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Introduo
Autores
Graziella S. Figueiredo Durante a reao, o primer liga-se seqncia complementar e os nucleotdeos so
Biologia graduanda UniCEUB,
RHAE CNPq. incorporados de acordo com a fita molde. Ocorre tanto a incorporao dos
Ana Cludia M. Reis nucleotdeos livres no marcados, quanto a dos nucleotdeos marcados com
Biologia graduanda - FTB,
RHAE-CNPq. fluorescncia. Estes nucleotdeos so chamados de nucleotdeos de terminao, por
que, cada vez que um nucleotdeo de terminao incorporado, a leitura da fita molde
Adauto Silva Castro
Assistente de Operaes I,
interrompida, gerando um fragmento de tamanho respectivo ao local onde o
Embrapa Recursos Genticos
e Biotecnologia, Farmcia
nucleotdeo de terminao foi incorporado. No final da reao so gerados fragmentos
graduando - UnB;
8mL, que custa US$ 2000,00. placas so submetidas a um spin at 300rpm com as
Neste trabalho, foram avaliados dois aspectos: o efeito placas invertidas sobre o papel toalha e posteriormente
da reduo da concentrao do kit Big Dye encaminha-se para estufa a 37 C durante 15
Terminator na reao de seqenciamento e o impacto minutos. Aps secas, as placas recebem 10mL de
final desta reduo na qualidade das seqncias e na formamida e so encaminhadas para o termociclador
reduo dos custos. para a reao desnaturao. Aps essa etapa, as
placas so encaminhadas para o Sequenciador
Materiais e Mtodos Automtico de DNA, modelo ABI 3700 Prism
Os trabalhos iniciais foram realizados utilizando-se 2uL Analyzer.
de BigDye num volume total de reao de 10uL. Ento,
montou-se a reao em uma placa de PCR, nas Resultados e Discusso
seguintes propores: 2uL de DNA, 3uL de gua milliQ, O seqenciamento automtico permite que amostras
2uL de tampo Save Money, 1uL de primer 3,2 mM e sejam seqenciadas em larga escala. Em nosso
2uL de BigDye. Laboratrio, so seqenciadas 1.152 amostras
diariamente, 5.760 amostras semanalmente. A
Posteriormente, testou-se uma diluio do BigDye, purificao, embora indispensvel para preservao
utilizando-se ento 1uL por reao. As propores dos capilares do Seqenciador Automtico de DNA e
utilizadas foram: 2uL de DNA, 3uL de gua milliQ, 3uL para garantir a qualidade das seqncias produzidas,
de Save Money, 1uL de primer e 1uL de BigDye, um procedimento muito barato custando apenas 2%
totalizando um volume final de 10uL. do valor total de uma placa seqenciada.
Aps a reao em cadeia da polimerase, as placas Utilizando-se 2uL de BigDye por reao, os resultados
(PCR Optical 96 well reaction plate number N - 801 obtidos foram: num total de 53.568 seqncias
0560) so retiradas dos termocicladores, recebem obtidas, 43.872 (81,90%) foram seqncias vlidas
isopropanol na concentrao de 65%. So seladas com (phred 20, mnimo de 250 bases). Utilizando-se 2uL
adesivo resistente a lcool (Adhesive PCR Film N por reao, possvel realizar 4.000 reaes com um
21950), misturadas por inverso durante trs vezes, a kit, a um custo de US$ 0,50 por reao.
seguir permanecem ao abrigo da luz em temperatura
ambiente durante 15 minutos. Posteriormente so No teste com 1uL de BigDye por reao, os resultados
centrifugadas por 45 minutos a 3400rpm. O excesso foram: num total de 125.664 seqncias obtidas,
de isopropanol descartado e as placas so invertidas 100.279 (79,80%) foram seqncias vlidas (phred
em papel toalha. Acrescenta-se etanol 60% e 20, mnimo de 250 bases). Utilizando-se 1uL por
centrifuga-se mesma velocidade por 10 minutos. reao, a economia no gasto do BigDye foi de 50%,
Descarta-se novamente o excesso de etanol e resultando um gasto de US$ 0,25 por reao. Um kit
invertem-se as placas sobre o papel toalha, repetindo- passou a ser suficiente para 8.000 reaes. Os
se este processo por mais uma vez. Para secar, as resultados obtidos esto relacionados na Tabela 1.
Reao de Sequenciamento de DNA e Purificao - Protocolos Otimizados 3
Tabela 1: Seqncias vlidas produzidas e respectivas economia (em dlares norte-americanos) na utilizao do Kit BigDye
Terminator
Concluso
Bibliografia Recomendada
Circular Exemplares desta edio podem ser adquiridos na: Comit de Presidente: Luzemar Alves Duprat
Tcnica , 22 Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia publicaes Secretrio-Executivo: Maria Jos de Oliveira Duarte
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Normalizao Bibliogrfica: Maria Alice Bianchi
1a edio Editorao eletrnica: Giscard Matos de Queiroz
1a impresso (2003): 150 unidades