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org), 207-222

Evidencias de la presencia de lipasas en el hepatopncreas de

Litopenaeus schmitti
Alberto del Monte1, Hctor Nolasco2, Alina Forrellat 3, Carlos Aragn1,
1 1 3
Aliosha Garca , Joaqun Daz , Olimpia Carrillo
1
Centro de Estudio de Protenas, Facultad de Biologa, Universidad de la Habana (Cuba)
2
Laboratorio de Nutricin Acucola, Centro de Investigaciones Biolgicas del Noroeste, Baja
California Sur (Mxico)
3
Grupo de Gentica, Nutricin y Sistemtica Molecular de Organismos Marinos, Dpto. de
Bioqumica y Centro de Investigaciones Marinas, Universidad de la Habana (Cuba)

Resumen
El conocimiento de las lipasas de los organismos
con importancia en el sector acucola como son los
camarones peneidos, permite ampliar el
conocimiento fisiolgico de las especies y optimizar
las formulaciones (calidad de lpidos) de las dietas,
lo que las hace ms eficientes para cada especie.
Adems se abren posibilidades en la formulacin de
aditivos alimenticios (enzimticos) para la
acuacultura. En el presente trabajo se estudi la
actividad lipsica frente a diferentes sustratos
naturales y sintticos con el extracto enzimtico
acuoso del hepatopncreas de Litopenaeus schmitti,
se determin el efecto del pH en la actividad
enzimtica y se inici el aislamiento e inmovilizacin
por adsorcin interfacial de los responsables de la
actividad lipsica en este extracto enzimtico
acuoso. Se discute la importancia terica y prctica
de estos hallazgos en camarones peneidos .
Summary
Evidence s of lipolytic activity in the midgut gland of
Litopenaeus schmitti
The knowledge of the lipases of the organisms with
importance in the aquatic sector like the peneid shrimps,
allows to widen the physiologic knowledge of the
species and to optimize the diets formulations (lipids
quality), what makes them more efficient for each
species. Possibilities also open up in the formulation of
nutritious additives (enzymatic) for the aquaculture. In
the present work we report the lipasic activity against
different natural and synthetic substrates of the aqueous
enzymatic extract of the Litopenaeus schmitti midgut
glands. The pH effect on enzymatic activity was
determined. The isolation and immobilization by
interfacial adsorption of the responsible of lipase activity
in aqueous extract was initiated. The theory and
practical importance of these discoveries in peneid
shrimps was discussed.

Introduccin
Las lipasas son un grupo muy verstil de enzimas que tambin expresa otras actividades
como fosfolipasa, lisofosfolipasa, colesterol esterasa, amidasa y esterasa. Por lo general
tienen preferencia por el tipo de sustrato, triglicrido o di glicrido y por lo tanto tienen como
productos a los diglicridos y monoglicridos, adems que al glicerol y los cidos grasos
libres. La regin de selectividad es alta para las posiciones 1 y 3 ms que para la 2. Si bien
existen amplios conocimientos sobre las lipasas de vertebrados y de microorganismos (1),
no sucede lo mismo con las lipasas de invertebrados y los conocimientos son aun ms
escasos de estas enzimas en invertebrados marinos. La presencia de una verdadera lipasa
(glicerol-ster hidrolasa) en crustceos slo ha sido demostrada en Homarus americanus
(adultos) por Brockerhoff et al. en 1967 (2) y en larvas por Biesiot y Capuzzo (3). En
adultos, Brockerhoff et al. (2) informaron la digestin del triglicrido trioleina por el jugo
gstrico de este decpodo a pH 4.7. En un trabajo posterior Brockerhoff et al. (4) plantearon
que la hidrlisis de la tributirina a pH 6.5 y de la trioleina a pH 7.5 por el jugo gstrico de
Homarus americanus estaba relacionado con una verdadera lipasa y que sta tena un
peso molecular de 43000 Da. Tambin Biesiot y Capuzzo (3) utilizaron trioleina para
determinar la actividad de la lipasa en larvas y registraron la liberacin de cidos grasos
(cidos oleico), siendo el pH ptimo de esta lipasa de 5.5.
No obstante, otras enzimas pueden ser las responsables de la actividad lipoltica registrada
en los crustceos, tales como carboxilesterasas o esterasas, enzimas que tienen una
especificidad ms amplia que la verdadera lipasa. (5) afirmaron que en Palaemon serratus

I Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 207

no existe una verdadera lipasa, aunque encontraron dos esterasas. Tambin
Nagabhushanam y Sarojini (6) registraron, en Diogenes bicristimanus, una actividad
lipoltica sobre un amplio rango de sustratos con un pH ptimo de 7.4. Es en 1996 cuando
Deering et al. (7) informan la presencia de una verdadera lipasa en hepatopncreas del
Penaeus monodon, estos autores utilizaron trioleina como sustrato, la hidrlisis in vitro de
este lpido, a pH 8.0 produjo 1,2-diacilglicerol y cidos grasos libres.
El objetivo del presente trabajo ha sido ampliar los escasos conocimientos que existen en la
actualidad sobre las lipasas de peneidos..

Material y mtodos
Obtencin del material biolgico
Los ejemplares adultos de Litopenaeus schmitti fueron extrados del medio natural en
estadio de intermuda en la costa sur de la Provincia de Camagey, Cuba. Trasladndose
inmediatamente al laboratorio donde se les extrajo el hepatopncreas por diseccin y se
congelaron a 20C.

Preparacin del homogenado de hepatopncreas

El homogenado de hepatopncreas se prepar por homogeneizacin de los
hepatopncreas con tampn fosfato de sodio 0.01 mol/L, pH 8.0, en una relacin peso
hmedo/volumen (1:2), en un homogenizador (mAm mod. LMU 9090, Alemania) a 4C
durante 5 minutos.
Una vez obtenidos los homogenados se centrifugarn los mismos a 18000 g durante 60
minutos con una temperatura de 4C, el sobrenadante se proces por diafiltracin en un
ultrafiltro (Amicon, USA) con una membrana Tipo YM3 (Diaflo, USA) de 3000 Da como cut
off y el cambio de tampn se realiz con Fosfato de sodio 0.01 mol/L. Esta solucin
resultante fue conservada en congelacin a 60C hasta su utilizacin.

Determinacin de la concentracin de protenas

La concentracin de protenas del extracto enzimtico soluble y de los filtrados y lavados
procedentes de los experimentos de inmovilizacin se determin segn Bradford (8).
Para determinar la concentracin de protenas se realiz una curva patrn con albmina de
suero bovino (BSA) en concentraciones desde 0.25 mg/mL hasta 20 mg/mL. Los resultados
de esta curva patrn fueron procesados mediante una regresin lineal simple utilizando el
mtodo de los mnimos cuadrados (9). El valor de la pendiente fue utilizado para calcular la
cotangente y sustituir en la frmula siguiente:

Conc.Prot.(mg/mL ) =
Abs. 595 nm
cot.
Venz.
donde:
Conc. Prot. (mg/mL): es la concentracin de protenas.
Abs.595 nm: es la absorbancia a 595 nm de la muestra.
cot: es el valor de la cotangente determinada con los resultados de la curva patrn.
Venz.: es el volumen de extracto enzimtico utilizado en el ensayo (40 L).

I Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 208

Electroforesis en geles de poliacrilamida
Las electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS se realizaron segn
Laemmli (10), en una cmara vertical (Pharmacia-Biotech., USA) conectada a una fuente de
poder (Pharmacia LKB Multi Drive XL, Suecia).
Las concentraciones de los geles de poliacrilamida fueron 15% y el tampn de la cmara
Tris-Glicina 0.05 mol/L, pH 8.5.
Las protenas utilizadas como patrones (Sigma, USA) fueron:
Protena Masa molecular (Da)
Insulina 6 000
-Lactoalbmina 14 400
Pepsina 34 000
Ovoalbmina 43 000
BSA 68 000

Se aplicaron 10 L de cada muestra utilizando bromofenol azul como indicador. La corrida

electrofortica se realiz a 15C, 145 voltios y durante 60 minutos.
La tincin especfica de esterasas se realiz segn Hunter y Market en 1957 (11), 500 L
de solucin -naftil acetato 200 mmol/L en acetona, 500 L de solucin -naftil acetato 200
mmol/L en acetona como sustratos y 500 L de solucin Fast Blue BB 100 mmol/L en
DMSO como revelador, es tas dos soluciones son mezcladas con 100 mL tampn Fosfato
de sodio 0.1 mol/L, pH 7.0) y adicionado al gel previamente lavado con solucin Tritn
X-100 al 20% para la remocin del SDS presente en la muestra y en el gel.
Las bandas de protenas fueron reveladas con una solucin de azul Coomassie R-250 al
25% en metanol 50%: cido actico glacial (conc.), relacin v:v (10:1), durante 1 hora.
La preparacin de las muestras se llev a cabo por desnaturalizacin de las mismas en 5%
de SDS y 100C durante 10 minutos.

Actividades enzimticas
Determinacin de la actividad enzimtica estersica utilizando p-nitrofenil acetato (pNPA),
p-nitrofenil butirato (pNPB) o p-nitrofenil caprilato (pNPC) como sustrato:
Se emple un mtodo continuo para la determinacin de la actividad enzimtica estersica
del extracto enzimtico soluble y en el derivado inmovilizado, utilizando para ello un
espectrofotmetro (Spekol 11, Alemania) con un aditamento que proporciona agitacin
magntica y temperatura constante (30C) en una cubeta de 1 cm de paso ptico.
Se utiliz pNPA o pNPB como sustrato y la reaccin se sigui por el incremento de la
absorbancia a 348 nm producto de la liberacin del p-nitrofenol. Esta longitud de onda
corresponde al punto isobstico, en el que absorben igual las formas ionizadas y no
ionizadas del p-nitrofenol. El para estas condiciones es 5150 cm-1 (mol/L)-1.

I Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 209

La mezcla de reaccin para el ensayo enzimtico fue la siguiente:
Para el extracto enzimtico soluble.
1.655 mL de tampn Tris-HCl 0.025 mol/L, pH 8.0.
0.02 mL de una dilucin del extracto enzimtico soluble que contenga 0.959
mg/mL de concentracin de protenas.
0.140 mL de pNPA, pNPB o pNPC (disuelto en acetonitrilo) con una concentracin
de 50 mmol/L.
Vol. Total = 1.815 mL.
Para los biocatalizadores inmovilizados.
1.665 mL de tampn Tris-HCl 0.025 mol/L, pH 8.0.
0.1 mL de una dilucin 1:10 de los biocatalizadores inmovilizados.
0.050 mL de pNPA, pNPB o pNPC (disuelto en acetonitrilo) con una concentracin
de 50 mmol/L.
Vol. Total = 1.805 mL.
En todos los experimentos los volmenes se mantuvieron constantes, excepto en aquellos
donde se sealan las modificaciones.
La unidad de actividad enzimtica (U) se define como la cantidad de extracto enzimtico
soluble o biocatalizador inmovilizado capaz de transformar 1 mol de pNPA, pNPB o pNPC
en un minuto, a una temperatura de 30C.
La actividad enzimtica se calcul segn la ecuacin:
bs.348nm 1 1 Vtotal
AE (U/mL ) = dil.
t l Venz.
donde:
AE: es la actividad enzimtica informada en unidades por mL de solucin de
extracto enzimtico soluble o de biocatalizador inmovilizado.
Abs.348 nm: es la diferencia de absorbancia obtenida a 348 nm.
l: es el espesor de la cubeta en cm.
t: es el tiempo (minutos) transcurridos entre dos lecturas sucesivas.
: es el coeficiente de extincin molar del pNPA, pNPB o pNPC a 348 nm.
Vtotal: es el volumen total de la mezcla de reaccin en mL.
Venz.: es el volumen de extracto enzimtico soluble o de la dilucin 1:10 del
biocatalizador inmovilizado.
dil.: es la dilucin de la solucin enzimtica utilizada.
Para cada determinacin de actividad enzimtica y para los controles de hidrlisis
espontnea del pNPA, pNPB o pNPC se realizaron 3 rplicas.

Determinacin de la actividad enzimtica lipsica.

Se emple un mtodo de titulacin automtica en un titulador (en modo pH-Stat) Mettler-
Toledo DL-21 (Suiza) para la determinacin de la actividad enzimtica lipsica en el
extracto enzimtico soluble y en el biocatalizador inmovilizado. Las determinaciones se
realizaron en agitacin constante y temperatura de 30C.

I Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 210

Se utilizaron como sustrato tributirina, triolena, tripalmitina, triestearina, aceite de Calamar,
aceite de Camarn, aceite de Bacalao, aceite de Atn, aceite de Langostilla, aceite de
Girasol, aceite de Oliva y fosfatidil colina de Soya. La reaccin se sigui mediante la
liberacin de protones, producto de la hidrlisis de los enlaces steres de estos sustratos, lo
que provoca una disminucin del pH en el medio de reaccin, que permite la titulacin con
NaOH 0.1 mol/L, para mantener fijo el pH en el valor deseado.

Preparacin de las emulsiones

57.56 mL tampn Universal (12)
4.0 mL de Sustrato.
14 mL de Goma Arbiga al 10%
homogeneizar durante 20 minutos en un homogeneizador (mAm mod. LMU 9090,
Alemania) y aplicar ultrasonido durante 10 minutos.
La mezcla de reaccin para el ensayo enzimtico fue la siguiente:
30 mL de emulsin
1mL de extracto enzimtico soluble o biocatalizador inmovilizado.

V t Conc.NaOH
AE (U mL ) =
V enzima

donde:
AE: es la actividad enzimtica informada en unidades por mL de solucin de
extracto enzimtico soluble o de biocatalizador inmovilizado.
V: volumen de solucin valorante consumida entre dos adiciones sucesivas.
t: es el tiempo (minutos) transcurridos entre dos adiciones de solucin valorante
sucesivas.
Venzima.: es el volumen de extracto enzimtico soluble o del biocatalizador
inmovilizado utilizado en el ensayo.
Conc. NaOH: es la concentracin de la solucin valorante (NaOH 100 mol/mL).
Para cada determinacin de actividad enzimtica y para los controles de hidrlisis
espontnea de la Tributirina se realizaron 3 rplicas.

Inmovilizacin por adsorcin interfasial del extracto enzimtico en el soporte Octyl-

Sepharose 4 B Cl
El soporte Octyl-Sepharose 4 B Cl fue mezclado con el extracto soluble y tampn Fosfato
de sodio 10 mmol/L, pH 7.0 de manera que la dilucin final del extracto fuera 1:8 (v:v). Esta
mezcla fue agitada durante 2 horas a una temperatura de 4 ?C. Despus de este tiempo se
filtr por embudo de placa porosa grado 4 y al filtrado se le realizaron determinaciones de
actividad enzimtica frente a pNPA, pNPB, aceite de Girasol y tributirina, y la concentracin
de protenas (8) y se cuantific el volumen total. El biocatalizador inmovilizado que qued
en el embudo de placa porosa fue lavado con el tampn de inmovilizacin 2 veces, filtrando
en ambas ocasiones al vaco y realizando el mismo procedimiento utilizado para el filtrado.
Al biocatalizador inmovilizado se le determin la actividad enzimtica frente pNPA y pNPB
mediante un mtodo directo continuo y frente a aceite de Girasol y tributirina por titulacin
mediante el mtodo de pH-Stat.

I Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 211

Se determinaron los parmetros GI diferencial, GI directo , % RAF (13), % Inmovilizacin (%I) e
Hiperactivacin (14 y 15) mediante los valores de actividad enzimtica, tanto en la forma
soluble como en la inmovilizada. El parmetro GIProt.diferencial, (13) tambin se determin
mediante los valores de concentracin de protenas.
Los clculos se realizaron mediante las siguientes frmulas:
mg Prot.total Inmov. mg Prot.total inicial mg Prot.total filtrado + lavado
GI Pro t. diferenc. =

mL Soporte V Soporte V Soporte
donde:
GI Prot. diferenc.: es el grado de inmovilizacin determinado mediante el mtodo
diferencial tomando en cuenta los mg de protena total inmovilizada por mL de
soporte.
mg Prot. total inicial: es la concentracin de protena de la solucin inicial en la
inmovilizacin multiplicado por el volumen total de esta solucin.
mg Prot. total filtrado + lavado: es la sumatoria de las concentraciones de protenas del
filtrado y los lavados multiplicados por el volumen total de cada uno.
V Soporte : es el volumen total del soporte utilizado en la inmovilizacin (Octyl-
Sepharose 4 B Cl).

U totales Inmov. U totales inicial. U totales filtrado + lavados

GI diferenc.
=
mL Soporte V Soporte V Soporte
donde:
GI diferenc .: es el grado de inmovilizacin determinado mediante el mtodo diferencial
tomando en cuenta las U totales de actividad estersica inmovilizada por mL de
soporte.
U totales inicial: son las U de actividad estersica de la solucin inicial en la inmovilizacin
multiplicado por el volumen total de esta solucin.
U totales filtrado + lavado: es la sumatoria de las U de actividad estersica del filtrado y los
lavados multiplicados por el volumen total de cada uno.
V Soporte : es el volumen total del soporte utilizado en la inmovilizacin (Octyl-
Sepharose 4 B Cl).

U U totales
GI directo =
mL soporte V Soporte

donde:
GI directo: es el grado de inmovilizacin determinado mediante el mtodo directo.
U totales , son las unidades de actividad estersica del derivado inmovilizado medidas
por el mtodo directo multiplicadas por el volumen total de soporte utilizado en la
inmovilizacin.
V Soporte: Es el volumen total de soporte utilizado en la inmovilizacin (Octyl-Sepharose
4 B Cl).

GI directo V soporte
% RAF = 100
U totales iniciales
donde:
%RAF: es el porcentaje de actividad funcional retenida por el derivado inmovilizado
con respecto a las unidades totales iniciales.
GI directo: es el grado de inmovilizacin determinado por el mtodo directo.
U totales iniciales: son las unidades totales de actividad estersica puestas a inmovilizar.
I Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 212
 GI diferenc. V Soporte
%I= 100
U totales iniciales
donde:
%I: es el porcentaje de inmovilizacin.
GI diferenc .: es el grado de inmovilizacin determinado por el mtodo diferencial.
U totales iniciales : son las unidades totales de actividad estersica puestas a inmovilizar.
V Soporte: es el volumen total del soporte utilizado en la inmovilizacin (Octyl-
Sepharose 4 B Cl).

GI directo
Hiperactiv acin =
GI diferenc.
donde:
Hiperactivacin: es la sobreexpresin de las unidades de actividad estersica
producto de la adsorcin interfacial de las enzimas a la interfase hidrofbica.
GI diferenc .: es el grado de inmovilizacin determinado por el mtodo diferencial.
GI directo: es el grado de inmovilizacin determinado por el mtodo directo.

Resultados
El extracto enzimtico acuoso obtenido de hepatopncreas de Litopenaeus schmitti
hidroliz todos los triglicridos utilizados como sustrato, se observ una preferencia en la
actividad hidrolt ica frente a los sustratos Tributirina, Triestearina, Tripalmitina, aceite de
Atn y aceite de Girasol (Fig. 1).

Figura 1
Actividad lipsica detectada en el extracto enzimtico acuoso de hepatopncreas
de L. schmitti frente a diferentes sustratos en emulsin por el mtodo de pH-Stat

I Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 213

Se realiz un estudio de la actividad lipsica del extracto enzimtico acuoso a diferentes pH
(desde pH 3 hasta pH 11) (Fig. 2) y se observ la presencia de dos mximos de actividad
enzimtica, uno a pH 5.5 y otro a pH 8.

Figura 2
Evaluacin de la actividad lipsica del extracto enzimtico acuoso en un intervalo de pH
comprendido entre 3 y 11, por el mtodo de pH-Stat utilizando como sustrato una emulsin
de aceite de Girasol

Se evalu la capacidad hidroltica de extracto enzimtico acuoso frente a steres de p-

nitrofenol (Fig. 3). Se observ una disminucin de la actividad enzimtica especfica cuando
aumentamos el largo de la cadena del cido esterificado.

Figura 3
Actividad estersica del extracto enzimtico acuoso obtenido de
hepatopncreas de L. schmitti frente a steres de p-nitrofenol por un mtodo
espectrofotomtrico continuo

I Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 214

Como se observa en la figura 3 el extracto enzimtico acuoso tambin exhibe actividad
estersica frente a steres del p-nitrofenol. Se registr una mayor actividad cuando se
utiliz como sustrato p-NPA y se observ que la actividad enzimtica especfica disminuye
en la medida en que aumenta el largo de la cadena del cido esterificado.
Como se observa en la figura 4 la actividad lipoltica frente a derivados del p-nitrofenol
disminuye en relacin con el largo de la cadena aliftica que se esterifica. Un
comportamiento similar se observ al utilizar tributirina y aceite de girasol como sustratos.
Sin embargo, al comparar la actividad lipoltica del extracto inmovilizado, se observ un
incremento de la actividad en la medida que aument el largo de la cadena de cido graso,
lo que apunta hacia el hecho de que al gel de Octyl-Sepharose 4 B Cl se adsorben
selectivamente aquellas protenas con una actividad enzimtica que tienen como
caracterstica distintivas que necesitan de una interfase para exhibir su actividad cataltica.

Figura 4
Actividad estersica del extracto enzimtico acuoso obtenido de hepatopncreas de L.
schmitti frente a steres de p-nitrofenol por un mtodo espectrofotomtrico continuo

Tomando en consideracin que las enzimas con actividad lipsica de origen marino, al igual
que las lipasas de otras especies se comportan como catalizadores interfasiales y que
hasta el momento no existen mtodos adecuados para aislar y purificar este tipo de
enzimas, se utiliz la tcnica de inmovilizacin de enzimas, especficamente la
inmovilizacin por adsorcin interfasial en soporte de Octyl-Sepharose 4 B Cl como un
mtodo auxiliar en la purificacin de enzimas con actividad hidroltica sobre steres de
cidos grasos (Tabla I). Estos parmetros nos muestran un porcentaje de retencin de
actividad funcional bajo, as como una hiperactivacin tambin baja, con todos los sustratos
utilizados en la determinacin de las actividades estersicas y lipsicas. Se obtienen
valores altos de % I cuando se utilizan como sustratos steres de p-nitrofenol.

I Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 215

Tabla I
Parmetros de inmovilizacin por adsorcin interfasial en el soporte Octyl-Sepharose 4 B Cl del
extracto enzimtico acuoso obtenido del hepatopncreas de L. schmitti
GI Prot GI dif GI direct
% RAF %I Hiperactiv.
(mg/mL sop) (U/mL sop) (U/mL sop)
p-NPA - 41.856 0.342 0.649 79.453 0.008
p-NPB 111.446 5.162 0.885 15.259 89.000 0.171
Girasol - 8.420 1.997 12.388 52.233 0.237
Tributirina - 8.060 2.578 6.052 18.920 0.320
GI Prot: Grado de inmovilizacin de la protena sobre soporte de Octyl Sepharose 4 B Cl
GI dif : Grado de inmovilizacin diferencial tomando en cuenta los mg de protena total inmovilizados por mL de soporte
GI direct: Grado de inmovilizacin directo
% RAF: Porcentaje de actividad funcional retenida por derivado inmovilizado con respecto a las unidades totales iniciales
% I: Porcentaje de inmovilizacin
Hiperactiv: Sobreexpresin de las unidades de actividad estersica producto de la adsorcin interfasial de las enzimas a la
interfase hidrofbica.

En cuanto a los grados de inmovilizacin se observan la no concordancia entre el GIdirecto y

el GIdiferencial, siendo el directo el que menores valores de Unidades de actividad enzimtica
expresa para cada uno de los sustratos ensayados en la determinacin de las actividades
estersicas y lipsicas. El GI Protdiferencial es bajo, corresponde al 51% de la protena
presente en el extracto enzimtico acuoso obtenido de hepatopncreas de L. schmitti. Esto
pone de manifiesto la selectividad del mtodo de inmovilizacin por adsorcin interfacial y
su posible utilidad en el aislamiento de este tipo de enzimas.
Los resultados de la electroforesis en geles de SDS-PAGE teidos con tincin especfica
para esterasas y protenas totales se muestran en la figura 5 (a y b). Se observ una sola
banda teida en el preparado inmovilizado (carril 2 en ambas figuras) a diferencia de lo que
se observa en el carril 3 en la figura 5a y carril 1 para la figura 5b correspondiente al
extracto enzimtico acuoso obtenido a partir de hepatopncreas de camarn blanco L.
schmitti.

Figura 5
5a. Electroforesis en SDS -PAGE extracto 5b. Electroforesis en SDS-PAGE del extracto
enzimtico acuoso y el preparado enzimtico acuosos y el preparado inmovilizado
inmovilizado tincin de protenas totales con utilizando tincin especfica para esterasas ( y
azul de Coomassie. naftil acetato).

Carril 0: Patrones de Peso Molecular Carril 1: Extracto enzimtico acuoso

Carril 1: Derivado inmovilizado Carril 2: Derivado inmovilizado
Carril 2: Extracto enzimtico acuoso

I Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 216

Discusin
El metabolismo de los lpidos en los crustceos ocurre de manera similar a como tiene lugar
en los mamferos (16). En primer lugar los crustceos son capaces de oxidar los cidos
graso va -oxidacin. Llevan a cabo la biosntesis de lpidos como glicridos y fosfolpidos
por rutas metablicas similares a las de los mamferos. Son incapaces de sintetizar
colesterol y carecen de enzimas capaces de elongar las cadenas de cidos grasos y de
introducir un segundo o tercer doble enlace en la cadena, por lo que el colesterol y los
cidos grasos poliinsaturados tienen un carcter esencial para estos organismos.
El principal sitio de reserva de lpidos en los crustceos es el hepatopncreas y estas
reservas son movilizadas para procesos vitales en estos animales como son la
vitelognesis y el ciclo de l a muda. Por estas razones se han observado variaciones cclicas
del metabolismo lipdico relacionadas con el ciclo de la muda lo que hace pensar que existe
una regulacin hormonal particular de la lipognesis en estos animales (16).
Las investigaciones iniciadas en el aislamiento y aplicacin de las esterasas presentes en
organismos marinos (17, 18 y 19) utilizando los protocolos informados en la literatura por
Fernndez-Lafuente et al. (15) han permitido el esclarecimiento de aspectos en el
aislamiento de enzimas con actividad lipsica y fosfolipsica y la caracterizacin de los
extractos enzimticos solubles en cuanto a estas actividades y sus correspondientes
derivados inmovilizados con buenas perspectivas para su utilizacin en reacciones de
inters con aplicacin en procesos de sntesis orgnica.
En nuestro caso particular se ha seleccionado como modelo de estudio al camarn blanco
L. schmitti, especie de inters comercial, cuya batera enzimtica ha sido ampliamente
estudiada por Forrellat et al. (20 y 21) y Gonzlez et al. (22) teniendo en cuenta la
importancia que tiene para el sector productivo un aprovechamiento ptimo del alimento.
Sin embargo algunas enzimas, como las lipasas han sido poco estudiadas en estas
especies debido a grandes controversias existentes en la literatura de si realmente estos
crustceos tienen o no una verdadera lipasa. Por tanto el hecho de poder demostrar la
presencia de lipasas en estos camarones ampla considerablemente el conocimiento terico
acerca de la fisiologa de la digestin en crustceos, y permite profundizar en los
mecanismos de control de la digestin en estos organismos lo que posibilitar la utilizacin
de estos hallazgos en la optimizacin de la formulacin de alimentos (calidad de lpidos
incluidos) suministrados durante su cultivo.
La utilizacin de los ingredientes de la dieta y la movilizacin de las reservas endgenas
requiere de la accin de enzimas hidrolticas. Dentro de la amplia clase de enzimas
hidrolticas se encuentran aquellas que catalizan la hidrlisis del enlace ster: las esterasas,
que son enzimas ampliamente distribuidas en la naturaleza y entre ellas se diferencian en
las que hidrolizan steres carboxlicos o carboxiesterasas como las lipasas o glicerol ster
hidrolasas (E.C. 3.1.1.3) (23, 24 y 25).
Las lipasas son enzimas nicas que requieren de activacin en la interfase lpido-agua para
desplegar a totalidad su actividad cataltica. Este fenmeno fue observado por varios
autores desde hace ms de tres dcadas (26 y 27); pero no fue hasta 1958 que fue definido
por Sarda y Desnuelle y se ha comprobado por elucidacin de la estructura tridimensional
de algunas lipasas y esterasas mediante cristalografa de rayos X (28, 29, 30 y 31). Es
comn para todas las lipasas la presencia de una -hlice (denominada tapadera)
cubriendo el centro activo y que se desplaza (se abre) durante la activacin en la interfase,
permitiendo el acceso al sitio activo hasta ese momento inaccesible (32). Adems de este
centro activo, algunos autores han encontrado para la lipasa pancretica humana y porcina
un grupo de residuos aminoacdicos localizados en la regin C-terminal y que acta,

I Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 217

presumiblemente, como un sitio cataltico mnimo para la hidrlisis de sustratos solubles
como los steres del p-nitrofenol (pNPA) (33, 34 y 35).
Un gran nmero de extractos de diferentes organismos ha sido investigado (23) para la
deteccin de actividad lipsica. Berner y Hammond en 1970 (36) ensayaron 26 especies de
organismos marinos de varios Phyla, encontrando actividad lipsica verdadera en la mitad
de las especies examinadas, mientras que la actividad esterasa fue demostrada para todas.
Por otro lado, la actividad lipsica en especies de camarones slo se ha informado en
Penaeus monodon (7) y constituye an hoy un aspecto controversial entre los especialistas
dedicados a este tema.
Erdmann et al. en 1991 (37), investigaron actividades enzimticas de 68 extractos de
lipasas de diferentes fuentes utilizando sustratos como triolena, tributirina, p-NPP y p-NPB.
Estos autores encontraron actividad lipsica en diez extractos que coincidieron con la
presencia de actividad para los sustratos no especficos p-NPP y p-NPB.
Las lipasas han sido definidas como especficas para la catlisis de acilgliceroles de cidos
grasos de cadena larga, que son sus sustratos naturales (38). Los steres de glicerol de
cadena corta son hidrolizados ms rpido que los de cadena larga aunque son sustratos
menos especficos (39). Por otra parte, el nmero de cidos grasos esterificados al glicerol
tambin influye en la especificidad de estas enzimas. Al estudiar la actividad lipoltica del
extracto enzimtico acuoso utilizando diferentes sustratos (Fig. 1) se observ una
preferencia de hidrlisis sobre tripalmitina y triestearina de ah que la actividad enzimtica
informada se corresponda con la actividad de una verdadera lipasa que hidroliza
preferentemente triacilgicridos a diferencia de las esterasas.
Los mejores valores de hidrlisis se obtuvieron cuando se utiliz tributirina como sustrato
(Fig. 1) y es importante sealar que la tributirina es un triacilglicrido saturado de cadenas
cortas que puede ser hidrolizado por otras enzimas y hidrolasas particularmente
esterasas y carboxiesterasas (39). No obstante, a pesar de ser un sustrato que pudiera
resultar inespecfico es muy til para poder determinar la actividad lipsica en los derivados
inmovilizados ya que al tener un menor tamao molecular presenta menos restriciones
difusionales internas en la determinacin de la actividad cataltica en estos derivados
inmovilizados que contienen selectivamente aquellas enzimas con capacidad de adsorcin
en interfase.
En estos resultados (Fig. 1) se detect una buena hidrlisis cuando utilizamos como
sustratos de la enzimas aceites de origen marino como el de atn y aceites vegetales como
el de girasol. Estos aceites son ricos en cidos grasos poliinsaturados de la serie -3 y -6
que tienen un carcter esencial para estas especies de crustceos (16). Sin embargo,
cuando se determin la actividad enzimtica del extracto enzimtico acuoso utilizando como
sustratos trioleina y aceite de oliva, que son ricos en cidos grasos de la serie -9, la
actividad lipsica encontrada fue muy baja. Los aceites vegetales y grasa animales han sido
ampliamente utilizados en la confeccin de dietas para el desarrollo y crecimiento de
organismos marinos y en especial en la camaronicultura donde suele usarse mezclas de
aceites vegetales y de animales marinos para poder cubrir los requerimientos lipdicos
esenciales y obtener los mejores resultados (40 y 41). De ah que resulta indispensable que
para un buen aprovechamiento de la dieta que los camarones cuenten con enzimas
capaces de hidrolizar selectivamente estos lpidos, como son las lipasas.
Las lipasas han sido diferenciadas de las esterasas, principalmente sobre la base de su
relativa especificidad preferencial. Los sustratos naturales para las lipasas son aceites y
grasas, como los triacilglicridos de cidos grasos de cadena larga y pueden catalizar la
sntesis de steres, mientras que las esterasas actan sobre steres simples de cidos de

I Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 218

bajo peso molecular (23). Por otro lado, dependiendo del punto de partida en trminos de
sustrato, puede catalizar la cidolisis, alcoholisis y transesterificacin (42).
Se escogi el aceite de girasol para el estudio de la actividad lisica del extracto enzimtico
acuoso a diferentes valores de pH (Fig. 2) teniendo en cuenta que es un aceite muy
utilizado para elaboracin de dietas para camarones por su carcter esencial para estos
crustceos. Se encontraron dos mximos de actividad lipsica, uno a pH 5.5 y otro a pH 8.
Estos resultados coinciden con los informados por Berner y Hammond (36) que encontraron
ms de un mximo de actividad (uno a pH 4 y otro a pH 9) utilizando como sustrato
tributirina y como fuente de enzima extractos de hepatopncreas de Cambarus virilis.
Resultados similares informaron Biesiot y Capuzzo (3) en larvas de Homarus americanus.
Estos autores utilizando trioleina como sustrato informaron que existe un mximo de
actividad lipsica a pH 5.5.
Existen enzimas que exhiben dos valores de pH ptimo y pudiramos estar en presencia de
una enzima de este tipo de acuerdo a los resultados obtenidos o bien pudieran
corresponder estos dos mximos de actividad a isoformas diferentes de la enzima ya que
en otras especies se ha informado ms de una isoforma de la enzima cuyos pH ptimos
oscilan entre 7.5 y 10 en dependencia de la forma de la enzima.
Por otro lado en el filtrado de la inmovilizacin queda retenida actividad lipoltica lo que
pudiera hacer pensar que puede existir alguna forma de la enzima que no se adsorbe
selectivamente sobre el soporte de Octyl Sepharose 4 B Cl. La masa molecular de las
lipasas vara de acuerdo con la fuente entre 27 y 60 kDa (43, 44, 45 y 46) y el punto
isoelctrico vara desde 3.8 hasta 7 para las diferentes enzimas e isoenzimas aisladas de
diversas fuentes (46, 47, 48 y 49).
Se han estudiado lipasas utilizando steres de p-nitrofenol con diferentes longitudes de
cadena (50). Estos autores encontraron que la lipasa de Candida cylindracea (C. rugosa)
era ms afn por steres de p-nitrofenol de 8 a 12 tomos de carbono. En las figuras 3 y 4
se observ una marcada actividad hidroltica del extracto enzimtico acuoso y del derivado
inmovilizado sobre steres de p-nitrofenol con diferentes longitudes de cadena y se obtuvo
un comportamiento diferencial. En el extracto enzimtico acuoso se observ una
disminucin de la actividad enzimtica especfica en relacin con el tamao de la cadena
del cido esterificado. Este comportamiento responde a la presencia en este extracto de
otras enzimas pertenecientes al grupo de las / hidrolasas como son las proteasas y
esterasas que son capaces de reconocer estos compuestos como sustratos, de ah que, en
la medida que aumenta el largo de la cadena pudiramos estar observando una actividad
ms propia de los componentes responsables de la actividad lipsica en el extracto.
Al analizar este fenmeno en el derivado inmovilizado (Fig. 4) se observ que a medida que
aumenta el largo de la cadena de los cidos esterificados se incrementa la actividad
enzimtica especfica. De acuerdo con estos resultados y teniendo en cuenta que el
preparado enzimtico fue sujeto a inmovilizacin por adsorcin en la interfase podemos
plantear que estamos en presencia de uno de los componentes con actividad lipoltica en el
extracto. Estos resultados se corroboran por los obtenidos por electroforesis donde se
observa una sola banda con actividad en el derivado inmovilizado (Fig. 5b).
Los resultados obtenidos en la inmovilizacin por adsorcin en la interfase mostraron altos
porcentajes de inmovilizacin para la actividad estersica con un incremento de la misma
cuando el ster de p-nitrofenol utilizado posee un largo de cadena mayor en el cido
esterificado, por lo que inferimos una mayor preferencia por sustratos con estas
caractersticas en las enzimas adsorbidas al soporte Octyl-Sepharose 4 B Cl, localizadas en
una banda de aproximadamente 14500 Da (Fig. 5a).

I Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 219

Las diferencias observadas entre los parmetros GIdiferencial y GIdirecto pueden deberse
a que el comportamiento cintico del derivado inmovilizado no coincide con el observado en
la enzima soluble cuando utilizamos como sustrato steres de p-nitrofenol, este fenmeno
nuestro grupo lo ha encontrado tambin con protenas con actividad estersica y lipsica
aisladas de la anmona marina Stichodactyla helianthus (19) determinando que la causa
del mismo responde a inhibicin por exceso de sustrato y que se muestra ms evidente
cuando las enzimas estn unidas a interfases, como es el caso del derivado inmovilizado,
confirindole a este parmetro un carcter aparente. Las diferencias observadas para estos
parmetros cuando utilizamos triacilgliceroles como sustratos responden al incremento de
las restricciones difusionales internas en los derivados inmovilizados debido a la talla de los
sustratos y a la preparacin de los mismos es en forma de emulsin.
Tomando en cuenta todos los antecedentes y resultados discutidos planteamos que existe
al menos una fraccin con actividad lipsica en el hepatopncreas de L. schmitti.

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