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ACREDITACIN, COMPROMISO DE TODOS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA


FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

Ao de la Diversificacin Productiva y Fortalecimiento de la


Educacin

DOCENTE : Dr. Cesar Torres Daz

ALUMNA : Hurtado Ruiz Mara Eugenia

CICLO : IV

CURSO : Mecanismos de Agresin y


Defensa I

Piura -2015

INTRODUCCION

La familia Enterobacteriaceae constituye un grupo grande y heterogneo de


bacterias gramnegativas. Reciben su nombre por la localizacin habitual como
saprofitos en el tubo digestivo, aunque se trata de grmenes ubicuos,
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encontrndose de forma universal27en el suelo, el agua y la vegetacin, as


como formando parte de la flora intestinal normal de muchos animales adems
del hombre.

En los individuos hospitalizados o inmunodeprimidos (incluyendo los pacientes


alcohlicos y diabticos), en especial en los pacientes que reciben tratamiento
antibitico, hay colonizacin por Enterobacteriaceae, adems de en el tubo
digestivo, en la orofaringe, el aparato genitourinario y la piel. La infeccin por
estas bacterias es frecuente en estos contextos. La proporcin de aislados
resistentes a mltiples antimicrobianos, incluidos aquellos que producen
betalactamasas de espectro extendido (BLEE), ha aumentado de forma
ininterrumpida, de modo que casi todos los aislados nosocomiales, y muchos
de los aislados adquiridos en la comunidad, son ahora resistentes a varias
clases importantes de antimicrobianos.

Diferentes factores han contribuido al incremento de las infecciones por


enterobacterias en nuestros hospitales: el uso cada vez mayor de tcnicas
diagnsticas y teraputicas agresivas (catteres intravenosos, endoscopias,
intervenciones), el empleo de potentes inmunosupresores y las estancias
hospitalarias prolongadas, entre otros.

AISLAMIENTO DE ENTEROBACTERIAS

Generalidades

La Flia. Enterobacteriaceae est formada por bacilos y cocobacilos gramnegativos,


anaerobios facultativos, no formadores de esporas, fermentadores de glucosa, no
presentan actividad de citocromooxidasa (son oxidasa negativa), reducen nitratos a

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27 flagelos de distribucin peritrica. Estn


nitritos y las especies mviles lo son mediante
muy diseminadas en la naturaleza, las encontramos en el agua, en la tierra, en los
animales, etc. En el hombre se localizan en las vas areas superiores (en pequea
proporcin), en la piel (sobre todo en la regin perianal), en la uretra anterior y sobre
todo en el intestino. Desde el estmago al intestino grueso, la concentracin va
aumentando a lo largo del tubo digestivo.

Taxonoma

Dentro de la esta Familia se reconocen ms de 30 gneros diferentes. Actualmente,


varios de ellos estn siendo sometidos a revisin mediante tcnicas de Biologa
Molecular, estudiando la homologa de sus ADN y frecuentemente se crean nuevos
gneros con especies de gneros ya existentes.
A continuacin se presentan algunos de los gneros, y dentro de ellos algunas
especies, que con mayor frecuencia se aslan a partir de muestras clnicas humanas

Gneros Especies

Escherichia E. coli
Shigella S. flexneri, S. sonnei, S. boydii, S. dysenteriae
Salmonella S. enterica, S. bongori
Klebsiella K. pneumoniae, K. oxytoca
Enterobacter E. cloacae, E. aerogenes, E. agglomerans
Serratia S. marcescens, S. odorifera, S. fonticola
Citrobacter C. freundii, C. kooseri
Proteus P. vulgaris, P. mirabilis
Morganella M. morganii
Providencia P. rettgeri, P. stuartii
Yersinia Y. enterocolitica, Y. pestis

Estructura antignica

Las enterobacterias poseen una estructura antignica muy compleja. Mencionaremos


los ms importantes.

Antgeno O o somtico, es parte de un lipopoliscarido que se encuentra en


la pared celular. Este lipopolisacrido tiene tres fracciones:
Regin uno: oligosacrido que contiene al Antgeno O.
Regin dos: polisacrido central constante para un gnero determinado.
Regin tres: dado por el lpido A, que constituye la endotoxina.

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Antgeno K o capsular, que 27 est presente slo en algunas bacterias


capsuladas como Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli.

Antgeno Vi es un polisacrido que rodea a la bacteria sin llegar a ser una


cpsula y es caracterstico de algunas especies de Salmonella.

Antgeno H o flagelar es proteico, es especfico de especie y est presente


slo en las especies mviles.

Antgeno F o fimbrial: presente en las fimbrias. Son de naturaleza proteica.

Factores determinantes de patogenicidad

La cpsula tiene propiedades de adhesina y es antifagocitaria.


Las fimbrias permiten la adherencia a la clula husped e impiden el barrido
por las barreras mecnicas de defensa del organismo.
Algunas especies producen exoenzimas como ureasa, gelatinasa, lipasa,
desoxirribonucleasa, las cuales actan permitiendo la sobrevida de la bacteria
dentro del rgano afectado.
Debido a que el hierro es indispensable para ciertas funciones de las bacterias,
estos microorganismos producen aerobactinas que permiten la captacin de
hierro desde el medio.
Todas las enterobacterias poseen el lipopolisacrido (LPS) de pared, el cual
tiene accin de endotoxina, la cual se libera al destruirse la bacteria.
Exotoxinas: no todas las especies las producen. Slo son producidas por las
patgenas obligadas y poseen efectos especficos.

Enterobacterias Patgenas Oportunistas

Dentro de este grupo se incluyen aquellas especies que forman parte de la flora
normal del hombre y los animales, estn presentes en el suelo, el agua y las plantas.
Producen infeccin cuando salen de su hbitat o hay alteraciones de las defensas
locales. Los Gneros oportunistas que con mayor frecuencia se aslan de muestras
clnicas son Escherichia, Klebsiella, Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Proteus,
Morganella, Providencia, etc.

Estas bacterias producen infecciones extraintestinales como ser infecciones urinarias,


sepsis, meningitis, abscesos, neumonas, otitis, sinusitis, meningitis, etc.

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Gnero Escherichia 27

Dentro del gnero la especie de mayor importancia es Escherichia coli. E. coli se


encuentra en nmero muy elevado en el contenido intestinal y tiene la capacidad de
suprimir el crecimiento de microorganismos proteolticos debido a la liberacin de
bacteriocinas (colicinas), sustancias con accin bactericida, y est relacionado con la
sntesis de vitamina K. Son fermentadoras de lactosa y mviles.

E. coli es el principal agente etiolgico de infecciones urinarias, tanto en pacientes


internados como ambulatorios ya que posee fimbrias capaces de adherirse al epitelio
urinario y colonizarlo. Produce adems peritonitis, abscesos, meningitis, endocarditis,
neumonas nosocomiales, etc.

Gnero Klebsiella

El gnero Klebsiella est muy extendido en la naturaleza: en la tierra, en el agua, en el


polvo, en la leche, en los alimentos. Tambin se las ve como organismos saprfitos de
las vas respiratorias y del tracto digestivo del hombre y de los animales.

Son microorganismos capsulados, inmviles, fermentadores de lactosa, que fermentan


la glucosa mediante la va de fermentacin del 2-3 butanodiol al igual que los del
gnero Enterobacter.

Dentro de este gnero, la especie ms importante es K. pneumoniae. Es la especie


tipo y produce infecciones urinarias, respiratorias y sepsis, siendo frecuentemente
involucrada en brotes de infecciones hospitalarias. En algunos hospitales Klebsiella ha
desplazado a E. coli como agente etiolgico de infecciones intrahospitalarias. Existen
dos subespecies, Klebsiella rhinoescleromatis y K. ozenae que se relacionan con otitis
y rinitis de olor ftido con destruccin granulomatosa de la nariz y la faringe.

Gneros Proteus

Este gnero est muy difundido en la naturaleza, se lo encuentra en el suelo, agua,


aguas servidas, materiales de animales en descomposicin, tracto intestinal del
hombre, etc. Juega un papel importante en la descomposicin de los cadveres.

Se presenta con flagelos pertricos muy abundantes que hacen que hormiguee
sobre la superficie de un medio slido de cultivo. Dentro del gnero Proteus las
especies ms importantes son: P. mirabilis (indol negativo) y P. vulgaris (indol positivo).

Estos microorganismos son lactosa negativos y son productores de ureasa, factor de


patogenicidad en la produccin de infecciones urinarias ya que esta enzima desdobla
a la urea (muy abundante en la orina) en amonaco y dixido de carbono. El amonaco
es txico para las clulas con lo que se produce la irritacin del epitelio urinario, lo que
desencadena una reaccin inflamatoria. La alcalinidad alcanzada por la orina
predispone a la litiasis urinaria.

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Ciertas cepas de P. vulgaris (OX19 y OXK) 27comparten determinantes antignicos con


algunas Rickettsias, por lo que los stas cepas de Proteus sirven como antgeno para
encontrar anticuerpos anti-Rickettsias en la llamada prueba de Weil-Felix.

Diagnstico de laboratorio de infecciones extraintestinales

A continuacin se presenta un esquema del procesamiento de una muestra


extraintestinal a partir de la cual se espera aislar una Enterobacteria.

Es conveniente incluir algn medio selectivo para bacilos gramnegativos como el Agar
Eosina Azul de Metileno (EMB) o Agar Mac Conkey, especialmente en aquellas
muestras donde pueda aparecer flora acompaante.

Luego de aislada la bacteria, la identificacin se lleva a cabo mediante pruebas


bioqumicas, de las cuales existe un elevado nmero para llegar a identificar el gnero
y la especie. En la siguiente tabla se muestra el resultado de algunas pruebas
bioqumicas para los gneros ms frecuentes.

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Otras pruebas que se utilizan son produccin de indol, descarboxilacin de lisina y


ornitina, prueba del rojo de metilo, produccin de DNAsa, prueba de Voges-Proskauer,
fermentacin de az- cares, etc.

Siempre debe realizarse un antibiograma una vez identificada la bacteria, ya que los
miembros de esta Familia presentan resistencia muy variable a los antimicrobianos,
pudiendo muchos de ellos, especialmente los recuperados a partir de muestras de
pacientes hospitalizados, ser resistentes a mltiples antimicrobianos.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

MATERIALES

Agar EMB
Agar Mc Conkey
Agar SS
Asa Siembra en punta y en anillo
Mandil
Guantes
Material para coloracin Gram
Tubos de Ensayo
Lminas Portaobjetos
Microscopio
Mechero

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Muestras a
sembrar

Medios de cultivo:

Agar EMB
Agar Mc Conkey
Agar SS

Otros medios de cultivo:

Caldo Urea
Medio SIM
CITRATO DE Simmons
LIA
TSI

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Asas de siembra en
punta y anillo

PROCEDIMIENTOS , RESULTADOS E INTERPRETACIN :

Da 1:

Siembra en estra de
muestra 04 en Agar SS

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Siembra en estra de
muestra 05 en agar
Macconkey

Siembra en estra de la
muestra 01 en agar EMB

Da 2 :

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Revisin de las colonias


sembradas

Despus de aplicar la Tincin Gram a las colonias encontradas en los medios


cultivos, se observaron el microscopio, concluyendo que son Gram Negativo (-)
Con lo cual se presume que son enterobacterias.

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Muestra 01 en Agar
EMB

Muestra 04 en Agar SS

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Muestra 05 en Agar
Macconkey

Siembra en caldo nutritivo


(inclinado)

Da 3: Realizacin de pruebas bioqumicas.

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Tubos de ensayos con diferentes sustancias con las que


actuaran las enterobacterias cultivadas, as tenemos:

Caldo urea
Medio SIM
Citrato de Simmons
Agar LIA
Agar TSI
AGAR TSI: siembre el agar TSI haciendo una puncin central hasta el fondo del tubo y
estra en superficie.

o Principio: en TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar


los hidratos de carbono GLUCOSA, LACTOSA y/o SACAROSA, con
produccin o no de gases (CO2 y H2), junto con la produccin o no de cido
sulfhdrico (H2S).
o Lectura: se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Se lee un
quebrado, la reaccin ocurrida en la superficie del medio corresponde al
numerador (parte aerobia) y la reaccin ocurrida en la profundidad del medio
corresponde al denominador (parte anaerobia) La acidez se denomina con la
letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color rojo)
o Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas:
Fermentacin de la glucosa (K/A).
Fermentacin de glucosa, lactosa y/o sacarosa (A/A)
No fermentacin de los carbohidratos (K/K), la bacteria no utiliza los hidratos
de carbono, produciendo aminas que alcalinizan el fondo y la superficie del
medio.
Algunas bacterias no fermentadoras solamente atacan la peptona
aerbicamente dando un TSI: K/N, es decir no hay cambio en el fondo
del tubo.
Produccin de gas: ruptura del medio.
Produccin de H2S: ennegrecimiento del medio

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El agar TSI tiene tres azcares: glucosa (1 g/L), lactosa (10 g/L) y sacarosa (10 g/L).
Como indicador de PH tiene ROJO DE FENOL el cual vira al color amarillo en
presencia de acidez y al color rojo en presencia de alcalinidad.

Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para que las
bacterias puedan producir H2S y como indicador de H2S, SULFATO FERROSO el cual
reacciona con el H2S produciendo un precitado negro e insoluble de sulfato ferroso.
Para que se produzca H2S, se requiere de un medio cido por lo que dicha produccin
generalmente est limitada al fondo del medio, razn por la cual un fondo negro debe
leerse como A (cido), aunque el color amarillo usual est tapado por el color negro.

AGAR LIA: Sembrar con asa recta, por doble picadura hasta el fondo del tubo y en
superficie.

o Principio: en agar LIA se determina la capacidad de un microorganismo para


atacar el aminocido LISINA descarboxilndolo o desaminndolo, la
fermentacin de glucosa, la produccin o no de gases (CO 2), junto con la
produccin o no de cido sulfhdrico (H2S).
o Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin (48 horas si es
necesario) a 37C. Se lee un quebrado, la reaccin ocurrida en la superficie del
medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reaccin ocurrida en la
profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia). La
acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K
(color prpura).
o Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas:
Fermentacin de la glucosa (K/A), la bacteria no ataca el aminocido
solo fermenta la glucosa.
Descarboxilacin de la lisina: (K/K)
Desaminacin de la lisina: R/A) rojo/ amarillo

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Produccin de gas: ruptura 27


del medio
Produccin de H2S: ennegrecimiento del medio

Muchas bacterias poseen descarboxilasas que atacan el aminocido lisina, con


liberacin de aminas de reaccin alcalina y con produccin de CO 2. Para que acten
las descarboxilasas se requiere PH cido que se obtiene por la fermentacin de la
glucosa que tiene el medio.

La desaminacin de la lisina es un proceso oxidativo que se manifiesta por la aparicin


de color rojo en el tendido, siendo el fondo del tubo amarillo por fermentacin de la
glucosa que posee el medio. Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO,
necesario para las bacterias puedan producir H2S y como indicador H2S, CITRATO
FERRICO DE AMONIO el cual reacciona con el H 2S produciendo un precipitado negro
e insoluble de sulfato ferroso. Para que se produzca H 2S se requiere de un medio
cido por lo que dicha produccin generalmente est limitada al fondo del medio,
razn por la cual un fondo negro debe leerse como A (cido), aunque el color amarillo
usual est tapado por color negro.

AGAR CITRATO DE SIMMONS: sembrar con asa recta, solamente en superficie.

o Principio: en agar CITRATO DE SIMNONS se determina la capacidad de un


microorganismo de emplear el citrato como nica fuente de carbono en
ausencia de fermentacin de azcares o de produccin de cido lctico.
o Lectura: se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin (48 horas s es
necesario) a 37C.
o Fundamento: Normalmente el metabolismo del citrato comprende una
condensacin de acetilo con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo
de Krebs. El medio utilizado contiene tambin sales de amonio inorgnicas. Un
organismo capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono tambin es
capaz de utilizar las sales de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las
sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NH) con la consiguiente
alcalinidad del medio.
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El indicador de PH es el AZUL DE BROMOTIMOL27 el cual en presencia de alcalinidad


vira al color azul indicando que la prueba es POSITIVA.

Cuando no hay cambio de color ni crecimiento se dice que la prueba es NEGATIVA. Si


no hay cambio de color, pero s hay crecimiento la prueba es DUDOSA.

AGAR UREA: Sembrar con asa recta, solamente en superficie.

o Principio: en agar UREA se determina la capacidad de un microorganismo de


producir UREASA y desdoblar la urea, formando 2 molculas de amoniaco. +
+d -5
o Lectura. Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C.
o Fundamento: El sustrato urea es una diamina del cido carbnico, denominada
carbamida. Todas las amidas (RCO- NH2) son rpidamente hidrolizadas. La
hidrlisis de la urea es catalizada por una enzima especfica que es la ureasa
es una enzima microbiana importante, relacionada con la descomposicin de
los compuestos orgnicos.

Las enzimas bacterianas se clasifican en adaptativas o constitutivas. Una enzima


adaptativa o inducida es aquella que es producida por una bacteria solamente cuando
se encuentra presente su sustrato especfico. La ureasa es una enzima constitutiva ya
que la sintetizan ciertas bacterias sin tener en cuenta si hay o no el sustrato urea.

El indicador de PH es rojo de fenol, el cual en alcalinidad vira a un color violeta


indicando una prueba POSITIVA. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA.

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AGAR SIM: sembrar con asa recta, por picadura central hasta la mitad del tubo.

o Principio: EN AGAR SIM se determina la capacidad e un microorganismo de


moverse (presencia e flagelos), de producir INDOL y H2S.
o Lectura: Se efecta de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Agregar 10 gotas
de reactivo de ERLICH.
o Fundamento: el INDOL es uno de los productos del metabolismo del
aminocido TRIPTOFANO. Las bacterias que poseen la enzima
TRIPTOFANASA son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con
produccin de indol, cido pirvico y amoniaco.

El indol se puede detectar en un medio adecuado observando el desarrollo de un color


rojo despus de agregar el reactivo de Erlich o de Kovacs indicando una prueba
POSITIVA, debido a que el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-
dimetilaminobenzaldehido. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA. EL
SIM es un medio semislido sin hidratos de carbono que inhiban la produccin de H 2S
y tiene TIOSULFATO DE SODIO fuente de azufre y HIERRO PEPTONADO como
indicador de HS, lo que lo hace ms sensible en la deteccin de H2S por produccin
de un precipitado negro de sulfuro ferroso.

La MOVILIDAD BACTERIANA es otra caracterstica importante en la identificacin


final de especie, se realiza en medios semislidos como el SIM, debindose leer antes
que la prueba de indol porque al agregar el reactivo de Erlich sta se puede
enmascarar. La prueba de motilidad se interpreta realizando un cuidadoso examen
macroscpico del medio para observar una zona de desarrollo difuso que parte de la
lnea de inoculacin.

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CALDOS MR-VP: sembrar en cada caldo con asa recta.

o Principio: En el caldo MRVP se determina por qu va metablica fermenta la


glucosa la bacteria.
o Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Agregar
10 gotas de ROJO DE METILO al tubo MR, la aparicin inmediata de un color
rojo indica que la prueba es positiva para MR, la aparicin de un color amarillo
indica que la prueba es NEGATIVA.
Al tubo VP agregar 10 gotas de KOH al 40% y 5 gotas de ALFA NAFTOL al 5%,
mezclar fuerte despus de la adicin de cada reactivo, esperar 15 minutos y
leer, la aparicin de un color rojo indica una prueba de VP POSITIVA, la
aparicin de un color amarillo o caf indica una prueba de VP NEGATIVA.
o Fundamento: La bacteria puede fermentar la glucosa por la VIA ACIDA MIXTA
con produccin de metabolitos como cido lctico, frmico y succnico, los
cuales van a hacer descender el pH inicial del medio de 6.9 a 4.2, lo cual se
visualiza al agregar el indicador de pH ROJO DE METILO, el cual a pH cido
vira a un color rojo.

La bacteria puede fermentar la glucosa por la VIA BUTILEN GLICOLICA con


produccin de productos neutros como el ACETIL METIL CARBINOL (ACETOINA), el
2,3 BUTILEN GLICOL y el DIACETIL. El producto final ms frecuente es el 2,3
BUTILEN GLICOL, que es fcilmente oxidado a ACETIL METIL CARBINOL y luego a
DI-ACETIL. El VP realmente es una bsqueda de DI- ACETIL.

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Da 4: Resultados de la prueba de bioqumica.

Muestra 01 en Agar TSI, se


obtuvo:

Gas (+)
Glucosa (+)
Sacarosa (+)
Lactosa (+)
H2S (-)

Muestra 04 en el Agar TSI, se


obtuvo:

glucosa negativo
H2S (+)
no se puede saber nada de
la lactosa ni la sacarosa ya
q se ha puesto negro

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Muestra 05 en Agar TSI:

No hay fermentacin de
los 3 azucares
Gas (-)
H2S (-)

Muestra 01 en
Agar LIA:

Positivo

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Muestra 04 en
Agar LIA:

Positivo
H2S (+)

Muestra 05 en Agar
LIA:

Positivo

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Muestra 01, 04 y 05 en Medio SIM, se


obtuvo:

Negativo

Muestra 01 en Agar
Citrato de Simmons, se
obtuvo:

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Muestra 04 en Agar Citrato de


Simmons, se obtuvo:

Positivo

Muestra 05 en Agar Citrato


de Simmons, se obtuvo:

Negativo

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Muestra 01, 04 y 05 en Caldo de urea,


se obtuvo:

Negativo

Da 5: Prueba de BPRM y Vogers Proskauer

Materiales usados en la
prueba:

Hidrxido de
Potasio al 40%
Alfa naftol al 5 %

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Prueba de RM(Rojo de Metilo) y VP(Vogues Prospauer)


Encontramos en los resultados de ambas pruebas VP
despus de haber agregado 0,2 ml KOH 40% y 0,6 alfanaftol
5% indicndonos que para ambas bacterias son negativas,
mientras que a la mano derecha encontramos la prueba RM
despus de haber aadido 5 gotas de Rojo de Metilo toman
una coloracin rosa y eso nos indica que el examen es
positivo para ambas bacterias

CONCLUSIONES

Las enterobactericas son bacilos y cocobacilos gramnegativos, anaerobios


facultativos, no formadores de esporas, fermentadores de glucosa, no
presentan actividad de citocromooxidasa, reducen nitratos a nitritos y las
especies mviles lo son mediante flagelos de distribucin peritrica.
Estn muy diseminadas en la naturaleza, las encontramos en el agua, tierra,
animales, etc. En el hombre se localizan en las vas areas superiores, en la
piel, en la uretra anterior y sobre todo en el intestino.
Dentro de la esta Familia se reconocen ms de 30 gneros diferentes
Las enterobacterias poseen una estructura antignica muy compleja que junta
a factores determinantes le otorgan un grado importante de patogenecidad.

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REFRENCIA BIBLIOGRAFICA

Manual de Pruebas Bioqumicas y Microbiolgicas.


http://www.adiveter.com/ftp_public/E.coli.pdf
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/tesis/basic/flores_al/antec.pdf
http://www.inti.gob.ar/productos/pdf/mat_escherichia_coli.pdf
http://www.bvsops.org.uy/pdf/salmonella.pdf

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