termoestabilidad de la protena dado el
acoplamiento de los equilibrios de desnaturalizacin y de formacin de complejo
(ec. 5)

+
L (ec. 6)

NL

Como todas las especies de protena nativa pueden desnaturalizar, la constante

de desnaturalizacin efectiva ( ) ser:
[]
= ([]+[]) (ec. 7)

a) Explique mediante el Principio de Le Chatellier como se modificar la

termoestabilidad del estado N en presencia de ligando segn el equilibrio
planteado.

b) Puede predecir de que depender la magnitud de este cambio?

c) Exprese en funcin de y .

72
 d) Cunto vale a T= ? Cunto vale a T= ?

Para derivar una expresin matemtica que nos permita conocer la nueva
temperatura de desnaturalizacin en presencia de ligando ( ) asumiremos que:

I. Cp=0 y por lo tanto es independiente de la temperatura

II. Hb=0 y por lo tanto es independiente de la temperatura

f) Encuentre la expresin analtica para integrando la ecuacin de vant

Hoff para el equilibrio de desnaturalizacin (ec. 8) evaluando en las dos
temperaturas de inters: y


= (ec. 8)
1

Se determinaron las constantes de asociacin de dos mononucletidos

fosfato (2GMP y 2CMP) con la protena RNAsaT1 a 25 0C. Los valores
obtenidos fueron: 2GMP =5,8x105 M-1; 2CMP =7,7x102 M-1.

g) Complete el siguiente cuadro sabiendo que T=25 0C y [RNAsa T1]= 5 M.

[L]tot
2GMP 2CMP
(M)

[L] (M) TmL (0C) [L] (M) TmL (0C)

0 0 0

50 45.2 49.8

h) Explique los resultados obtenidos en el punto anterior.

73