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AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS
CELULOLITICOS A PARTIR DE RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y

EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE CRISANTEMO
(Dendranthema grandiflora)
DIANA MARIA GAITAN BOHORQUEZ

LILIANA IBETH PEREZ PEREZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito
Para optar al ttulo de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIA
Bogot, D.C.
Enero de 2007
i
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia.
ii
DIANA MARIA GAITN BOHORQUEZ

APROBADO
Adriana Matiz Villamil Balkys Quevedo Hidalgo

Bacteriloga M.Sc. Ingeniera Quimica M.Sc.
DIRECTORA CODIRECTORA
Andrea Aguirre Ivonne Gutierrez

Bacteriloga M.Sc. Bacteriologa M.Sc.
JURADO JURADO
iii
DIANA MARIA GAITAN BOHORQUEZ

APROBADO
Angela Umaa Muoz, M. Phil. David Gomez Mendez, M.Sc.

Decana acadmica Director Carrera
Facultad de Ciencias Microbiologa Industrial
i
A Dios por ser mi gua, a mi familia, en especial a mi mam, mis abuelitos,
Camila y Batty por su infinito amor y compaa.
A Gustavo por brindarme su amor y orientacin como lo hace un padre.
A Liliana por su constante dedicacin, pero sobre todo por su amistad.
A Paulis, Pili y Memo por su amistad incondicional.
A Mario A. por su continuo inters, apoyo y por hacerme rer siempre.
Diana Gaitn
ii
A Dios por permitirme finalizar este trabajo.
A mis padres y hermanitos por su amor, inters, gua y continuo apoyo.
A mi Ta Nubia y Camilo por su apoyo incondicional.
A Dianis por sus enseanzas y confianza.
A la familia Bohrquez Galindo, por acogerme en su hogar.
Liliana Prez
AGRADECIMIENTOS
A la Doctora Adriana Matz, por sus conocimientos, dedicacin, paciencia y

confianza.
A la Ingeniera Balkys Quevedo, por su continua orientacin, inters y

paciencia.
Al Doctor David Gmez, por su asesoria y apoyo contino.
A cultivos del Norte, por permitirnos hacer uso de sus instalaciones.
A Viviana Gutirrez por su amistad, ayuda y conocimientos.
A Johanna Buitrago y Dolly Tenjo, por su amistad y colaboracin

permanente.
A Marcela Quintero, Martha Hernndez, Jhon Manosalva, Paula Sarmiento,

Erika Fajardo, Sandra Sarmiento, Angela Pinzn, Mnica Chvez, Sandra
Gmez, Leonardo Sastoque, Maritza Lpez por su amistad y su apoyo.
A Carlos Roa, por su paciencia y disposicin.
A todas las personas que de una u otra manera formaron parte de esta
investigacin.
vii
TABLA DE CONTENIDO
Pag.
1. INTRODUCCIN 1
2. MARCO TERICO 2
2.1 La Celulosa 2
2.2 Degradacin de la celulosa 4
2.2.1 Enzimas implicadas en la degradacin de la celulosa 4
2.2.2 Evaluacin de la Actividad Enzimtica 5
2.2.2.1 Endoglucanasas 5
2.2.2.2 Exoglucanasas 6
2.2.2.3 -glucosidasas 6
2.2.2.4 Celulasas Totales 7
2.2.3 Microorganismos Celulolticos 7
2.2.3.1 Degradacin de la celulosa por microorganismos aerobios
y anaerobios 9
2.2.4 Factores ambientales que determinan la degradacin
microbiolgica de la celulosa 10
2.2.4.1 Concentracin de Nitrgeno en el suelo 11
2.2.4.2 Temperatura 11
2.2.4.3 Aireacin 11
2.2.4.4 pH 11
2.2.5 Factores que determinan la Actividad enzimtica de las
Celulasas 12
2.2.5.1 Sinergismo 12
2.2.5.2 Adsorcin 13
2.2.6 Alternativas en el bioprocesamiento de materiales
Lignocelulsicos 13
2.2.7 Productos de degradacin de la celulosa y su utilidad industrial 13
2.2.8 Aplicacin de la glucosa a nivel industrial 14
viii
2.2.9 Determinacin de actividad celuloltica 15
2.2.9.1 Prueba cualitativa con Rojo Congo 15
2.2.9.2 Prueba cuantitativa por la tcnica del cido
3,5- dinitrosaliclico (DNS) 16
2.2.10 Cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora) 17
2.2.10.1 Disponibilidad y valor comercial del Residuo Vegetal
generado en cultivos de flores (Cultivos del Norte) 18
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN 19
4. OBJETIVOS 20
4.1 Objetivo general 20
4.2 Objetivos especficos 20
5. MATERIALES Y MTODOS 21
5.1 Localizacin y condiciones de muestreo 21
5.2 Aislamiento e identificacin de microorganismos celulolticos 21
5.2.1 Aislamiento primario 21
5.2.2 Aislamiento secundario 22
5.3 Pruebas de antagonismo 22
5.4 Conservacin de cepas 23
5.5 Caracterizacin y procesamiento del residuo vegetal 23
5.6 Proceso de fermentacin en cultivo discontinuo 24
5.6.1 Utilizacin del sustrato vegetal por parte de los microorganismos
celulolticos seleccionados 24
5.6.1.1 Pruebas preliminares de actividad celuloltica de las cepas
seleccionadas (Individualmente) 24
5.6.1.2 Evaluacin de la actividad celuloltica de las
cepas seleccionadas (Consorcio) 25
5.7 Determinacin de azcares reductores 25
5.8 Determinacin de actividad celuloltica 26
ix
5.8.1 Solucin de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer fosfato 0.1M
pH 7.0 26
5.8.2 Solucin de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer cido ctrico
0.1M pH 5 27
5.9 Identificacin Bioqumica 27
5.10 Evaluacin de azcares fermentables en el extracto crudo 28
5.11 Anlisis Estadstico 28
6. RESULTADOS Y DISCUSION 29
6.1 Aislamiento de microorganismos celulolticos 29
6.2 Pruebas de Antagonismo 35
6.3 Pretratamiento del residuo vegetal 39
6.4 Evaluacin preliminar de la actividad celuloltica de las cepas
aisladas 40
6.4.1 Evaluacin preliminar de la actividad celuloltica del consorcio 41
6.5 identificacin Bioqumica 44
6.6 Utilizacin del sustrato vegetal por parte del consorcio celuloltico 47
6.6.1 Condiciones de pH y temperatura durante la fermentacin 50
6.7 Actividad enzimtica y liberacin de azcares reductores
a partir del residuo vegetal de crisantemo 51
7. CONCLUSIONES 56
8. RECOMENDACIONES 57
9. LITERATURA CITADA 58
x
INDICE DE TABLAS
Pag
Tabla 1. Bacterias con alta Actividad Especfica de celulasas 8
Tabla 2. Hongos con alta Actividad Especfica de celulasas 9
Tabla 3. Caracterizacin macro y microscpica de las cepas

con actividad celuloltica aisladas en agar CMC 1%(p/v) 30
Tabla 4. Actividad celuloltica cualitativa de las cepas aisladas

en agar CMC 1%(p/v) 30
Tabla 5. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 1%(p/v) 38
Tabla 24. Identificacin Bioqumica cepa 8 44
Tabla 25. Identificacin Bioqumica Actinomiceto 46
xi
INDICE DE FIGURAS
Pag.
Figura 1. Estructura Qumica de la celulosa 3
Figura 2. Estructura de la Celulosa: regiones cristalinas y amorfas 4
Figura 3. Zonas de aclaramiento, cepa 1 en Agar CMC 1%(p/v) 31
Figura 11. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1 35
Figura 18. Resistencia cepa 8 36
Figura 19. Residuo vegetal de crisantemo molido 40
xii
Figura 20. Azcares reductores en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8)
en SVS al 10% (p/v) 42
Figura 21. Actividad enzimtica en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8)

en SVS al 10%(p/v), establecida bajo condiciones de
pH7 37C y pH5 50C 43
Figura 22. Azcares reductores en el cultivo de Streptomyces sp. en

SVS al 10%(p/v) 43
Figura 23. Actividad enzimtica en el cultivo de Streptomyces sp.

en SVS al 10%(p/v), establecida bajo condiciones de
pH7 37C y pH5 50C 43
Figura 24. Caractersticas macroscpicas cepa 8 en agar

CMC 1%(p/v) 44
Figura 25. Caractersticas macroscpicas Streptomyces sp.

en agar avena 5%(p/v) 45
Figura 26. Caractersticas microscpicas Streptomyces sp. 45
Figura 27. Azcares reductores en el cultivo del consorcio

(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v) 49
Figura 28. Azcares reductores en el cultivo del consorcio

Figura 29. Variacin de pH en el cultivo del consorcio

Figura 30. Variacin de pH en el cultivo del consorcio

(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS
al 10%(p/v) 51
Figura 31. Actividad enzimtica en el cultivo del consorcio

(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v)
bajo condiciones de pH7 37C 51

(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV al 10%(p/v)
bajo condiciones de pH7 37C y pH5 50C 52
xiii
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SVS al 10%(p/v)
bajo condiciones de pH7 37C 52
xiv
LISTA DE ANEXOS
Pag.
ANEXO 1. Medios de cultivo y reactivos 64
ANEXO 2. Determinacin de azcares reductotes por el mtodo

del Acido 3,5- dinitrosaliclico 66
ANEXO 3. Pruebas preliminares: Determinacin de Azcares

reductores y Actividad enzimtica cepas 1, 3,4 y 7 68

reductores y Actividad enzimtica de Bacillus sp.
(cepa 8) y Streptomyces sp. por separado y en consorcio 71

reductores y Actividad enzimtica del consorcio
(Bacillus sp y Streptomyces sp.) en cultivo discontinuo
en SV y SVS al 5 y 10%(p/v) 74
ANEXO 6. Anlisis fisicoqumico del residuo vegetal de crisantemo 76
ANEXO 7. Perfil cromatogrfico: Sobrenadante de la hora seis de

fermentacin en SV Y SVS al 10%(p/v) 77
ANEXO 8. Anlisis estadstico (SPSS, versin 14) 79
xv
RESUMEN
El presente trabajo tuvo como objetivo aislar y evaluar microorganismos

degradadores de celulosa a partir de residuos vegetales frescos y en
compost de crisantemo. Ocho cepas bacterianas mesoflicas con actividad
celuloltica a partir de residuos vegetales de crisantemo en compostaje. La
actividad celuloltica de estas cepas fue evaluada cualitativamente mediante
el revelado de halos de hidrlisis con rojo congo en medio
Carboximetilcelulosa (CMC) al 1%(p/v), posteriormente, con el objetivo de
establecer un consorcio bacteriano celuloltico se realizaron pruebas de
antagonismo para determinar si exista algn tipo de inhibicin entre stas.
La actividad celuloltica de las cepas escogidas fue evaluada mediante la
tcnica del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) a partir de la cual slo una cepa
fue seleccionada para hacer parte del consorcio. Con el fin de potencializar la
actividad de dicha cepa se us un actinomiceto aislado y evaluado en otro
estudio. Estos microorganismos fueron identificados como Bacillus sp. y
Streptomyces sp.. La capacidad degradadora del consorcio sobre el residuo
vegetal de crisantemo fue evaluada en dos medios: uno con sustrato vegetal
a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), suplementado con sales, llamado
medio sustrato vegetal suplementado (SVS) y otro, compuesto de sustrato
vegetal en las mismas concentraciones, extracto de levadura y peptona,
llamado medio sustrato vegetal (SV), determinando la concentracin de
azcares reductores liberados mediante la tcnica de DNS y la actividad
enzimtica en buffer fosfato pH7 37C y buffer cido ctrico pH5 50C. Los
resultados obtenidos mostraron que la degradacin del sustrato vegetal de
crisantemo fue mejor cuando las microorganismos actuaron en consorcio
demostrando una accin sinrgica entre sus enzimas, por otro lado, en el
medio SV en una concentracin del 10%(p/v) se di la mayor liberacin de
azucares reductores con un valor de 1.665g/L y una actividad enzimtica
de0.1056UC.
ABSTRACT
The present investigation was with the aim of isolate and evaluate cellulose
degradation by microorganisms. Eight mesophilic bacteria with cellulolytic
activity were isolation and purified from vegetable wastes of a composting
system of crisantemo. The cellulolytic activity of this microorganism was
evaluated qualitatively through hydrolysis halo using congo red and
carboximethylcellulose (CMC) 1%(w/v) as the substrate, afterwards with the
objective to create a cellulolytic bacterial association developed antagonism
test for determine if any type of inhibition existed between them. The
cellulolytic activity of the selected strain was evaluated with dinitrosalicyc acid
(DNS) method, only one microorganism was selected for the bacterial
association. With the aim of boost the bacteria activity, employed a cellulolytic
actinomycete previously isolated and evaluated in other investigation. This
microorganisms were identified as Bacillus sp. and Streptomyces sp. The
degradation capacity of bacterial association using vegetable wastes of
crisantemo was evaluated employing two broths: one of this with vegetable
waste at different concentrations (5%(w/v) and 10%(w/v)), and additional salts
(SVS), the other only with vegetable waste with the same concentrations,
yeast extract and peptone (SV) the concentration of reducing sugars was
evaluated with DNS method and the cellulose activity using CMC phosphate
buffer pH7 37C and CMC citric acid pH5 50C. The obtained results
indicated that the best degradation of vegetable wastes was using the
bacterial association, showing a synergetic cellulose degradation,
furthermore, the SV 10%(w/v) broth showed the best concentration of
reducing sugars (1.665 g/L) and cellulose activity of 0.1056 UC.
1. INTRODUCCION
La floricultura es una de las actividades ms desarrolladas en Colombia, el

crisantemo ocupa el cuarto lugar en flores de exportacin y genera durante
casi todas las etapas del proceso productivo, grandes cantidades de residuos
vegetales de difcil degradacin en el medio ambiente. Dentro del programa
de gestin ambiental de este sector los residuos slidos generados son
tratados en pilas de compostaje, sin embargo, otra alternativa biotecnolgica
es la utilizacin de microorganismos celulolticos capaces de degradar estos
residuos, con la consecuente produccin de azcares fermentables que a su
vez puedan ser usados como sustrato glicosdico natural.
Los microorganismos encargados de la degradacin de la celulosa, principal

componente de la pared celular de las plantas incluyen bacterias, hongos y
actinomycetes, aerobios, anaerobios, mesoflicos y termoflicos, los cuales
cuentan con la maquinaria enzimtica necesaria para dicho propsito, por tal
razn, su aislamiento e identificacin representa un importante recurso para
lograr la disminucin del impacto ambiental y la generacin de un sustrato
fermentable cuya utilidad podra estar en la produccin de etanol, obtencin
de cidos orgnicos, edulcorantes, productos farmacuticos y alimentos,
entre otros.
2. MARCO TERICO
2.1 La Celulosa
La celulosa es un importante constituyente carbonado de las plantas

superiores y probablemente el compuesto orgnico ms abundante en la
naturaleza. Debido a que gran parte de la vegetacin que pasa a formar
parte del suelo es celulsica, la descomposicin de este carbohidrato tiene
una importancia muy especial en el ciclo biolgico del carbono,
consecuentemente los microorganismos del suelo que catabolizan la
hidrlisis del material vegetal (40-60% de residuos de plantas) influencian el
flujo de energa desde ste hasta la formacin de CO2 y su liberacin a la
atmsfera. Como las bacterias y hongos del suelo son los microorganismos
mayormente involucrados en el ciclaje del material vegetal, cambios en el
nmero de estos pueden indicar modificaciones en el contenido de materia
orgnica del suelo. Cuando esto se corrobora con otros indicadores
ecolgicos (biomasa y diversidad de especies encontradas) se obtiene
informacin acerca del estado del suelo y su productividad (Hendricks, et al,
1995). Como resultado, se ha prestado gran atencin a los organismos que
participan en la descomposicin de esta sustancia (Alexander, 1980).
Estructuralmente, la celulosa es un carbohidrato compuesto de unidades de

glucosa unidas en una larga cadena lineal por enlaces en los tomos de
carbono 1 y 4 de la molcula de azcar (Fig. 1)
2
Fig.1 Estructura Qumica de la celulosa (Heldt, 1997)
La celulosa existe en las plantas superiores, en las algas, en muchos tipos de

hongos y en los quistes de algunos protozoarios. El polisacrido est
localizado en la pared celular donde se encuentra como unidades
submicroscpicas de forma alargada conocidas como micelas. A su vez,
estas micelas se arreglan en estructuras ms grandes, las microfibrillas, las
cuales estn suficientemente empaquetadas para prevenir la penetracin no
slo de enzimas sino de pequeas molculas semejantes al agua (Lynd, et
al, 2002).
Una importante caracterstica de la celulosa, relativamente inusual de los

polisacridos es su estructura cristalina (Fig. 2), sin embargo, las fibras
individuales no son puramente cristalinas, lo que genera regiones amorfas
donde las fibras contienen torceduras y espacios en sus microfibrillas lo cual
permite la formacin de microporos y capilares lo suficientemente espaciosos
para permitir la penetracin de molculas relativamente grandes incluyendo,
en algunos casos enzimas celulolticas (Lynd, et al, 2002).
Las microfibrillas de celulosa estn estabilizadas por enlaces de hidrgeno

intra e intermoleculares y rodeadas por polisacridos hemicelulsicos
(manano y xilano) que se unen a la celulosa por puentes de hidrgeno y
enlaces covalentes, los cuales la hacen extremadamente resistente a la
3
hidrlisis qumica y biolgica. As mismo, las regiones amorfas de la
estructura cristalina de la celulosa tienen una composicin heterognea
caracterizada por una variedad de enlaces. Finalmente este arreglo
asimtrico que caracteriza las regiones amorfas es crucial para la
biodegradacin de la celulosa (Malherbe y Cloete, 2002)
Fig. 2 Estructura de la celulosa: regiones cristalinas y amorfas

(Guevara, et al, 2003)
2.2 Degradacin de la celulosa

2.2.1 Enzimas implicadas en la degradacin de la celulosa
El mecanismo ampliamente aceptado para explicar la hidrlisis enzimtica de

la celulosa involucra la accin enzimtica de tres enzimas: la endo -1,4
glucanasa (-1,4 glucano glucanohidrolasa), la exo -1,4 celobiohidrolasa y
la -1,4 glucosidasa (Lymar, et al, 1995; Zhang et al, 2006).
La endo - 1,4 glucanasa hidroliza aleatoriamente los enlaces - 1,4

glucosdicos intramoleculares accesibles de cadenas de celulosa para
4
producir oligosacridos de varias longitudes. La exo -1,4 celobiohidrolasa
cliva los extremos no reductores del sustrato generando unidades de
celobiosa o glucosa y por ltimo la -1,4 glucosidasa, completa el proceso
hidroltico convirtiendo los fragmentos de celobiosa a glucosa o removiendo
glucosa desde los extremos no reductores de pequeos celoligosacridos.
(Lymar, et al, 1995; Zhang et al, 2006).
2.2.2 Evaluacin de la Actividad Enzimtica
La actividad enzimtica de las celulasas puede ser medida de dos formas

bsicas:
Medicin de la actividad individual de cada celulasa (endoglucanasas,

exoglucanasas y -glucosidasas).
Medicin de la actividad total de las celulasas (Zhang et al, 2006).
2.2.2.1 Endoglucanasas
Las endoglucanasas actan al azar sobre los enlaces - 1,4 glucosdicos y

su actividad es con frecuencia medida sobre celulosa soluble con alto grado
de polimerizacin, como es el caso de la carboximetilcelulosa CMC. La
accin de las endoglucanasas sobre este sustrato celulsico se caracteriza
por la disminucin de la viscosidad realizando clivajes intramoleculares
(Zhang et al, 2006). Adems la tasa de hidrlisis est condicionada a la
habilidad de las endoglucanasas para actuar en las regiones amorfas de la
matriz cristalina de la celulosa y crear nuevos extremos reductores en los
cuales las exoglucanasas puedan actuar (Malherbe y Cloete, 2002).
5
La medicin de la actividad de endoglucanasa puede ser basada en la
reduccin de la viscosidad del sustrato y/o en el incremento de extremos
reductores que se determinan por tcnicas que permitan medir azcares
reductores. Sin embargo, la actividad de las exoglucanasas tambin
incrementa el nmero de extremos reductores por lo cual, es recomendable
que la actividad de las endoglucanasas sea medida por ambos mtodos
(viscosidad y extremos reductores) (Lynd et al, 2005).
Por otro lado, dicha actividad puede ser fcilmente detectada en medios con
CMC o celulosa y adicin de varios colorantes como el rojo congo, debido a
que estos son adsorbidos slo por largas cadenas de polisacridos. Este
mtodo es semi-cuantitativo y muy adecuado cuando se requiere procesar un
gran nmero de muestras (Ten et al, 2004).
2.2.2.2 Exoglucanasas
Las exoglucanasas clivan los extremos accesibles de la molcula de celulosa

para liberar glucosa y celobiosa. La celulosa microcristalina (Avicel) es un
sustrato adecuado para la medicin de la actividad por tener un bajo grado
de polimerizacin y una baja accesibilidad (Lynd et al, 2005; Zhang et al,
2006).
2.2.2.3 -glucosidasas
La -glucosidasa hidroliza la celobiosa soluble y otras celodextrinas con un

grado de polimerizacin superior a 6 y la posterior produccin de glucosa. La
tasa de hidrlisis disminuye con el incremento en el grado de polimerizacin
del sustrato. La actividad de esta enzima tambin puede ser medida usando
celobiosa, la cual no es hidrolizada por las endoglucanasas ni exoglucanasas
(Lynd et al, 2005).
6
2.2.2.4 Celulasas Totales
El sistema de celulasas esta conformado por endoglucanasas,

exoglucanasas y - glucosidasas, las cuales hidrolizan sinrgicamente la
celulosa cristalina. La evaluacin de la actividad de las enzimas celulolticas
es con frecuencia evaluada usando sustratos insolubles los cuales incluyen:
papel filtro Whatman N1 y celulosa microcristalina. La heterogeneidad de la
celulosa insoluble y la complejidad del sistema de celulasas causa problemas
en la medicin de la actividad total. Resultados experimentales muestran que
la estructura heterognea de la celulosa insoluble induce la disminucin en la
tasa de hidrlisis en corto tiempo (menos de una hora) provocando la
desactivacin de las celulasas (Zhang et al, 2006).
2.2.3 Microorganismos Celulolticos
Los microorganismos degradadores de celulosa incluyen hongos y bacterias,

aerobios y anaerobios, mesoflicos y termoflicos que ocupan una variedad
de habitats (Aubert, 1988). Entre los hongos celulolticos se destacan:
Trichoderma reesei, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani,
Penicillum funiculosum, Trichoderma koningii, Sporotrix sp., Alternaria sp.,
Geotrichum sp., Rhizoctonia sp., Trametes sp., Paecilomyces sp. , Mucor
sp.,Cladosporium sp., Bulgaria sp., Chaetomium sp., Helotium sp.,
Aspergillus sp.. Las bacterias celulolticas ms abundantes y conocidas son
las aerobias entra las cuales se pueden citar: Cellulomonas sp., Microbispora
bispora, Thermomonospora sp. ,Cytophaga sp., Corynebacterium sp., Vibrio
sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp.,Thermobifida sp.. Adems se encuentran
algunos anaerobios como: Acetivibrio cellulolyticus, Butirivibrio sp.,
Bacteroides cellulosolvens, Bacteroides succinogenes, Clostridium
cellulovorans, Clostridium thermocellum, Ruminococcus albus,
Ruminococcus flavefaciens (Lynd, et al, 2002). Entre los actinomicetes se
7
destacan: Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces cellulolyticus (Semedo,
et al., 2004; Grigorevski, et al., 2005; Li, 1997), Themomonospora curvata,
Thermomonospora chromogena, Thermomonospora alba y Thermomobifida
fusca (Ramrez y Coha, 2003).
El pH ptimo para la actividad de las celulasas producidas por bacterias

abarca un amplio rango, el cual incluye condiciones cidas y alcalinas. (Tabla
1). Por otro lado, las celulasas producidas por hongos requieren
generalmente un pH cido (Tabla 2).
Tabla 1. Bacterias con alta Actividad Especfica de celulasas
Microorganismo Actividad Especfica (mol.min-1.mg-1) pH ptimo
Bacillus subtilis 514 5-7
Clostridium thermocellum 428 7

Streptomyces murinus 6.7 6
Bacillus macerans 5030 6

Bacillus sp. 369.6 9
(Howard et al., 2003)
8
Tabla 2. Hongos con alta Actividad Especfica de celulasas.
Microorganismo Actividad Especfica pH ptimo

-1 -1
(mol.min .mg )
Sclerotium rolfsii 475 3.3
Aspergillus niger 194 5
Achlya bisexualis 7840 6
Orpinomyces sp. 3659 5.8
Rizhopus chinensis 4800 ND
Penicillium 405 4.2
brefeldianum
(Howard et al., 2003)

N.D. No determinado
2.2.3.1 Degradacin de la celulosa por microorganismos aerobios y

anaerobios
Existe una diferencia fundamental en el mecanismo de hidrlisis de la

celulosa entre bacterias y hongos aerobios y anaerobios. Los hongos y
bacterias aerbicos caractersticamente cuentan con un sistema de celulasas
no complejo lo cual, conlleva a la secrecin de enzimas hidrolticas de
celulosa en el medio de cultivo. Sin embargo, bacterias anaerbicas
especialmente Clostridium spp. y hongos del gnero Neocallimastix,
Piromonas y Sphaeromonas contienen un sistema de celulasas que forman
un complejo donde las enzimas que degradan la celulosa estn contenidas
en una membrana llamada celulososoma. Esta fundamental diferencia tiene
implicaciones en el uso biotecnolgico de estos microorganismos, pues las
basadas en bacterias y hongos anaerobios pueden tener ventajas sobre los
sistemas aerbicos en trminos de eficiencia hidroltica. El sistema de
celulasas dispuestas en un complejo permite un alto grado de coordinacin
entre las enzimas involucradas en la hidrlisis de la celulosa lo que permite
9
evitar la prdida de los intermediarios durante la degradacin por los cambios
en las condiciones ambientales (Malherbe y Cloete, 2002).
En los sistemas aerbicos donde se requiere una agitacin y aireacin

continuas, la prdida de las enzimas secretadas y de los intermediarios de
degradacin puede afectar la eficiencia del proceso. Sin embargo, los
microorganismos aerobios ganan ms energa de la glucosa que los
anaerobios (38 moles de ATP vs 2-4 moles de ATP por cada mol de glucosa)
por lo tanto, la aparente eficiencia hidroltica de los microoganismos
aerbicos es benfica en cuanto a ganancia energtica. Sin embargo, dado
los bajos requerimientos tcnicos para la aplicacin de microorganismos
anaerbicos comparados con los sistemas aerbicos (ausencia de agitacin
vigorosa para facilitar la aireacin y tecnologas para el control de flujo) el uso
de hongos y bacterias anaerobios en proyectos de biorremediacin pueden
ser ms atractivos por el bajo costo que requieren y la alta eficiencia de la
maquinaria hidroltica sobre la celulosa (Malherbe y Cloete, 2002).
2.2.4 Factores ambientales que determinan la degradacin

microbiolgica de la celulosa
La tasa a la cual se metaboliza la celulosa est dada por varios factores del
medio ambiente, y los suelos que varan en sus caractersticas fsicas y
qumicas poseen marcadas diferencias en su capacidad celuloltica. Los
principales factores del medio ambiente que afectan la transformacin son el
nivel de nitrgeno disponible, la temperatura, aireacin, humedad, pH, la
presencia de otros carbohidratos y la proporcin relativa de lignina en los
restos vegetales ( Alexander, 1980).
10
2.2.4.1 Concentracin de Nitrgeno en el suelo
La aplicacin de nitrgeno inorgnico aumenta la descomposicin de la

celulosa en el suelo y tanto las sales de amonio como las de nitrato son
buenas fuentes de este elemento. La respuesta a ste indica que el nivel de
nitrgeno en el suelo es un factor limitante (Alexander, 1980).
2.2.4.2 Temperatura
La utilizacin biolgica de la celulosa puede llevarse a cabo desde

temperaturas cercanas a la congelacin hasta alrededor de los 65C. Cada
una de las variedades de organismos celulolticos es afectada en forma
diferente por la temperatura. Los mesfilos dominan en temperaturas
moderadas mientras que la microflora termoflica puede degradar la celulosa
por arriba de los 45C. Debido a los cambios en la composicin de la flora
inducidos por la temperatura, el calor aumenta la velocidad de transformacin
del sustrato a causa del efecto directo de sta sobre la accin enzimtica
(Alexander, 1980).
2.2.4.3 Aireacin
La aireacin tambin rige la composicin de la flora activa. A causa del

proceso anaerbico, el metabolismo de la celulosa es reducido
significativamente en medios deficientes de oxigeno en comparacin con
habitats aireados (Alexander, 1980).
2.2.4.4 pH
En medios con pH entre neutro y alcalino, muchos microorganismos son

capaces de crecer y liberar las enzimas apropiadas para la hidrlisis del
11
polisacrido; bajo condiciones cidas la desaparicin de la celulosa se debe
principalmente a los hogos filamentosos. Aunque el proceso es rpido a pH
menor de 5 y ocasionalmente por debajo de 4, los suelos con bajas
concentraciones del ion hidrgeno degradan la celulosa ms fcilmente
(Alexander, 1980).
2.2.5 Factores que determinan la Actividad enzimtica de las celulasas
Diversos factores asociados con la naturaleza del sistema enzimtico de las

celulasas ha sido sugerido por influenciar el proceso hidroltico. Estos
incluyen: inhibicin del complejo de celulasas por el producto final,
inactivacin trmica, sinergismo e irreversible adsorcin de las enzimas,
teniendo estos ltimos la mayor influencia en la tasa de degradacin del
polisacrido (Mansfield et al, 1999).
2.2.5.1 Sinergismo
El sinergismo ocurre cuando la accin combinada de dos o ms enzimas

aumenta la tasa de accin sobre el sustrato respecto a la accin individual.
Se han hecho estudios en los que se ha observado una actividad cooperada
de las celulasas de Trichoderma reseei en el que las endoglucanasas actan
al azar a lo largo de las cadenas de celulosa generando sitios donde actan
las exoglucanasas las cuales liberan celobiosa como producto principal, una
tercera enzima, la -glucosidasa es necesaria para hidrolizar la celobiosa
previniendo de esta manera la inhibicin de las exoglucanasas por
acumulacin de producto y por tanto generando un aumento en la tasa
hidroltica. (Mansfield et al, 1999)
12
2.2.5.2 Adsorcin
La hidrlisis de la celulosa difiere de otras reacciones enzimticas en que el

sustrato es insoluble y requiere una previa adsorcin de la enzima al
sustrato. La adsorcin de las celulasas es facilitada por la presencia de
dominios en el sustrato los cuales son susceptibles al clivaje proteoltico
mediante uniones por fuerzas de van der waals y puentes de hidrogeno.
Adems dichos dominios cuentan con aminocidos aromticos que confieren
una especificidad adicional y estabilidad al complejo enzima - sustrato
(Mansfield et al., 1999).
Existen dos teoras para explicar la interaccin de los dominios con la

celulosa. La primera se basa en que los dominios incrementan la
concentracin local de enzimas en la superficie de la celulosa, la segunda
propone que los dominios son un instrumento que permite el rompimiento de
cadenas de celulosa cristalina pero no de celulosa amorfa (Mansfield et al.,
1999).
2.2.6 Alternativas en el bioprocesamiento de materiales lignocelulsicos
Los materiales lignocelulsicos pueden ser tratados aplicando estrategias

que incluyen: tratamiento anaerbico, compostaje, produccin de protena
celular para la alimentacin de animales rumiantes y cultivo de champin
(Howard et al., 2003).
2.2.7 Productos de degradacin de la celulosa y su utilidad industrial
Las bacterias aerobias generalmente convierten la celulosa en dos productos

principales: CO2 y biomasa. No existen acumulaciones significativas de
intermediarios carbonados y la concentracin de cidos orgnicos raramente
13
alcanza un nivel apreciable. Por otro lado, en condiciones anaerobias las
bacterias son incapaces de metabolizar completamente dicho sustrato,
siendo los principales productos de acumulacin, CO2, CH4, H2, etanol y
cidos actico, frmico, succnico, butrico y lctico (Alexander, 1980).
La celulosa es empleada a nivel industrial en la manufactura de papel y

cartn, telas, pelculas fotogrficas, celofanes, explosivos, diluyentes,
jabones, aromas y alimentos (Alexander, 1980).
En Colombia se han adelantado diferentes investigaciones en bsqueda de

nuevas alternativas para la utilizacin de celulosa fibra, entre estas:
Diseo, frmula, elaboracin y evaluacin de un excipiente

coprocesado a base de celulosa fibra para la elaboracin de formas
farmacuticas slidas (tabletas) por el mtodo de compresin directa
(Snchez y Zuluaga, 1999).
Utilizacin de residuos vegetales generados en el sector floricultor

nacional en la elaboracin de papel manual (Prez, 1996).
Obtencin de etanol como biocombustible a partir de residuos

lignocelulsicos y amilceos mediante ensayo de hidrlisis y
fermentacin de azcares (Tellez y Pava, 2003).
2.2.8 Aplicacin de la glucosa a nivel industrial
La glucosa, por ser un producto que posee diferentes caractersticas, entre

ellas el ser edulcorante, preservativo de la humedad, inhibidor frente a
levaduras y mohos, estabilizador de la viscosidad, etc, tiene gran aplicacin
en la industria farmacutica y de alimentos. La caracterstica reductora de la
14
glucosa referida a la capacidad de su grupo carboxilo para reaccionar como
tal, esta directamente relacionado con la capacidad de formar colores, y
aromas de tostado por la reaccin con las protenas (Forero, 1986).
Industria de alimentos: En confitera como agente anti cristalizador, en

produccin de jaleas y mermeladas previene la cristalizacin del azcar,
en la elaboracin de productos horneados de panadera se utiliza para
dar volumen, endulzar y prolongar la vida til de los productos.
Industria Farmacutica: Es utilizada como excipiente en la elaboracin de

jarabes y grageas, hace parte de la formulacin de algunos sueros orales,
etc.
Produccin de etanol como biocombustible
Produccin de cidos orgnicos (Forero, 1986).
2.2.9 Determinacin de actividad celuloltica
2.2.9.1 Prueba cualitativa con Rojo Congo
Diferentes procedimientos utilizados en la identificacin y enumeracin de

los microorganismos capaces de utilizar la celulosa han sido descritos;
siendo la base de estos la hidrlisis de sustratos celulsicos. La utilizacin de
medios lquidos que contienen celulosa permiten estimar cualitativa y
cuantitativamente los microorganismos degradadores, los medios slidos son
generalmente ms usados pero en estos las colonias de microorganismos
que utilizan el sustrato son con frecuencia difciles de diferenciar de otros
microorganismos que no lo hacen. Teather y Wood en 1982, observaron que
el rojo congo poda ser usado en los ensayos para evidenciar la hidrlisis de
15
polisacridos debido a que el colorante forma complejos con las molculas
an no hidrolizadas, facilitando as la diferenciacin entre microorganismos
celulolticos y no celulolticos por la formacin de zonas de aclaramiento
alrededor de las colonias (Hendricks, et al., 1995).
2.2.9.2 Prueba cuantitativa por la tcnica del cido 3,5- dinitrosaliclico

(DNS)
La actividad del sistema enzimtico en el complejo celuloltico puede medirse

determinando la cantidad de glucosa liberada mediante DNS. Esta tcnica
demuestra la presencia del grupo carbonilo libre (C=O) de los azcares
reductores que implica la oxidacin del grupo funcional aldehdo de la
glucosa (Miller,1959).
En este mtodo el cido 3,5- dinitrosaliclico es reducido a cido 3-amino-5-

nitrosaliclico, mientras que los grupos aldehdos son oxidados a grupos
carboxilos. La reduccin del cido genera un color amarillo el cual es
proporcional a la concentracin del azcar reductor presente y se evidencia
por medio de la lectura de absorbancias en el espectrofotmetro lo que
implica la aplicacin de la ley de Beer Lambert (Miller,1959).
La lectura de la prueba de DNS es altamente influenciada por las mismas

condiciones de la prueba, como la temperatura del agua de calentamiento, la
transferencia de calor, el tiempo de reaccin, la proporcin de glucosa,
celobiosa y celodextrinas presentes y el tiempo de preparacin del reactivo,
el cual con frecuencia es ignorado (Zhang et al., 2006).
16
2.2.10 Cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora)
Uno de los cultivos que actualmente genera el mayor nmero de divisas

dentro de las exportaciones no tradicionales colombianas es el de la
floricultura. En un perodo no superior a diez aos, Colombia se ha
convertido en el segundo exportador mundial (despus de Holanda) de flores
cortadas, con una participacin del 10% sobre el total de las exportaciones
mundiales. Ms de 50 tipos diferentes de flores, entre las cuales se destacan
el clavel, el pompn, la rosa y el crisantemo se cultivan principalmente en la
Sabana de Bogot, el Oriente Antioqueo y el Valle del Cauca siendo sus
principales mercados Estados Unidos (80%) y la Unin Europea (14%).
(http://www.unalmed.edu.co/~prensa/impro4.htm).
El crisantemo (Dendranthema grandiflora) es un hbrido complejo

perteneciente a la familia Asteraceae y engloba flores de las ms antiguas
cultivadas en Colombia. Las hojas pueden ser lobuladas o dentadas,
ligulosas o rugosas, de color variable entre el verde claro y oscuro,
recubiertas de un polvillo blanquecino que le da un aspecto grisceo (Stace,
2003; Santana, et al, 2002).
La propagacin se realiza por esquejes terminales que se obtienen de

plantas madre seleccionadas por su conformacin a la progenie, capacidad
de cosecha y vigor mantenidas bajo condiciones de da largo para inhibir la
formacin de botones finales. Los esquejes terminales de 8-10cm de longitud
pueden colocarse directamente en el medio para enraizamiento o
almacenarse a 0-3C durante unas seis semanas, en cajas de cartn
forradas con polietileno para evitar la deshidratacin (Vidiale, 1983). Entre los
sustratos utilizados en el proceso de enraizamiento se destacan: perlita,
vermiculita, arena, turba o mezclas de estos. En la sabana de Bogot se
17
emplean productos naturales como cascarilla de arroz o escoria (Santana, et
al,2002).
En cuanto a sus requerimientos nutricionales el crisantemo es un cultivo

bastante exigente en lo referido a las cantidades de nitrgeno, fsforo y
potasio necesarias para la obtencin de flores y plantas de ptima calidad.
Cuando existen deficiencias, aplicaciones moderadas no logran remediar los
trastornos ocasionados, por lo cual, luego de la siembra de los esquejes se
recomienda utilizar fertilizantes con alto contenido en nitrgeno, potasio y
otros microelementos, manteniendo un pH entre 55.5 y 6.5 (Santana, et al.,
2002).
2.2.10.1 Disponibilidad y valor comercial del Residuo Vegetal generado

en cultivos de flores (Cultivos del Norte).
Durante la actividad de cosecha realizada en cultivo de flores (Cultivos del

Norte) se generan aproximadamente cuatro toneladas de residuos vegetales
al mes, dichos residuos son acumulados y posteriormente llevados en su
totalidad a pilas de compostaje; con el fin de obtener abono orgnico utilizado
en la adecuacin de los suelos, por lo cual en este caso los residuos
vegetales no tienen ningn valor comercial. (comunicacin verbal)
18
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
Actualmente una gran cantidad de residuos de celulosa que puede ser

medida en billones de toneladas son producidos en el mundo entero como
resultado de actividades en la agricultura y la industria.
En Colombia, el cultivo de flores representa una fuente importante de dichos

residuos, se cultivan ms de 50 tipos diferentes, del total de las
exportaciones colombianas de flores para el ao 2001 la participacin fue de
24.7% de rosa, 21.4% de clavel estndar, 11.3% de mini clavel y 2.3% de
crisantemo. Actualmente este sector libera altos volmenes de residuos
vegetales que dificultan su manejo y debido a su lenta degradacin se
convierten en un problema de alto impacto ambiental (prdida de espacio
fsico, impacto paisajstico, generacin de plagas, etc) (Asocolflores, 2001)
La utilizacin de microorganismos con actividad celuloltica representa una

de las opciones con mayor viabilidad en la solucin de esta problemtica ya
que el costo de inversin es bajo y se da un uso adecuado a dichos residuos
obteniendo un sustrato que puede ser aprovechado como fuente de carbono
en produccin industrial.
En el presente trabajo se plantea el aislamiento e identificacin de consorcios

microbianos con actividad celuloltica, a partir de residuos celulsicos
generados en un cultivo productor de crisantemo (Dendranthema
grandiflora), tiles en la degradacin celulsica de residuos vegetales y
adems generadores de sustratos glucosdicos que pueden ser empleados
en la obtencin de etanol, cidos orgnicos, edulcorantes, alimentos e
industria farmacutica.
19
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Aislar y evaluar microorganismos degradadores de celulosa a partir de

residuos vegetales frescos y en compost generados en un cultivo de
crisantemo (Dendranthema grandiflora).
4.2 Objetivos especficos
Aislar e identificar microorganismos con actividad celuloltica a partir

de residuos vegetales frescos y en compost provenientes de un cultivo
de crisantemo (Dendranthema grandiflora).
Seleccionar los microorganismos que presenten mayor actividad

celuloltica y realizar banco de cepas.
Realizar pruebas de antagonismo entre las cepas que presenten

mayor actividad celuloltica.
Evaluar actividad celuloltica del consorcio microbiano aislado

utilizando como sustrato residuo vegetal con y sin suplemento, a una
concentracin del 5%(p/v) y 10%(p/v).
20
5. MATERIALES Y MTODOS
5.1 Localizacin y condiciones de muestreo
El muestreo del residuo vegetal se realiz a partir de residuos frescos y en

compostaje de un cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora)
localizado en el municipio de Tocancip, ubicado a 2606 m.s.n.m cuya
temperatura promedio es de 13C y una humedad relativa del 80%
(http:/www.alcaldiatocancipa.gov.co)
Se tomaron en forma aleatoria cinco submuestras de residuo fresco de 1

semana de almacenamiento, de 100g cada una, registrando una temperatura
de 18C; en el caso de los residuos en degradacin se muestrearon
diferentes puntos de la pila de compostaje de 4 semanas de degradacin,
registrando una temperatura de 50C y un pH de 8.6. Los residuos vegetales
fueron recolectados manualmente con ayuda de un barreno y depositados en
bolsas de polipropileno, que posteriormente fueron llevadas al laboratorio de
Biotecnologa Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana y mantenidas
en nevera a 4C, mientras fueron procesadas.
5.2 Aislamiento e identificacin de microorganismos celulolticos
5.2.1 Aislamiento primario
Se pesaron 10g de las muestras de residuos vegetales frescos y en

compostaje, cada uno de los cuales fueron llevados a 90ml de agua
peptonada 0.1%(p/v). Posteriormente se realizaron diluciones seriadas de
10-1 a 10-5 en agua peptonada a 0.1%(p/v). A partir de las diluciones
preparadas se realiz siembra en superficie en agar Carboximetilcelulosa
(CMC) al 1%(p/v) (Anexo 1). Las cajas fueron incubadas a 35oC por 48
21
horas. Transcurrido el tiempo de incubacin se adicion rojo congo al
1%(p/v) (Anexo 1) como revelador a las colonias presentes en los medios,
luego de quince minutos se retir el exceso y se adicion NaCl 0.1M (Anexo
1), dejando reposar por quince minutos ms, para luego hacer el recuento de
las colonias que presentaron halos de hidrlisis (Teather y Wood, 1982).
5.2.2 Aislamiento secundario
A partir de los microorganismos obtenidos en el aislamiento primario se

realizaron repiques en agar CMC al 1%(p/v) de las colonias que presentaron
actividad celuloltica, llevando a incubacin y revelado bajo las mismas
condiciones del aislamiento primario.
5.3 Pruebas de antagonismo
Para llevar a cabo las pruebas de antagonismo se sigui el mtodo de

Gauze, para lo cual se prepar una suspensin en solucin salina 0.85%
(p/v) de 10ml de cada uno de los microorganismos seleccionados por
presentar mayor actividad enzimtica, igualando la concentracin al tubo uno
del patrn de Mc Farland (3x108 cel/ml) y llevando a incubacin a 100 rpm,
35C durante 14h. (Moreno et al, 2000). Por triplicado se dispusieron sobre
agar CMC al 1%(p/v), 2%(p/v) y 3%(p/v) (con siembra masiva del
microorganismo a enfrentar), anillos plsticos estriles de un centmetro de
dimetro de tal modo que una parte del anillo qued dentro del agar sin tocar
la base de la caja de petri. Dentro de los anillos se inocul una suspensin de
50l del microorganismo antagonista. Control negativo: anillo con agua
destilada estril. Teniendo como criterio de seleccin halos mayores a 5mm
(Gauze, 1967).
22
5.4 Conservacin de cepas
Las cepas seleccionadas en la pruebas de antagonismo fueron sometidas a

tincin de Gram y una vez definidas sus caractersticas microscpicas se
procedi a obtener cultivos axnicos en agar CMC 1%(p/v). Se llevaron a
cabo suspensiones de cada una de las cepas en caldo celulosa al 1%(p/v)
(composicin igual a agar celulosa excepto agar) igualando la concentracin
al tubo 1 del patrn de Mc. Farland (3*108 cel/ml). Estas suspensiones se
mezclaron con glicerol a una concentracin final de 25% (v/v), posteriormente
las suspensiones celulares fueron distribuidas en tubos eppendorf, cada uno
conteniendo un volumen de un mililitro que luego fueron almacenados a
20C (Poutou, et al., 1994).
5.5 Caracterizacin y procesamiento del residuo vegetal
Los residuos vegetales frescos provenientes del cultivo de crisantemo fueron

sometidos a una caracterizacin fsico-qumica en AGRILAB, laboratorio de
anlisis qumicos e insumos agrcolas certificado como laboratorio de
referencia por el ICA. Para el procesamiento de dicho residuo se llev a cabo
el siguiente protocolo: lavado con agua para retirar partculas de suelo,
reduccin de tamao mediante picado, lavado con SDS (Sodio Dodecil
Sulfato) al 1%(p/v) ebullicin por un perodo de media hora con SDS al 1%
(p/v), secado a 55C y finalmente molienda en molino Industrial. (Guevara, et
al., 2003)
23
5.6 Proceso de fermentacin en cultivo discontinuo
5.6.1 Utilizacin del sustrato vegetal por parte de los microorganismos

celulolticos seleccionados
Para la realizacin de este proceso se emplearon dos medios: uno con

sustrato vegetal a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v) junto con los
componentes del caldo celulosa exceptuando la carboximetilcelulosa,
llamado medio sustrato vegetal suplementado (SVS) (Anexo 1) y otro,
compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto de
levadura (2.5g/L) y peptona (2.5g/L) llamado medio sustrato vegetal (SV)
(Anexo 1).
5.6.1.1 Pruebas preliminares de actividad celuloltica de las cepas

seleccionadas (Individualmente)
Las curvas preliminares para evaluar el comportamiento enzimtico y la

subsecuente liberacin de azcares reductores utilizando las cepas aisladas
y seleccionadas en las pruebas de antagonismo, se llevaron a cabo en caldo
CMC al 1%(p/v), 3%(p/v) y 5%(p/v) y SVS al 10%(p/v).
Inicialmente estas cepas fueron reactivadas del banco en cajas de agar CMC
al 1%(p/v) e incubadas a 35C durante 48 horas. A partir de cada cepa se
hizo un raspado en caldo CMC 1%(p/v) llevando a una concentracin de 3 x
108 cel/ml e incubando a 35C y 120rpm durante 24 horas. Las
fermentaciones se llevaron a cabo por triplicado en un VET de 250ml
adicionando el 10% de inculo, con un tiempo de duracin entre 18 y 24
horas, a 35C y 120rpm, muestreando cada dos horas hasta completar el
tiempo de fermentacin. En cada una de las horas de muestreo. En cada una
de las horas de muestreo se realiz la determinacin de azcares reductores
24
por triplicado mediante la tcnica de DNS (Numeral 5.7). Adems se evalu
Actividad enzimtica en CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato pH7 37C y buffer
acido ctrico pH5 50C relacin 1:1 (numeral 5.8) con tiempos de reaccin
enzima-sustrato de 30, 60 y 120, realizando cada una de estas
evaluaciones por triplicado.
5.6.1.2 Evaluacin de la actividad celuloltica de las cepas

seleccionadas (En consorcio)
Para evaluar la actividad hidroltica de las cepas en consorcio se realizaron

fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v), caldo SV y SVS en
concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), cada uno, con un VET de 1000ml, .
adicionando 10% de inculo repartido en volmenes iguales de cada cepa a
evaluar ; incubando a 35C y 120 rpm durante 18-24 horas. La biomasa
inicial fue determinada mediante recuento en placa, en el caso de bacterias y
recuento de conidios en cmara de Neubawer, para microorganismos
filamentosos. A partir de los muestreos realizados la determinacin de
azcares reductores mediante DNS (numeral 5.7) y actividad enzimtica en
CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato pH7 37C y CMC al 1%(p/v) en buffer cido
ctrico pH5 50C, relacin 1:1 (numeral 5.8) con tiempo de reaccin enzima-
sustrato de 60 minutos.
5.7 Determinacin de azcares reductores
Las muestras tomadas en cada hora de fermentacin fueron inmediatamente

centrifugadas durante 20 minutos a 100rpm, a partir del sobrenadante
obtenido se tom un volumen de 0.25ml, al cual se adicion 0.25ml de DNS
(Anexo 2), esta mezcla se someti a ebullicin por 5 minutos, transcurrido
este tiempo, la mezcla se llev a un recipiente con hielo durante 5 minutos y
posteriormente se adicionaron 2.5ml de agua destilada. Esta solucin fue
25
leda en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540nm y sensibilidad
media, para registrar la absorbancia generada, la cual se reemplaz en la
ecuacin de la lnea recta arrojada por la curva patrn previamente realizada
(Anexo2), para la obtencin de la concentracin de glucosa residual en cada
hora de muestreo (Miller, 1959).
5.8 Determinacin de actividad celuloltica
Se prepararon dos soluciones de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer

fosfato 0.1M pH 7 y buffer cido ctrico pH5 (Anexo 1).
5.8.1 Solucin de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer fosfato 0.1M

pH7
Se tom 1ml de extracto crudo correspondiente a cada tiempo de muestreo

en cada una de las fermentaciones para hacerlos reaccionar con 1ml de la
solucin carboximetilcelulosa - buffer fosfato pH7. Dicha preparacin se
realiz por triplicado para evaluar la reaccin enzima-sustrato durante el
tiempo de reaccin establecido para cada curva, incubando a 37C en bao
termostatado. Transcurrido el tiempo de incubacin las muestras fueron
llevadas a un recipiente con hielo durante diez minutos para detener la
reaccin enzimtica, posteriormente se centrifugaron por 20 minutos a 100
rpm. A partir de los sobrenadantes se tomaron 0.25ml adicionando 0.25ml
de DNS, la mezcla fue puesta en ebullicin por 5 minutos para luego
detener la reaccin en hielo por 10 minutos luego, se adicionaron 2.5ml de
agua destilada y finalmente de hizo la lectura de las absorbancias
generadas en el espectrofotmetro a 540nm, sensibilidad media,
registrando los valores obtenidos para luego reemplazarlos en la curva
patrn de DNS (Anexo 2) (Dvila, et al, 2002).
26
5.8.2 Solucin de carboximetilcelulosa celulosa al 1%(p/v) en buffer
cido ctrico 0.1M pH5
La determinacin de la actividad enzimtica con buffer cido ctrico pH5. (se

llevo a cabo haciendo reaccionar 1ml de extracto crudo correspondiente a
cada hora de muestreo con 1ml de la solucin de celulosa en buffer cido
ctrico pH5. Esta preparacin se realiz por triplicado para evaluar la reaccin
enzima-sustrato durante 60 minutos a 50C. Transcurrido cada tiempo de
incubacin se detuvo la reaccin en hielo por 10 minutos para
posteriormente ser centrifugado por 20 minutos a 100rpm. A partir del
sobrenadante se tom 0.25ml adicionando 0.25ml de DNS, la mezcla se llev
a ebullicin por 5 minutos, posteriormente se paso a hielo por 10 minutos y
por ltimo se adicionaron 2.5ml de agua destilada realizando las lecturas de
absorbancia en el espectrofotmetro a 540nm, sensibilidad media registrando
los valores obtenidos para luego reemplazarlos en la curva patrn de DNS
(Anexo 2) (Adrado, et al, 2005).
5.9 Identificacin Bioqumica
La identificacin bioqumica se realiz a los dos microorganismos que

finalmente fueron seleccionados para conformar el consorcio microbiano
celuloltico, por presentar la mejor actividad hidroltica sobre el sustrato
evaluado. Las cepas fueron identificadas macroscpica y
microscpicamente, as mismo se realiz la evaluacin del comportamiento
metablico de acuerdo con el Manual de Bergeys de Bacteriologa
Sistemtica.
27
5.10 Evaluacin de azcares fermentables en el extracto crudo
El extracto crudo correspondiente a la hora seis de fermentacin en SV y

SVS al 10%(p/v), obtenido como resultado de la actividad hidroltica del
consorcio celuloltico definitivo, fue evaluado mediante cromatografa lquida
en el laboratorio de Ingeniera Qumica de la Universidad Nacional de
Colombia, con el fin de determinar la concentracin de azcares reductores
presentes.
5.11 Anlisis Estadstico
El anlisis estadstico de los datos obtenidos durante la prueba experimental

se realiz determinando inicialmente la distribucin normal de los datos
mediante la prueba de Chapiro Wilk y como prueba paramtrica T student,
utilizando el programa estadstico SPSS versin 14.
28
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 Aislamiento de microorganismos celulolticos
Los residuos vegetales frescos de crisantemo no permitieron el aislamiento

de microorganismos con actividad celuloltica, mientras que a partir de los
residuos vegetales en compostaje se logr el aislamiento de 8 cepas
bacterianas con dicha actividad (Tabla 3), esta diferencia probablemente se
debi a que en el proceso de compostaje la actividad metablica microbiana
se incrementa, adems, el tiempo de degradacin transcurrido, la alta
temperatura y el pH alcalino permitieron el aislamiento de microorganismos
celulolticos, pues dichas condiciones facilitan que bacterias esporgenas y
actinomicetes incrementen su actividad y por ende su poblacin (Granados y
Valderrama, 2003).
La actividad celuloltica se evidenci mediante evaluacin cualitativa con el

revelado de zonas de aclaramiento utilizando rojo congo al 1% (p/v) como ha
sido reportado por diferentes autores (Hendricks et al., 1995; Lu et al.,2005;
Zhang et al.,2006). El dimetro de los halos de hidrlisis generados no fue
establecido para la mayora de las cepas, pues, se obtuvieron zonas de
aclaramiento que se difundieron en todo el medio; sin embargo, en el caso de
la cepas 2, 6 y 8 el dimetro del halo fue de 0.3, 0.2 y 0.35mm,
respectivamente (Tabla 4, figura 3-10), que comparados con el estudio
realizado por Lu et al. (2005), en el que los dimetros de hidrlisis de las
cepas aisladas de tallos de flores cultivadas en agar CMC e incubadas a una
temperatura de 30+/-2C durante 5 das, alcanzaron valores de 6.4cm,
demuestran una baja actividad celuloltica de las cepas 2, 6 y 8 en este
medio. Sin embargo, se debe resaltar que las dems cepas pueden poseer
una actividad superior a la reportada por este autor.
29
Tabla 3. Caracterizacin macro y microscpica de las cepas aisladas con actividad
celuloltica en agar CMC 1%(p/v)
Cepa Morfologa Gram Borde Color Textura
1 Bacilos esporulados Positivo Irregular Rosa plido Cremosa
2 Bacilos esporulados Positivo Irregular Blanco Cremosa
3 Bacilos esporulados Negativo Irregular Incolora Cremosa
4 Bacilos esporulados Negativo Irregular Blanco Cremosa
5 Bacilos esporulados Positivo Irregular Blanco Cremosa
6 Bacilos esporulados Positivo Irregular Incolora Cremosa
7 Bacilos esporulados Positivo Irregular Incolora Cremosa
8 Bacilos esporulados Positivo Regular Beige Cremosa
Fuente: Autores
Tabla 4. Actividad celuloltica cualitativa de las cepas aisladas en agar CMC 1%(p/v)
Cepa Figura Dimetro halo de hidrlisis

1 3 Indeterminado
2 4 0.3 mm
3 5 Indeterminado
4 6 Indeterminado
5 7 Indeterminado
6 8 0.2 mm
7 9 Indeterminado
8 10 0.35 mm
Fuente: Autores
30
Fig 3 Zonas de aclaramiento, cepa 1 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
Fig 4. Zonas de aclaramiento, cepa 2 en Agar CMC 1% (p/v)

Fuente: Autores
31
Fuente: Autores

Fuente: Autores
32
Fuente: Autores

Fuente: Autores
33
Fuente: Autores

Fuente: Autores
34
6.2 Pruebas de Antagonismo
Con el fin de potencializar la actividad celuloltica de algunos de los

microorganismos aislados, se plante la posibilidad de establecer un
consorcio microbiano para lo cual fue necesario realizar pruebas de
antagonismo que descartaran aquellas cepas que generaran algn tipo de
inhibicin sobre las dems.
Durante las pruebas de antagonismo en agar CMC al 1%(p/v) la cepa 8 tuvo

la mayor actividad antagnica frente a las dems cepas evaluadas
generando el mximo halo de inhibicin (7.5mm) frente a la cepa 1 (Figura
11), por lo que en un principio fue descartada como parte del consorcio
microbiano, debido a su antagonismo frente a las siete cepas restantes
(Tabla 5, Figura 11-18).
Fig 11 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1 Fig 12 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 2
Fuente: Autores Fuente: Autores
35
Fig 18 Resistencia cepa 8

Fuente: Autores
36
La mayor susceptibilidad se observ en las cepas 2, 5 y 6, cuyo crecimiento
se vi inhibido por las dems cepas, generndose halos con dimetros hasta
de 5.0mm (Tabla 5). Las pruebas de antagonismo tambin se realizaron en
concentraciones de CMC al 2%(p/v) y 3 %(p/v) con el fin de determinar si el
comportamiento antagnico y crecimiento de cada cepa se mantena a pesar
del incremento en la concentracin de la fuente de carbono y de alguna
manera evaluar la inhibicin por sustrato de las cepas seleccionadas.
En la concentracin de 2%(p/v) en agar CMC se confirm la susceptibilidad

de las cepas 2, 5 y 6 (Tabla 6) pues los resultados fueron muy similares a los
obtenidos en agar CMC al 1%(p/v) por lo cual, quedaron descartadas para
ser parte del consorcio.
La actividad antagnica evidenciada durante el desarrollo de las pruebas en

CMC al 1%(p/v) y 2 %(p/v) demuestra que a pesar de tratarse de
microorganismos aislados de una misma fuente puede generarse inhibicin
entre ellos, una posible explicacin a este hecho es que existan diferencias
en la complejidad del sistema enzimtico que les permite degradar el
sustrato, generando diferentes tasas de crecimiento y dando lugar a una
competencia por sustrato y espacio.
En los resultados obtenidos en agar CMC al 3%(p/v) las cepas 1, 3, 4 y 7, no

desarrollaron ningn efecto antagnico entre s (Tabla 7), presentando un
crecimiento normal a dicha concentracin, lo que demostr que estos
microorganismos contaban con una maquinaria enzimtica adecuada para
degradar un sustrato celulsico, por lo cual, fueron escogidos inicialmente
para conformar el consorcio microbiano celuloltico.
37
Tabla 5. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 1%(p/v)
Cepa Cepas en siembra masiva

Antagnica 1 2 3 4 5 6 7 8
a a a
1 N.D. - - - 0.6 0.5 0.5 -
2 - N.D. - - 1.0 a - - -
a a a
3 - 5.0 N.D. - 1.8 2.0 - -
a a
4 - 5.0 - N.D. - 2.0 - -
5 - 4.0 a - - N.D. 2.5 a - -
a
6 - 3.2 - - - N.D. - -
a a
7 - - - - 0.7 1.0 N.D. -
8 7.5 a 4.4 a 3.8 a 3.1 a 5.0 a 3.8 a 2.9 a N.D.
Fuente: Autores
a
Promedio de tres repeticiones del dimetro del halo de inhibicin (mm)
( - ) No hubo inhibicin
ND No se determina
Cepa en siembra masiva

Cepa Antagnica 2 5 6
1 - - 0.8 a
2 N.D. - -
a a
3 3.0 1.5 -
4 4.5 a - 2.5 a
5 3.5 a N.D. 3.2 a
6 - 2.8 a N.D.
7 - 1.5 a 4.0 a
Fuente: Autores
a
Promedio de tres repeticiones del dimetro del halo de inhibicin (mm)
(-) No hubo inhibicin
N.D. No se determino
38
Cepa en siembra masiva

Cepa Antagnica 1 3 4 7
1 N.D. - - -
3 - N.D. - -
4 - - N.D. -
7 - - - N.D.
Fuente: Autores
( - )No hubo inhibicin
ND No se determina
6.3 Pretratamiento del Residuo Vegetal
Un pretratamiento eficiente reduce el contenido de lignina y de celulosa

cristalina e incrementa el rea superficial para las reacciones enzimticas.
Los pretratamientos pueden ser clasificados en mtodos mecnicos,
qumicos y fsicos (Mtui y Nakamura, 2005).
En este estudio los residuos vegetales de crisantemo fueron sometidos a un

pretratamiento mecnico el cual involucr la reduccin de tamao del
material celulsico por cortado, molienda y pulverizacin con el fin de
modificar la estructura cristalina de la celulosa (figura 19), pues la cantidad
de lignina que contiene este residuo no hizo necesario someter el sustrato a
otro tipo de tratamiento ya que los resultados de los anlisis fsico-qumicos
indicaron un muy bajo porcentaje de esta (Anexo 6).
39
Fig 19. Residuo vegetal de Crisantemo molido
Fuente: Autores
El pretratamiento mecnico utilizado permiti la obtencin de un tamao de

partcula muy pequeo (menor a 850) que adems de favorecer el acceso
de las enzimas hidrolticas del consorcio facilit la preparacin de los medios
de produccin y el seguimiento de los montajes realizados. Krishna (1999)
report la importancia de esta condicin pues afecta la relacin rea/
volumen y la densidad de empaquetamiento que determina la fraccin de
sustrato inicialmente accesible al microorganismo. Esta relacin se
incrementa cuando el tamao de partcula disminuye determinando as el
espacio vaco que es ocupado por el aire, y por ende la tasa de transferencia
de oxigeno que afecta directamente el crecimiento de los microorganismos.
6.4 Evaluacin preliminar de la actividad celuloltica de las cepas

aisladas
Con las cepas seleccionadas (1, 3, 4 y 7) en las pruebas de antagonismo se

realizaron pruebas preliminares para evaluar la capacidad celuloltica de
cada una de ellas determinando la liberacin de azcares reductores por la
tcnica de DNS (Miller,1959) y utilizando como sustrato CMC al 1%(p/v),
3%(p/v) y 5%(p/v), los resultados indicaron una actividad celuloltica nula en
todas las cepas, en las tres concentraciones y durante las veinte horas de
40
fermentacin (Anexo 3, Tablas 8-11), lo cual indic la falta de concordancia
entre la evaluacin cualitativa y cuantitativa de actividad, una posible
explicacin de este hecho es que en la prueba cualitativa, el microorganismo
permaneci en contacto con el sustrato durante 48 horas de incubacin,
aumentando as la probabilidad de liberar las enzimas necesarias para
degradar el polisacrido; mientras que en la tcnica de actividad cuantitativa
por DNS, el extracto enzimtico entr en contacto con la celulosa con un
tiempo de reaccin de 60 minutos que probablemente no fue suficiente para
que se diera una reaccin enzima-sustrato completa.
Otro posible factor a tener en cuenta es que la cantidad de enzima presente

en el sobrenadante no haya sido suficiente para hidrolizar la celulosa o para
obtener cantidades de azcares reductores que pudieran ser detectados por
esta tcnica, a pesar de que la prueba se realiz en condiciones de pH y
temperatura ptimos para la deteccin de las enzimas encargadas de la
degradacin del sustrato.
6.4.1 Evaluacin preliminar de la actividad celuloltica del consorcio
Al evaluar la actividad celuloltica de las cepas 1, 3, 4 y 7 en consorcio, los

resultados obtenidos tanto en la fermentacin realizada en caldo CMC al 1%
(p/v) como en caldo SVS al 10%(p/v), mostraron que la cantidad de azcares
reductores y la actividad enzimtica del consorcio en los dos sustratos fue
nula. (Anexo 3, tablas 12-14). Con base en estos resultados se decidi
buscar una segunda opcin que incluy la evaluacin de la cepa 8 que haba
sido inicialmente descartada en las pruebas de antagonismo, para lo cual,
se realizaron fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v) y SVS al 10%(p/v)
determinando azcares reductores y actividad enzimtica, alcanzndose
valores mayores a los obtenidos con el consorcio propuesto (Anexo 2, Tablas
15-16).
41
Con el objetivo de potencializar la actividad enzimtica de la cepa 8, teniendo
en cuenta que fue un microorganismo nativo del sustrato vegetal a evaluar
y, que durante la realizacin de las pruebas de antagonismo se caracteriz
por inhibir a las dems cepas, probablemente por tener una alta tasa de
crecimiento que lo haca competitivo por espacio y nutrientes y basados en
que el sinergismo de las enzimas celulolticas hacen posible la hidrlisis de
celulosa a glucosa (Lu, et al., 2005; Malherbe y Cloete, 2002) se evalu el
efecto sinrgico entre la cepa 8 y un actinomiceto con buena actividad
celuloltica cualitativa en CMC al 1%(p/v) (halos de hidrlisis de 2.14cm de
dimetro) aislado de suelo de un cultivo de Stevia durante el desarrollo del
trabajo de investigacin: Estandarizacin de la tcnica de deteccin de -
1,4 Glucanasas con el uso de sustratos fluorgenos en suelos provenientes
de cultivos de Stevia Rebaudiana bertoni (Gutierrez, et al, 2006).
Para lo anterior se realizaron curvas de cada microorganismo por separado

en caldo SVS al 10%(p/v) con el fin de evaluar la actividad enzimtica sobre
dicho sustrato. Los dos microorganismos presentaron una degradacin del
sustrato vegetal de crisantemo, lo que se evidenci con la cuantificacin de
azcares reductores y la actividad enzimtica obtenida (Anexo 2, Tablas 15-
18) (Figura 20-23).
1,2
Azcares reductores (g/L)
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
Fig 20 Azcares reductores en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8) en SVS al 10%(p/v)
42
0,07
Actividad enzimtica (UC)

0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
UC pH 7 37C UC pH 5 50C
Fig 21. Actividad enzimtica en el cultivo de Bacillus sp. (Cepa 8) en SVS al

10%(p/v), establecida bajo condiciones de pH7 37C y pH5 50C
1,4
1,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
Fig 22. Azcares reductores en el cultivo de Streptomyces sp. en SVS al 10%(p/v)
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
UC pH 7 37C UC pH 5 50C
Fig 23. Actividad enzimtica en el cultivo de Streptomyces sp. en SVS al 10%(p/v),

establecida bajo condiciones de pH7 37C y pH5 50C
43
6.5 Identificacin Bioqumica
El perfil bioqumico de la cepa 8 (Figura 24) indic su capacidad para

asimilar la glucosa como fuente de carbono y la subsecuente produccin de
cidos, as mismo redujo sulfatos y nitratos, produjo la enzima catalasa y
mostr crecimiento en concentracin de NaCl al 3%(p/v) (Tabla 24).
Teniendo en cuenta el perfil bioqumico obtenido segn Bergeys y que al
realizar la coloracin de Gram se observaron bacilos Gram positivos
esporulados, la cepa 8 fue identificada como Bacillus sp.
.
Fig. 24 Caractersticas macroscpicas

cepa 8 en agar CMC 1%(p/v)
Fuente: Autores
Tabla 24. Identificacin Bioqumica cepa 8
Caracterstica Resultados (Cepa 8)

Motilidad Negativo
Reduccin de sulfato a sulfito Negativo
Reduccin de nitratos a nitritos Positivo
Oxidasa Negativo
Catalasa Positivo
Produccin de cidos a partir de glucosa Positivo
Crecimiento en concentracin de NaCl 3% (p/v) Positivo
Produccin endosporas Positivo
Fuente: Autores
44
La identificacin del Actinomiceto se llev a cabo mediante observacin de
las caractersticas macro y microscpicas. En agar avena (Anexo 1) dicho
microorganismo desarroll un micelio areo abundante inicialmente blanco y
con el transcurso del tiempo de color caf, las colonias se observaron
pequeas, de borde irregular y aspecto pulverulento (Fig 25), al reverso de la
caja se observ la produccin de un pigmento difusible de color amarillo
oscuro, gener un olor caracterstico a suelo hmedo. Microscpicamente el
microorganismo se ti como Gram positivo, en cuanto al nmero y
disposicin de esporas otra caracterstica importante para distinguir los
gneros de Actinomicetes- se presentaron esporas ovoides en cadenas
espiraladas y rectas (Fig 26).
Fig 25 Caractersticas macroscpicas Fig 26 Caractersticas microscpicas

Streptomyces sp. en agar avena 5 %(p/v) Streptomyces sp.
Como parte complementaria de la identificacin se realiz el perfil bioqumico

del actino. (Tabla 25). El microorganismo hidroliz galactosa, fructosa,
sucrosa, arabinosa, rafinosa, xilosa, celobiosa, ramnosa, esculina e inositol,
as mismo se evidenci la produccin de la enzima catalasa y la reduccin de
nitratos a nitritos.
45
Tabla 25. Identificacin Bioqumica Actinomiceto
Caracterstica Resultados (Actino)
Galactosa Positivo
Fructosa Positivo
Sucrosa Positivo
Arabinosa Positivo
Rafinosa Positivo
Xilosa Positivo
Urea Negativo
Celobiosa Positivo
Ramnosa Positivo
Melobiosa Negativo
Inositol Positivo
Manitol Negativo
Fenilalanina Negativo
Triptofano Negativo
Esculina Positivo
Reduccin de nitratos a nitritos Positivo
Catalasa positivo
Gelatina Negativo
Fuente: Autores
Con base en las caractersticas macro y microscpicas la cepa fue

identificada como presuntiva de Streptomyces sp. Lo que se corrobor con
los resultados obtenidos a partir del perfil bioqumico del microorganismo
(Holt, et al, 2000).
Tanto Bacillus sp. como Streptomyces sp. han sido reportados como
microorganismos con alta actividad celuloltica. Muchas especies del gnero
Bacillus estn normalmente presentes en el suelo y en la materia orgnica en
degradacin, por lo que se considera que juegan un papel importante en la
biodegradacin y bioconversin de componentes de alto peso molecular. Se
ha realizado el aislamiento de Bacillus licheniformis a partir de residuos
vegetales de flores en compostaje (Lu et al, 2005) y Bacillus subtilis en
muestras de suelo y agua en la regin amaznica (Heck et al, 2002), en
residuos de banano (Krishna,1999), y en fibras de palma (Apun et al, 2000),
46
en los que dicho gnero bacteriano ha demostrado un alto potencial
celuloltico.
Por otro lado, Streptomyces sp. ha sido muy estudiado debido a que es parte
importante de la comunidad microbiana del suelo responsable de la
degradacin y recirculacin de biopolmeros como la celulosa, la
hemicelulosa y la lignina (Semedo et al, 2004). Los estudios realizados con
este microorganismo en cuanto a su capacidad hidroltica en materiales
lignocelulsicos han reportado buenos resultados, como es el caso de
Streptomyces drozdowiczii y Streptomyces cellulolyticus asilados de
muestras de suelo (Semedo et al, 2004; Grigorevski et al, 2005; Li, 1997).
Ramrez y Coha (2003) aislaron 145 cepas de actinomicetos celuloltcos
entre los cuales Streptomyces sp. tuvo una prevalencia de 50.63% y adems
mostr los ms altos niveles de actividad enzimtica en el estudio.
6.6 Utilizacin del sustrato vegetal por parte del consorcio celuloltico
Teniendo en cuenta la actividad hidroltica de Streptomyces sp. y Bacillus sp

en el residuo vegetal a evaluar (Anexo 4, Tablas 16 y 18 )(Figura 20-23); y
con el objetivo de potencializar la degradacin del sustrato por una posible
accin sinrgica entre las enzimas de cada cepa, se realizaron curvas en las
que los microorganismos actuaron en consorcio.
Durante las curvas realizadas con el consorcio microbiano en SV y SVS al

5% (p/v) se obtuvieron valores mximos de azcares reductores de 0.624 y
0.849g/L, respectivamente, en la hora 18 de fermentacin, (Anexo 5, Tablas
20 y 21) (Figura 27) mientras que, en SV y SVS al 10%(p/v) se alcanzaron
valores de 1.665 y 1.474g/L, (Anexo 5, Tablas 22 y 23) (Figura 28)
respectivamente, en la hora seis de fermentacin. Los resultados de la
cromatografa liquida realizada a los sobrenadantes obtenidos en la hora seis
47
de las fermentaciones en los medios al 10%(p/v) mostraron la presencia de
glucosa y fructosa como azcares reductores. En el medio SV la glucosa se
encontr en una concentracin de 0.475g/L, mientras que, en el medio SVS
adems de la glucosa en una concentracin de 0.391g/L se detecto fructosa
en una concentracin de 1.417 g/L (Anexo 7) estos resultados permitieron
inferir en primer lugar que el sustrato celulsico a concentracin de 10%(p/v)
estimul la actividad hidroltica del consorcio microbiano, generndose
diferencias significativas (p<0.05) (Anexo 8) con la actividad hidroltica al
5%(p/v), en segundo lugar que la adicin de sales al medio de produccin no
gener diferencias significativas (p>0.05) (Anexo 8) en la liberacin de
azcares reductores respecto al medio sin suplemento, como habra de
esperarse, pues los elementos traza en un medio de cultivo, juegan un papel
importante en la sntesis de cidos nucleicos, fosfolpidos, pared celular,
enzimas y otros constituyentes celulares, lo cual incrementa la biomasa
celular responsable de la hidrlisis del sustrato vegetal. Esto demuestra que
el residuo vegetal de crisantemo provee una fuente de carbono, nitrgeno y
minerales que suplen los requerimientos nutricionales necesarios para el
crecimiento y la actividad metablica de los microorganismos evaluados; lo
que puede corroborarse con los anlisis fisicoqumicos realizados al sustrato
(Anexo 6), la composicin de este residuo se presenta como una ventaja
para su utilizacin, pues, no se hace necesario suplementarlo con la adicin
de compuestos qumicos que generaran un costo adicional.
Finalmente, como pudo verse en los resultados obtenidos en la

cromatografa lquida se corrobor que la suplementacin del medio sustrato
vegetal no gener un incremento en la conversin de celulosa a glucosa, por
el contrario la concentracin de este azcar fue mayor en el medio sin
suplemento.
48
Sin embargo, se esperaba una mayor concentracin de azcares reductores
teniendo en cuenta que el residuo vegetal de crisantemo contena un alto
porcentaje de celulosa (65.3%) de acuerdo al anlisis fisicoqumico realizado
(Anexo 6).
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 6 12 16 18 20 22
Tiempo (h)
SV 5% (p/v) SVS 5% (p/v)
Figura 27. Azcares reductores en el cultivo del consorcio ( Bacillus sp. y

Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v)
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiem po (h)
SV 10%(p/v) SVS 10%(p/v)
Figura 28. Azcares reductores en el cultivo del consorcio ( Bacillus sp. y

Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v)
Por otro lado, al comparar la concentracin de azcares reductores obtenidos

en las pruebas preliminares en las que Bacillus sp y Streptomyces sp.
actuaron por separado en la degradacin de SVS al 10% (p/v) (Anexo
49
4,Tablas 16 y 18) con los obtenidos con el consorcio (Bacillus sp.-
Streptomyces sp.) en el mismo sustrato y a la misma concentracin (Anexo 4
y 5,Tablas 19 y 23), demuestran que se estableci un sinergismo en el que
probablemente se logr una complementariedad entre las enzimas
celulolticas que favorecieron la degradacin del sustrato con el consecuente
aumento en la liberacin de azcares reductores.
6.6.1. Condiciones de pH y Temperatura durante la Fermentacin
Durante las curvas de degradacin del residuo vegetal realizadas, el pH y la

temperatura se mantuvieron en un valor cercano a 6.0 y 35C,
respectivamente (Figura 29 y 30). Krishna (1999), report que el pH y la
temperatura de la fermentacin tienen una gran influencia en la produccin
de enzimas celulolticas, en su investigacin la mayor produccin se alcanz
a un pH de 7.0 manteniendo una temperatura constante de 35C, sin
embargo, el autor reporta otros estudios donde a un pH de 6.0 se da la
mayor liberacin enzimtica, lo que permite afirmar que tanto el pH como la
temperatura de operacin en esta investigacin favorecieron la hidrlisis del
residuo vegetal.
6,3
6,2
6,1
6
pH
5,9
5,8
5,7
5,6
5,5
0 6 12 16 18 20 22
Tiempo (h)
SV 5% (p/v) SVS 5% (p/v)
Figura 29 Variacin de pH en el cultivo del consorcio

(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v)
50
6,6
6,4
6,2
pH
6
5,8
5,6
5,4
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
SV 10% (p/v) SVS 10% (p/v)
Figura 30 Variacin de pH en el cultivo del consorcio

(Bacillus sp. Y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v)
6.7 Actividad Enzimtica y liberacin de azcares reductores a partir

del residuo vegetal de Crisantemo.
El nivel ms alto de celulasas se produjo en la fermentacin con SV al 10%

(p/v) en la hora 6, pH 7 37C con un valor de 0.1056 UC (UC definida como
la cantidad de enzima capaz de liberar un micromol de glucosa por minuto)
(Anexo 5 Tablas 22 y 23) (Figura 31) valor que coincidi con la mayor
concentracin de azcares en el mismo sustrato. Sin embargo, no existieron
diferencias significativas (p>0.05) en la concentracin de celulasas liberadas
en los medios SV y SVS en las concentraciones evaluadas.
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
UC SV 10% (p/v) UC SVS 10% (p/V)
Figura 31. Actividad enzimtica en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y

Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v),bajo condiciones de pH7 37C
51
Por otro lado, la actividad enzimtica a pH cido y una temperatura de 50C
(Figuras 32 y 33) fue menor, demostrando que dicha actividad vara de
acuerdo a las condiciones de pH y la temperatura en la que es evaluada
(p<0.05). Una explicacin a este hecho puede ser que en condiciones
naturales la actividad hidroltica de la celulosa se ve afectada cuando el pH
del suelo es cido, como es el caso de Cellulomonas sp. cuyo
comportamiento metablico se ve influenciado bajo estas condiciones (Lynd
et al.,2002)
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
UC pH7 37C UC pH 5 50C
Figura 32. Actividad enzimtica en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y

Streptomyces sp.) en SV al 10%(p/v),bajo condiciones de pH7 37C y pH5 50C
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
UC pH7 37C UC pH5 50C
Figura 33. Actividad enzimtica en el cultivo del consorcio(Bacillus sp. y

Streptomyces sp.) en SVS al 10%(p/v), bajo condiciones de pH7 37C
y pH5 50C
52
La actividad enzimtica del consorcio evaluada en SV y SVS en
concentraciones de 5%(p/v) y 10%(p/v), no es comparable con los resultados
reportados por otros estudios en los que tambin se ha realizado la
evaluacin de microorganismos celulolticos en residuos celulsicos (Lu et al
2005), (Krishna, 1999), debido a que el material celulsico difiere en sus
caractersticas fsico-qumicas como son: el tamao y la superficie de las
fibrillas, el espacio entre las microfibrillas y las molculas de celulosa en las
regiones amorfas, el grado de cristalinidad de la celulosa, la conformacin
estereoscpica y la rigidez de las unidades de celulosa, el grado de
polimerizacin de la celulosa, la naturaleza de los componentes con los que
la celulosa esta asociada, la naturaleza, concentracin y distribucin de
grupos sustituyentes (Malherbe y Cloete, 2002; Petre et al., 1999; Zhang et
al., 2006). Dichos parmetros condicionan drsticamente la habilidad de los
microorganismos celulolticos para degradar este tipo de sustratos, lo cual
explica que el comportamiento metablico sea especfico y por ende, la
acumulacin del producto de hidrlisis difiera de un ensayo a otro.
Por otro lado, las interacciones complejas entre las enzimas encargadas de
hidrolizar la celulosa (endoglucanasas, exoglucanasas y -glucosidasas ) y
los cambios en las caractersticas del sustrato durante la hidrlisis han sido
simulados por modelos matemticos aplicados a una variedad de materiales
lignocelulsicos teniendo en cuenta dos propiedades importantes: la fraccin
de enlaces -glucosidicos accesibles a las celulasas y el grado de
polimerizacin, dicho modelo sugiere que es casi imposible la prediccin del
funcionamiento hidroltico de una mezcla de celulasas de un sustrato a otro
debido a variaciones como la concentracin de celulasas, la proporcin
endo/exocelulasas, el tiempo de reaccin y las caractersticas del sustrato
(Zhang et al., 2006). De esta manera, la actividad celuloltica de los
53
microorganismos va a ser especfica para cada sustrato celulsico a evaluar,
como ha sido reportado en diferentes estudios, Lu et al (2005) obtuvo 7.9 y
28UC en una fermentacin de residuos de tallos de flores con Bacillus
pasteuri y Bacillus cereus, dichos microorganismos crecieron en un medio
que contena sulfato, fosfato y nitrato entre otros componentes, durante 7
das a 35C y un pH de 6.8-7.2; Krishna (1999) report 3.30UC a partir de
residuos de banano utilizando Bacillus subtilis durante 72 horas de
fermentacin, pH7, 35C, y en este estudio la mayor actividad fue de 0.1056
UC a partir de residuos vegetales de crisantemo.
(En todos los casos la actividad celuloltica fue definida como la cantidad de
enzima necesaria para producir una micromol de glucosa por minuto).
Durante las pruebas realizadas se observaron marcadas diferencias entre la

actividad celuloltica cualitativa y cuantitativa evaluada, lo cual puede estar
directamente relacionado con el tipo de sustrato en el que se realizaron
dichas pruebas, pues, segn Zhang et al.,(2006), es necesario tener en
cuenta la solubilidad o insolubilidad en agua del sustrato que se quiere
evaluar ya que determina los parmetros para realizar el screening y
determinacin de la actividad enzimtica de microorganismos con capacidad
celuloltica.
En esta investigacin el screening se realiz en agar CMC al 1%(p/v)

(sustrato celulsico soluble), posteriormente la induccin de enzimas en
residuos vegetales de crisantemo (sustrato insoluble) y la cuantificacin de
dichas enzimas fue llevada a cabo en CMC al 1%(p/v) buffer fosfato y buffer
cido ctrico (pH7 y 5). La utilizacin de sustratos con diferente tipo de
solubilidad probablemente influy en la variacin de los resultados, pues la
relacin existente entre la tasa de hidrlisis obtenida en sustratos solubles e
insolubles no es clara, principalmente porque existen diferencias en la
accesibilidad de las enzimas al sustrato y el grado de polimerizacin (Zhang
54
et al., 2006), lo cual explica la obtencin de halos de dimetro incuantificable
y su baja correlacin con los niveles de azcares reductores obtenidos y la
actividad enzimtica evaluada tanto para las cepas inicialmente aisladas
como para el consorcio. Este mismo autor concluy que los datos obtenidos
en la hidrlisis de sustratos solubles no pueden ser comparados con la
hidrlisis de sustratos insolubles. Un claro ejemplo de este concepto es el
reportado por Himmel et al.,(1999) quien en su estudio obtuvo una actividad
especfica de endoglucanasas de Thermobifida fusca diez veces ms alta
que la actividad de la endoglucanasa de Trichoderma reesei al ser evaluada
en CMC (sustrato soluble). Sin embargo, esta actividad no se mantuvo
cuando dicha enzima fue evaluada en celulosa insoluble.
Otro de los factores que pudo haber influido en la variacin de los resultados
es el tiempo de fermentacin y el de reaccin enzima-sustrato durante las
pruebas de actividad enzimtica. Teniendo en cuenta que la lignocelulosa
pretratada utilizada para evaluar la actividad enzimtica de preparaciones
comerciales de celulasas, requiere un rango de tiempo que va de minutos a
horas para que inicie la hidrlisis y hasta varios das para obtener una
digestibilidad final (conversin de la celulosa) (Zhang et al, 2006), hace
pensar que probablemente las evaluaciones realizadas requeran un mayor
tiempo de reaccin que diera lugar a la obtencin de mejores resultados.
Finalmente se puede considerar la importancia de continuar realizando

screening de microorganismos celulolticos pues la utilizacin de estos se
convierte en una alternativa viable para el tratamiento de residuos
celulsicos, pues tan solo se ha identificado y evaluado menos del 1% del
potencial de dichos microorganismos presentes en la biosfera (Howard et al,
2003)
55
7. CONCLUSIONES
Se logr el aislamiento de ocho cepas bacterianas con actividad

celuloltica en CMC 1%(p/v) a partir de residuos vegetales de crisantemo en
compostaje
Las pruebas de antagonismo en CMC (1%(p/v), 2% (p/v) y 3%(p/v))

permitieron seleccionar los microorganismos capaces de actuar en consorcio
en la degradacin del residuo vegetal
Las enzimas de Bacillus sp. y Streptomyces sp. actuaron sinrgicamente

en la degradacin del residuo vegetal
La mayor concentracin de azcares reductores y actividad enzimtica se

obtuvieron en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV
10% (p/v)
El residuo vegetal de crisantemo aport los nutrientes necesarios para

estimular la actividad enzimtica de los microorganismos evaluados por lo
cual no se hace necesario suplementar el residuo con sales
56
8. RECOMENDACIONES
Realizar screening de microorganismos celulolticos termfilos que

puedan ser aprovechados en el tratamiento de residuos agroindustriales
Realizar el aislamiento y evaluacin de microorganismos con actividad

celuloltica, empleando sustratos de la misma naturaleza de donde fueron
aislados
Evaluar la actividad hidroltica de los microorganismos celulolticos en

rangos de tiempo ms amplios a los empleados en este estudio
Tener en cuenta el tamao de partcula del sustrato vegetal, pues,

puede generar inconvenientes en la manipulacin y seguimiento de las
fermentaciones
Establecer el tipo de interaccin que ocurre entre Bacillus sp. y

Streptomyces sp., durante el desarrollo de la biomasa
Evaluar actividad celuloltica cualitativa y cuantitativa en tiempos iguales
Determinar el tipo de enzimas que libera cada microorganismo, evaluando

la actividad de cada una de estas en sustratos especficos
Evaluar el sustrato fermentable obtenido, en la produccin de etanol
Lleva a cabo la determinacin de azcares reductores y evaluacin de la

actividad enzimtica utilizando residuo vegetal de crisantemo en
concentraciones entre 5%(p/v) y 10%(p/v)
57
9. LITERATURA CITADA
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63
ANEXO 1
Medios de cultivo y reactivos
MEDIO DE CULTIVO COMPOSICIN (g/L)

Agar CMC 1%(p/v) Carboximetilcelulosa 10
Extracto de levadura 2.5
Peptona universal 2.5
Sulfato de amonio 0.5
Cloruro de calcio 0.5
Fosfato monobsico de potasio 0.1
Fosfato dibsico de potasio 0.1
Agar-agar 15
Ajustar pH 7.0+/-2
Caldo Sustrato vegetal Residuo vegetal de Crisantemo 50-100
(SV) 5%(p/v) 10%(p/v) Extracto de levadura 2.5
Peptona universal 2.5
Ajustar pH 7.0+/-2
Caldo Sustrato vegetal Residuo vegetal de Crisantemo 50-100
suplementado (SVS) Extracto de levadura 2.5
5%(p/v) 10%(p/v) Peptona universal 2.5
Sulfato de amonio 0.5
Cloruro de calcio 0.5
Fosfato monobsico de potasio 0.1
Fosfato dibsico de potasio 0.1
Agar-agar 15
Ajustar pH 7.0+/-2
Agar avena Avena molida 50
NaCl 10
Agar-agar 15
REACTIVOS COMPOSICIN (g/L)
Rojo congo 1%(p/v) Rojo congo 10
NaCl 0.1 M Nacl 200
64
Preparacin buffer fosfato pH 7
1. Preparacin buffer fosfato 0.1 M pH 7
9 Pesar 3.5 g de Na2HPO4 y disolver en 100 ml de agua destilada

9 Pesar 3.45 g de NaH2PO4 y disolver en 100 ml de agua destilada
9 Mezclar lentamente las dos soluciones
9 Ajustar pH 7+/- 0.2
9 Enrasar en baln aforado hasta completar 500 ml
2. Preparacin de Carboximetilcelulosa al 1.0%(p/v) en buffer fosfato 0.1M
9 Pesar 1.0g de carboximetilcelulosa y disolver lentamente en 50ml

de buffer fosfato 0.1M pH7
9 Calentar la solucin en horno microondas por un minuto
9 Ajustar pH a 7 +/-2
9 Enrasar a 100ml con el buffer fosfato 0.1M pH7 en baln
volumtrico
Preparacin buffer cido ctrico pH 5
1. Preparacin buffer cido ctrico 0.1M pH5
9 Pesar 5.37g de Na2PH4.7H2O

9 Pesar 2.10g de cido ctrico
9 Pesar 1g de carboximetilcelulosa
9 Disolver todos los componentes en 100 ml de agua destilada
9 Ajustar a pH5
65
ANEXO 2
Determinacin de azcares reductores

por el mtodo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS)
Preparacin del reactivo de DNS
Depositar en un beaker de 250ml, 50ml de agua destilada, adicionar 1.6g de

Hidrxido de sodio y disolver mediante agitacin continua en plancha
magntica a temperatura ambiente. Posteriormente adicionar lentamente
43.8g de Tartrato de sodio y potasio hasta que se disuelva por completo.
Recubrir el beaker con papel kraft y agregar lentamente 1g de cido 3,5-
dinitrosaliclico. Complete con agua destilada hasta 100ml en baln aforado.
Deje en agitacin toda noche en un frasco oscuro
Preparacin de la solucin stock de glucosa 2g/L
Pese 2g de glucosa anhdrida y disuelva en 500ml de agua destilada

utilizando un baln volumtrico de 1000ml, homogenice y complete hasta
100ml con agua destilada
Preparacin de las soluciones de concentracin conocida 0.5- 2g/L
Empleando la formula V1*C1 = V2*C2. Se preparan seis soluciones que

tengan un volumen final de 2ml
Concentracin g/L Solucin concentrada de Agua destilada

glucosa en ml ml
0.5 0.5 1.5
0.7 0.7 1.3
1 1 1
1.5 1.5 0.5
1.7 1.7 0.3
2 2 0
66
Curva patrn de glucosa N 1
Concentracin Absorbancia
g/L 540nm Curva patrn de Glucosa (g/L) N1
Abso rban cia 540n m

0.5 0.271 1,2
1
0.7 0.353 0,8
1 0.484 0,6
0,4 y = 0,4883x + 0,0153
1.5 0.774 0,2 R2 = 0,996
0
1.7 0.827
0,5 0,7 1 1,5 1,7 2
2 0.995
Concentracin glucosa (g/L)
Curva patrn de glucosa N 2
Concentracin Absorbancia Curva patrn de Glucosa (g/L) N2

g/L 540nm
Absorbancia 540 nm
0,8
0.5 0.247
0,6
0.7 0.36 0,4

y = 0,4981x + 0,098
0,2 R2 = 0,995
1 0.529 0
0,5 0,7 1 1,5
1.5 0.746
Concentracin glucosa (g/L)
67
ANEXO 3
Pruebas preliminares: Determinacin Azcares reductores y Actividad
enzimtica cepas 1, 3,4 y 7
Tabla 8. Azcares reductores (g/L) en el cultivo de la cepa 1 en diferentes concentraciones

de caldo CMC
Tiempo Azcares reductores Azcares reductores Azcares reductores

(h) (g/L),CMC 1%(p/v) (g/L), CMC 3%(p/v) (g/L), CMC 5%(p/v)
0 0.075 0.079 0.094
1 0.108 0.062 0.090
2 0.030 0.081 0.040
4 0.0076 0.075 0.049
6 0.063 0.069 0.079
8 0.32 0.061 0.088
10 0.049 0.093 0.104
12 0.028 0.055 0.067
14 0.083 0.106 0.11
16 0.062 - 0.10
18 0.065 0.079 -
Fuente: Autores
Tabla 9. Azcares reductores (g/L) en el cultivo de la cepa 3 en diferentes concentraciones

de caldo CMC

(h) (g/L), CMC 1%(p/v) (g/L), CMC 3%(p/v) (g/L), CMC 5%(p/v)
0 0.06 0.055 0.084
1 0.99 0.048 0.085
2 0.028 0.076 0.037
4 0.01 0.072 0.048
6 0.054 0.065 0.076
8 0.26 0.060 0.081
10 0.05 0.089 0.1
12 0.020 0.052 0.058
14 0.072 0.1 0.13
16 0.05 0.05 0.09
18 0.06 0.070 0.069
Fuente: Autores
68
Tabla 10 Azcares reductores (g/L) en el cultivo de la cepa 4 en diferentes concentraciones
de caldo CMC

(h) (g/L), CMC 1%(p/v) (g/L), CMC 3%(p/v) (g/L), CMC 5%(p/v)
0 0.071 0.074 0.07
1 0.046 0.051 0.065
2 0.049 0.06 0.081
4 0.05 0.05 0.068
6 0.06 0.07 0.054
8 0.07 0.06 0.06
10 0.058 0.075 0.043
12 0.07 0.077 0.062
14 0.072 0.069 0.053
16 0.065 0.06 0.068
18 0.063 0.07 0.068
Fuente: Autores
Tabla11. Azcares reductores (g/L) en el cultivo de la cepa 7 en diferentes concentraciones

de caldo CMC

(h) (g/L), CMC 1%(p/v) (g/L), CMC 3%(p/v) (g/L) CMC 5%(p/v)
0 0.075 0.079 0.094
1 0.108 0.062 0.090
2 0.030 0.081 0.040
4 0.0076 0.075 0.049
6 0.063 0.069 0.079
8 0.32 0.061 0.088
10 0.049 0.093 0.104
12 0.028 0.055 0.067
14 0.083 0.106 0.11
16 0.062 - 0.10
18 0.065 0.079 -
Fuente: Autores
69
Tabla 12. Azcares reductores (g/L) en el cultivo del consorcio (cepas 1, 3, 4 y 7) en caldo
CMC al 1%(p/v) y SVS al 10%(p/v)
Tiempo(h) Azcares reductores (g/L) Azcares reductores (g/L)

CMC 1%(p/v) SVS 10%( p/v)
0 0.0076 0.083
2 0.011 0.08
4 0.03 0.08
6 0.32 0.073
8 0.07 0.120
11 0.02 0.051
15 0 0.036
19 0 0.028
23 - 0.034
Fuente: Autores
Tabla 13 Actividad enzimtica del consorcio (cepas 1, 3, 4 y 7) en caldo CMC al 1%(p/v),a

pH7 37C y tiempos de reaccin enzima sustrato de 30, 60 y 120
Tiempo (h) Actividad enzimtica Actividad enzimtica Actividad enzimtica

(UC) 30 (UC) 60 (UC) 120
2 0.005 0.012 0.016
4 0.016 0.022 0.043
6 0.002 0.016 0.022
8 0.011 0.026 0.018
11 0.029 0.015 0.014
15 - 0.004 0.004
19 - 0.023 0.008
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una mol de glucosa por minuto a
pH 7 37C
Tabla 14 Actividad enzimtica del consorcio (cepas 1, 3, 4 y 7) en caldo SVS al 10%(p/v), a

pH7 37C y tiempos de reaccin enzima sustrato de 30,60 y 120
Tiempo (h) Actividad enzimtica Actividad enzimtica Actividad enzimtica

(UC) 30 (UC) 60 (UC) 120
2 0.031 0.024 0.023
4 0.032 0.028 0.023
6 0.003 0.025 0.032
8 0.002 0.025 0.036
11 0.003 0.034 0.013
15 - 0.017 0.017
19 - 0.025 0.023
Fuente: Autores
pH7 37C
70
ANEXO 4
Pruebas preliminares: Determinacin Azcares reductores y Actividad

enzimtica de Bacillus sp. (Cepa 8) y Streptomyces sp. por separado y en
consorcio
Tabla 15. Azcares reductores (g/L) y Actividad enzimtica a pH7 37C con tiempo de
reaccin enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Bacillus sp. en caldo CMC al
1%(p/v)
Tiempo (h) Azcares reductores Actividad enzimtica

(g/L) (UC) pH7 37C
12 0.26 0.025
14 0.23 0.028
16 0.19 0.043
18 0.23 0.033
20 0.20 0.024
22 0.15 0.023
24 0.16 0.025
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una mol de glucosa
por minuto a pH 7 37C y pH5 50C
Tabla 16. Azcares reductores (g/L) y Actividad enzimtica a pH7 37C, pH5 50C con
tiempo de reaccin enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Bacillus sp. en caldo SVS
al 10% (p/v)
Tiempo (h) Azcares reductores Actividad enzimtica Actividad enzimtica

(g/L) (UC) pH7 37C (UC) pH5 50C
12 1.07 0.03 0.04
14 0.88 0.03 0.035
16 0.91 0.03 0.04
18 0.87 0.06 0.05
20 0.81 0.04 0.05
22 0.53 0.04 0.02
24 0.95 - -
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una mol de glucosa por minuto
a pH7 37C y pH5 50C
71
Tabla 17. Azcares reductores (g/L) y Actividad enzimtica a pH7 37C, con tiempo de
reaccin enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Streptomyces sp. en caldo CMC al
1% (p/v)
Tiempo (h) Azcares reductores Actividad enzimtica

(g/L) (UC) pH7 37C
12 0.29 0.05
14 0.28 0.05
16 0.26 0.04
18 0.27 0.04
20 0.25 0.03
22 0.24 0.02
24 0.15 0.02
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una mol de glucosa
por minuto a pH7 37C
tiempo de reaccin enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Streptomyces sp. en
caldo SVS al 10%(p/v)

(g/L) (UC) pH7 37C (UC) pH5 50C
12 1.173 0.04 0.04
14 1.054 0.04 0.03
16 0.98 0.03 0.03
18 1.30 0.06 0.05
20 1.0 0.04 0.04
22 0.644 0.03 0.02
24 0.876 - -
Fuente: Autores
a pH7 37C y pH5 50C
72
tiempo de reaccin enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo del consorcio (Bacillus sp.y
Streptomyces sp.) en caldo SVS al 10%(p/v)

(g/L) (UC) pH7 37C (UC) pH5 50C
12 1.109 0.03 0.03
14 1.085 0.04 0.02
16 0.96 0.04 0.04
18 1.092 0.06 0.04
20 1.197 0.04 0.04
22 0.501 0.04 0.02
24 1.095 - -
Fuente: Autores
pH7 37C y pH5 50C
73
ANEXO 5
Determinacin de azcares reductores y Actividad enzimtica del consorcio

(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en cultivo discontinuo en SV y SVS al
5%(p/v) y 10% (p/v)
Tabla 20. Azcares reductores y Actividad celuloltica en el cultivo del consorcio

celuloltico con SV al 5%(p/v)
Actividad celuloltica (UC) pH7

Tiempo (h) pH Azcares reductores (g/L) 37C
0 6,18 0,437
6 6,15 0,591 0,0175
12 6,22 0,445 0,0149
16 5,95 0,535 0,0227
18 5,97 0,624 0,0258
20 6,1 0,296 0,0471
22 6,07 0,317 0,0178
Fuente: Autores
pH7 37C

celuloltico con SVS al 5%(p/v)
Actividad celuloltica (UC) pH7

Tiempo (h) pH Azcares reductores (g/L) 37C
0 5,78 0,378
6 5,82 0,435 0,01185
12 5,86 0,352 0,03027
16 5,88 0,589 0,0178
18 5,84 0,849 0,0357
20 5,81 0,423 0,035
22 5,8 0,419 0,0255
Fuente: Autores
pH7 37C
74
celuloltico con SV al 10%(p/v)
Azcares reductores* Actividad celuloltica* Actividad celuloltica*

Tiempo (h) pH (g/L) (UC) pH7 37C (UC) pH5 50C
0 6,27 1,38
6 5,88 1,665 0,1056 0,0394
12 5,87 1,145 0,05074 0,026
16 5,89 0,858 0,042 0,0279
18 5,99 0,856 0,0387 0,02954
20 6,24 0,9 0,0372 0,0291
22 6,31 1,27 0,0625 0,0321
25 6,23 0,647 _ _
Fuente: Autores
a pH7 37C y pH5 50C
*Valores hallados a partir de la curva patrn de Glucosa N 2

celuloltico con SVS al 10%(p/v)
Azcares
reductores* Actividad celuloltica* Actividad celuloltica* (UC)
Tiempo(h) pH (g/L) (UC) pH7 37C pH5 50C
0 6,26 1,289
6 5,79 1,474 0,08555 0,0328
12 5,98 1,074 0,0502 0,02231
16 6,01 0,884 0,04426 0,01916
18 6,08 0,82 0,0465 0,01842
20 6,3 0,777 0,04574 0,0177
22 6,29 1,225 0,0575 0,03092
25 6,41 0,767 _ _
Fuente: Autores
pH7 37C y pH5 50C
*Valores hallados a partir de la curva patrn de glucosa N 2
75
ANEXO 6
Anlisis fisicoqumico del residuo vegetal de crisantemo
PARMETRO RESULTADO UNIDADES MTODO

ANALTICO
Humedad 7.92 % GRAVIMTRICO
(MET. INTERNO
GRAVIMTRICO
Fraccin Mineral 2,84 %
(MET. INTERNO)
Prdidas por GRAVIMTRICO
89,2 %
Volatilizacin (MET. INTERNO)
CARACTERIZACIN DE LA FRACCIN ORGNICA (89.2 %)
MICRO-KJELDHAL
Protena 5,01 %
(MET. INTERNO)
Celulosa 65,3 % SUMATORIA
Hemicelulosa 2,03 % SUMATORIA
Carbohidratos no COLORIMTRICO
16,6 %
estructurales (MET. INTERNO)
GRAVIMTRICO
Lignina 0,51 %
(MET. INTERNO)
Fuente: Laboratorio de Anlisis qumicos e insumos agrcolas, AGRILAB
MTODO
ELEMENTO RESULTADO UNIDADES
ANALTICO
FRACCIN ORGNICA (89.2%)
GRAVIMTRICO
Grasa 0,31 %
(MET. INTERNO)
GRAVIMTRICO
Fibra Cruda 46,4 %
(MET. INTERNO)
Extracto no
37,5 % SUMATORIA
Nitrogenado
Fibra detergente GRAVIMTRICO

68,3 %
neutra (MET. INTERNO)
Fibra detergente GRAVIMTRICO
66,3 %
cida (MET. INTERNO)
NUTRIENTES
COLORIMTRICO
Fsforo (P2O5) 0,27 %
(NTC 234)
ABS. ATMICA
Calcio (CaO) 0,69 %
(MET. INTERNO)
ABS. ATMICA
Slice (SiO2) 0,55 %
(MET. INTERNO)
Fuente: Laboratorio de Anlisis qumicos e insumos agrcolas, AGRILAB
76
ANEXO 7
Perfil cromatogrfico
Sobrenadante de la hora seis de fermentacin en SV al 10%(p/v)
Fuente: Laboratorio de Ingeniera Qumica de la Universidad Nacional de Colombia
77
Perfil cromatogrfico
Sobrenadante de la hora seis de fermentacin en SVS al 10%(p/v)
Fuente: Laboratorio de Ingeniera Qumica de la Universidad Nacional de Colombia
78
ANEXO 8
Anlisis estadstico (SPSS, versin 14.)
Distribucin de datos
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
AzR
,135 28 ,200(*) ,919 28 ,033
et
* This is a lower bound of the true significance.
a Lilliefors Significance Correction
Resultados arrojados (F28=0,919, p=0,033)
Datos normalizados
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Log ,136 28 ,196 ,956 28 ,278
a Lilliefors Significance Correction
79
Comparacin de la liberacin de azcares reductores entre sustrato vegetal
concentraciones 5%(p/v) y 10%(p/v)
Oneway Analysis of Log A.R By Concentracion

0,3
0,2
0,1
0
Log A.R
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
-0,6
10% 5%
Concentracion
Oneway Anova
Summary of Fit
Rsquare 0,7622
Adj Rsquare 0,742383
Root Mean Square Error 0,120137
Mean of Response -0,14997
Observations (or Sum 14
Wgts)
t-Test
Difference t-Test DF Prob > |t|
Estimate 0,398255 6,202 12 <.0001
Std Error 0,064216
Lower 95% 0,258341
Upper 95% 0,538170
Assuming equal variances
80
Comparacin de la liberacin de azcares reductores entre los medios SV y
SVS a concentracin de 5%(p/v) y 10%(p/v)
Oneway Analysis of Log A.R By Medio

0,3
0,2
0,1
0
Log A.R
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
-0,6
SV SVS
Medio
Oneway Anova
Summary of Fit
Rsquare 0,000039
Adj Rsquare -0,03842
Root Mean Square Error 0,230817
Mean of Response -0,14859
Observations (or Sum 28
Wgts)
t-Test
Difference t-Test DF Prob > |t|
Estimate -0,00277 -0,032 26 0,9750
Std Error 0,08724
Lower 95% -0,18209
Upper 95% 0,17656
Assuming equal variantes
81
Diana Gaitn, Liliana Prez
AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS CELULOLITICOS A PARTIR DE

RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE
CRISANTEMO (Dendranthema grandiflora)
Diana Gaitn, Liliana Prez, Adriana Matiz, Balkys Quevedo

dgaitan@javeriana.edu.co, liliana.perez @javeriana.edu.co,
amatiz @javeriana.edu.co. bquevedo@javeriana.edu.co.
Departamento de Microbiologa. Pontificia Universidad Javeriana, Cra 7 N 43-88
RESUMEN
El presente trabajo tuvo como objetivo aislar y evaluar microorganismos degradadores de celulosa a
partir de residuos vegetales frescos y en compost de crisantemo. Ocho cepas bacterianas mesoflicas
con actividad celuloltica fueron aisladas y purificadas a partir de residuos vegetales de crisantemo en
compostaje. La actividad celuloltica de estas cepas fue evaluada cualitativamente mediante el revelado
de halos de hidrlisis con rojo congo en medio Carboximetilcelulosa (CMC) al 1% (p/v),
posteriormente, con el objetivo de establecer un consorcio bacteriano celuloltico se realizaron
pruebas de antagonismo para determinar si exista algn tipo de inhibicin entre stas. La actividad
celuloltica de las cepas escogidas fue evaluada mediante la tcnica del cido 3,5-dinitrosaliclico
(DNS) a partir de la cual slo una cepa fue seleccionada para hacer parte del consorcio. Con el fin de
potencializar la actividad de dicha cepa se us un actinomiceto aislado y evaluado en otro estudio.
Estos microorganismos fueron identificados como Bacillus sp. y Streptomyces sp.. La capacidad
degradadora del consorcio sobre el residuo vegetal de crisantemo fue evaluada en dos medios: uno con
sustrato vegetal a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), suplementado con sales (SVS) y otro,
compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto de levadura y peptona (SV),
determinando la concentracin de azcares reductores liberados mediante la tcnica de DNS y la
actividad enzimtica en CMC en buffer fosfato pH7 37C y CMC en buffer cido ctrico pH5 50C.
Los resultados obtenidos mostraron que la degradacin del sustrato vegetal de crisantemo fue mejor
cuando las microorganismos actuaron en consorcio demostrando una accin sinrgica entre sus
enzimas, por otro lado, en el medio SV en una concentracin del 10%(p/v) se di la mayor liberacin
de azucares reductores con un valor de 1.665g/L y una actividad enzimtica de 0.1056 UC.
Palabras clave: actividad celuloltica, azcares reductores, celulosa, residuo vegetal
ABSTRACT
The present investigation was with the aim of isolate and evaluate cellulose degradation by
microorganisms. Eight mesophilic bacteria with cellulolytic activity were isolation and purified from
vegetable wastes of a composting system of crisantemo. The cellulolytic activity of this microorganism
was evaluated qualitatively through hydrolysis halo using congo red and carboximethylcellulose
(CMC) 1%(w/v) as the substrate, afterwards with the objective to create a cellulolytic bacterial
association developed antagonism test for determine if any type of inhibition existed between them.
The cellulolytic activity of the selected strain was evaluated with dinitrosalicyc acid (DNS) method,
only one microorganism was selected for the bacterial association. With the aim of boost the bacteria
activity, employed a cellulolytic actinomycete previously isolated and evaluated in other investigation.
This microorganisms were identified as Bacillus sp. and Streptomyces sp. The degradation capacity of
bacterial association using vegetable wastes of crisantemo was evaluated employing two broths: one of
this with vegetable waste at different concentrations (5%(w/v) and 10%(w/v)), and additional salts
(SVS), the other only with vegetable waste with the same concentrations, yeast extract and peptone
(SV) the concentration of reducing sugars was evaluated with DNS method and the cellulose activity
using CMC phosphate buffer pH7 37C and CMC citric acid pH5 50C. The obtained results indicated
that the best degradation of vegetable wastes was using the bacterial association, showing a synergetic
cellulose degradation, furthermore, the SV 10%(w/v) broth showed the best concentration of reducing
sugars (1.665 g/L) and cellulose activity of 0.1056 UC.
Key words: cellulose, cellulolytic activity, reducing sugars, vegetable waste.
1
INTRODUCCION
La floricultura es una de las actividades ms desarrolladas en Colombia. El

crisantemo ocupa el cuarto lugar en flores de exportacin. Este sector libera altos
volmenes de residuos vegetales que dificultan su manejo y debido a su lenta
degradacin se convierten en un problema de alto impacto ambiental; prdida de
espacio fsico, generacin de plagas, impacto paisajstico etc. (Asocolflores, 2001).
Dentro del programa de gestin ambiental los residuos vegetales generados son
tratados en pilas de compostaje, sin embargo, otra alternativa biotecnolgica es la
utilizacin de microorganismos celulolticos capaces de degradar estos residuos, con
la consecuente produccin de azcares fermentables que a su vez puedan ser usados
como sustrato glicosdico natural y permitan la reduccin en el volumen de los
residuos vegetales generados.
Los microorganismos encargados de la degradacin de la celulosa, principal

componente de la pared celular de las plantas incluyen bacterias y hongos, aerobios,
anaerobios, mesoflicos y termoflicos, los cuales cuentan con la maquinaria
enzimtica necesaria para dicho propsito (Lynd, et al., 2002), por tal razn, su
aislamiento e identificacin representa un importante recurso para lograr la
disminucin del impacto ambiental y la generacin de un sustrato fermentable cuya
utilidad podra estar en la produccin de etanol, obtencin de cidos orgnicos,
edulcorantes, productos farmacuticos y alimentos, entre otros.
METODOLOGIA
Localizacin y condiciones de muestreo
El muestreo del residuo vegetal se realiz a partir de residuos frescos y en compostaje

de un cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora) localizado en el municipio
de Tocancip cuya temperatura promedio es 13C, una humedad relativa del 80% y
esta ubicado a 2606m.s.n.m. Se tomaron en forma aleatoria cinco submuestras de
residuo fresco de 1 semana de almacenamiento, de 100g cada una, registrando una
temperatura de 18C; en el caso de los residuos en degradacin se muestrearon
diferentes puntos de la pila de compostaje de 4 semanas de degradacin, registrando
una temperatura de 50C y un pH de 8.6.
Aislamiento e identificacin de microorganismos celulolticos
Se pesaron 10 g de las muestras de residuos vegetales frescos y en compostaje, cada

uno de los cuales fueron llevados a 90ml de agua peptonada 0.1%(p/v).
Posteriormente se realizaron diluciones seriadas de 10-1 a 10-5 en agua peptonada al
0.1%(p/v). A partir de las diluciones preparadas se realiz siembra en superficie en
agar Carboximetilcelulosa (CMC) al 1%(p/v). Las cajas fueron incubadas a 35oC por
48 horas. Transcurrido el tiempo de incubacin se adicion rojo congo al 1%(p/v),
luego de quince minutos se retir el exceso y se adicion NaCl 0.1M, dejando reposar
2
por quince minutos ms, para luego hacer el recuento de las colonias que presentaron
halos de hidrlisis (Teather y Wood, 1982).
Posteriormente se realizaron repiques en agar CMC al 1%(p/v) de las colonias que

presentaron actividad celuloltica, llevando a incubacin y revelado bajo las mismas
condiciones del aislamiento primario. Realizando medicin de los halos de hidrlisis
generados.
Pruebas de antagonismo
Para llevar a cabo las pruebas de antagonismo se sigui el mtodo de Gauze, para lo
cual, se prepar una suspensin de cada uno de los microorganismos seleccionados a
igual concentracin celular, que presentaron mayor actividad enzimtica, en 10ml de
solucin salina 0.85%(p/v), llevando a incubacin a 100 rpm, 35C durante 14h.
(Moreno et al., 2000). Por triplicado se dispusieron sobre agar CMC al 1%(p/v),
2%(p/v) y 3%(p/v) (con siembra masiva del microorganismo a enfrentar), anillos
plsticos estriles de un centmetro de dimetro. Dentro de los anillos se inocul una
suspensin de 50l del microorganismo antagonista y agua destilada estril como
control negativo. Teniendo como criterio de seleccin halos mayores a 5mm (Gauze,
1967).
Conservacin de cepas
Las cepas seleccionadas en la pruebas de antagonismo fueron sometidas a tincin de

Gram y luego se procedi a obtener cultivos axnicos en agar CMC 1%(p/v). Se
llevaron a cabo suspensiones de cada una de las cepas en caldo celulosa al 1% (p/v).
Estas suspensiones se mezclaron con glicerol a una concentracin final de 25%(v/v),
posteriormente fueron almacenados a 20C como banco de cepas de la Pontificia
Universidad Javeriana (Poutou, et al., 1994).
Caracterizacin y procesamiento del residuo vegetal
Los residuos vegetales frescos provenientes del cultivo de crisantemo fueron

sometidos a una caracterizacin fsico-qumica. Para el procesamiento de dicho
residuo se llev a cabo el siguiente protocolo: lavado con agua, reduccin de tamao
mediante picado, lavado con Sodio Dodecil Sulfato SDS al 1%(p/v), ebullicin por
un perodo de media hora con SDS al 1% (p/v), lavado con agua, secado a 55C y
finalmente molienda en molino Industrial. (Guevara, et al., 2003).
Proceso de fermentacin en cultivo discontinuo
Utilizacin del sustrato vegetal por parte de los microorganismos celulolticos

seleccionados
Para la realizacin de este proceso se emplearon dos medios: uno con sustrato vegetal
a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v) suplementado con sulfato de amonio
3
(0.5g/L), cloruro de calcio (0.5g/L), fosfato monobsico de potasio (0.1g/L), fosfato

dibsico de potasio (0.1g/L), llamado medio sustrato vegetal suplementado (SVS) y
otro, compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto de
levadura y peptona llamado medio sustrato vegetal (SV).
Pruebas preliminares cepas seleccionadas
Las curvas preliminares para evaluar el comportamiento enzimtico y la subsecuente

liberacin de azcares reductores utilizando las cepas aisladas y seleccionadas en las
pruebas de antagonismo, se llevaron a cabo en caldo CMC al 1%(p/v), 3%(p/v) y
5%(p/v) y caldo SVS al 10%(p/v).
Inicialmente, estas cepas fueron reactivadas del banco. A partir de cada cepa se
prepar un inoculo en caldo CMC 1%(p/v) llevando a una concentracin de 3 x 108
cel/ml e incubando a 35C y 120 rpm. Transcurrido el tiempo de incubacin, 25ml de
inculo fueron adicionados a cada uno de los caldos de fermentacin, con un VET de
250ml y condiciones de operacin de 35C y 120rpm. En cada una de las horas de
muestreo se determinaron azcares reductores mediante la tcnica de DNS y
actividad enzimtica utilizando CMC en buffer fosfato pH7 37C y CMC en buffer
cido ctrico pH5 50c, evaluando tiempos de reaccin enzima-sustrato de 30, 60 y
120.
Pruebas Consorcio
Para evaluar la actividad hidroltica de las cepas en consorcio se realizaron

fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v), caldo SV y SVS en concentraciones del
5%(p/v) y 10%(p/v), cada uno; incubando a 35C y 120 rpm. Adicionando un inculo
de volmenes iguales de cada cepa a evaluar. La biomasa inicial fue determinada
mediante recuento en placa, en el caso de bacterias y recuento de conidios en cmara
de Neubawer, para microorganismos filamentosos. A partir de los muestreos
realizados la determinacin de azcares reductores mediante DNS y actividad
enzimtica en CMC al 1% (p/v) en buffer fosfato pH 7 37C y CMC al 1%(p/v) en
buffer cido ctrico pH 5 50C, relacin 1:1 con tiempo de reaccin enzima-sustrato
de 60 minutos.
Determinacin de azcares reductores
Las muestras tomadas en cada hora de fermentacin fueron inmediatamente

centrifugadas durante 20 minutos a 100 rpm, a partir del sobrenadante se tom un
volumen de 0.25 ml, al cual se adicion 0.25 ml de DNS, esta mezcla se someti a
ebullicin por 5 minutos, transcurrido este tiempo, la mezcla se llev a un recipiente
con hielo durante 5 minutos y posteriormente se adicionaron 2.5 ml de agua destilada.
Esta solucin fue leda en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nm y
sensibilidad media, para registrar la absorbancia generada, la cual se reemplaz en la
ecuacin de la lnea recta arrojada por la curva patrn previamente realizada, para la
obtencin de la concentracin de azcares reductores en cada hora de muestreo
(Miller, 1959).
4
Determinacin de actividad celuloltica
Se prepararon dos soluciones de carboximetilcelulosa al 1%(p/v), una en buffer

fosfato 0.1M pH7.0 y otra en buffer cido ctrico pH 5.0.
Preparacin de la Solucin de CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato 0.1M pH7.0
Se tom 1ml de extracto crudo correspondiente a cada tiempo de muestreo de cada

una de las fermentaciones para hacerlos reaccionar con 1 ml de la solucin de CMC
1%(p/v) en buffer fosfato pH7. Dicha preparacin se realiz para evaluar la reaccin
enzima-sustrato durante el tiempo de reaccin establecido para cada curva, incubando
a 37C en bao termostatado. Transcurrido el tiempo de incubacin las muestras
fueron llevadas a un recipiente con hielo durante diez minutos para frenar la reaccin
enzimtica, posteriormente se centrifugaron por 20 minutos a 100 rpm. A partir de
los sobrenadantes se tomaron 0.25 ml para evaluar la concentracin de azcares
reductores liberados, empleando la tcnica de DNS (Dvila, et al., 2002).
Solucin de CMC al 1%(p/v) en buffer cido ctrico 0.1M pH5.0
La determinacin de la actividad enzimtica con buffer cido ctrico pH 5.0 se llev a

cabo haciendo reaccionar 1 ml de extracto crudo correspondiente a cada hora de
muestreo con 1ml de la solucin de CMC en buffer cido ctrico pH 5.0. Esta
preparacin se realiz para evaluar la reaccin enzima-sustrato durante 60 minutos a
50C. Transcurrido cada tiempo de incubacin se detuvo la reaccin en hielo por 10
minutos para posteriormente ser centrifugado por 20 minutos a 100 rpm. A partir del
sobrenadante se tomaron 0.25 ml para evaluar la concentracin de azcares
reductores liberados, empleando la tcnica de DNS (Adrado, et al., 2005).
Identificacin Bioqumica
La identificacin bioqumica se realiz a los microorganismos que finalmente fueron

seleccionados para conformar el consorcio microbiano celuloltico, por presentar la
mejor actividad hidroltica sobre el sustrato evaluado. Las cepas fueron identificadas
mediante evaluacin de caractersticas macroscpicas, microscpicas y
comportamiento metablico de acuerdo con el Manual de Bergeys de Bacteriologa
Sistemtica.
Evaluacin de azcares fermentables en el extracto crudo
El extracto crudo correspondiente a la hora de fermentacin en la que se present la

mayor liberacin de azcares reductores fue evaluado mediante cromatografa lquida
(HPLC) con el fin de determinar el tipo y concentracin de los azcares reductores
presentes.
Anlisis Estadstico
5
El anlisis estadstico de los datos obtenidos durante la prueba experimental se realiz

determinando inicialmente la distribucin normal de los datos mediante la prueba de
Chapiro Wilk y como prueba paramtrica T student, utilizando el programa
estadstico SPSS, versin 14.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Aislamiento de microorganismos celulolticos
Los residuos vegetales frescos de crisantemo no permitieron el aislamiento de

microorganismos con actividad celuloltica, mientras que a partir de los residuos
vegetales en compostaje se logr el aislamiento de 8 cepas bacterianas mesoflicas
con dicha actividad, esta diferencia probablemente se debi a que en el proceso de
compostaje la actividad metablica microbiana se incrementa, adems, el tiempo de
degradacin transcurrido, la alta temperatura y el pH alcalino permitieron el
aislamiento de microorganismos celulolticos, pues dichas condiciones facilitan que
bacterias esporgenas y actinomicetes incrementen su actividad y por ende su
poblacin (Granados y Valderrama, 2003).
La actividad celuloltica se evidenci mediante evaluacin cualitativa con el revelado

de zonas de aclaramiento utilizando rojo congo al 1%(p/v) como ha sido reportado
por diferentes autores (Hendricks et al, 1995; Lu et al, 2005; Zhang et al, 2006). El
dimetro de los halos de hidrlisis generados no fue establecido para la mayora de
las cepas, pues, se obtuvieron zonas de aclaramiento que se difundieron en todo el
medio; una alta actividad hidroltica en CMC 1%(p/v); sin embargo, en el caso de la
cepas 2, 6 y 8 el dimetro del halo fue de 0.3, 0.2 y 0.35 mm, respectivamente
(figura 1), que comparados con el estudio realizado por Lu, et al. (2005), en el que
los dimetros de hidrlisis de las cepas aisladas de tallos de flores cultivadas en agar
CMC, alcanzaron valores de 6.4cm, demuestran una baja actividad celuloltica de las
cepas 2, 6 y 8 en este medio.
Cepa 1 Cepa 2
Cepa 6 Cepa 8
Fig 1. Zonas de aclaramiento en agar CMC 1%(p/v)
Fuente: Autores
6
Pruebas de Antagonismo
Con el fin de potencializar la actividad celuloltica de algunos de los

microorganismos aislados, se plante la posibilidad de establecer un consorcio
microbiano para lo cual fue necesario realizar pruebas de antagonismo que
descartaran aquellas cepas que generaran algn tipo de inhibicin sobre las dems.
Durante las pruebas de antagonismo en agar CMC al 1%(p/v) la cepa 8 tuvo la mayor
actividad antagnica frente a las dems cepas evaluadas generando el mximo halo de
inhibicin (7.5 mm) frente a la cepa 1 (Figura 2), por lo que en un principio fue
descartada como parte del consorcio microbiano.
Fig 2. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1

Fuente: Autores
Las pruebas de antagonismo tambin se realizaron en concentraciones de CMC al 2 y

3 % (p/v) con el fin de determinar si el comportamiento antagnico y crecimiento de
cada cepa se mantena a pesar del incremento en la concentracin de la fuente de
carbono y de alguna manera evaluar la inhibicin por sustrato de las cepas
seleccionadas.
En la concentracin de 2%(p/v) en agar CMC las cepas 2, 5 y 6 quedaron descartadas

para ser parte del consorcio.
La actividad antagnica evidenciada durante el desarrollo de las pruebas en CMC al
1%(p/v) y 2 %(p/v) demuestra que a pesar de tratarse de microorganismos aislados de
una misma fuente puede generarse inhibicin entre ellos, una posible explicacin a
este hecho es que existan diferencias en la complejidad del sistema enzimtico que
les permite degradar el sustrato, generando diferentes tasas de crecimiento y dando
lugar a una competencia por sustrato y espacio
Los resultados obtenidos en agar CMC al 3%(p/v), permitieron seleccionar a las

cepas 1, 3, 4 y 7 como parte del consorcio microbiano celuloltico.
Pretratamiento del Residuo Vegetal
En este estudio los residuos vegetales de crisantemo fueron sometidos a un

pretratamiento mecnico el cual involucr la reduccin de tamao del material
celulsico por cortado, molienda y pulverizacin con el fin de modificar la estructura
cristalina de la celulosa. El pretratamiento mecnico utilizado permiti la obtencin
de un tamao de partcula muy pequeo (menor a 850) que adems de favorecer el
acceso de las enzimas hidrolticas del consorcio facilit la preparacin de los medios
7
de produccin y el seguimiento de las fermentaciones realizadas. Krishna (1999)

report la importancia de esta condicin pues afecta la relacin rea/ volumen y la
densidad de empaquetamiento que determina la fraccin de sustrato inicialmente
accesible al microorganismo. Esta relacin se incrementa cuando el tamao de
partcula disminuye determinando as el espacio vaco que es ocupado por el aire,
aumentando la tasa de transferencia de oxigeno que afecta directamente el
crecimiento de los microorganismos.
Evaluacin preliminar de la actividad celuloltica de las cepas aisladas
Con las cepas seleccionadas (1, 3, 4 y 7) en las pruebas de antagonismo se realizaron

pruebas preliminares para evaluar la capacidad celuloltica de cada una de ellas
determinando la liberacin de azcares reductores por la tcnica de DNS
(Miller,1959) y utilizando como sustrato CMC al 1%(p/v), 3%(p/v), y 5%(p/v), los
resultados indicaron una actividad celuloltica nula en todas las cepas, en las tres
concentraciones y durante las veinte horas de fermentacin, lo cual indic la falta de
concordancia entre la evaluacin cualitativa y cuantitativa de actividad, una posible
explicacin de este hecho es que en la prueba cualitativa, el microorganismo
permaneci en contacto con el sustrato durante 48 horas de incubacin, aumentando
as la probabilidad de liberar las enzimas necesarias para degradar el polisacrido;
mientras que en la tcnica de actividad cuantitativa por DNS, el extracto enzimtico
entr en contacto con la celulosa con un tiempo de reaccin de 60 minutos que
probablemente no fue suficiente para que se diera una reaccin enzima-sustrato
completa, o, la cantidad de enzima presente en el sobrenadante no era suficiente para
hidrolizar la celulosa o para obtener cantidades de azcares reductores que pudieran
ser detectados por esta tcnica, a pesar de que la prueba se realiz en condiciones de
pH y temperatura ptimos para la deteccin de las enzimas encargadas de la
degradacin del sustrato.
Evaluacin preliminar de la actividad celuloltica del consorcio
Al evaluar la actividad celuloltica de las cepas 1, 3, 4 y 7 en consorcio, los resultados

obtenidos tanto en la fermentacin realizada en caldo CMC al 1%(p/v) como en caldo
SVS al 10%(p/v), mostraron que la cantidad de azcares reductores y la actividad
enzimtica del consorcio en los dos sustratos fue nula. Con base en estos resultados se
decidi buscar una segunda opcin que incluy la evaluacin de la cepa 8 que haba
sido inicialmente descartada en las pruebas de antagonismo, para lo cual, se
realizaron fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v) y SVS al 10%(p/v)
determinando azcares reductores y actividad enzimtica, alcanzndose valores
mayores a los obtenidos con el consorcio propuesto.
Con el objetivo de potencializar la actividad enzimtica de la cepa 8, teniendo en

cuenta que fue un microorganismo nativo del sustrato vegetal a evaluar y, que
durante la realizacin de las pruebas de antagonismo se caracteriz por inhibir a las
dems cepas, probablemente por tener una alta tasa de crecimiento que lo haca
competitivo por espacio y nutrientes y basados en que el sinergismo de las enzimas
celulolticas hacen posible la hidrlisis de celulosa a glucosa (Lu, et al., 2005;
8
Malherbe y Cloete, 2002) se evalu el efecto sinrgico entre la cepa 8 y un

actinomiceto aislado a partir de suelo, en cultivo de Stevia con buena actividad
celuloltica cualitativa en CMC al 1% (p/v), (halos de hidrlisis de 2.14cm de
dimetro) (Gutirrez, et al., 2002) aislado de suelo. Para lo anterior se realizaron
curvas de cada microorganismo por separado en caldo SVS al 10%(p/v) con el fin de
evaluar la actividad enzimtica sobre dicho sustrato. Los dos microorganismos
presentaron una degradacin del sustrato vegetal de crisantemo, lo que se evidenci
con la cuantificacin de azcares reductores (Figura. 3)
1,4
Azcares reductores
1,2
1
0,8
(g/L)
0,6
0,4
0,2
0
12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
CEPA 8 EN SVS 10%(p/v) ACTINO EN SVS 10%(p/v)
Fig.3 Azcares reductores en el cultivo de cepa 8 y actinomicete en SVS al 10% (p/v).
Identificacin Bioqumica
Los resultados del perfil bioqumico y la observacin de las caractersticas macro y
microscpicas realizadas a la cepa 8 y el actimomicete permitieron identificarlos
como Bacillus sp. y Streptomyces sp.
Tanto Bacillus sp. como Streptomyces sp. han sido reportados como microorganismos
con alta actividad celuloltica. Muchas especies del gnero Bacillus estn
normalmente presentes en el suelo y en la materia orgnica en degradacin, por lo
que se considera que juegan un papel importante en la biodegradacin y
bioconversin de componentes de alto peso molecular. Se ha realizado el aislamiento
de Bacillus licheniformis a partir de residuos vegetales de flores en compostaje (Lu et
al., 2005) y Bacillus subtilis en muestras de suelo y agua en la regin amaznica
(Heck et al., 2002), en residuos de banano (Krishna, 1999), y en fibras de palma
(Apun et al., 2000), en los que dicho gnero bacteriano ha demostrado un alto
potencial celuloltico.
Por otro lado, Streptomyces sp. ha sido muy estudiado debido a que es parte
importante de la comunidad microbiana del suelo responsable de la degradacin y
recirculacin de biopolmeros como la celulosa, la hemicelulosa y la lignina (Semedo
et al., 2004). Los estudios realizados con este microorganismo en cuanto a su
capacidad hidroltica en materiales lignocelulsicos han reportado buenos resultados,
como es el caso de Streptomyces drozdowiczii y Streptomyces cellulolyticus asilados
de muestras de suelo (Semedo et al., 2004; Grigorevski et al., 2005; Li, 1997).
Ramrez y Coha (2003) aislaron 145 cepas de actinomicetos celuloltcos entre los
cuales Streptomyces sp. tuvo una prevalencia de 50.63% y adems mostr los ms
altos niveles de actividad enzimtica en el estudio.
9
Utilizacin del sustrato vegetal por parte del consorcio celuloltico
Teniendo en cuenta la actividad hidroltica de Streptomyces sp. y Bacillus sp. en el

residuo vegetal a evaluar (Figura 3); y con el objetivo de potencializar la degradacin
del sustrato por una posible accin sinrgica entre las enzimas de cada cepa, se
realizaron curvas en las que los microorganismos actuaron en consorcio.
Durante las curvas realizadas con el consorcio microbiano en SV y SVS al 5% (p/v)

se obtuvieron valores mximos de azcares reductores de 0.624 y 0.849g/L,
respectivamente en la hora 18 de fermentacin, (Figura 4) mientras que, en SV y
SVS al 10% (p/v) se alcanzaron valores de 1.665 y 1.474g/L, respectivamente en la
hora seis de fermentacin (Figura 5). Los resultados de la cromatografa liquida
realizada a los sobrenadantes obtenidos en la hora seis de las fermentaciones en los
medios al 10% (p/v) mostraron la presencia de glucosa y fructosa como azcares
reductores. En el medio SV la glucosa se encontr en una concentracin de 0.5g/L,
mientras que, en el medio SVS adems de la glucosa en una concentracin de 0.4g/L
se detect fructosa en una concentracin de 1.4g/L. Estos resultados permitieron
inferir en primer lugar que el sustrato vegetal de crisantemo a concentracin de
10%(p/v) estimul la actividad hidroltica del consorcio microbiano, generndose
diferencias significativas (p<0.05) con la actividad hidroltica al 5% (p/v), en segundo
lugar, que la adicin de sales al medio de produccin no gener diferencias
significativas (p>0.05) en la liberacin de azcares reductores, lo que demuestra que
el residuo vegetal de crisantemo provee una fuente de carbono, nitrgeno y minerales
que suplen los requerimientos nutricionales necesarios para el crecimiento y la
actividad metablica de los microorganismos evaluados, as mismo, los resultados de
la cromatografa lquida corroboraron que la suplementacin del medio sustrato
vegetal no gener un incremento en la conversin de celulosa a glucosa, por el
contrario la concentracin de este azcar fue mayor en el medio sin suplemento. Sin
embargo, se esperaba una mayor concentracin de azcares reductores teniendo en
cuenta que el residuo vegetal de crisantemo contena un alto porcentaje de celulosa
(65.3%) de acuerdo al anlisis fisicoqumico realizado.
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 6 12 16 18 20 22
Tiempo (h)
SV 5% (p/v) SVS 5% (p/v)
Fig. 4 Azcares reductores en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomcyes sp. en SV
y SVS al 5% (p/v)
10
1,8

1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiem po (h)
SV 10%(p/v) SVS 10%(p/v)
Fig. 5 Azcares reductores en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomcyes sp.) en
SV y SVS al 10% (p/v)
Por otro lado, al comparar la concentracin de azcares reductores obtenidos en las

pruebas preliminares en las que Bacillus sp. y Streptomyces sp. actuaron
individualmente en la degradacin de SVS al 10%(p/v), con los obtenidos con el
consorcio (Bacillus sp.- Streptomyces sp.) el mismo sustrato y a la misma
concentracin, demuestran que se estableci un sinergismo en el que probablemente
se logr una complementariedad entre las enzimas celulolticas que favorecieron la
degradacin del sustrato con el consecuente aumento en la liberacin de azcares
reductores (Figura 6).
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 6 12 14 16 18 20 22 24 25
Tiempo (h)
Bacillus sp. Streptomyces sp. consorcio
Fig 6. Azcares reductores en los cultivos de Bacillus sp.y Streptomyces sp.(individual y en

consorcio) en SVS al 10%(p/v)
Condiciones de pH y Temperatura durante la Fermentacin
Durante las curvas de degradacin del residuo vegetal realizadas, el pH y la

temperatura se mantuvieron en un valor cercano a 6.0 y 35C, respectivamente.
Krishna (1999), report que el pH y la temperatura de la fermentacin tienen una gran
influencia en la produccin de enzimas celulolticas, en su investigacin la mayor
produccin se alcanz a un pH de 7.0 manteniendo una temperatura constante de
35C, sin embargo, el autor reporta otros estudios donde a un pH de 6.0 se da la
mayor liberacin enzimtica, lo que permite afirmar que tanto el pH como la
temperatura de operacin en esta investigacin favorecieron la hidrlisis del residuo
vegetal.
11
Actividad Enzimtica y liberacin de azcares reductores a partir del residuo

vegetal de Crisantemo.
El nivel ms alto de celulasas se produjo en la fermentacin con SV al 10%(p/v) en

la hora 6, pH7 37C con un valor de 0.1056 UC (UC definida como la cantidad de
enzima capaz de liberar un micromol de glucosa por minuto) (Figura 7) valor que
coincidi con la mayor concentracin de azcares en el mismo sustrato. Sin embargo,
no existieron diferencias significativas (p>0.05) en la concentracin de celulasas
liberadas en los medios SV y SVS en las concentraciones evaluadas.
Por otro lado, la actividad enzimtica a pH cido y una temperatura de 50C fue
menor, demostrando que dicha actividad vara de acuerdo a las condiciones de pH y
la temperatura en la que es evaluada (p<0.05). Una explicacin a este hecho puede ser
que en condiciones naturales la actividad hidroltica de la celulosa se ve afectada
cuando el pH del suelo es cido, como es el caso de Cellulomonas sp., cuyo
comportamiento metablico se ve influenciado bajo estas condiciones (Lynd et
al.,2002)
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
UC pH7 37C UC pH 5 50C
Fig.7 Actividad enzimtica en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en
SV al 10% (p/v), bajo condiciones de pH7 37C y pH 5 50C
La actividad enzimtica del consorcio evaluada en SV y SVS en concentraciones de

5%(p/v) y 10%(p/v), no es comparable con los resultados reportados por otros
estudios en los que tambin se ha realizado la evaluacin de microorganismos
celulolticos en residuos celulsicos (Lu et al 2005), (Krishna, 1999), debido a que el
material celulsico difiere en sus caractersticas fsico-qumicas como son: el tamao
y la superficie de las fibrillas, el espacio entre las microfibrillas y las molculas de
celulosa en las regiones amorfas, el grado de cristalinidad de la celulosa, la
conformacin estereoscpica y la rigidez de las unidades de celulosa, el grado de
polimerizacin de la celulosa, la naturaleza de los componentes con los que la
celulosa esta asociada, la naturaleza, concentracin y distribucin de grupos
sustituyentes (Malherbe y Cloete, 2002; Petre et al., 1999; Zhang et al., 2006).
Dichos parmetros condicionan drsticamente la habilidad de los microorganismos
celulolticos para degradar este tipo de sustratos, lo cual explica que el
comportamiento metablico sea especfico y por ende, la acumulacin del producto
de hidrlisis difiera de un ensayo a otro. (Zhang et al., 2006).
Por otro lado, las interacciones complejas entre las enzimas encargadas de hidrolizar
la celulosa (endoglucanasas, exoglucanasas y -glucosidasas ) y los cambios en las
12
caractersticas del sustrato durante la hidrlisis han sido simulados por modelos
matemticos aplicados a una variedad de materiales lignocelulsicos, dicho modelo
sugiere que es casi imposible la prediccin del funcionamiento hidroltico de una
mezcla de celulasas de un sustrato a otro debido a variaciones como la concentracin
de celulasas, la proporcin endo/exocelulasas, el tiempo de reaccin y las
caractersticas del sustrato (Zhang et al, 2006). De esta manera, la actividad
celuloltica de los microorganismos va a ser especfica para cada sustrato celulsico a
evaluar.
Durante las pruebas realizadas se observaron marcadas diferencias entre la actividad

celuloltica cualitativa y cuantitativa evaluada, lo cual puede estar directamente
relacionado con el tipo de sustrato en el que se realizaron dichas pruebas, pues, segn
Zhang et al., (2006), es necesario tener en cuenta la solubilidad o insolubilidad en
agua del sustrato que se quiere evaluar ya que determina los parmetros para realizar
el screening y determinacin de la actividad enzimtica de microorganismos con
capacidad celuloltica.
En esta investigacin el screening se realiz en agar CMC al 1%(p/v) (sustrato

celulsico soluble), posteriormente la induccin de enzimas en residuos vegetales de
crisantemo (sustrato insoluble) y la cuantificacin de dichas enzimas fue llevada a
cabo en CMC al 1% (p/v) en buffer fosfato pH7 y en buffer cido ctrico pH5. La
utilizacin de sustratos con diferente tipo de solubilidad probablemente influy en la
variacin de los resultados, pues la relacin existente entre la tasa de hidrlisis
obtenida en sustratos solubles e insolubles no es clara, principalmente porque existen
diferencias en la accesibilidad de las enzimas al sustrato y el grado de polimerizacin
(Zhang et al., 2006), lo cual explica la obtencin de halos de dimetro incuantificable
y su baja correlacin con los niveles de azcares reductores obtenidos y la actividad
enzimtica evaluada tanto para las cepas inicialmente aisladas como para el
consorcio. Este mismo autor concluy que los datos obtenidos en la hidrlisis de
sustratos solubles no pueden ser comparados con la hidrlisis de sustratos insolubles.
Otro de los factores que pudo haber influido en la variacin de los resultados es el
tiempo de fermentacin y el de reaccin enzima-sustrato durante las pruebas de
actividad enzimtica, si se tiene en cuenta que la lignocelulosa pretratada utilizada
para evaluar la actividad enzimtica de preparaciones comerciales de celulasas,
requiere un rango de tiempo que va de minutos a horas para que inicie la hidrlisis y
hasta varios das para obtener una digestibilidad final (conversin de la celulosa)
(Zhang et al., 2006), las evaluaciones realizadas requeran un mayor tiempo de
reaccin que diera lugar a la obtencin de mejores resultados.
Finalmente, se puede considerar la importancia de continuar realizando screening de

microorganismos celulolticos pues la utilizacin de estos se convierte en una
alternativa viable para el tratamiento de residuos celulsicos, pues tan solo se ha
identificado y evaluado menos del 1% del potencial de dichos microorganismos
presentes en la biosfera (Howard et al., 2003)
13
CONCLUSIONES
Se logr el aislamiento de ocho cepas con actividad celuloltica en CMC 1%

(p/v) a partir de residuos vegetales de crisantemo en compostaje
No se estableci una relacin directa entre la actividad celuloltica cualitativa

y cuantitativa de los microorganismos evaluados durante el estudio.
La mayor concentracin de azcares reductores y actividad enzimtica se

obtuvieron en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV
10% (p/v).
El residuo vegetal de crisantemo aport los nutrientes necesarios para

estimular la actividad enzimtica de los microorganismos evaluados por lo
cual no se hace necesario suplementar el residuo con sales.
LITERATURA CITADA
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16

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AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS

CELULOLITICOS A PARTIR DE RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y

DIANA MARIA GAITAN BOHORQUEZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

DIANA MARIA GAITN BOHORQUEZ

Adriana Matiz Villamil Balkys Quevedo Hidalgo

Andrea Aguirre Ivonne Gutierrez

DIANA MARIA GAITAN BOHORQUEZ

Angela Umaa Muoz, M. Phil. David Gomez Mendez, M.Sc.

A la Doctora Adriana Matz, por sus conocimientos, dedicacin, paciencia y

A la Ingeniera Balkys Quevedo, por su continua orientacin, inters y

Al Doctor David Gmez, por su asesoria y apoyo contino.

A cultivos del Norte, por permitirnos hacer uso de sus instalaciones.

A Viviana Gutirrez por su amistad, ayuda y conocimientos.

A Johanna Buitrago y Dolly Tenjo, por su amistad y colaboracin

A Marcela Quintero, Martha Hernndez, Jhon Manosalva, Paula Sarmiento,

A Carlos Roa, por su paciencia y disposicin.

Tabla 1. Bacterias con alta Actividad Especfica de celulasas 8

Tabla 2. Hongos con alta Actividad Especfica de celulasas 9

Tabla 3. Caracterizacin macro y microscpica de las cepas

Tabla 4. Actividad celuloltica cualitativa de las cepas aisladas

Tabla 5. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 1%(p/v) 38

Tabla 6. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 2%(p/v) 38

Tabla 7. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 3%(p/v) 39

Tabla 24. Identificacin Bioqumica cepa 8 44

Tabla 25. Identificacin Bioqumica Actinomiceto 46

Figura 1. Estructura Qumica de la celulosa 3

Figura 2. Estructura de la Celulosa: regiones cristalinas y amorfas 4

Figura 3. Zonas de aclaramiento, cepa 1 en Agar CMC 1%(p/v) 31

Figura 4. Zonas de aclaramiento, cepa 2 en Agar CMC 1%(p/v) 31

Figura 5. Zonas de aclaramiento, cepa 3 en Agar CMC 1%(p/v) 32

Figura 6. Zonas de aclaramiento, cepa 4 en Agar CMC 1%(p/v) 32

Figura 7. Zonas de aclaramiento, cepa 5 en Agar CMC 1%(p/v) 33

Figura 8. Zonas de aclaramiento, cepa 6 en Agar CMC 1%(p/v) 33

Figura 9. Zonas de aclaramiento, cepa 7 en Agar CMC 1%(p/v) 34

Figura 10. Zonas de aclaramiento, cepa 8 en Agar CMC 1%(p/v) 34

Figura 11. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1 35

Figura 12. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 2 35

Figura 13. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 4 36

Figura 14. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 5 36

Figura 15. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 6 36

Figura 16. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 7 36

Figura 18. Resistencia cepa 8 36

Figura 19. Residuo vegetal de crisantemo molido 40

Figura 21. Actividad enzimtica en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8)

Figura 22. Azcares reductores en el cultivo de Streptomyces sp. en

Figura 23. Actividad enzimtica en el cultivo de Streptomyces sp.

Figura 24. Caractersticas macroscpicas cepa 8 en agar

Figura 25. Caractersticas macroscpicas Streptomyces sp.

Figura 26. Caractersticas microscpicas Streptomyces sp. 45

Figura 27. Azcares reductores en el cultivo del consorcio

Figura 28. Azcares reductores en el cultivo del consorcio

Figura 29. Variacin de pH en el cultivo del consorcio

Figura 30. Variacin de pH en el cultivo del consorcio

Figura 31. Actividad enzimtica en el cultivo del consorcio

Figura 32. Actividad enzimtica en el cultivo del consorcio

ANEXO 1. Medios de cultivo y reactivos 64

ANEXO 2. Determinacin de azcares reductotes por el mtodo

ANEXO 3. Pruebas preliminares: Determinacin de Azcares

ANEXO 4. Pruebas preliminares: Determinacin de Azcares

ANEXO 5. Pruebas preliminares: Determinacin de Azcares