TEMA 6- Tcnicas de estudio de la

clula. La membrana celular.

1. La clula como unidad funcional. Teora celular.

2. Mtodos de investigacin en biologa celular. (punto 1 del resumen).

2.1. Microscopia ptica
2.1.1 Microscopia de fluorescencia ptica.
2.2. Microscopia electrnica.
2.2.1. Interpretacin de resultados en microscopa electrnica.
2.2.2. La criofactura.
2.3. Fraccionamiento celular.
2.4. Tcnicas de cultivo. Cultivos celulares.
2.5. Otras tcnicas.
2.5.1. Difraccin de rayos X
2.5.2. Autorradiografia

3. La membrana plasmtica como unidad estructural.

4. Composicin de la membrana plasmtica

4.1. Lpidos de membrana
4.2. Protenas de membrana

5. Modelos de membrana

6. Funciones de la membrana celular

7. Transporte de molculas
7.1. Transporte pasivo
7.2. Transporte activo
7.2.1. ATPasa de membrana

8. Endocitosis y exocitosis
8.1. Procesos de endocitosis
8.1.1 Tipos de endocitosis
8.2. Proceso de exocitosis

9. Diferenciaciones de la membrana
9.1. Microvellosidades
9.2. Estereocilios
9.3. Invaginaciones
9.4. Uniones intercelulares.

1. METODOS DE INVESTIGACION EN BIOLOGIA CELULAR.

1.1. MICROSCOPIA OPTICA
Los microscopios son instrumentos pticos que permiten aumentar el tamao de una imagen.
Los microscopios pticos estn formados por una lente ocular y una serie de lentes objetivo. En
muchos microscopios adems se incluyen lentes de inmersin que requieren la colocacin de un
aceite entre la muestra y la lente.
Caractersticas de un microscopio:
Amplificacin cuanto se aumenta el tamao original de la muestra
 Resolucin capacidad para observar separados dos puntos muy cercanos de la
muestra.
El poder de resolucin de los microscopios depende de:
a. El tamao de las lentes objetivo
b. La calidad de las lentes objetivo
c. La longitud de onda de la luz incidente
d. ndice de refraccin del medio que se encuentra entre el objetivo y la preparacin.

Tipos de microscopios pticos.

1. Microscopio de campo claro En este microscopio las muestras se observan
directamente. Como las clulas vivas son muy transparentes, el contraste suele ser bajo
y se utilizan con frecuencia tinciones con colorantes para obtener una imagen ms
definida de algunos componentes celulares
2. Microscopio de contraste de fases se basa en las diferencias en la refraccin de la
luz de las distintas estructuras celulares
3. Microscopio de campo oscuro un disco opaco bloquea el haz de luz, de forma que
solo la luz refractada por la muestra alcanza el objetivo y esta aparece iluminada sobre
un fondo oscuro.
4. Microscopia de interferencia diferencial de Nomarsky utiliza un prisma refringente
que divide la luz en dos rayos polarizados que interfieren entre s y proporcionan una
imagen de la celula que aparece tridimensional.
5. Microscopia de fluorescencia se emplea una lmpara especial y un filtro que
permiten emitir luz a diferentes longitudes de onda y excitar ciertas molculas
(fluorocromos) capaces de emitir fluorescencia.
Algunos pigmentos como las clorofilas, presentan autofluorescencia, es decir, pueden
visualizarse directamente las clulas si son iluminadas con la longitud de onda
adecuada.

Microscopia de fluorescencia ptica.

Las tcnicas de inmunodeteccion se utilizan para localizar en la clula estructuras que presentan
determinadas protenas como componentes. Para ello se emplean anticuerpos dirigidos contra la
protena en cuestin, marcados con un fluorocromo o conjugados con un segundo anticuerpo
fluorescente, mediante inmunofluorescencia indirecta al microscopio ptico de fluorescencia.

2.2. MICROSCOPA ELECTRNICA.

Este instrumento se basa en la utilizacin de un haz de electrones que atraviesa una serie de lentes
electromagnticas en un sistema de vaco. Existen dos tipos de microscopio electrnico: el de
transmisin (MET) y el de barrido (MEB).
1. Microscopio electrnico de transmisin (MET) las muestras se las realiza un corte ultrafino
y se montan sobre rejillas de cobre que permiten el paso de los electrones. Se aumenta el
contraste mediante la utilizacin de metales pesados, como el plomo, en lugar de colorante.
2. Microscopio electrnico de barrido (MEB) el paso de los electrones por un deflector
provoca el barrido de la muestra, generndose electrones secundarios en funcin del relieve, y
una imagen tridimensional. La muestra se cubre previamente con una capa fina de oro.

2.2.2 Interpretacion de resultados de microscopia electrnica.

La microscopia electrnica de transmisin aporta informacin sobre la ultraestructura celular y
pone de manifiesto la morfologa y disposicin de los componentes internos de la celula en cortes
ultrafinos.

2.2.2.1. Celula procariota.

Si observamos una seccin de una celula procariota podemos distinguir:
La pared celular gruesa y la membrana plasmtica de estructura trilaminar.
Zona de aspecto fibrilar, ms clara, en el centro de la celula, que corresponde al nucleoide,
que contiene el material gentico.
 Inclusiones de reserva electronclaras de carbono o lipidicas e invaginaciones de la
membrana, presentes en ciertas bacterias.
En algunas bacterias podemos apreciar apndices mviles, como los flagelos, e inmviles,
rgidos y ms cortos, como fimbrias o pelos.

2.2.2.2. Los virus.

Para poder observar partculas tan pequeas se utiliza la tincin negativa, un mtodo de
microscopa electrnica que permite aumentar el contraste tiendo el medio circundante con un
colorante, como el acetato de uranilo.

2.2.2.3. Clula eucariota animal y vegetal.

En las clulas eucariotas se puede determinar la estructura y localizacin de los orgnulos
celulares:
Estructuras externas a la membrana: matriz extracelular y pared celular en clulas animales
y vegetales.
Membrana plasmtica: estructura trilaminar.
Nucleo celular : rodeado por una doble membrana y con un interior fibrogranular con zonas
ms densas a los electrones y el nuclolo.
Mitocondrias: con una membrana externa y una membrana interna con crestas o
invaginaciones mitocondriales.
Cloroplastos (en las clulas vegetales): rodeados de una doble membrana y con sistemas
de sculos membranosos aplanados en su interior.
Sistema interno de membranas: constituido por el retculo endoplasmatico (rugoso si tiene
ribosomas y liso si no los tiene) y el complejo de Golgi, un conjunto de cisternas
membranosas apiladas.
Elementos citoesquelticos: filamentos de diversa naturaleza
Vacuolas y otras inclusiones de reserva o con funciones especficas.
 2.2.3. La criofactura.
La criofactura es una tcnica de microscopa electrnica utilizada para estudiar los componentes
de la membrana.
Consiste en la congelacin de la muestra, que posteriormente se fractura con una cuchilla por las
superficies que ofrecen menor resistencia. A continuacin, se sombrea con un metal y se cubre
con una fina capa de carbono para obtener una rplica, que es la que se observa al microscopio.

3. LA MEMBRANA PLASMTICA COMO UNIDAD ESTRUCTURAL.

La membrana plasmtica es una barrera que delimita el contorno de la celula separndola fsicamente
del medio externo, adems constituye uno de los componentes celulares ms importantes, ya que
regula el transporte de sustancias entre la clula y el exterior y recibe seales frente a diversos
estmulos.
La membrana tiene un espesor de 7,5 nm y posee la misma estructura en todas las clulas.
Esta organizacin es comn al resto de las membranas biolgicas limitantes de los orgnulos
celulares, por lo que se denomina unidad de membrana.
La estructura trilaminar corresponde a una bicapa lipdica con protenas embebidas. Los lpidos se
disponen en dos capas con las zonas hidrfilas hacia el exterior, mientras que las zonas hidrfobas
quedan enfrentadas hacia el interior. Las membranas presentan dos caras: una cara externa y una
cara interna, que, en la membrana plasmtica, est en contacto con el citoplasma celular. Las
protenas pueden estar asociadas a la cara interna o externa o ser transmembranales.

4. COMPOSICION DE LA MEMBRANA PLASMATICA.

La membrana est compuesta de lpidos y protenas.

4.1. Lpidos de membrana.

Los lpidos de la membrana pertenecen a 3 categoras:
Fosfolpidos Son los lpidos ms abundantes en las membranas biolgicas. Presentan una
parte hidrfila y una hidrfoba. Los fosfolpidos son, por tanto, molculas antipticas.
Glucolpidos son muy semejantes a los fosfolpidos, pero contienen carbohidratos. En las
clulas animales suelen ser derivados de esfingolpidos. En las clulas vegetales y en las
bacterias, los glucolpidos derivan de los fosfoglicridos. Se encuentran en la cara externa de la
membrana plasmtica.
Esteroles Entre ellos, el colesterol es el ms abundante en las clulas animales, mientras
que en las clulas vegetales abundan ms los fitoesteroles. Tambin se han detectado
esteroles en protistas y hongos y en bacterias desprovistas de pared celular.
Los esteroles confieren estabilidad a las membranas: las molculas rgidas se unen mediante
enlaces dbiles a los fosfolpidos.
La longitud y el grado de saturacin de los cidos grasos tambin determinan la fluidez de las
membranas.
4.2. Protenas de membrana.

Las protenas asociadas a la membrana cumplen la funcin estructural o bien pueden estar implicadas en
funciones de reconocimiento y recepcin de seales, adhesin, transporte de sustancias y metabolismo
celular. Segn su grado de asociacin a la membrana, estas protenas se clasifican en dos grupos:

Integrales presentan regiones hidrfobas, por las que se pueden asociar al interior de la
membrana, y regiones hidrfilas, que se sitan hacia el exterior. Solo pueden separarse de la
membrana si se destruye la bicapa. Dentro de este grupo existen protenas transmembranales y
protenas cuya zona hidrfila est solo asociada a la cara externa o a la cara interna de la
membrana. Algunas protenas presentan carbohidratos unidos a ellas covalentemente
(glucoprotenas) y se disponen en el lado externo de la membrana, como los glucolpidos.
Perifricas Protenas que no presentan zonas hidrfobas y que no pueden penetrar en el
interior de la membrana. Se unen a la membrana por enlaces de tipo inico y se separan de ella
con facilidad. Aparecen principalmente en la cara interna de la membrana.

Las protenas de la membrana pueden desplazarse lateralmente por ella (difusin lateral).
La composicin de los lpidos y protenas es diferente en las dos caras de la membrana. Por esta razn
se dice que las membranas son asimtricas, es decir, la estructura es diferente en sus caras interna y
externa. Esta asimetra se evidencia por procedimientos de criofractura.

5. MODELOS DE MEMBRANA.
Gorter y Grendel en 1925 fueron los primeros en proponer que las membranas biolgicas deban estar
compuestas por una bicapa lipdica.
Posteriormente, en 1935, Bavson y Danielli propusieron un modelo estructural denominado modelo de
sndwich, segn el cual la bicapa lipdica estara recubierta en ambos lados por protenas. Las protenas,
tal y como estos mismos autores plantearon podran adems, formar canales que atravesaran la bicapa.
Mas tardes se propusieron otros modelos como el de Sjstrand y Elvin, quienes consideraron que la
estructura de las membranas internas era diferente a la de la membrana plasmtica y presentaban una
estructura lipdica globular con protenas asociada a las zonas hidrfila.
Por ltimo, en 1972, Singer y Nicholson apuntaron que la membrana es una estructura fluida que permita
el movimiento de las protenas embebidas o asociadas a la bicapa lipdica. Propusieron as un
modelo,conocido como modelo del mosaico fluido.
La mayor o menor fluidez de la membrana dependa de varios factores:
1. Grado de saturacin de los cidos grasos en los lpidos de membrana. La fluidez disminuye
cuanto mayor es el grado de saturacin de los cidos grasos, dado que aumenta la rigidez de los
mismos y disminuye la libertad de movimiento dentro de la bicapa.
2. Longitud de las cadenas de los cidos grasos en los lpidos de membrana. Las membranas ricas
en cidos grasos de cadena larga son menos fluidas.
3. Temperatura. La fluidez disminuye a medida que desciende la temperatura. La membrana solo
podr mantener su fluidez si la temperatura se sita por encima del punto de fusin de sus lpidos.
4. Proporcin de colesterol. El colesterol es una molcula plana y rgida, por lo cual hace las
membranas menos flexibles y fluidas.

6. FUNCIONES DE LA MEMBRANA CELULAR.

Adems de separar el citoplasma y sus orgnulos del medio externo, la membrana plasmtica
desempea otras funciones:
 1. Produccin y control de gradientes electroqumicos. En la membrana o en las membranas de
ciertos orgnulos se encuentran las protenas que regulan el intercambio de sustancias y las
cadenas de transporte.
2. Intercambio de seales. Detecta y transmite seales con el medio externo o con otras clulas.
3. Divisin celular. Est implicada en el control y el desarrollo de la divisin celular o citocinesis1.
4. Adhesin. La membrana presenta protenas que facilitan la unin y la comunicacin entre clulas
adyacentes en organismos pluricelulares.
5. Barrera selectiva. Regula el transporte y el intercambio de sustancias entre el citoplasma y el
exterior de un modo selectivo, es decir, se trata de una membrana semipermeable.
6. Endocitosis y exocitosis. La membrana est relacionada con la captacin de partculas y con la
secrecin de sustancias al exterior (exocitosis).

7. TRANSPORTE DE MOLCULAS.
Las membranas celulares son semipermeables, porque permiten el paso de unas molculas o iones y
restringen el paso de otros:
Pueden atravesar la membrana algunas molculas apolares de pequeo tamao, molculas
polares sin carga o solubles en lpidos.
No pueden atravesar la membrana las molculas con carga, como los cidos orgnicos, los
aminocidos y otros iones. Para poder atravesarlo necesitan protenas de transporte especficas.
En relacin con el gasto energtico que requieren las protenas transportadoras, se distinguen dos tipos
de transporte: pasivo y activo.

7.1. Transporte pasivo.

Consiste en el transporte de sustancias a favor de gradiente, ya sea gradiente de concentracin o
gradiente de carga, y no requiere gasto energtico.
El transporte pasivo se puede realizar mediante:
Difusin simple las molculas atraviesan directamente la membrana.
Difusin facilitada Las molculas de mayor tamao o los iones pasan a favor de gradiente a
travs de protenas transmembranales. Las protenas de canal o canales membranosos
permiten el paso de las sustancias sin experimentar cambios conformacionales, mientras que
las protenas transportadoras o permeasas experimentan un cambio conformacional a la vez
que transportan las molculas polares o con carga.
La difusin facilitada puede presentar dos modalidades:
Uniporte si se transporta una sola sustancia
Cotransporte si se transportan simultneamente dos sustancias. Si las sustancias se
transportan hacia el mismo lado se habla de simporte, y si lo hacen en sentidos opuestos,
de antiporte.
Las protenas transportadoras presentan una alta especificidad para el transporte de un
determinado tipo de compuesto qumico. El ligando se une a sitios especficos en el exterior y
se produce entonces un cambio conformacional por el cual los lugares donde se ha unido el
ligando pasan a estar expuestos al interior de la clula.

7.2. Transporte activo.

Se define como el transporte de sustancias en contra de gradiente electroqumico o de concentracin,
para la cual se requiere un gasto energtico. Pueden distinguirse dos tipos de transporte activo:
1. Transporte activo directo la protena transportadora puede estar directamente acoplada a una
ATPasa (aporte directo de energa).
2. Transporte activo indirecto la protena transportadora puede transportar una molcula en contra
de gradiente y otra molcula a favor de gradiente (puede ser un simporte o un antiporte).

7.2.1. ATPasa de membrana.

La ATPasa es una protena transmembranal con distinta configuracin a ambos lados de la membrana.

1Citocinesis divisin del citoplasma y reparto de los orgnulos contenidos en l entre las dos
clulas hijas en la divisin celular.
 La ATPasa permite el paso de protones a favor de gradiente, el cual es utilizado para la sntesis de
ATP, por lo que tambin se denomina ATP sintasa, aunque puede actuar en sentido contrario.
La ATPasa localizada en la membrana plasmtica de las clulas eucariotas tambin est implicada en
el transporte activo de Na+ y K+: bombea Na+ al exterior y conduce K+ hacia el interior. El Na+ se
expulsa en contra de concentracin, por lo que gasta energa en forma de ATP; la entrada de K +:
tambin en contra de gradiente, esta acoplada a la salida de Na +. Esta bomba extrae tres iones Na+
por cada dos iones K+ que introduce.
Ambos tipos de transporte activo pueden acoplarse; por ejemplo, los protones son transportados hacia
el exterior por una ATPasa y el gradiente electroqumico es aprovechado por otra protena de
transporte indirecto para introducir una sustancia en contra de gradiente.
Existen unas protenas transportadoras denominadas ATPasas de tipo ABC acopladas a la hidrolisis
de ATP, con dos dominios hidrofbicos transmembranales y dos hidrofilicos perifricos. Adems de
cationes, estas ATPasas pueden transportar azucares, pptidos, polisacridos y diversas drogas que
expulsan al exterior, evitando as su efecto daino para la celula.
En las bacterias se ha descrito un tercer tipo de transporte activo: el transporte por translocacin de
grupo, en el cual la sustancia transportada se une a la protena transportadora y es liberada en el
interior de la celula. As se transfieren al interior de la celula molculas energticas, como la glucosa,
manosa y fructosa, que son fosforiladas durante el proceso.
Gracias al transporte activo se consigue mantener diferentes concentraciones intra y extracelulares de
determinadas sustancias.

8. ENDOCITOSIS Y EXOCITOSIS.
Los procesos de endocitosis y exocitosis permiten el trnsito de macromolculas o partculas de mayor
tamao a travs de la clula.
Endocitosis implica el paso de sustancias hacia el interior.
Exocitosis proceso opuesto al endocitosis, es decir, paso de sustancias y partculas desde el
interior hacia el exterior celular.
Ambos procesos suponen un gasto energtico.

8.1. Procesos de endocitosis.

En el proceso de endocitosis, la membrana plasmtica de la celula se invagina y engloba partculas del
exterior. De esta manera, se forma una vescula que pasa al interior celular.
Una vez dentro, las vesculas de endocitosis pueden seguir dos caminos:
1) Fusin con lisosomas primarios para formar vacuolas digestivas, en las que las enzimas hidrolticas
del lisosoma permiten la digestin del material.
La digestin celular origina productos que se utilizarn para el metabolismo celular y sern
aprovechados como fuentes de nutrientes y energa, as como material de desecho que ser
expulsado al exterior.
 2) Otras vesculas de endocitosis tienen como funcin el trnsito intracelular de sustancias desde un
punto a otro de la clula.

Algunas macromolculas importantes para el organismo son transportadas hacia el interior por unin a
receptores especficos situados en la membrana plasmtica. Este tipo de endocitosis se denomina
endocitosis mediada por receptor.
Los receptores estn en la cara externa de la membrana, mientras que en la cara interna se encuentra la
clatrina, una protena asociada a otros polipptidos que forma una red que recubre estas vesculas de
endocitosis. Una vez que se internaliza la vescula se pierde el revestimiento de clatrina.

8.1.1. Tipos de endocitosis.

En funcin del tamao y la naturaleza de las partculas ingeridas, la endocitosis puede ser de dos
tipos:
1. Pinocitosis Ingestin de lquidos o partculas de pequeo tamao mediante la formacin
de vesculas muy pequeas, solo visibles al microscopio electrnico. Se produce en todo tipo
de clulas.
2. Fagocitosis Ingestin de partculas de gran tamao, organismos vivos o restos celulares
que forman grandes vesculas, visibles al microscopio ptico, denominadas vesculas o
vacuolas de fagocitosis (fagosomas).

El proceso de endocitosis es caracterstico de ciertas clulas del sistema inmunitario, como los
macrfagos y neutrfilos, que ingieren partculas extraas. Tambin constituye un mecanismo de
nutricin de algunos grupos de protistas, como amebas flagelados y ciliados, que son organismos
fagtrofos.

8.2. Proceso de exocitosis.

La exocitosis implica la fusin con la membrana plasmtica de vesculas procedentes del citoplasma celular.
Las vesculas de secrecin son transportadas intracelularmente y, despus, se produce la unin a la
membrana a travs de la interaccion con elementos citoesquelticos.
Los procesos de exocitosis realizan diversas funciones:
1. Funcioes estructurales secrecin de sustancias sintetizadas en el interior de la celula cuyo destino
final es la formacin del glicocalix, la matriz celular o la pared celular vegetal, as como la formacin de
escamas, caparazones, paredes qusticas y extrusomas en diversos protistas.
2. Funciones de relacin Consisten en el intercambio de metabolitos o seales con otras clulas o con
el medio.
3. Funciones de excrecin Secrecin de los productos de desecho que se producen tras la digestin
celular de partculas ingeridas por fagocitosis. Este proceso es comn en protistas, macrfagos, y
clulas fagocitcas sanguneas.

La secrecin puede ser de dos tipos:

 1. Constitutiva se realiza de forma continua a partir de vesculas originadas en el sistema retculo
endoplasmatico- Golgi y se lleva a cabo con sustancias con funcin estructural. Por ejemplo: renovacin
de la membrana o del glicocalix.
2. Regulada Se produce en lugares localizados de la clula ante determinados estmulos externos. Es
tpica de clulas secretoras de las glndulas exocrinas o endocrinas, y tambin est implicada en la
liberacin neuronal de neurotransmisores. En este caso, como en el del endocitosis mediada por
receptor, las vesculas tambin se encuentran revestidas de clatrina.

9. DIFERENCIACIONES DE LA MEMBRANA.
En algunos tipos de clulas, la membrana plasmtica se ha especializado para cumplir distintas
funciones:
Apical: microvellosidades y estereocilios.
Basal: invaginaciones
Lateral: uniones intercelulares.

9.1. Microvellosidades.
Se trata de prolongaciones membranosas digitiformes, caractersticas de ciertas clulas animales, que
presentan filamentos de actina y otras protenas que los conectan con la membrana plasmtica. Las
microvellosidades aumentan la superficie de intercambio de la clula con el exterior y su membrana
contiene enzimas y sistemas de transporte implicados en la digestin.

9.2. Estereocilios.
Son grandes microvellosidades tpicas de las clulas de la cclea y del vestbulo del odo interno,
reforzadas en su interior por microfilamentos de actina. A pesar de su nombre, los estereocilios no estn
implicados en el movimiento de las clulas. Las vibraciones del sonido provocan movimientos en los
estereocilios y son convertidas en seales elctricas que se transmitirn hasta el cerebro.

9.3. Invaginaciones.
Las invaginaciones son repliegues de la membrana plasmtica hacia el interior celular. Un ejemplo, son
las diferenciaciones basales de las clulas epiteliales del tbulo contorneado proximal de las nefronas.

9.4. Uniones intercelulares.

Segn la funcin que desempean, las uniones intercelulares se clasifican en:
Uniones de adherencia unen entre s las membranas de las clulas que se mantienen pegadas
entre s. Se encuentran en tejidos que estn sometidos a tensiones mecnicas. Por ejemplo, los
desmosomas de las clulas de los tejidos epiteliales.
Uniones impermeables unen entre s las membranas de las clulas vecinas por medio de
protenas asociadas a elementos fibrilares que actan como una cremallera de cierre, por lo que
impiden el paso de sustancias. Por ejemplo, se encuentran en las clulas epiteliales del intestino.
Uniones comunicantes o de tipo gap unen las membranas adyacentes de las clulas de forma
ntima mediante grupos de canales proteicos, pero permiten el paso de molculas pequeas y de
impulsos elctricos. Este tipo de unin interviene en la transmisin del impulso elctrico entre
neuronas.