Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas

Facultad de Medio Ambiente y Recursos Naturales

Ingeniera Ambiental
Bioqumica 06 de Agosto de 2016

Julin David aez Cd.:20132180221 Grupo: 543

Gabriel Andrs Ramrez Cd.:20142180043
Rafael Santiago Penagos Cd.:20142180017
Marlon Herrera Cd.:20142181008

OBJETIVOS
Generales
- Comprender el papel fundamental que cumplen ciertas enzimas en la conservacin
del medio ambiente

- Conocer algunas pruebas bioqumicas especficas para identificar la enzima

papana.

- Reconocer mediante pruebas sencillas el accionar de la enzima papana y el mejor

uso que se le puede dar a esta enzima.

Especficos
- Caracterizar qumicamente la papana

- Explicar la importancia de conservacin ambiental de la papana en nuestro medio

ambiente.

- Describir las pruebas bioqumicas utilizadas para determinar y obtener la presencia

de la papana.

- Realizar pruebas (en teora) sencillas de laboratorio para detectar la presencia de

papana en muestras de origen orgnico
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La presencia de protenas en el medio ambiente tiene diferentes fuentes, tanto naturales
como la descomposicin de animales y organismos, como antrpicos de los vertimientos
industriales, emisiones atmosfricas entre otros.
Las protenas en altas concentraciones en agua o suelo son un problema ambiental ya que
stas se desnaturalizan y generan problemas como la denominada DBO-N ( Demanda
biolgica de oxigeno Nitrogenada) en donde los cuerpos de agua se ven afectadas por la
proliferacin de organismos que crecen y consumen oxigeno utilizndolo como receptor de
electrones en procesos bioqumicos y biogeoqumicos , donde usan el nitrgeno amoniacal
que se desprende de las protenas , como fuente de energa y nutriente de crecimiento; por
lo cual se hace necesaria desarrollar mtodos bioqumicos empleando degradacin
enzimtica de protenas, previamente a que las industrias y actividades domsticas las
viertan al medio ambiente alterando cuerpos hdricos y suelos.
En el presente trabajo se plantea el uso de la enzima Papana para realizar de forma efectiva
la ruptura y degradacin de protenas, como un mtodo de solucin no qumica para evitar
y solucionar en medida el problema que afecta en algunos casos los sistemas de depuracin
y tratamiento de aguas residuales.

METODOLOGA
Primera Etapa
Extraccin de papana
La papana es una enzima proteasa que se encuentran en la papaya y su funcin es romper
los enlaces peptdicos de las protenas.
1- Obtencin de Papana
a) Extraccin de papana consiste en aislar, concentrar y estabilizar la enzima.
Adems, necesitamos remover los contaminantes crticos. Luego, debe transferirse
el extracto purificado a un ambiente apropiado para conservar su calidad.
(G.Glibota)
En esta fase utiliza buffer cido ctrico-fosfato cido de sodio para concentrar la
papana en el buffer y eliminar los polisacridos en forma de precipitado. Este
buffer y la papana, debido a la afinidad cido-cido, lograrn una interaccin fsica
que permitir separar el enzima
 b) Purificacin intermedia: Se debe precipitar la mayor cantidad de enzima y remover,
adems, en la fase soluble la mayor parte de las impurezas tales como otras
protenas, cidos nucleicos y vitaminas. En los procedimientos de Biologa
Molecular, en la extraccin de protenas de las clulas se utiliza etanol o acetona.
Estos solventes, de alta resolucin, miscibles con el agua, disminuyen la solubilidad
de los enzimas que se encuentran en la solucin extrada de la fase de extraccin y
logran su precipitacin de acuerdo a la disminucin del grado de ionizacin de los
residuos del enzima. En este precipitado se encontrar dos enzimas proteolticos:
papana y quimopapana.

c) Purificacin final (Refinado): se debe lograr una alta pureza mediante la remocin
de las trazas de impurezas an presentes. Se necesita un ajuste de pH, sal o aditivos
para el almacenamiento del producto final. Se arriesga una prdida de muestra para
lograr una alta resolucin. Los estudios de purificacin de enzimas recomiendan que
se suspenda el extracto purificado de la fase anterior en un buffer y luego que la
precipitacin se lleve a cabo hasta que se alcance el punto isoelctrico. El sulfato de
amonio es la sal ms comn en este tipo de trabajos ya que es soluble en soluciones
tampn fras. Otros sustitutos son el sulfato de sodio, polietilnglicol y acetona.

Segunda Etapa
Pruebas y ensayos de actividad enzimtica
Para poder comparar la actividad enzimtica y el rendimiento de la papana se montar una
serie de ensayos y mediciones con unos sustratos complejos y otros ms especficos.
Ensayos
- Se someter las enzimas a prueba en sustratos proteicos complejos como son la
leche, la carne (Hgado), albumina de huevo.
- Se someter las enzimas a pruebas especficas en concentraciones de 5 - 10 -20 -30
y 50 % de concentracin de solucin proteica (solucin de polipptidos o
polipeptna)
La medicin en los sustratos complejos se realizara de manera cualitativa una coloracin en
placa a travs del tiempo aplicando Biuret para evidenciar el paso de la decoloracin a
travs del tiempo.
Las mediciones con el sustrato especfico sern montadas a espectrofotmetro usando
siempre un testigo cero o blanco a longitud de 420nm.
Tercera Etapa
Anlisis de actividad enzimtica y conclusin
Terminadas las mediciones se proceder a realizar las grficas para determinar la actividad
enzimtica de la papana, con lo cual se debe apreciar en funcin del tiempo y de la
absorbancia.

RESULTADOS ESPERADOS
-Extraccin papana: Extraeramos la papana a partir del ltex por procesos qumicos. Los
objetivos seran aislar, concentrar y estabilizar la enzima. Adems, necesitamos remover los
contaminantes crticos. Luego, debe transferirse el extracto purificado a un ambiente
apropiado para conservar su calidad. En esta fase, utiliza buffer cido ctrico-fosfato cido
de sodio para concentrar la papana en el buffer y eliminar los polisacridos en forma de
precipitado. Este buffer y la papana, debido a la afinidad cido-cido, lograrn una
interaccin fsica que permitir separar el enzima del ltex. (G.Glibota)
El objetivo es precipitar la mayor cantidad de enzima y remover, adems, en la fase soluble
la mayor parte de las impurezas tales como otras protenas, cidos nucleicos y vitaminas.
En la extraccin de protenas de las clulas se utiliza etanol o acetona. Estos solventes, de
alta resolucin, miscibles con el agua, disminuyen la solubilidad de los enzimas que se
encuentran en la solucin extrada de la fase de extraccin y logran su precipitacin de
acuerdo a la disminucin del grado de ionizacin de los residuos del enzima. En este
precipitado se encontrar dos enzimas proteolticos: papana y quimopapana.
Ensayo con carne: aplicada directamente sobre la carne y sometiendo a
comparacin con un ablandador comercial para carnes, se procedera a cocer ambas
piezas de carne, la que se le aplico papana y la que se le aplico ablandador
comercial.
Se esperara que por la excelente accin proteoltica de la papana sobre materia
proteica como la carne, esta demuestre mejor resultado sobre el ablandador
comercial en cuestin de blando de la carne, por la degradacin de protenas que
lleva a cabo esta enzima.

Ensayo con leche: Pasterizando la leche y agregando la papana junto con un cuajo
comercial, y comparando con una muestra de leche y cuajo comercial solamente,
podemos evidenciar la calidad superior del cuajo producido con la papana agregada
al procedimiento, teniendo el cuajo dado con la papana una forma visible ms pura
 en su color y textura adems de tener menos grasa sobrante en este proceso de
transformacin.
Esto se debe a que la papana potencia la accin proteoltica de la quimosina del
cuajo comercial, que contiene una proteasa aspartilendopeptidasa sintetizada
qumicamente para llevar a cabo la labor biolgica dada en los sistemas digestivos
de algunos mamferos que producen cuajo de forma natural en sus formas de vida
temprana.
Las grficas de (Abs vs t) nos darn cambio en absorbancia por segundo. sta pendiente
(Abs/seg) se usa para calcular la cantidad de producto que se genera por segundo. La
pendiente se calcula de la parte donde se ve la parte de ascendencia rpida, a partir del
tiempo 0. Se espera que la grfica sea una lnea creciente, debido a que la absorbancia
debera aumentar en cuanto al tiempo.

DISCUSION
- Uso de la papana dentro de la industria de alimentos
La obtencin de la papana es un proceso simple en el que se extrae el ltex de la corteza de
la papaya, luego esta se diseca y se obtiene una papana casera bastante til en
procedimientos como ablandamiento de carnes y potenciador en procesos de degradacin
de protenas, tales como la produccin de cuajo como lo examinamos en nuestro segundo
experimento.
Para cuantificar la cantidad de protena se realiz el ensayo de Lowry. En este tipo de
terminacin se usa con frecuencia la albmina de suero bovino (BSA) como estndar para
realizar una curva de calibracin. Dado que en este tipo de mtodos colorimtricos
diferentes protenas dan como resultado diferentes valores de absorbancia, es mejor utilizar
la protena de inters papana en la construccin de las curvas de calibracin
(Stoschek, 1990).
El ltex colectado al hacer incisiones en los frutos verdes de Carica papaya se mezcl con
buffer fosfato-citrato (Stoll y Blanchard, 1990) 0.02M en una proporcin 1:10 a valores de
pH, que comprendieron des del pH 3 hasta el pH 7. Para evaluar la actividad recuperada se
tom una alcuota de cada extracto y se llev a pH 6.20 para determinacin de la actividad.
La mxima actividad recuperada se produjo a pH 3.0 a las 0, 24 y 120 horas de haber
realizado la extraccin. El resultado se explica porque la papana se encuentra inactiva a pH
3.0 y no se produce la autolisis o auto digestin de la papana por la propia papana
(Greenberg y Winnick, 1940); adicionalmente a este efecto de desactivacin reversible se
suma el efecto que los iones fosfato y citrato tienen sobre la papana: favorecen la
activacin aunque esta no se encuentre al pH ptimo (Kimmel y Smith, 1954).
La papana puede ser producida de forma ms sinttica y pura en los laboratorios, como lo
hemos observado en este proyecto, esto se hace con el fin de evitar impurezas y examinar
de forma ms detallada todo el potencial que nos puede brindar esta enzima en
determinadas situaciones para degradacin de protenas.
La verdad es que de manera ms manual y rudimentaria se puede obtener una papana igual
de eficaz que la aislada en laboratorio para procesos en la industria alimentaria siendo ms
coste-eficiente que otros materiales usados en esta industria, adems de otras caractersticas
beneficiosas.
La integracin de las diversas etapas, puede permitir obtener hasta 80 g de papana a partir
de 1 kg de ltex fresco. El estimado de costos indica que la produccin de 1 kg de papana
purificada tendra un costo de US$4.241,86; el gramo de papana purificada y liofilizada se
encuentra en un rango que oscila entre US$10 y US$60, dependiendo de la pureza de la
preparacin y del uso que se le dar al producto.

CONCLUSIONES
- Como resultado de la base terica desarrollada a lo largo de este proyecto, podemos
encontrar investigaciones que avalan la utilizacin de esta enzima en acciones
concretas que tienen implicaciones medio ambientales, esto, ya que el accionar de
esta enzima en particular nos ayuda a encontrar soluciones a varios compuestos
orgnicos, en especfico, varios proteicos que se encuentran en suspensiones de
residuos, en el agua por ejemplo, y que podemos tratar con reacciones de
degradacin gracias a la papana.

La industria alimentaria, que es culpable de malversacin de recursos y, por ende,

una elevada produccin de residuos que van dirigidos en su gran mayora a formar
parte de factores de contaminacin en el medio ambiente, puede hacer un uso
adecuado de los estudios que se adelantan con una serie de enzimas, en nuestro caso
la papana, para dar un mejor uso de los desechos que producen y en una cierta
parte, mejorar procesos alimenticios con respecto a los procesos adelantados con la
papana.

Especficamente la degradacin de protenas por medio de enzimas es el tema en el

que nos enfocamos y vimos como una necesidad para futuros desarrollos que se
 plante la ciencia, ya que su contribucin al cuidado del medio ambiente se hace
evidente, con los factores desarrollados en el proyecto. Sera muy interesante ver los
alcances de la enzima papana en lo concerniente a la degradacin de compuestos
proteicos y las otras utilidades que se le puedan hacer a este compuesto como tal.

BIBLIOGRAFIA
Nitsawang, S.; Hatti-Kaul, R. et al. Purification of papain from Carica papaya
latex: Aqueous two-phase extraction versus two step salt precipitation. Enzyme
and Microbial Technology 39, 2006.
Stoschek, C. M. Quantitation of protein. Guide to protein purification 182. San
Diego: Aca demic Press, 1990.
Monti, R.; Basilio, C. A. et al. (2000). Purification of papain from fresh latex of
Carica pa pa ya. Brazilian Archives of Biology and Technology 43, 2000.
Roberts, S. M.; Turner, N. J. et al. Introduction to biocatalysis using enzymes and
micro-organisms. Cambridge: Cambridge University Press, 1995.
Stoll, V. S. y J. S. Blanchard. Buffers: Principles and practice. Methods in
Enzimology: Guide to protein purification 182. San Diego: Academic Press, 1990.
Greenberg, D. M. y T. Winnick. Plant proteases: pH-activity curves. The Journal
of Biological Chemistry 2, 1940.
Kimmel, J. R. y E. L. Smith. Crystalline papain. I. Preparation, specificity, and
activation. J. Biol Chem 207, 1954.