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Analyse spectroscopique
Stephanie Bonneau
Stephanie.bonneau@upmc.fr
http://stephanie.bonneau.free.fr
Plan du cours
1
1- interaction lumire matire A- Bases physiques de la lumire
Une forme dnergie
petits paquets discrets : les quanta -> photons
Propage par vagues
Vitesse (c)
Radiation lectromagntique
Longueur donde croissante = nergie par quantum dcroissante
E
E 400 500 600 700
1 10 102 103 104 105 106 nm
lectron
E rotation < E vibration < E lectronique chimique < E lectronique atomique
noyau
Mouvements dans la molcule Elle peut interagir avec les diples stables ou induits,
Polarisabilit / polarisation et donc avec la matire
Liaison chimique
Quand un photon rencontre une molcule, il peut tre Rflchi Pas deffet
Transmis (il traverse)
tat excit S2 Absorb
tat excit S1
tat fondamental S0
Seuls les photons dont le quantum dnergie correspond un des niveaux dnergie autoriss
de la molcule peuvent tre absorbs. Ce phnomne est discret.
2
1- interaction lumire matire C - Conclusions
E E
Extraction des e- des Saut lectronique sur Saut d'un niveau lectro- saut d'un saut d'un
couches lectroniques orbitale molculaire . nique dans une orbitale niveau de niveau de
de latome Formation de radical libre molculaire dlocalise vibration rotation
Complexit
Spcificit biologique due leur conformation et aux mouvements autoriss
E (liaisons etc) ractions, en fonction des paramtres
thermodynamiques et biologiques
Cas particuliers : certaines captent et transforment lE lumineuse (ex. : chlorophylles)
Milieux aqueux
protine
lipide
Acide nuclique
3
3- Sp. absorbance UV-visible A Principe et lois gnrales
Trs utilise
Rpond des problmes simples (dosage concentration)
Rpond des problmes complexes (structure et mouvement des molcules)
l
Fente Enregistrement
Dtecteur
I0 I
C
Loi de Beer-Lambert
A une longueur donde donne () : Trajet optique (cm)
A = .l.C
Transmission I Concentration
T = x 100 (mol.L-1)
ou transmittance Coefficient dabsorption molculaire
I0 ou dextinction molaire (L.mol-1.cm-1
ou cm2.mol-1)
Absorbance I Milieu I T A
ou Densit optique A = Log10
ou Extinction transparent I0 100% 0
I0
opaque 0 0%
Spectre dabsorbance :
S2 Courbe de niveau auquel le
compos absorbe la lumire
en fonction de la longueur
donde
S1 Abs.
S0
(Exemple : figure 3)
4
3- Sp. absorbance UV-visible C - Les chromophores a - lmentaires
* Dans le n-heptane
Protines :
- liaison peptidique 180 230 nm
- R dans mme rgion spectrale
- sauf Tyr, Phe et Trp abs.
5
3- Sp. absorbance UV-visible C - Les chromophores b biologiques (2)
Quest-ce quon
3- Sp. absorbance UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b -dosage
a biologiques (2)
A = .l.C
6
Quest-ce quon
3- Sp. absorbance UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b -dosage
a biologiques
(suite)
(2)
A = .l.C
A
1- On connat : mesurer A et calculer C A = .l.C C=
.l
2- On ne connat pas :
2.1- Mthode par comparaison avec un talon unique (solution de concentration connue)
2.2- Mthode avec une gamme d'talonnage : gamme de dilutions courbe d'talonnage A = f(c)
(A)e1 = .l.Ce A
(A)e2 = .l.Ce/5 A Dtermination graphique
(A)e3 = .l.Ce/10
etc puis mesure de A C
c
permet de vrifier la linarit, et tient compte des ventuelles erreurs de manipulation (trac d'une droite statistique)
Quest-ce quon
3- Sp. absorbance UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b - environnement
biologiques (2)
7
3- Sp. absorbance IR
4- UV-visible A - Principes
Une molcule soumise une radiation infrarouge la structure molculaire se met vibrer
Transitions nergtiques :
- entre les niveaux dnergie de rotation (20 250 m i.e. 500 40 cm-1)
- entre leurs niveaux dnergie de vibration (1 20 m i.e. 10000 500 cm-
1)
Spectroscopie
UV-visible
Spectroscopie IR
3- Sp. absorbance IR
4- UV-visible B - Spectres et informations
T T
= 1/ = 1/
!
acides amides
ester
aldhydes et ctones
(aliphatiques puis aromatiques)
Mthode qualitative:
Informations structurales et/ou puret du produit
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5- Sp. de fluorescence A Principe et lois gnrales
Plus sensible que labsorbance (1000 10 000 fois); Par rapport une base zro
Rapidit : abs (10-15s) et fluo (10-9s) on voit certains mouvements
Monochromateur 2
Enregistrement Dtecteur I2
Miroir
S0
A une longueur donde d'excitation (1) et une longueur donde dmission (2)
I2 = k.I10.Q2..l.C
Concentration
(mol.L-1)
Coefficient dabsorption molculaire
ou dextinction molaire (L.mol-1.cm-1
!
ou cm2.mol-1) DO < 0,05
S2
I.
S1
(Exemple : figure 4)
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5- Sp. de fluorescence B Les spectres b dexcitation
S2
I.
S1
Protines
10
5- Sp. de fluorescence C - Les fluorophores b - extrinsques
(1)
(2) (3)
Quest-ce quon
3- Sp. de
5- absorbance
fluorescence
UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b -dosage
a biologiques (2)
Les mthodes fluorimtriques sont plus sensibles que celles par absorbance
proportionnalit
I2 = k.I10.Q2..l.C
2.1- Mthode par comparaison avec un talon unique (solution de concentration connue)
2.2- Mthode avec une gamme d'talonnage : gamme de dilutions courbe d'talonnage I = f(c)
(I2)e1 = k.I10.Q2..l.Ce I
(I2)e2 = k.I10.Q2..l.Ce/5 I2 Dtermination graphique
(I2)e3 = k.I10.Q2..l.Ce/10
etc puis mesure de I2 C
c
permet de vrifier la linarit, et tient compte des ventuelles erreurs de manipulation (trac d'une droite statistique)
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Quest-ce quon
3- Sp. de
5- absorbance
fluorescence
UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b - environnement
biologiques (2)
em max rendement
Trp dans eau 355 0,15
Interactions avec le solvant
Trp dans dioxane 325 0,3
- Balance hydrophile/hydrophobe
Tyr dans eau 303 0,06
- Ionisation (dans leau, sensible au pH)
Tyr dans dioxane 301 0,21
rendement
Trp
Tyr
pH (Exemple : figure 4 et voir aussi figure 14 et 16)
350
330
340
Quest-ce quon
3- Sp. de
5- absorbance
fluorescence
UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b - environnement
biologiques (2)
em max rendement
Trp dans eau 355 0,15
Interactions avec le solvant
Trp dans dioxane 325 0,3
- Balance hydrophile/hydrophobe
Tyr dans eau 303 0,06
- Ionisation (dans leau, sensible au pH)
Tyr dans dioxane 301 0,21
rendement
Trp
Tyr
pH (Exemple : figure 4 et voir aussi figure 14 et 16)
Interactions molculaires
Transfert de fluorescence
ex em A B
A 400 nm 500 nm
B 500 nm 600 nm
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Quest-ce quon
3- Sp. de
5- absorbance
fluorescence
UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b - environnement
biologiques (2)
em max rendement
Trp dans eau 355 0,15
Interactions avec le solvant
Trp dans dioxane 325 0,3
- Balance hydrophile/hydrophobe
Tyr dans eau 303 0,06
- Ionisation (dans leau, sensible au pH)
Tyr dans dioxane 301 0,21
rendement
Trp
Tyr
pH (Exemple : figure 4 et voir aussi figure 14 et 16)
Interactions molculaires
Transfert de fluorescence
ex em A
A 400 nm 500 nm B
B 500 nm 600 nm
Insensible la concentration
Trs sensible
Lenvironnement local
Conformation et mouvement
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6- Dichroisme circulaire
Repose sur la capacit qu'on les structures optiquement actives d'absorber de faon ingale la
lumire polarise circulairement droite de la lumire polarise circulairement gauche.
6- Dichroisme circulaire
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6- Dichroisme circulaire
Maintenant, si nous combinons deux rayons lumineux polariss 90 l'un de l'autre mais se propageant
dans la mme direction. On obtiendra les ondes suivantes:
La rsultante des deux ondes est une autre onde sinusodale situe entre les deux premires.
6- Dichroisme circulaire
Lumire polarise
circulaire droite
Lumire polarise
circulaire gauche
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6- Dichroisme circulaire
6- Dichroisme circulaire
Les structures optiquement actives n'absorbent pas de faon gale la lumire polarise circulairement vers la
droite et la lumire polarise circulairement vers la gauche.
L'absorption prfrentielle de l'une de ces deux polarisations rsultera en une dviation de la rsultante (au lieu
d'un cercle, le trac de la rsultante entre la spirale tournant droite et la spirale tournant gauche donnera une
ellipse).
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6- Dichroisme circulaire
6- Dichroisme circulaire
La dviation mesure permet d'tablir un spectre (appel CD spectra en anglais) de forme caractristique pour
trois structures secondaires retrouves dans les protines: l'hlice, le feuillet et la forme alatoire (ou random
coil), qui chacune prsentent des asymtries structurales.
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7- Polarisation de fluorescence
LA LUMIERE POLARISEE
Filtre polariseur et filtre analyseur
7- Polarisation de fluorescence
MESURE DE POLARISATION
ex Verticale ex Verticale
P P
em Vertical P em Horizontale P
III I
III I
P=
III + I
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7- Polarisation de fluorescence
abs
a em
P0
La valeur de P dpend de:
langle entre abs et em (P0)
lorientation des fluorophores dans la solution (P1)
du mouvement des fluorophores pendent le temps de vie de ltat excit (P2)
du transfert ventuel dnergie de fluorescence entre molcules (P3)
7- Polarisation de fluorescence
abs
a em
P1 < P0
P dpend de:
langle entre abs et em (P0)
lorientation des fluorophores dans la solution (P1)
du mouvement des fluorophores pendent le temps de vie de ltat excit (P2)
du transfert ventuel dnergie de fluorescence entre molcules (P3)
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7- Polarisation de fluorescence
abs
a em
P2 < P1 < P0
P dpend de:
langle entre abs et em (P0)
lorientation des fluorophores dans la solution (P1)
du mouvement des fluorophores pendent le temps de vie de ltat excit (P2)
du transfert ventuel dnergie de fluorescence entre molcules (P3)
7- Polarisation de fluorescence
abs
a em
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8- Consquences biologiques possibles
Au niveau molculaire
Au niveau cellulaire
Retard de mitose (synchronisation)
Mort cellulaire
Conclusion
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