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MANUAL DE PRACTICAS

DE BIOQUMICA
MANUAL
DE
PRCTICAS
DE
BIOQUMICA

Dr. Ricardo Yez vila

ZZZPHGLOLEURVFRP
INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
Manual de Prcticas de Bioqumica
Dr. Ricardo Yez vila
D.R. 1996 INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
ISBN 968-7724-43-9
Primera Edicin
Impreso en Mxico
PRESENTACIN

La actividad editorial desarrollada por el Instituto


Politcnico Nacional, est encaminada al cumplimiento
de objetivos fundamentales, tales como: el abatimiento
del costo de los textos de apoyo para los planes de
estudio de las diversas carreras y disciplinas que se
cursan en la institucin, y el estmulo al profesorado para
que su esfuerzo en el campo de la investigacin tcnica
y cientfica y su experiencia en la ctedra, se plasmen
en volmenes que circulen entre el mayor nmero de
estudiantes, docentes e investigadores.
En este contexto, iniciamos la publicacin de una
nueva coleccin de libros institucionales de carcter
acadmico y costo reducido, que ofrece a los jvenes
estudiantes de los niveles medio superior y superior un
acceso ms directo hacia el conocimiento forjado en el
esfuerzo y la dedicacin de los docentes e investigadores
del propio Instituto.
Este material bibliogrfico especializado, se nutre en
parte de trabajos originales de nuestra planta de
profesores, lo que reviste la mayor importancia puesto
que adems de contemplar de forma particular los
aspectos pedaggicos especficos que desarrollan en
su prctica diaria, permite incentivarlos y demuestra que
en Mxico contamos con la suficiencia cientfico-tcnica
que nos permitir impulsar el desarrollo del pas.
Este programa editorial pretende abarcar gran parte
de las materias que integran el conjunto de planes de
estudio del Instituto y reflejar en sus publicaciones la
unificacin de esfuerzos y voluntades que, sin lugar a
dudas, repercutirn en una entusiasta aceptacin
estudiantil. Adems, se inserta en el espritu que ha
distinguido siempre al Politcnico, de realizar la
encomiable tarea de llevar el conocimiento cientfico y
tecnolgico a los sectores mayoritarios de nuestro pas.
En un periodo histrico como el que vivimos, esta
tarea reviste suma importancia, ya que se hace en
extremo urgente extender la ayuda institucional para que
nuestros educandos encuentren los apoyos que les
faciliten el continuar sus estudios profesionales, tan
necesarios para el desarrollo de la nacin.
Este proyecto editorial seguramente marcar un
nuevo rumbo en el proyecto acadmico del Instituto
Politcnico Nacional, e impactar en la educacin
tecnolgica y en el desarrollo integral del Mxico del siglo
XXI.

Didoro Guerra Rodrguez


NDICE DE PRACTICAS

Prctica: Pg.:

SOLUCIONES.................................... ................................................... 3

ELECTROLITOS y pH.......................................................................... 13

SOLUCIONES REGULADORAS ......................................................... 23

PROTENAS ........................................................................................ 30

CINTICA QUMICA Y CATLISIS....................................................... 41

ENZIMAS ............................................................................................. 51

OXIDACIONES BIOLGICAS ............................................................. 59

CIDOS NUCLEICOS.......................................................................... 68

GLCIDOS........................................................................................... 75

FENMENOS DE INTERFASE Y SISTEMAS DISPERSOS ................ 85

LPIDOS ............................................................................................... 98

DIGESTIN........................................................................................ 107

METABOLISMO .................................................................................. 115

1
SOLUCIONES

En esta prctica se estudiarn las soluciones, formas de expresar su con-


centracin y sus principales propiedades.
Se puede definir una solucin como un sistema monofsico formado por
dos o ms sustancias qumicas. Un sistema monofsico es aquel que pre-
senta las mismas propiedades fsicas y qumicas en todas sus partes. Por
ejemplo si se mezclan agua y cloruro de sodio (NaCI), el NaCI se distribuye
en el solvente (agua), hasta que la concentracin sea la misma en cual-
quier parte de la solucin, es decir hasta que se alcanza la homogeneidad.
Generalmente se acostumbra denominar soluto a la sustancia que se
disuelve o se dispersa molecularmente en otra a la cual se le denomina
solvente. Sin embargo, cuando se trata de lquidos miscibles en todas sus
proporciones, por ejemplo alcohol y agua, cualquiera de los dos puede ser
solvente o soluto. Debido a sto se acostumbra nombrar solvente al com-
ponente que se encuentra en mayor cantidad.
La relacin que existe entre las cantidades de soluto y solvente en una
solucin se llama concentracin.
Mol. Se define como el peso molecular de una sustancia expresado en
gramos, o sea; la masa de una sustancia que contiene el mismo nmero de
12
tomos o molculas que hay en 12 g de C. Experimentalmente este n-
23
mero es igual a 6.022 x 10 (nmero de Avogadro). La masa molecular o
peso molecular (P.M.) de una sustancia es la suma de los pesos atmicos
de los componentes de la sustancia; por ejemplo: P.M. del cido sulfrico
1
(H2SO4)98gmor .
Equivalente qumico (Eq). Se define segn el tipo de reaccin que se
est examinando. Para las reacciones cido-base, un equivalente de un
cido es la cantidad expresada en gramos que suministra un mol de iones
+
hidrgeno (H ); un equivalente de una base es la cantidad que reacciona
con un mol de iones hidrgeno; por ejemplo: el Eq del H2SO4 es 49 g Eq1.
Existen varias formas de expresar la concentracin de una solucin. Las
de uso ms frecuente son:
MOLARIDAD (M). Nmero de Moles de soluto en un litro de solucin. Un
mol es el peso molecular expresado en gramos.
MOLALIDAD (m). Nmero de Moles de soluto en 1000 gramos de solvente.
NORMALIDAD (N). Nmero de equivalentes qumicos de soluto en un litro
de solucin.
FRACCIN MOLAR (Xi). Nmero de moles de una sustancia en una solu-
cin, entre la suma de los moles de todos los componentes de la misma.

3
PORCENTUAL (%). Expresa el porcentaje de soluto en una solucin y exis-
ten diferentes tipos
Porciento en peso (%p/p). Nmero de gramos de soluto en 100 gramos de
solucin.
Porciento en volumen (%v/v). Nmero de mililitros de soluto en 100 mililitros
de solucin.
Porciento en peso-volumen (%p/v) Nmero de gramos de soluto en 100
mililitros de solucin.
Porciento en moles (%mol). Nmero de moles de soluto disuelto en 100
mililitros de solucin.

PROPIEDADES DE LAS SOLUCIONES

Las propiedades fsicas de las soluciones se pueden dividir en tres catego-


ras: constitutivas, aditivas y coligativas.

Propiedades constitutivas. Son aquellas que dependen exclusivamente


de la naturaleza de las molculas que la forman, es decir, de su constitu-
cin qumica (presencia de grupos funcionales, tipo y disposicin de los
tomos, etc.). Son propiedades constitutivas: El carcter cido, bsico,
oxidante, reductor, radiactivo, dulce, inspido, colorido, etc.
Propiedades aditivas. Son aquellas que dependen de la suma de las pro-
piedades correspondientes a los constituyentes de la solucin. La nica
propiedad rigurosamente aditiva es el peso molecular, ya que es igual a
la suma de los pesos de los tomos que la constituyen.
Propiedades coligativas. Son todas aquellas que dependen del nmero
de molculas por unidad de volumen o sea, de la concentracin del soluto.
Estas propiedades, muy importantes para las soluciones biolgicas son:
descenso de la presin de vapor, descenso del punto de congelacin,
elevacin del punto de ebullicin, y presin osmtica.

PARTE EXPERIMENTAL.
PREPARACIN DE DIFERENTES TIPOS DE SOLUCIONES.

EXPERIMENTO 1 a
Preparacin de una solucin 0.5M de cido actico (CH3COOH). Pre-
pare 100 mi. de una solucin de cido actico 0.5M tomando como base
para sus clculos los siguientes datos: El cido actico tiene un peso
molecular de 60, la pureza del reactivo comercial es de 99.5% y la densi-

4
fi
dad a 20 C es de 1.05 gml'.Una vez preparada consrvela para utilizarla
en el experimento No.2

1).- Describa los clculos que hizo para conocer el volumen de cido
actico concentrado que utiliz para preparar 100 mi. de dicha solucin.

2).- Al considerar que la solucin es 0.5M calcule lo siguiente:

Preparacin de una solucin de cloruro de sodio (NaCI) al 5% (p/v).

EXPERIMENTO 1b.

Utilice la cantidad que se proporciona en el sobre de NaCI con el mate-


rial, prepare una cantidad determinada de solucin de NaCI al 5% conside-
rando que la pureza del reactivo es de 100%.

1).- Describa los clculos para conocer la cantidad de agua destilada


que es necesario aadir al NaCI del sobre en cada caso para que la solu-
cin sea al 5%.

2).- Al considerar que la solucin es al 5%, calcule lo siguiente:

5
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN
DE UNA SOLUCIN POR TITULACIN.

EXPERIMENTO 2.
En este experimento se utilizar la solucin de cido actico (solucin pro-
blema) que se prepar en el experimento 1a.

En un matraz Erlenmeyer de 250 mi. se colocan 10 mi. de la solucin de


cido actico problema, midindolos con la mxima exactitud posible. Aa-
da de 3 a 5 gotas de solucin de fenolftalena y titule utilizando solucin de
hidrxido de sodio (NaOH) 0.2N. Recuerde que el punto de equivalencia se
observar cuando persista, por ms de un minuto, un ligero color rosa.
f
1).- Cuntos mi. de NaOH 0.2N gast para neutralizar los 10 mi. de la
solucin de cido actico?
R= ______________ mi.

2).- Segn los resultados que obtuvo y considerando que la solucin de


NaOH es exactamente 0.2N, Cul es la verdadera normalidad del cido
actico problema?
R= _____________

3).- Escriba el concepto de titulacin cido-base:

PROPIEDADES COLIGATIVAS DE LAS SOLUCIONES

EXPERIMENTO 3.
Elevacin del punto de ebullicin. Determine la temperatura de ebullicin
de las siguientes soluciones: NaCI 2m, NaCI 4m y H2O destilada. Deposite
20 mi. de las soluciones mencionadas en sendos vasos de precipitados de
100 mi. Caliente directamente con la llama del mechero y mida la tempera-
tura a la cual cada solucin hierve.
Determine el incremento en la temperatura de ebullicin para cada
solucin.
Calcule el valor terico de la Teb.y compare sus resultados .
Para calcular el punto terico de ebullicin se usa la formula:

Teb= Teb solvente puro + A Teb


en la cual:

6
donde:
C 1
Keb = constante ebulloscpica = 0.52 C mol kg\ m = molalidad
Fd = factor de disociacin, que para sustancias de:

dos partculas = 1.73


tres partculas = 2.35
cuatro partculas = 3.35

SOLUCIN Teb Terica Teb experimental


H2O dest.
NaCI 2m
NaCI 4m

DIFUSIN, DILISIS Y OSMOSIS

La difusin, la dilisis y la osmosis constituyen las propiedades dinmi-


cas de las soluciones.
Difusin es el proceso fsico qumico por el cual las molculas, ya sea en
estado de gas lquido, tienden a distribuirse uniformemente por todo el
espacio del que disponen formando un medio homogneo. En el caso de los
gases, la difusin est sujeta a la "Ley de la distribucin general de la ener-
ga", la cual establece que la velocidad con que se mueve una partcula es
inversamente proporcional a la raz cuadrada de su masa. En los lquidos la
velocidad de difusin es afectada por varios factores. Entre ellos tenemos:

a) naturaleza de la sustancia c) tamao y concentracin de


que difunde las partculas

b) rea de difusin d) temperatura

Graham hizo notar estos factores que influyen sobre la difusin y Fick,
de acuerdo con los mismos estableci la siguiente relacin:

V = (dm / dt) * K * Q * (dc / ds)

V = Velocidad de difusin.
K = Constante de difusin,
dm = cantidad de sustancia que difunde.
dt = tiempo que tarda en efectuarse la difusin.
de = concentracin de la sustancia que difunde.
ds = espacio que recorre la sustancia al difundir.
Q = rea de difusin

As, la velocidad de difusin es directamente proporcional al gradiente


de concentracin y al rea de seccin. A temperatura, gradiente de con-

7
centracin y rea constante, cada sustancia tiene una velocidad de difu-
sin caracterstica en relacin al peso molecular por lo que se incluye una
constante K, llamada constante de difusin.

DIFUSIN EN LQUIDOS

EXPERIMENTO 4.
Llene casi completamente una probeta con agua de la llave, enseguida
espolvoree.con un aplicador de madera, unos granitos de azul de metileno
sobre la superficie del agua y observe qu ocurre. Anote sus observaciones.
A continuacin acerque la llama del mechero a la probeta en cual-
quier punto y nuevamente observe que ocurre al aplicar calor. Anote sus
observaciones.
Una vez homogenizado el colorante, la difusin se ha efectuado.
1).- Es uniforme el descenso del colorante a travs de la columna de agua?
2).- Qu sucede si se calienta ligeramente un punto de la probeta?
3).- Qu es disolucin, conveccin y difusin?

DIFUSIN A TRAVS DE MEMBRANAS

Cuando se interpone una membrana dialtica en el sistema, la sustan-


cia sigue difundiendo dependiendo de los factores ya sealados, pero la
naturaleza de la membrana ser un factor adicional. En estos casos, K re-
cibe el nombre de constante de permeabilidad.
En 1861 Graham coloc una membrana dialtica de pergamino entre una
solucin y un solvente puro, encontr que las sustancias que difunden lo
hacen como si la membrana no existiera y esta difusin es inversamente
proporcional a su peso molecular. Las membranas dialticas son aquellas
permeables al agua y a solutos cristaloides (no a coloides) y como ejemplo
tenemos el celofn y el colodin.

DILISIS

EXPERIMENTO 5.
Humedezca un tubo de colodin o de celofn de aproximadamente
6 cm de largo por 2.5 cm de dimetro en agua destilada y cierre un extremo
atndolo con hilo. Agregele una mezcla de 1 mi de solucin de NaCI al 1%
y 10 mi de solucin de almidn al 1%.
Ate cuidadosamente el otro extremo del saco y suspndalo en un vaso de
precipitados con agua destilada. Se determinarn almidn por medio de la prue-
ba de lodo, y de cloruros con solucin de nitrato de plata, en el lquido del vaso
de precipitados que rodea al saco, a tiempo cero, a la hora y a las dos horas.

8
Despus de este tiempo repita las dos pruebas en el lquido contenido
en el saco.
a).- Ha dializado el almidn a travs de la membrana? b).-
Dializ el cloruro de sodio? c).- Explique este fenmeno

OSMOSIS Y PRESIN OSMTICA

Cuando se colocan dos soluciones de diferente concentracin, separa-


das por una membrana semipermeable, se lleva a cabo la difusin del sol-
vente de la solucin de menor concentracin a la de mayor concentracin.
De no existir una fuerza que se oponga al paso del solvente, se alcanzar
el equilibrio de concentracin por dilucin de la solucin ms concentrada
y concentracin de la ms diluida. El fenmeno, conocido como osmosis,
desarrolla una presin que se llama presin osmtica, una de las propieda-
des coligativas que tiene mayor importancia fisiolgica.
Podemos definir presin osmtica como la fuerza ejercida por una sustan-
cia disuelta en virtud del movimiento de sus molculas o bien, de la presin
necesaria para impedir el paso del solvente hacia la solucin concentrada.

Para explicar el paso del solvente de la solucin diluida a la concentra-


da se han emitido varias teoras. Termodinmicamente se considera que la
solucin diluida tiene una tendencia de escape o presin de vapor muy
grande. Esta tendencia de escape o presin de vapor es muy baja cuando
la solucin est concentrada. De aqu que est ms favorecido el paso de
solvente de la solucin ms diluida (que se concentra y disminuye su pre-
sin de vapor) hacia la solucin ms concentrada, y entre mayor sea la
concentracin mayor ser el descenso.

MEDIDA DE LA PRESIN OSMTICA. MTODO DIRECTO

EXPERIMENTO 6.
La medicin directa de la presin osmtica es posible gracias a las
membranas semipermeables artificiales hechas por Traube y utilizadas y
perfeccionadas por Pfeffer. No existe membrana semipermeable perfecta,
pero las que ms se acercan a esto son las de ferrocianuro de cobre y las
de pergamino. La elaboracin de membranas de ferrocianuro es laboriosa
por lo que en este experimento se utilizar una membrana dialtica (colodin
o celofn) que nos dar una medida aproximada de presin osmtica usando
el dispositivo llamado osmmetro.
El osmmetro consiste en un saco de colodin o celofn previamente
preparado (humedecido y atado de un extremo) lleno con una solucin pro-
blema de sacarosa 1M teida con rojo neutro. Este saco se fija a un tapn
de hule que tiene insertado un tubo capilar.

9
Una vez hecho sto, se marca el nivel de la sacarosa en el tubo capilar,
se sumerge el dispositivo en un vaso de precipitados con agua y se marca
cada 10 minutos el nivel ascendido hasta que se detenga el proceso.
Nota: cualquier error e,n el montaje del osmmetro se manifestar por la
salida de la solucin coloreada de la bolsa.
Cundo deber detenerse el proceso osmtico?

CALCULO DE LA PRESIN OSMTICA

La columna de sacarosa ejercer finalmente una presin que se opone


al paso del agua (Presin Hidrosttica),. Calculando esta presin se puede
conocer la presin osmtica, puesto que en este momento ambas presio-
nes son iguales. P.O.= P.H. Sabemos que:
P = fuerza / rea y como fuerza = masa * aceleracin entonces P = masa
* aceleracin / rea y como densidad (D) = masa / volumen de donde masa
= densidad * volumen y el volumen de un cilindro = T]V*h
2
y el rea de una circunferencia = U*r al sustituir estos valores en la
formula de presin (P) tenemos:
P = (densidad * volumen)*aceleracin/rea o P = (densidad * rea * al-
tura) * aceleracin / rea
y al simplificar nos queda que:
P.H.= densidad*altura*aceleracin o P.O.= D * h * g

Donde: r = radio del capilar


h = Altura a la que asciende la solucin de sacarosa D =
3
Densidad de la solucin (1.088 gcnr ) g = Aceleracin
2
debida a la gravedad (9.81 m s ) m = masa v =
volumen

a).- Depende slo de la altura la P.O.? Explique


b).- Influye el radio del capilar en la P.O.? Explique
c).- Al observar el saco de colodin en el seno del agua, Hay algn
indicio de que salga el contenido del saco? d).-
La sacarosa y el colorante dializan?

MINUTOS ALTURA
0
10
20
30
40
50
60

10
TONICIDAD

El estudio de la presin osmtica es una caracterstica fcil de determi-


nar en los eritrocitos; su membrana es comparable a la membrana
semipermeable ideal y el efecto del paso de agua a travs de ella es fcil-
mente observable al microscopio cuando el glbulo rojo se encuentra en
medios hipotnico hipertnico.

EXPERIMENTO 7.

En un tubo de ensaye recoja 1.5 mi. de sangre sobre 30 mg. de citrato


de sodio, diluya con 9.5 mi. de solucin de NaCI al 0.86% y homogenice.
(Esta solucin servir para todo el grupo).
Deposite una gota de la dilucin de sangre en un portaobjetos y obser-
ve al microscopio el aspecto y el tamao de los eritrocitos. Inmediatamente
despus aplique, con una pipeta Pasteur, una o dos gotas de solucin de
NaCI al 0.6% y observe.
Repita lo anterior agregando a la solucin original solucin salina al 1.2%.
Anote sus observaciones y dibuje esquemas de lo observado.

a) Cul es la solucin hipotnica, la hipertnica y la isotnica?


b) Qu cambios morfolgicos experimenta el eritrocito en cada una de
estas soluciones?
c) Qu es turgencia, y qu es plasmlisis?

PERMEABILIDAD

La permeabilidad es una propiedad intrnseca de las membranas que


se debe nicamente a la naturaleza de las mismas. Si una membrana celu-
lar se deja atravesar por una sustancia, se dice que es permeable a esa
sustancia. Los mtodos que se utilizan para el estudio de la permeabilidad
en membranas celulares pueden ser cualitativos y cuantitativos.
En los cualitativos es posible percibir la entrada de solutos a las clulas
por la aparicin de color, precipitados, cambios de color, entre otros, dentro
de ellas. Un mtodo cuantitativo para estudiar la permeabilidad de las mem-
branas es la determinacin de la velocidad de plasmlisis o de desplasmolisis
de las clulas.

11
PENETRACIN DE CIDOS Y BASES AL
INTERIOR DE LAS CLULAS

EXPERIMENTO 8.
Coloque en un portaobjetos un filamento de Spirogyra teida pre-
viamente con rojo neutro, que actuar como indicador (rojo en medio cido
y amarillo en medio alcalino).Seque la preparacin con la punta de un pa-
pel filtro y en seguida agregue dos gotas de NH4OH 0.01 N, midiendo el tiem-
po de vire. Enseguida seque la preparacin y agregue dos gotas de HCI
0.01 N, mida el tiempo de vire, comprelo con el anterior y anote sus resul-
tados:

SUSTANCIA Tiempo de vire Vire (cambio de color)


NH4OH 0.01 N
HCI 0.01 N

Cul de las dos sustancias penetr ms rpidamente a la clula y por qu?

12
ELECTROLITOS Y pH

1. ELECTROLITOS
A principios del siglo XIX el cientfico ingls Mlchael Faraday, observ
que cuando conectaba dos electrodos de material inerte a una batera y los
sumerga en una solucin acuosa de sal, se desprenda hidrgeno (H2) en
el electrodo positivo, el estudio de este fenmeno le permiti en 1834 con-
cluir que cuando una corriente elctrica circula por una solucin, hay una
transferencia de materia, una parte circula con la corriente y otra e mueve
en sentido contrario. Faraday llam a los transportadores de corriente "ione'
y denomin "nodo' al electrodo conectado con el polo positivo de la bate-
ra, y "ctodo" al conectado con el polo negativo de la batera. Los iones
que se mueven hacia el nodo los denomin aniones, y a los que migran
hacia el ctodo los llam cationes, y design "electrlisis al proceso total.

Refiri tambin a las sustancias que en solucin acuosa permiten el paso


de la corriente como "electrolito^' y a los que no manifiestan esta capaci-
dad como "no electrolito^'. A la capacidad de dar paso a la electricidad se
le conoce como "conductancia".

Los electrolitos se clasifican en fuertes y dbiles, segn su potencia para


conducir la corriente elctrica, la cual va paralela a su grado de disociacin;
sin embargo, no se encuentran definidas con exactitud las dos clases,
encontrndose todos los grados intermedios. En general se puede decir,
que las sales minerales, los hidrxidos de metales alcalinos y los cidos
minerales son electrolitos fuertes. En los lquidos del organismo encontra-
mos como ejemplos al cloruro de sodio (NaCI), cloruro de potasio (KCI),
cloruro de calcio (CaCI2), etc. La mayor parte de los compuestos orgnicos
como cidos (lctico, pirvico, etcj.compuestos nitrogenados, etc., son
electrolitos dbiles. En el agua corporal tenemos muchos ejemplos de com-
puestos no electrolitos como glucosa, urea y creatinina.

2. CONDUCTIVIDAD.
Posteriormente en 1887 Svante Arrehenius, cientfco sueco, afirm que
la conductividad de las soluciones electrolticas depende exclusivamente
de las "molculas activas" o sea de las molculas disociadas; y por lo tanto
depende del grado de disociacin y de la concentracin de los electrolitos
presentes. Entre mayor sea la concentracin mayor ser la conductividad,
hasta un lmite determinado en el cual se hace constante y luego dlsminu-

13
ye, explicndose sto porque cuando la concentracin de cationes y aniones
es grande, interfieren entre s, y en tal caso, los cationes tienen una menor
libertad para desplazarse, debido a la interaccin con los aniones cercanos
en la solucin, y visceversa. Esta explicacin se puede aprovechar para ex-
plicar la fuerza inica de una solucin, ya que al no desplazarse libremente
las partculas en la solucin, la "concentracin activa" o "actividad" de las
2
soluciones es menor que la concentracin real, por lo tanto ^i = Vz ZCZ (la
fuerza inica es la semisuma del producto de la concentracin del ion por
la valencia al cuadrado).
Se sabe que las fuerzas de atraccin, entre iones de carga opuesta dis-
1
minuye rpidamente al aumentar la distancia . En las soluciones concentra-
das, en las que los iones se encuentran ms cercanos, se hace mayor y
por lo tanto la actividad se hace menor; en las soluciones muy diluidas la
actividad y la concentracin efectiva son equivalentes entre s.

PARTE EXPERIMENTAL

Electrlisis del agua.

EXPERIMENTO 1

En un cristalizador colocar 50 mi de una solucin de NaCI al 10%, agre-


gar unas gotas de azul de timol o anaranjado de metilo como indicador y
mezclar bien, introducir en la solucin electrodos de carbn provenientes
de una fuente de energa como el Puente de Wheatstone. Observe la for-
macin de gas y los cambios de color en la solucin cercana a los electro-
dos, en el electrodo positivo se tornar amarilla, indicando la presencia de
un cido y en el electrodo negativo se tornar roja, demostrando la forma-
cin de una base.

a) Anote las reacciones que se llevan a cabo en cada uno de los electrodos
b) Esquematice el proceso de la electrlisis del agua.

Conduccin de corriente en electrolitos fuertes y dbiles.

EXPERIMENTO 2
a) Coloque solucin de NaCI al 10% en un cristalizador (en cantidad
suficiente para que tenga contacto con los electrodos en una tercera parte
de su longitud). Introduzca los electrodos de carbn provenientes de una
fuente de energa y obsrvese el paso de la corriente elctrica, manifesta-

14
do por la intensidad de luz emitida por el foco. Obsrvese tambin la inten-
sidad en relacin a la distancia a que se coloquen los electrodos.

b) Repita el experimento, empleando acetato de sodio (CH3COONa) al


10%.

Resultados:

Solucin Luminosidad
Cloruro de sodio (NaCI) al 10 %
Acetato de sodio (CH3COONa) al 10%.

Conductividad entre electrolitos dbiles y fuertes.

Para este experimento emplearemos tambin el puente de Wheatstone,


solo que en la parte de resistencias. Cuando se hace pasar una corriente
elctrica a travs de un conductor, se produce una diferencia de potencial
(E) que segn la ley de Ohm es igual al producto de la resistencia (R) por la
intensidad (I) y se puede representar como sigue:

E= I x R ...(1)

En las soluciones electrolticas el paso de corriente elctrica, depender


del grado de disociacin y de la concentracin de los electrolitos presentes.
Entre mayor sea la concentracin, mayor ser la conductividad, hasta un
lmite determinado en el cual se hace constante y luego disminuye . Para
explicar este fenmeno, Arrhenius afirma que la conductividad depende de
las "molculas activas" exclusivamente.
La conductividad de una solucin se puede medir en forma indirecta,
determinando su resistencia y utilizando el principio de Kirchoff, el cual es-
tablece que en toda red de resistencias, la suma de las cadas de tensin o
diferencia de potencial es igual a la suma de los productos de cada resis-
tencia por la intensidad de la corriente en dicha resistencia. El puente de
Wheatstone, consta de un sistema de cuatro resistencias, tres de las cua-
les son variables (previamente graduadas) y una resistencia desconocida
(resistencia de la solucin problema). Cuando se hace pasar una corriente
elctrica y el sistema no est en equilibrio, el registrador indicar una dife-
rencia de potencial. En cambio, cuando las cuatro resistencias estn en
equilibrio no habr paso de corriente. La resistencia de la solucin proble-
ma se calcula a partir de las lecturas que nos d el aparato. Ya que la
conductividad (C) es la recproca de la resistencia (R), la conductividad ser:

...(2)

15
Sin embargo, generalmente se acostumbra reportar la conductividad en
forma de "conductividad especfica", entendindose sta, por la inversa de
la resistencia especfica. Para determinar la resistencia especfica se debe
2
usar una celda con electrodos de 1 cm de seccin, separados entre s por
una distancia de 1 cm. Cuando no se cuenta con una celda de este tipo
debe calcularse la constante de la celda disponible aplicando la siguiente
frmula:

K= R x L ...(3)

despejando conductividad L= K / R ...(4)

donde:

K = Constante de la celda,
L = Conductividad especfica en mhos,
R= Resistencia en ohms

Para calcular la constante de la celda (K) se utiliza una solucin de


conductividad elctrica especfica conocida, como la de KCI 0.02N, cuya L
a 18 C = 0.002394 mhos, y se determina su resistencia (R) en la celda que
se va a utilizar. Aplicando la frmula (3) se puede calcular la conductividad
elctrica especfica de cualquier solucin, simplemente determinando su
resistencia en la celda cuya constante ya se conoce.

Comprobacin de la ley de ohm


Demostracin de la diferencia de conductividad entre
electrolitos dbiles y fuertes.

EXPERIMENTO 3
Al emplear la solucin de KCI 002 N y el dispositivo como le Indic el
maestro, determine la constante de la celda y posteriormente determine la
conductividad elctrica especfica de las soluciones de H2SO4 al 1.0 % y
CH3COOH al 1.0%, empleando la frmula indicada.

a) Compare sus resultados y concluya.

16
EXPERIMENTO 4

Efecto de la concentracin sobre la conductividad


Utilizando una solucin de KCI 0.02 N determine previamente la cons-
tante de la celda que va usar y luego proceda a determinar la conductividad
elctrica especfica de soluciones de H2SO4 al 5,10,15, 20 y 25 %, respec-
tivamente, usando el puente de Wheatstone y siguiendo las instrucciones
ya expuestas.
pH
La concentracin de iones hidrgeno, es un factor importante en una
gran variedad de procesos qumicos, pues intervienen determinando el
equilibrio inico de los electrolitos, modificando as la constitucin molecular
de las sustancias que actan entre s. Adems conviene recordar que las
propiedades de los anfoltos, y por ende de las protenas, que son los com-
ponentes fundamentales de la materia viva, dependen generalmente del pH
del medio en que se encuentran. Por ejemplo, conocemos que todas las
enzimas tienen un rango especfico de pH para su actividad.
La concentracin de iones hidrgeno en la sangre humana y dems
mamferos tiene un valor constante, el pH normal de la sangre, medido
potenciomtricamente oscila entre 7.35 y 7.45 a temperatura de 37 C.
Podra decirse que todos los fenmenos biolgicos necesitan, para su rea-
lizacin, condiciones ptimas dadas por determinados factores de los cua-
les uno de los ms importantes es, el pH.
Se sa6e que el agua pura es un mal conductor de la corriente elctrica
lo cual significa que su disociacin es muy baja. Esta se ha determinado y
se conoce que a 22 C es de 1.8 x 1016; o sea:

La concentracin molar del agua en un litro de sta se puede calcular


como: masa/ PM. Puesto que un litro de agua pesa aproximadamente un
kilogramo, es decir 1 000 g, al sustituir resulta
1
1 000 g /18 g mol = 55.5 mol

se tiene entonces que:


+ 16
[H ][HO] = [H2O](1.8x10" )
1 16 1
= (55.5mol|- )(1.8x10- molr ) = 1
14 1 2
x10 (mol ) =Kw

En el agua pura por cada ion hidrgeno existe un ion hidroxilo. Es decir,
+
que [H ] = [HO']; por tanto podemos escribir:
+ + + 2 14
[H ] [HO] = [H ] [H ] = [H+] = 1 x 10"
+ 14 1 2 7 1
[ H ] = (1 x 1Cr ) ' = 1 x 10" = 0.000 000 1 mol I [HO] =
14 1 2 7 1
(1 x 10 ) ' = 1 x 10" = 0.000000 1 mol I

17
7 7
Dicho de otro modo, existen 1 x 10 moles de iones hidrgeno y 1 x 10'
moles de iones hidroxilo por cada litro de agua pura.
Sin embargo, como resulta laborioso trabajar con potencias negativas
Srensen propuso que se usar el logaritmo decimal de la inversa de la
+
concentracin molar de iones hidrgeno (H ); para expresar la concentra-
cin del ion hidrgeno. A este valor se le da el nombre de pH, lo cual se
puede tambin expresar como el valor negativo del logaritmo decimal de la
concentracin molar de iones hidrgeno.
Del mismo modo, para expresar la concentracin de iones hidroxilo se
emplea el valor negativo del logaritmo decimal de la concentracin molar
del ion hidroxilo (HO), valor conocido como pOH.

Existen dos mtodos para medir el pH de una solucin:

1) Mtodo colorimtrico. Es el ms sencillo pero no el ms exacto. Est


basado en el uso de indicadores, comparando el color de la sustancia de
pH desconocido con el de una serie de soluciones de pH conocido. Los
indicadores de pH son, generalmente, colorantes orgnicos constituidos por
cidos o bases dbiles o sus sales, cuyas molculas no disociadas ofrecen
un color determinado, en tanto que sus molculas disociadas presentan otro
diferente. Cuando el indicador se comporta como un cido dbil se presen-
ta el equilibrio siguiente:

El color que el indicador presente depender de las proporciones rela-


tivas en que se encuentren las dos formas del mismo, lo que a su vez es
+
debido a la proporcin [ H ]/K. Pero como K es una constante propia de cada
indicador, el color depender nicamente de la concentracin de iones hi-
drgeno que existe en la solucin.
Hasta hace poco tiempo se empleaban con ms frecuencia soluciones
diluidas de los indicadores para la determinacin del pH, comparndolas
con soluciones tipo. Este mtodo tiene varios incovenientes, como los si-
guientes: se desperdicia un poco de muestra en cada determinacin, inter-
fieren la turbidez y la coloracin de las soluciones, etc. Por lo que en la
actualidad es ms frecuente el uso de estos indicadores en tiras de papel
filtro, en las cuales se encuentran adsorbidos los indicadores, stas se in-
troducen en las soluciones de pH desconocido y se compara la coloracin
obtenida con el patrn que acompaa a cada empaque.

2) Mtodo potenciomtrico. El mtodo potenciomtrico se basa en las


llamadas pilas o celdas de concentracin. Al introducir una varilla metlica
en una solucin del mismo metal se establece un equilibrio entre la llamada

18
presin de disociacin y la presin osmtica. La presin de disociacin es
la tendencia que tiene el metal a liberar iones a la solucin y la presin
osmtica tiende a fijar los iones a la barra. El equilibrio se alcanza cuando
la presin osmtica es igual a la presin de disolucin. Cuando estas dos
fuerzas son desiguales se establece una diferencia de potencial proporcio-
nal a la diferencia de concentraciones. La medicn de este potencial cons-
tituye el fundamento del mtodo potenciomtrico.

Determinacin del pH.

EXPERIMENTO 5
a) Prepare una serie de tubos de ensaye y numralos del 2 al 11
b) Coloque en cada uno 9 mi de agua hervida destilada
c) Agregue al tubo 2 de la serie, 1 mi de solucin de HCI 0.1 N y mezcle bien
d) Coloque 1 mi de esta solucin en el tubo 3
e) Repita la misma operacin con los tubos 4, 5, y 6, mezclando bien
f) El tubo 7 nicamente contendr agua destilada hervida
g) Adicione al tubo 11, 1 mi de solucin de KOH 0.01 N y mezcle bien
h) tome 1 mi de la solucin del tubo 11 y pselo al tubo 10
i) Repita la operacin con los tubos 9 y 8, mezclando bien

Al tomar en cuenta las cantidades de cido y base agregadas a cada


tubo, calcule el pH terico de toda la serie. Compruebe sus resultados por
los mtodos colorimtrico y potenciomtrico.

NOTA. Con el propsito de lograr resultados satisfactorios, extreme sus


precauciones al medir las soluciones y asegure la limpieza de los tubos y
pipetas y no agite demasiado los tubos.

Con sus resultados llene el siguiente cuadro:

No. pH pH por los mtodos colorimtrico (papel pH)


tubo terico Potenciomtrico
2
3
4
5
6.
7
8
9
10
11
I
19
Los cidos o las bases se clasifican en fuertes y dbiles segn su grado
de disociacin, as los electrolitos fuertes sern los que estn ms disocia-
+
dos y por lo tanto la concentracin molar del ion hidrgeno (H ), o del ion
hidroxilo (HO) en sus soluciones ser igual a la normalidad del cido o base
respectivamente, lo que simplifica el clculo de pH como:
+
pH = -log [H ] y pOH = -log [HO]

adems en toda solucin acuosa pH + pOH = 14

Pero en el caso de los cidos y bases dbiles; los cuales estn parcial-
mente disociados, adems de conocer la molaridad del cido o base, de-
ber conocerse el grado de disociacin de la sustancia, o sea, la constante
de disociacin acida (ka) o bsica (kb), la cual es especfica para cada sus-
tancia. En el clculo de pH o pOH se deber aplicar la frmula en la cual se
toman en cuenta la constante de disociacin respectiva y la molaridad de la
solucin (C).
1 1 1
pH = /2 pka - /2 log C y pOH = Vz pkb - /2 log C

Preparacin de soluciones de pH conocido con electrolitos


fuertes y dbiles

EXPERIMENTO 6
Empleando la frmula que corresponda, calcule tericamente las canti-
dades adecuadas para preparar 250 mi de cada una de las siguientes so-
luciones de cido clorhdrico a pH = 1.2 a 1.8; a partir de HCI al 36% de
3
pureza, densidad de 1.18 g crrr , y 250 mi de cada una de las siguientes
soluciones de cido actico a pH = 2.8, a 4.0; a partir de CH3COOH al 50 %
3
de pureza, densidad igual al 1.032 g cnr , pka = 4.74

Determine el valor de pH de cada solucin por los mtodos colorimtrico


y potenciomtrico

pH/sustancia cido clorhdrico cido actico


terico
colorimtrico
potenciomtrico

20
Acidez verdadera y acidez de titulacin

EXPERIMENTO 7
a) Determine potenciomtricamente los pH de las soluciones de HCI 0.01 N
yCH3COOH0.01 M
b) Mida exactamente 20 mi de cada solucin y colquels en sendos
matraces Erlenmeyer.
c) Adicione 2 gotas de fenolftalena y titule ambas muestras con NaOH
0.1 N
d) Anote sus resultados en el cuadro siguiente:

Solucin PH gasto de NaOH al 0.1 N


terico experimental terico experimental
HCI 0.01 N
CH3COOH 0.01 M !

Curvas de titulacin

Las curvas de titulacin se originan cuando, un cido fuerte o a un cido


dbil se le adiciona una base, produciendo la eliminacin de iones hidrge-
no. Esto nos lleva al concepto cido-base de Brnsted y Lowry, que nos
dice que, "un cido es toda sustancia que puede donar protones y una base
como toda sustancia que puede aceptar protones".

Existe otro tipo de electrolitos, muy importantes en bioqumica, que pue-


den comportarse como cidos o como bases, tal es el caso de los amino-
cidos, que se conocen como molculas anfotricas, como se demostrar
en la prxima prctica

EXPERIMENTO 8

a) Coloque 30 mi de HCI 0.1 N en un vaso de precipitados de 150 mi y


pngalo sobre el agitador magntico
b) Mida el pH de esta solucin original
c) Titule con NaOH 0.1 N como se indica en la tabla siguiente, midiendo
el pH despus de cada adicin.
d) Repita el procedimiento anterior con cido actico 0.1 N

21
mldeNaOHO.IN 30 mi de HCI 0.1 N 30mldeCH3COOH0.1 N
adicionados pH pH
0
2
3
5
5
5
5
1
1
1
1
0.5
0.5

a) Grafique los resultados obtenidos en la titulacin de cada cido.


b) Describa las diferencias entre la curva obtenida para el cido fuerte y
para el cido dbil.

22
SOLUCIONES REGULADORAS

Existen ciertas soluciones a las cuales se pueden adicionar cantidades re-


lativamente grandes de cidos o lcalis sin alterar de manera significativa
su pH. Por tal motivo se les denomina soluciones reguladoras, amortigua-
doras, buffer o tampn.
Lo que resulta evidente es que dichas soluciones tienen una accin
amortiguadora, entendindose por sta la capacidad de resistir la adicin o
prdida de iones hidrgeno o de iones hidroxilo sin que se produzca un cam-
bio acentuado en su pH. Si bien es cierto que los cidos y las bases fuertes
pueden actuar como amortiguadores, en circunstancias ordinarias la accin
amortiguadora se debe a la presencia en la solucin de un sistema forma-
do por un cido o por una base dbil y su sal correspondiente (cido-base
conjugado).
Si se toma como ejemplo una solucin que contenga un cido dbil, al
que representaremos por "HA", y su sal, representada por "BA" los iones
hidrgeno existentes en ella procedern nicamente de las molculas aci-
das, que se disocian como sigue:
+
HA o H + A-El equilibrio de la

disociacin est dado por la siguiente ecuacin:

= Ka donde: Ka es la constante de disociacin acida

De esta ecuacin se deduce que la concentracin de iones hidrgeno es:

La relacin de estas dos cantidades es, sin embargo, tan sensiblemen-


te constante en condiciones ordinarias que podemos afirmar que la con-
centracin de la base conjugada A" es igual a la concentracin de la SAL.
Sustituyendo una expresin por otra en la ecuacin anterior tenemos:

23
Si se toma el valor negativo del logaritmo decimal en ambos trminos
de la ecuacin queda as:

Ahora bien, si -log [H+] es igual a pH, por analoga podemos decir que -
log Ka es igual a pKa, por lo que:

Por otra parte, por las leyes de los logaritmos, las expresiones:

son iguales y la segunda puede reemplazar a la primera, de tal modo


que hechas todas las modificaciones la ecuacin queda finalmente como
sigue:

Esta ecuacin se conoce con el nombre de ecuacin de Henderson -


Hasselbalch y nos indica que el pH de una solucin que contenga un cido
dbil y su sal, est determinado por el valor de pKa (constante para cada
cido) y por el logaritmo del cociente que resulta de dividir la concentracin
de la sal entre la concentracin del cido. Por ejemplo, el valor de la cons-
5
tante de disociacin, Ka del cido actico es de 1.8 x 10 . El valor de su
pKa es por lo tanto igual a 4.74. Si tenemos una solucin reguladora que
posea iguales cantidades de cido actico y acetato de sodio en concen-
tracin 0.1 N, el pH de esa solucin estara dado por la ecuacin:

Adems de servir para la preparacin de soluciones de pH conocido,


las soluciones reguladoras tienen en el organismo un papel de importancia
capital que es el evitar que aumente o disminuya de manera importante la
concentracin de iones hidrgeno, ya que la vida humana es slo posible
en lmites muy estrechos de pH, es decir para la sangre arterial un pH de
7.40 y para sangre venosa y lquidos intersticiales 7.35. Este ltimo es menor
por tener ms CO2 y por lo tanto mas H2CO3 producido metablicamente.
Se sabe que los lmites mximos de pH en los que por algunos minutos,
puede permanecer el organismo sin sufrir muchas alteraciones es de 7.0 a
7.8. En los lquidos donde existen y actan al mismo tiempo varios siste-

24
mas amortiguadores, como sucede en la sangre, el cido o la base que entra
es amortiguado por todos los sistemas presentes de manera proporcional
a la eficacia de cada uno de ellos.
La regulacin fisicoqumica tiene lugar en todos los medios que contie-
nen reguladores, constituidos principalmente por cidos o bases dbiles y
=
sus sales. Por ejemplo el de fosfatos H2PCy/HP04 con un pKa2 de 7.2 (o
de 6.8 a la temperatura corporal), es el principal amortiguador intracelular.
El principal amortiguador extracelular en la sangre y lquidos intersticiales
es el sistema bicarbonato H2CO;)/ HC0'3 con un pKa, de 6.1.
Otros sistemas son los de protenas y aminocidos. En el interior del
eritrocito adems del bicarbonato el amortiguador de mayor importancia es
el de Hemoglobina reducida / Oxihernoglobinato (HHb / HbO2).
Todos estos sistemas funcionan de manera inmediata cuando existe
exceso de lcali o cido ya que un cambio del pH afecta la estructura y la
actividad de las protenas, la distribucin de otros iones entre las clulas y
el lquido extracelular, la actividad de hormonas y frmacos, etc.

PARTE EXPERIMENTAL
APRECIACIN DEL PODER REGULADOR Y EFECTO DE
LA CONCENTRACIN

EXPERIMENTO 1
Disponga 3 series de cuatro tubos de ensayo cada una. Numere los tubos
del 1 al 4. Coloque en los tubos nmero uno de cada serie 5 mi de agua
destilada hervida. En los tubos nmero 2; 5 mi de solucin de cloruro de
potasio (KCI) 0.5 M. en tanto que en los tubos nmero 3 ponga una mezcla
formada por 2 mi de solucin de fosfato dicido de potasio (KH2PO4) y 3 mi
de solucin de fosfato monocido disdico (Na2HPO4) de concentracin
0.01 M. En los tubos nmero 4 poner 2 mi de solucin KH2PO4 y 3 mi de
solucin Na2HPO4 de concentracin 0,1 M.. A continuacin, compruebe en
la serie I, que el pH de las soluciones es aproximadamente neutro, para ello
haga uso del mtodo colorimtrico empleando rojo de fenol; agregue una
gota de indicador a cada uno de los tubos de la serie y observe el color
caracterstico amarillo o rojo (pH 6.8 a 8.2).
A los cuatro tubos de la serie II, adicione una gota de verde de
bromocresol, que es un indicador de zona acida. A continuacin; agregue
10 gotas de HCI 0.01 M. al tubo nmero 1 y observe el cambio de color que
se opera (de verde a amarillo). Enseguida determine cuntas gotas de la
misma solucin de HCI es necesario agregar a los tubos 2, 3 y 4 de la serie
en cuestin, para igualar la coloracin con el tubo nmero 1.
A los cuatro tubos de la serie lll.adicione una gota de azul de timol, que
es un indicador de zona alcalina, que vira de amarillo a azul fuerte (pH 8.0
a 9.6) a continuacin; agregue 10 gotas de solucin de NaOH 0.01 M al tubo
nmero 1 y observe tambin el cambio de coloracin (de amarillo a azul).

25
Investigue cuntas gotas de la misma solucin de NaOH es necesario
agregar a los tubos nmero 2, 3, 4 de esta serie para que adquieran el
mismo color del tubo nmero 1. Ver instrucciones del cuadro siguiente:

INDICADOR: Rojo de fenol


Tubo No. 1 Tubo No. 2 Tubo No. 3 Tubo No. 4
KH2PO4 KH2PO4
KCI 0.01 M 0.1 M
SERIE I H2O 0.5 M 2 mi 2 mi
5 mi 5 mi NaaHPO4 Na2HPO4
0.01 M 0.1 M
3 mi 3 mi
INDICADOR: Verde de bromocresol
Tubo No. 1 Tubo No. 2 Tubo No. 3 Tubo No. 4
' v - KH2PO4 KH2PO4
KCI 0.01 M 0.1 M
SERIEN H2O 0.5 M 2 mi 2 mi
HCI0.01N 5,ml 5 mi Na2HPO4 Na2HPO4
0.01 M 0.1 M
3 mi 3 mi
INDICADOR: Azul de timol
Tubo No. 1 Tubo No. 2 Tubo No. 3 Tubo No. 4
KH2PO4 KH2PO4
KCI 0.01 M 0.1 M
SERIE III H2O 0.5 M 2 mi 2 mi
NaOH 0.01 N 5 mi 5 mi Na2HPO4 Na2HPO4
0.01 M 0.1 M
3 mi 3 mi

a) Qu indica el cambio de color en cada una de las series ?

b) Cmo explica usted la diferencia en las cantidades de cido y


base que hay que agregar a los tubos 2, 3 y 4 de las series
correspondientes para igualar la coloracin con el tubo 1?

26
COMPROBACIN DE LA PRESENCIA DE SISTEMAS
AMORTIGUADORES EN LQUIDOS BIOLGICOS
DETERMINACIN DEL pH DE LA ORINA HUMANA.

EXPERIMENTO 2a
Para hacer esta determinacin debe emplearse orina recin emitida,
teniendo cuidado de medir el pH lo ms rpidamente posible. Determine el
pH por el mtodo potenciomtrico.
a).- Cules son los valores normales del pH de la orina y cul es la que
obtuvo experimentalmente?

pH DE LA LECHE DE VACA.

EXPERIMENTO 2b

Mida el pH de una muestra de leche de vaca, enseguida, en un vaso de


precipitados, coloque 2 mi de leche y adicione 38 mi de agua destilada her-
vida. Determine el pH de esta dilucin.

EXPERIMENTO 2c

De la misma manera que trat la leche, haga una determinacin del pH de


una solucin de cido clorhdrico 0.1N sin diluir y despus de diluir.
Compare y analice sus resultados

Muestra pH normal pH experimental


Orina
Leche
Leche diluida

Muestra pH terico pH experimental


HCI0.1 N
HCI diluido

27
CURVAS DE TITULACIN.

Como ya mencionamos en la prctica de electrolitos y pH existen sus-


tancias de mucha importancia en bioqumica como son los aminocidos y
las protenas, que tambin poseen grupos titulables y que actan como
+
anfolitos aceptando iones H o iones OH".
En esta prctica se determinar la curva de titulacin de la glicina con
HCI y con NaOH y se har la comparacin de las curvas obtenidas en la
prctica de electrolitos y pH obtenidas con el cido fuerte y el cido dbil
para reafirmar los conceptos.

EXPERIMENTO 3

En dos vasos de precipitados de 150 mi coloque 30 mi de solucin de


glicina 0.1 N, agregue una barra magntica y colquela sobre el agitador,
determneles el pH y titule como se indica en la tabla, un vaso con NaOH
0.1 N y el otro con HCI 0.1 N.
Con los valores obtenidos hacer las grficas correspondientes, ponien-
do en las ordenadas el valor de pH y en las abscisas los mililitros gastados
de HCI y de NaOH.

Agregar HCI 30 mi Agregar NaOH 30 mi


0.1N Glicina 0.1N 0.1N Glicina 0.1 N
PH PH
0 0
2 2
3 3
5 5
5 5
5 5
5 5
1 1
1 1
1 1
1 H
0.5 0.5
0.5 0.5

Compare las curvas obtenidas para los cidos fuertes y dbiles con sta
y diga cuales son sus pKa y adems calcule el punto isoelctrico sabiendo
que:

28
PREPARACIN DE SOLUCIONES REGULADORAS

Empleando la formula de Henderson-Hasselbalch ya conocida vamos a


calcular tericamente, los volmenes necesarios para preparar soluciones
amortiguadoras y posteriormente comprobar prcticamente sus resultados.

EXPERIMENTO 4

Calcule tericamente 5 mezclas para soluciones amortiguadoras selec-


cionando volumen y valores de pH diferentes, empleando para ello cido
actico 0.1 N y acetato de sodio 0.05 N. Preprelos y compruebe sus re-
sultados con el potencimetro.

a) Explique detalladamente el procedimiento que sigui para preparar


cada mezcla.

29
PROTENAS

El nombre de protenas deriva del griego "protos" que significa "primero",


"primordial" o fundamental. Este nombre fue propuesto en 1940 por Mller
para asignar a ciertas sustancias orgnicas de extrema complejidad, son
las sustancias de mayor trascendencia en los seres vivos, ya que son qui-
z las macromolculas ms verstiles, responsables en gran parte de las
capacidades metablicas y de la morfologa de los seres vivos. Las prote-
nas son los constituyentes principales del protoplasma y las membranas
celulares, tanto de animales como de vegetales.
Las protenas contienen en su molcula C, H, O, N y en ocasiones P y
S; el nitrgeno en ellas se encuentra aproximadamente en un 16%; por
hidrlisis se desdoblan dando como producto final, alfa aminocidos, los
cuales varan en nmero, cantidad y posicin en cada protena.
Existen diferentes tipos de protenas en un organismo, cada una con
una funcin especfica; algunas son estructurales, otras actan como cata-
lizadores, hormonas, transportadores de gases, transportadoras de solutos
a travs de la membrana, de electrones, en mecanismos de defensa, me-
canismos genticos, en el mantenimiento del balance hidroelectroltico, etc.
Las diferencias entre una protena y otra se deben a: 1) el nmero total y
estructura de los aminocidos que contenga y 2) del orden o secuencia en
que estn unidos estos aminocidos. Esto quiere decir que el simple anli-
sis qumico no sirve para caracterizarlas individualmente, ya que es posible
que existan protenas que tengan el mismo peso molecular, el mismo tipo
de aminocidos y sin embargo exhiban propiedades y funciones completa-
mente diferentes. Esto se comprender si se recuerda que la estructura de
una protena esta determinada por cuatro niveles de organizacin, o nive-
les estructurales que se designan como estructura primaria, secundaria,
terciaria y cuaternaria.
La estructura primaria depende del nmero y secuencia de aminoci-
dos que se unen entre s por el enlace peptdico (-CO-NH) covalente.
La cadena polipeptdica puede enrollarse sobre si misma formando es-
tructuras helicoidales u otro tipo de conformacin, estabilizada por puentes
de hidrgeno (entre los enlaces peptdicos). Esta ordenacin espacial de la
molcula se conoce como estructura secundaria. La cadena polipeptdica
ya enrollada adopta en el espacio la conformacin ms estable, p sea, su-
fre un super enrollamiento que se designa como estructura terciaria. En la
mayora de las ocasiones una protena biolgicamente activa puede estar
constituida por ms de una cadena polipeptdica. La asociacin de estas
cadenas en el espacio para adoptar una estructura tridimensional caracte-
rstica es lo que se llama estructura cuaternaria. Tanto la estructura tercia-
ria como la cuaternaria carecen de enlaces definidos, ya que participan to-

30
dos los tipos de enlaces qumicos, fuertes o dbiles, en estos niveles es-
tructurales.
La actividad de una protena depende fundamentalmente de su confor-
macin espacial, ms que de su estructura qumica. Existe una gran canti-
dad de agentes fsicos y qumicos capaces de modificar la conformacin de
las protenas al alterar los diferentes enlaces que estabilizan las estructuras
secundaria, terciaria y cuaternaria. Estos agentes se denominan agentes
desnaturalizantes, algunos de los ms comunes son: cidos, bases,
detergentes, metales pesados, solventes orgnicos, alcaloides, calor, radia-
cin ultravioleta, rayos x, ondas ultrasnicas, sales inorgnicas, sustancias
orgnicas como urea, guanidina, agentes reductores, agentes oxidantes, etc.
Las protenas tal como existen en la naturaleza se denominan prote-
nas nativas; si se modifican por cualquiera de los agentes anteriores en su
conformacin, se transforman en protenas desnaturalizadas, las cuales
generalmente pierden su actividad, modifican su solubilidad y precipitan.

PARTE EXPERIMENTAL
ALGUNAS PROPIEDADES QUMICAS
DE LAS PROTENAS
Como ya se explic, las protenas estn formadas por aminocidos, uni-
dos por enlaces peptdicos y aunque presentan propiedades fisicoqumicas
y biolgicas caractersticas stas son reflejo de las de los aminocidos que
las constituyen. Muchas de las reacciones coloridas que se utilizan para el
anlisis de las protenas en realidad se deben a la presencia de un
aminocido especfico.

REACCIN DE MILLN

La reaccin de Milln es especfica para el grupo fenlico y por lo tanto, la


dan positiva todas las sustancias que poseen esta funcin, como el fenol, cido
saliclico, timol, tirosina y todas aquellas protenas que contengan tirosina.

EXPERIMENTO 1

Prepare una serie de 4 tubos de ensaye numerados.coloque en cada


uno, 2ml de una de las soluciones siguientes:

TUBO No Protena
1 Peptona
2 Casena
3 Gelatina
4 Albmina

31
Posteriormente aada 5 gotas del reactivo de Milln. Caliente ligeramente
hasta que la solucin hierva. PRECAUCIN! La presencia de tirosina se
pone de manifiesto por la aparicin de un precipitado blanco el cual por
accin del calor se vuelve rojo. La presencia de sales as como soluciones
muy alcalinas pueden interferir en esta reaccin.
a).- Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del captulo.
b).- Explique en qu consiste el reactivo de Milln y cual es el mecanis-
mo que se ha propuesto para esta reaccin.

REACCIN DE BIURET

Todas las molculas que contengan dos o ms uniones peptdicas, por


lo tanto todas las protenas y todos los pptidos no menores de 3 unidades,
dan positiva la reaccin de Biuret.
El nombre se debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) el cual
da positiva la prueba.
Cuando una protena o un polipptido se hacen reaccionar con sulfato
de cobre en solucin alcalina se produce un color caracterstico prpura
o violeta.
El color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los
tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Esta reaccin nos sirve para
diferenciar las protenas y pptidos de los aminocidos y su utilidad princi-
pal es la de seguir el proceso de hidrlisis proteica, la reaccin ser nega-
tiva cuando la hidrlisis sea completa.

EXPERIMENTO 2

Prepare una serie de 4tubos de ensaye numerados coloque en cada


uno 1ml de una de las siguientes

TUBO No. Protena


1 Peptona
2 Casena
3 Gelatina
4 Albmina

Aada 2 mi de solucin NaOH al 10% PRECAUCIN! y 3 a 5 gotas de


solucin de sulfato de cobre al 1%. Agite los tubos y observe la reaccin
que se produce en cada caso. La aparicin de una coloracin violeta o rosa,
en no ms de 20 minutos, debe considerarse como prueba positiva.
Esta reaccin tambin puede llevarse a cabo en base slida, colocando
unas gotas de cada solucin de prueba sobre unos cuadros de papel filtro
que previamente se han tratado con una mezcla formada por 25 mi de una
solucin de sulfato de cobre al 3% en un litro de solucin de hidrxido de
potasio al 10%.

32
a).- Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del captulo,
b).- Se puede considerar al biuret como una reaccin caracterstica para
todas las protenas? Por qu? c).-
Escriba la reaccin.

REACCIN XANTOPROTEICA

Esta reaccin se debe a la formacin de nitroderivados aromticos por


reaccin del cido ntrico sobre grupos bencnicos que poseen algunos
aminocidos como la fenilalanina, la tirosina y el triptofano. Por lo tanto, la
dan positiva todas aquellas protenas que tengan aminocidos aromticos
en su molcula.

EXPERIMENTO 3
Prepare una serie de 4 tubos de ensaye , numerados, agregue en cada
uno 2 mi de una de las siguientes soluciones:

TUBO No. Protena


1 Peptona
2 Casena
3 Gelatina
4 Albmina

Aada 1 mi de cido ntrico concentrado (HNO3), caliente ligeramente y


observe una coloracin amarilla caracterstica. Se deja enfriar esta solucin
y se aaden gotas de hidrxido de amonio (NH4OH) concentrado cuidado-
samente para estratificar. En la interase se observar un anillo naranja.

a).- Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del captulo,
b).- Se puede considerar esta reaccin general para todas las protenas?,
c).- Explique por qu se tie de amarillo la piel al contacto con el HNO3.

REACCIN DE HOPKINS-COLE

La reaccin de Hopkins-Cole es especfica para el aminocido triptofano


y el color violeta que se produce se debe a la condensacin del anillo indlico
del triptofano con el aldehido presente en el reactivo de Hopkins- Col. Esta
reaccin la darn positiva los pptidos y protenas que contengan triptofano
en su molcula.

33
EXPERIMENTO 4
Prepare una serie de 4 tubos de ensaye numerados, coloque en cada
uno 2 mi de una de las siguientes soluciones:

TUBO No. Protena


1 Peptona
2 Casena
3 Gelatina
4 Albmina

Agregue 3 mi del reactivo de Hopkins-Coe y mezcle vigorosamente.


Aada cuidadosamente resbalando por las paredes 1 mi de cido sulfrico
(H2SO4)concentrado PRECAUCIN! procurando que se formen dos capas.
Introduzca los tubos en un vaso con agua caliente y si la reaccin es posi-
tiva a los dos minutos aparecer un anillo violeta en la interfase.
a) Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del captulo.
b) Escriba la reaccin que se ha producido.

REACCIN DE AMINOCIDOS AZUFRADOS.

Los aminocidos cistina y cistena y las protenas que los contengan,


cuando se tratan con lcalis concentrados desprenden cido sulfhdrico, el
cual se puede reconocer por su olor fuertemente desagradable y caracte-
rstico, o bien, por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de plomo
(PbS).

EXPERIMENTO 5

Prepare una serie de 4 tubos de ensaye numerados, coloque en cada


uno 2 mi de una de las siguientes soluciones:

TUBO No. Protena


1 Peptona
2 Casena
3 Gelatina
4 Albmina

Agregue 2 mi de solucin de hidrxido de sodio (NaOH) al 10% PRE-


CAUCIN! caliente ligeramente. Aada a todos 0.5 mi de solucin de acetato
de plomo (Pb (CH3-COO)2). Coloque los tubos en bao mara a ebullicin
por 5 min. El oscurecimiento de la solucin o la formacin de un precipitado
negro indica la presencia de aminocidos azufrados.

34
a) Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del captulo.
b) Escriba la reaccin qumica que se ha efectuado.
c) Qu sustancias pueden interferir en esta reaccin?

REACCIN DE NINHIDRINA.

Esta es una de las reacciones mas sensibles que se conocen para iden-
tificar aminocidos en general (se puede detectar una parte de alanina en 1
500 000 partes de agua).
Por su sensibilidad esta reaccin se emplea para valoracin cuantitati-
va de aminocidos por colorimetra.
La valoracin de aminocidos en orina, por ejemplo, tiene importancia
en medicina ya que en algunas enfermedades como hepatopatas, infec-
ciones agudas o diabetes mellitus en las que se presenta hiperaminoacide-
mia se ve acompaada por hiperaminoaciduria paralela. Algunas enferme-
dades metablicas congnitas tambin dan lugar a eliminacin anormal de
algunos aminocidos en la orina.
Los aminocidos y muchas aminas primarias dan un color violeta ca-
racterstico. La prolina da coloracin amarilla.

EXPERIMENTO 6

Se utilizarn rectngulos de papel filtro Whatman No 1 ,de 2 x 2 cm, sobre


los cuales se colocarn gotas de una de las siguientes soluciones:

Cuadro de papel Sustancia


1 Glicina
2 Peptona
3 Gelatina
4 Casena
5 Albmina

PRECAUCIN! use guantes o pinzas para manipular el papel.


Anote debajo de cada muestra el nombre del compuesto y adale una
gota de solucin de ninhidrina en butanol al 0.1%.Coloque el papel en el
fi
horno a 110 C durante 5 minutos.

a)Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del captulo.


b)Escriba la reaccin qumica que se ha efectuado. c)Qu sustancias
dan positiva la reaccin de la ninhidrina, adems de las protenas,
pptidos y aminocidos?

35
TABLA DE RESULTADOS DE ALGUNAS PROPIEDADES
QUMICAS DE LAS PROTENAS

REACCIN- XANTO- HOPKINS- AMINOCIDOS


MILLN BIURET NINHIDRINA
SUSTANCIAD COLE AZUFRADOS
PROTEICA
GELATINA
PEPTONA
CASENA
ALBMINA

PROPIEDADES FISICO-QUIMICAS DE LAS PROTENAS.

Como ya se explic, muchas de las propiedades qumicas de las prote-


nas son comunes a varias especies debido a que contienen el mismo tipo
de aminocidos, por lo que es necesario estudiar sus propiedades fsicas y
biolgicas si se desea caracterizar una protena. Las propiedades fsico-
qumicas de las protenas dependen fundamentalmente del peso molecular,
de su carga elctrica neta y de la conformacin que adopte la molcula (es-
tructura 2a, 3a y 4a).

DESNATURALIZACIN DE PROTENAS

Las propiedades fsico-qumicas y biolgicas de las protenas se alte-


ran profundamente cuando se someten a la accin de agentes fsico-qu-
micos capaces de romper los diferentes enlaces que estabilizan las estruc-
turas 2a. 3a. y 4a. de las protenas. De tal forma que la estructura altamente
ordenada de una protena queda reducida al llamado polmero estadstico
formado por la cadena de aminocidos. Estos agentes pueden ser muy di-
versos y se denominan, en general, agentes desnaturalizantes. En esta
prctica se estudiarn algunos de los que se consideran ms importantes.

EFECTO DEL CALOR.

El calor es uno de los agentes primordiales de desnaturalizacin, la mayor


parte de las protenas en solucin son inestables a temperaturas superio-
res a 60 C.Las alteraciones que sufre la molcula disminuyen su solubilidad
y generalmente precipitan en forma de agregados insoluoles. Esta propie-
dad de las protenas se denomina: coagulacin.

36
EXPERIMENTO 7

Prepare una serie de 4 tubos de ensaye , numerados, coloque en cada


uno 3 mi de una de las siguientes soluciones:

TUBO Nc Protena
1 Peptona
2 Casena
3 Gelatina
4 Albmina

Adales 2 mi de NaCI al 5% . Caliente todos los tubos en bao mara


a ebullicin por 5 min. Observe cuidadosamente lo que ha ocurrido en cada
tubo y escriba:
a) sus resultados en la tabla que aparece al final del captulo.
b) Qu papel desempea el agua en el fenmeno de coagulacin?.
c) Explique la diferencia entre desnaturalizacin y coagulacin.

PRECIPITACIN DE PROTENAS POR METALES


PESADOS

Las protenas cuando se encuentran en solucin a pH superiores a su


punto isoelctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesa-
dos formando los correspondientes proteinatos insolubles.

EXPERIMENTO 8

Coloque en tubos de ensayo numerados, 1 mi de las siguientes solucio-


nes: peptona, gelatina al 2%. Aada 2 gotas de solucin de cloruro frrico
(FeCI3) al 3 %. Observe lo que sucede en cada caso y a continuacin aa-
da un exceso de FeCI3 (si no ocurre precipitacin compruebe el pH). Repita
este experimento utilizando nitrato de plata (AgNO3) cloruro mercrico
(HgCI2) y acetato bsico de plomo (Pb(CH3-COO)2) todos ai 2%.

a) Anote sus resultados en la tabla que aparece al final del captulo.

b) Tiene alguna influencia el pH en el efecto de los metales pesados


sobre las protenas ?

c) Tienen todos los metales pesados el mismo efecto precipitante so-


bre las protenas?

37
PRECIPITACIN DE PROTENAS POR EFECTO
DE CIDOS FUERTES.

Los cidos fuertes son capaces de desnaturalizar a las protenas for-


mando productos de desnaturalizacin insolubles conocidos como
metaloprotenas.

EXPERIMENTO 9a.
Coloque en tubos de ensaye numerados, 3 mi de las siguientes solucio-
nes: peptona, gelatina, casena y albmina al 2% y aada un volumen igual
de cido tricloroactico (CCI3COOH) al 5%.

a).- Anote sus resultados al final del captulo

b).- Cmo puede explicar el efecto desnaturalizante del cido tricloroactico


y, en general, de cualquier cido?

EXPERIMENTO 9b.

Prepare dos tubos de ensaye y mrquelos como "orina normal" y "orina


de paciente nefrtico", coloque en ellos 3 mi de la orina correspondiente.
Agregue en seguida, resbalando cuidadosamente por la pared del tubo para
estratificar, 2 mi de la mezcla HNCymetanol.

Observe:
a) Qu ocurre en la interase?
b)Qu explicacin le da al fenmeno?

PRECIPITACIN DE PROTENAS POR EFECTO


DE SALES.

Por regla general, las protenas en solucin son menos solubles cuan-
do se aumenta la fuerza inica y esto se puede lograr adicionando sales
solubles como el sulfato de amonio ((NH4)2SO4) Sin embargo, la concentra-
cin para precipitar diferentes protenas es variable. Esta diferencia en sen-
sibilidad se ha utilizado para separar y purificar protenas, por ejemplo las
albminas y globulinas a,b,g de la clara de huevo.

EXPERIMENTO 10.

Coloque en tubos de ensaye numerados, 2 mi de las siguientes solucio-


nes: peptona 2% y clara de huevo fresca diluida 1:2. Aada a cada tubo 2

38
mi de solucin saturada de sulfato de amonio, agitar y centrifugar a 3000
rpm durante 5 min.
Qu sustancias constituyen el precipitado? Disolver el precipitado
en 2 mi de agua destilada y hacer la prueba del biuret (utilizando
NaOH al 10% y CuSO4 al 1%) Es negativa o positiva la prueba del
biuret? Repita la prueba con un mi del sobrenadante. Qu
resultado obtuvo?
Al resto del sobrenadante agregele poco a poco sulfato de amonio
slido agitando para disolverlo en cada caso hasta que la solucin
se sature.
Se forma nuevamente precipitado y por qu? Centrifugar a 3000
rpm por 5' repetir la prueba del biuret en el precipitado y la solucin
disolviendo el precipitado en un mi de agua destilada. Qu resultado
obtuvo en ambos casos? Cul es la interpretacin y la conclusin
final con los resultados?

PRECIPITACIN POR ALCOHOL

Los alcoholes y la acetona son agentes desnaturalizantes de protenas


ya que las deshidratan al competir por el agua de solvatacin y por lo tanto
las precipitan.

EXPERIMENTO 11

Coloque en tubos de ensayo 2 mi de las siguientes soluciones: peptona,


casena, gelatina, albmina al 2%, estratificando cuidadosamente agregue
S
3 mi de alcohol de 96 y observe lo que ocurre en la interfase.
a) Observa turbidez o precipitacin en todos los tubos?
b) Anote sus resultados en la tabla:
c) Qu entiende por fuerza inica de una solucin ?
d) Mencione otras sales que se puedan utilizar para precipitar las pro
tenas.

TABLA DE RESULTADOS DE PROPIEDADES


FISICOQUMICAS DE LAS PROTENAS

AGENTES-^ CALOR Fe Hg Pb ACIDO SULFATO


TRICLORO- DE ALCOHOL
SUSTANCIASI ACETICO AMONIO
969
Peptona
Albmina
Gelatina
Casena

39
DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO

Las protenas, al igual que los aminocidos son molculas anfotricas,


es decir, pueden reaccionar con cidos o con lcalis. En medio cido las
protenas se combinan con los iones hidrgeno y quedan con carga positi-
va. En medio alcalino liberan protones y quedan con carga negativa. El pH
en el cual una protena no posee carga elctrica neta se denomina PUNTO
ISOELCTRICO, a este pH la protena presenta su mnima solubilidad y
generalmente precipita, teniendo adems una viscosidad mxima, propie-
dades que tomaremos en cuenta para el siguiente experimento.

EXPERIMENTO 12

Preparar una serie de 9 tubos de ensayo siguiendo las instrucciones de


la siguiente tabla:
Aada primero la casena, posteriormente el agua y al final el cido actico.
Agite todos los tubos y observe el grado de turbidez o la precipitacin
que se produce en cada tubo inmediatamente y despus de 15' y 30'.
a) Anote sus observaciones en la tabla, valorando con cruces.
b) Calcule el pH terico de cada tubo y antelo en la tabla, aplicando la
ecuacin de Hendersson-Hasselbalch.

No. Tubo- 1 2 3 4 5 6 7 8 9
SUSTANCIAS^
Casena 5% en 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Acetato de Sodio
0.1N
Agua Destilada 8.4 7.8 8.8 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4

Acido Actico -- --- --- -- -- --- --- --- 1.6


1N
cido Actico -- --- 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 .----
I 0.1N
Acido Actico 0.6 1.2 --- --- --- --- --- --- ---
0.01 N
pH Terico

Observacin a
los 15 min.
Observacin a
los 30 min.

40
CINTICA QUMICA Y CATLISIS
Segn la Ley de Accin de Masas, la velocidad de una reaccin qumi-
ca depende de la concentracin de las sustancias que intervienen en la
reaccin. Esta ley fue enunciada por Gldberg y Waage en 1867 y estable-
ce que: "La magnitud de una reaccin es proporcional a la masa activa de
las sustancias reaccionantes presentes en ese momento."
El trmino masa activa significa la concentracin molecular o sea, can-
tidad presente por unidad de volumen.
Si reaccionan:

La velocidad v, con que reaccionan A y B para producir C y D, depende


de la concentracin de cada reactivo y de la afinidad que tengan para reac-
cionar entre s, pero como sto se puede considerar constante, podemos
decir que:

La velocidad v2 con que reaccionan C y D para producir A y B, depende


a su vez, de la concentracin de C y D y de la afinidad. Por lo tanto pode-
mos decir tambin que:

Cuando se alcanza el equilibrio qumico, las dos velocidades son igua-


les; es decir:
v, = v2

sustituyendo estos valores por sus equivalentes, tenemos:

Como el cociente de dos constantes es siempre igual a una constante,


podemos decir que:

41
Que es la expresin matemtica de la Ley de Accin de Masas y Keq se
conoce como Constante de Equilibrio.

PARTE EXPERIMENTAL
COMPROBACIN DE LA LEY DE ACCIN DE MASAS.

EXPERIMENTO 1
En un vaso de precipitados de 500 mi de capacidad, aada 100 mi de
agua destilada, 0.5 mi de solucin de sulfocianuro de amonio (NH4SCN)0.2
M y 0.5 mi de solucin de Cloruro frrico (FeCI3 0.2 M) en HCI 0.1N mez-
clando hasta lograr la homogeneidad. Observar la aparicin de una
coloracin roja, debido a la formacin de sulfocianuro frrico(Fe(SCN)3).
En cuatro vasos de precipitados de 100 mi. de capacidad, coloque en
cada uno 25 mi de la mezcla reaccionante anterior, despus de haber agi-
tado hasta completa homogeneidad, enseguida agregue a cada vaso los
reactivos descritos en la tabla siguiente:

Reactivos- FeC 3(HCI) mi NH.SCN mi NH4CI mi


Vasoi
1 0.5 0.5
2 1.0 1.0
3 5.0
4 T E S T I G O
L

a) Escriba la reaccin qumica que se ha efectuado:


b) Observe la intensidad de la coloracin en cada vaso y segn la ley de
Accin de Masas y el Principio de Le Chetelier trate de explicar sus
resultados.

CINTICA QUMICA

El objetivo de la cintica qumica es predecir la velocidad de las reac-


ciones qumicas y describir el curso de las mismas.
La velocidad de una reaccin qumica puede medirse por varios mto-
dos. Uno de los ms utilizados consiste en tomar muestras de la mezcla
reaccionante, a un tiempo dado, suspender la reaccin y analizar los com-
ponentes de la mezcla en ese momento. Esto en ocasiones no es fcil, ya
que muchas reacciones en solucin acuosa son instantneas.

42
REACCIONES QUMICAS INSTANTNEAS

La mayor parte de los compuestos inorgnicos y muchos orgnicos que


son capaces de ionizarse en agua presentan una elevada reactividad qu-
mica por lo que solo con tcnicas de extremada sensibilidad es posible medir
la velocidad de tales reacciones.

EXPERIMENTO 2
2a.) Coloque en un tubo de ensaye 5 mi de una solucin de nitrato de
plata (AgNO3) 0.1 M y aada 1 mi de solucin de cloruro de sodio
(NaCI) al 1%. Observe la aparicin del precipitado, como resultado
de la reaccin que se efecta.
2b.) Coloque en un tubo de ensaye 5 mi de solucin de hidrxido de sodio
(NaOH) 0.1 N agregue 1 gota de solucin de fenolftalena al 0.1%
y aada finalmente 6 mi de cido clorhdrico (HCI) 0.1 N. Agite el
tubo.Observe la decoloracin que ocurre debido a la reaccin.
2c.) Coloque en un tubo de ensaye 5 mi de la solucin de cloruro frrico
(FeCI3) al 1% y aada 5 mi de solucin NaOH 0.5 N.Observe la for-
macin del floculado.

Escriba en cada caso la reaccin qumica que se ha efectuado:

2a)
2b)

2c)

En que condiciones experimentales cree que sea posible medir la ve-


locidad de estas reacciones?

VELOCIDAD DE UNA REACCIN QUMICA

Las reacciones qumicas de acuerdo a la teora del complejo activado,


por el nmero de molculas que toman parte en ellas se clasifican en:

Monomoleculares, cuando participa una sola molcula.


Ejemplo:

Bimoleculares, cuando participan dos molculas.


Ejemplo:

Trimoleculares, cuando participan tres molculas simultneamente.


Ejemplo:

43
Las reacciones trimoleculares son muy raras y reacciones de ms de
tres reaccionantes no se conocen.
Cuando se estudia la cintica de una reaccin, tiene ms importancia
conocer el orden de la reaccin que el tipo. El orden de una reaccin nos
indica la relacin entre velocidad y la concentracin de los reactivos, por lo
que se clasifican en reacciones de:

Orden Cero En estas reacciones la velocidad no es afectada por la


concentracin. Est determinada por algn otro factor
limitante como absorcin de luz, velocidad de difusin, etc.
Primer orden Son aquellas en las que, se ha demostrado experimen-
talmente, que la velocidad de reaccin es directamente
proporcional a la concentracin de una de las sustancias
reaccionantes.
Segundo orden Son aquellas en las cuales la velocidad de reaccin es
proporcional a la concentracin de dos sustancias
reaccionantes.
Tercer orden Son aquellas en las cuales la velocidad de reaccin es
proporcional a la concentracin de tres sustancias
reaccionantes.

La mayor parte de las reacciones enzimticas se caracterizan por se-


guir el modelo correspondiente a las reacciones de primer orden.

Matemticamente, la reaccin puede representarse as:


dc/dt = kc
dt = tiempo
de = concentracin del material
Kc = constante especfica de velocidad de reaccin.
Si representamos por (a) la concentracin inicial de material y por (x) la
cantidad que ha reaccionado en el tiempo (t), la expresin (a-x) significa
concentracin del material en el tiempo (t). La ecuacin anterior puede ex-
presarse en funcin de (a), (x) y (t) y al integrarla nos queda:

Cuando se ha completado la descomposicin de la mitad del material,


la ecuacin se simplifica:

44
Donde t/2 es el perodo de vida media, es decir, el tiempo necesario para
que se descomponga la mitad de una cantidad dada de material reaccionante.

DETERMINACIN DEL ORDEN DE REACCIN.


VELOCIDAD DE DESCOMPOSICIN DEL H2O2.

EXPERIMENTO 3

a) Coloque en un matraz erlenmeyer de 250mlde capacidad 5 mi de una


solucin problema de perxido de hidrgeno (H2O2) y 2 mi de cido sulfrico
(H2SO4) 1:6. Caliente la mezcla hasta casi ebullicin PRECAUCIN! y as,
en caliente, titule con una solucin de permanganato de potasio (KMnO4)
0.01 M. El punto final de la titulacin lo obsevar cuando persista un ligero
color rosa, por exceso de la solucin de permanganato.
El H2SO4, y el calentamiento tienen por objeto impedir la formacin de
MnO2. Haga esta determinacin por duplicado y si sus resultados no coin-
ciden repita el procedimiento.
b) A continuacin prepare una mezcla de 50 mi de sangre desfibrinada
al 0.06 % y 50 mi de la solucin problema de perxido de hidrgeno. A los
5, 10, 20 y 30 minutos tome alcuotas de 10 mi., trasnfiralas a un matraz
erlenmeyer de 250 mi de capacidad, aada 2 mi de solucin de H2SO41:6,
caliente a ebullicin y titule con solucin de permanganato de potasio 0.01 M,
en la forma ya explicada.
c) Escriba las reacciones qumicas que se han efectuado.
d) Resuma sus resultados en la siguiente tabla.
1
t(segundos) KMnO4 (mi) (a-x)mol I log a/a-x Kc
0
300
500
1200
1800

Para calcular la Kc a cada tiempo debe utilizar la siguiente ecuacin:

e) Determine grficamente el orden de reaccin.

45
INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA
VELOCIDAD DE UNA REACCIN QUMICA

Desde hace muchos aos se saba en forma emprica que la velocidad


de muchas reacciones aumenta cuando se eleva la temperatura. Arrhenius
encontr una relacin que expresa matemticamente la forma como la tem-
peratura afecta la velocidad de una reaccin, la cual est dada por la si-
guiente ecuacin:

La cual indica que el cambio en el logaritmo natural de la constante de


velocidad de una reaccin, es inversamente proporcional al cuadrado de la
temperatura absoluta multiplicada por la constante de los gases.

"Ea" es la "energa de activacin". Actualmente se considera que, para


que las molculas puedan reaccionar deben ser primero activadas, es de-
cir, requieren una determinada cantidad de energa.

Integrando entre lmites la ecuacin de Arrhenius nos queda:

Si consideramos que Ea = 12000 caloras al aumentar la temperatura


a B
de 22 C (295 K) a 32 C, (305 K) tendramos:

Esto quiere decir que por cada 10C de incremento, la velocidad de una
reaccin aumenta al doble. En la mayor parte de las reacciones se observa
este aumento bajo ciertas temperaturas lmites.

EXPERIMENTO 4
4a) Coloque en un matraz erlenmeyer de 250 mi de capacidad 0.25 g
de yoduro de potasio (Kl) y aada 25 mi de solucin de H2SO4 1:6. Agite
hasta disolucin completa y agregue agua destilada hasta completar 50
mi.

46
Esta solucin se denominar "solucin de cido yodhdrico (Hl)", que se
utilizar en este experimento y en el siguiente.
4b) Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mi y agregue
los reactivos segn la tabla que se muestra a continuacin:

1 2 3 4 5

Hl 5 mi 5 mi 5 mi 5 mi 5 mi
Na2S2O3 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
0.02N
Almidn 5 gotas 5 gotas 5 gotas 5 gotas 5 gotas
a S Q s s
Preincubar 5C 25 C 40 C 60 C 90 C
5 min a:
H2O2 0.2% 2 mi 2 mi 2 mi 2 mi 2 mi
tiempo de
reaccin

Deber medir con la mayor precisin posible el tiempo desde el


momento de aadir el H2O2 al 0.2 % hasta el momento en que aparece
sbitamente un color azul intenso.

a) Escriba las reacciones qumicas que se han efectuado:

b) Trace la grfica de tiempo de reaccin en las ordenadas contra


temparatura en las abscisas.

EFECTO DE LA [H+] SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA


REACCIN QUMICA

Se sabe que muchas reacciones qumicas son afectadas por el pH


del medio, sobre todo aquellas en las que participan cidos. Actualmente
se acepta que las molculas deben ser activadas antes de que puedan
reaccionar. Aparentemente el pH cido favorece la ionizacin y el estado
inico se puede considerar como un estado activado.

EXPERIMENTO 5

a) Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mi de capaci-


dad, numrelos del 1 al 5 y agregue los reactivos segn se indican en la
tabla siguiente:

47
1 2 3 4 5

Hl 5 mi 5 mi 5 mi 5 mi 5 mi
Na2S2O3 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
0.02N
Almidn 5 gotas 5 gotas 5 gotas 5 gotas 5 gotas
H20 dest. 5 mi
HCI.0.01N 5 mi
HCI0.1N 5 mi
HCI1 N 5 mi
HCI2N 5 mi
H2O20.2% 2 mi 2 mi 2 mi 2 mi 2 mi
tiempo de
reaccin

b) Segn sus resultados trace una grfica con el tiempo (en


+
segundos), en las ordenadas y [H ] en las abscisas.

Velocidad de reaccin y catalizadores

La velocidad de una reaccin qumica frecuentemente es afectada por


la presencia de "sustancias extraas" que permanecen inalteradas al ter-
minar la reaccin. Cualquier sustancia que sea capaz de acelerar una
reaccin qumica y que no sea consumida por ellas, se denomina
catalizador y el proceso se conoce con el nombre de catlisis.
La funcin de un catalizador es disminuir la energia de
activacin, por lo que las molculas son activadas con menor cantidad
de energa producindose reacciones ms rpidas. En un principio se
supuso que los catalizadores actuaban por "presencia", es decir, que no
intervenan en los procesos que catalizaban. Sin embargo, actualmente
se acepta que el catalizador se combina con el sustrato formando un
complejo intermediario inestable y altamente reactivo.

Supongamos la reaccin:

Esta reaccin, en condiciones normales se efecta muy lentamente,


pero si se agrega un catalizador "C" apropiado, tenemos:

48
Estas reacciones son rpidas y el catalizador puede ser usado una y
otra vez. Estas sustancias pueden ser de naturaleza inorgnica o bien sus-
tancias biolgicas producidas por las clulas, denominadas enzimas.

EFECTO DE UN CATALIZADOR INORGNICO


SOBRE LA VELOCIDAD DE HIDRLISIS
DE LA SACAROSA

La sacarosa es un disacrido no reductor, pero al hidrolizarse, por cada


molcula libera una molcula de glucosa y una de fructosa, ambas
reductoras. En base a esto es posible visualizar y cuantificar la hidrlisis de
la sacarosa midiendo la concentracin de azcares reductores con algn
reactivo apropiado.

EXPERIMENTO 6

Utilice dos tubos de ensaye y coloque en cada uno 5 mi de solucin de


sacarosa 0.05M. Un tubo quedar como testigo y al otro se agregarn 3
gotas de H2SO4 1:6. Se colocan ambos tubos en bao mara a ebullicin
durante 15 minutos, complete el volumen si es necesario. Emplearemos el
reactivo de Fehling para revelar la presencia de azcares reductores, por lo
que al tubo que contiene el H2SO4 se le agrega NaOH al 10% para neutra-
lizar, usando papel indicador para comprobarlo y, posteriormente se aa-
den a ambos tubos 2 mi de una mezcla del reactivo de Fehling. Debiendo
prepararse ste, al momento de usarse, de la siguiente manera:
En un tubo de ensaye se colocan 2 mi de la solucin "A" y 2 mi de la
solucin "B" del reactivo de Fehling mezclndolos perfectamente.
Una vez agregado el reactivo de Fehling a ambos tubos, se mezclan, se
colocan en bao mara a ebullicin por 5 minutos, al cabo de los cuales se
sacan del bao, se dejan enfriar y se observa si existe un precipitado rojo
de xido cuproso (Cu2O) en ambos tubos

a) Se puede considerar al H2SO4 como un catalizador?. Por qu?

EFECTO DE UN CATALIZADOR BIOLGICO (ENZIMA)


SOBRE LA VELOCIDAD DE HIDRLISIS
DE LA SACAROSA

Una de las principales diferencias entre los catalizadores inorgnicos y


las enzimas es que los primeros slo son capaces de acelerar un proceso
que ya est en marcha, mientras que las enzimas son capaces de iniciar
una nueva reaccin.

49
En este experimento emplearemos como enzima la sacarasa, tambin
conocida como invertasa o fructofuranosidasa la cual es una de las enzimas
mejor conocidas y estudiadas. Acta hidrolizando los azcares que contie-
nen fructosa. As, hidroliza la estaquiosa (tetrasacrido), la rafinosa
(trisacrido), y alcanza su mxima velocidad con la sacarosa (disacrido).Se
puede medir la hidrlisis observando el cambio en la rotacin ptica o valo-
rando el poder reductor de los productos obtenidos.

EXPERIMENTO 7

Utilice dos tubos de ensaye y coloque en cada uno 2 mi de solucin de


sacarosa 0.05 M y un mi de solucin reguladora de acetato 0.05M a pH de
4.7. Un tubo quedar como testigo y al otro se le agregan 0.2 mi de la solu-
cin de invertasa (solucin enzimtica).

Despus de mezclar bien el contenido de ambos tubos se colocan en


s
bao mara a 40 C, durante 15 minutos; cuando se ha completado el tiem-
po se les agrega, a ambos tubos, 2 mi de la solucin "A" y 2 mi de la solu-
cin "B" del reactivo de Fehling mezclndolos perfectamente. Se colocan
en bao mara a ebullicin por 5 minutos al cabo de los cuales se sacan del
bao y se dejan enfriar. Observe si existe un precipitado rojo de xido cuproso
(Cu2O) en ambos tubos

a) Compare este experimento con el anterior y explique qu sucede.

50
ENZIMAS

FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD


ENZIMATICA

La vida depende de una serie de reacciones qumicas cuyo curso y


velocidad estn determinados por la presencia de diversos catalizadores
orgnicos denominados enzimas: (del griego: en=en, zymo=fermento). La
definicin de enzimas dada por Woldschmidt y Leitz las describe como:
catalizadores producidos por las clulas pero que pueden actuar fuera
de ellas a diferencia de vitaminas y hormonas. La mayor parte de las
reacciones biolgicas seran cinticamente insignificantes si no fuera por
las enzimas.
La mayor parte de las enzimas desde el punto de vista qumico son
compuestos que pertenecen al grupo de las protenas (aunque algunas solo
funcionan asociadas a un grupo no proteico, grupo prosttico o coenzima).
Debido a su carcter protenico, las enzimas son muy sensibles a cualquier
cambio fsico, qumico o fisicoqumico. As, cualquier cambio en la tempe-
ratura, el pH, la fuerza inica, la adicin de sales, la presencia de agentes
oxidantes o reductores, la presencia de metales pesados, etc., producen
modificaciones profundas en su actividad. En general, cualquier factor que
sea capaz de desnaturalizar a las protenas ser capaz de alterar su actividad.

NATURALEZA QUMICA DE LAS ENZIMAS

Como ya se dijo, la mayor parte de las enzimas son protenas simples o


complejas. La parte protenica de las enzimas se denomina APOENZIMA;
la parte no protenica puede ser coenzima, si se separa fcilmente de la
protena. Las coenzimas pueden ser comunes a varias enzimas y no ac-
tan como catalizadores ya que se transforman en la reaccin que catalizan
y requieren de otra enzima para regenerar su actividad. La mayor parte de
las coenzimas estn relacionadas con las vitaminas. Si la parte no proteni-
ca se encuentra firmemente unida a la protena (enlace covalente) y no es
posible separarla por dilisis, se denomina grupo prosttico.
Hay varios factores que afectan la velocidad de una reaccin catalizada
por enzimas. Algunos de ellos son: temperatura, pH,concentracin de
sustrato.concentracin de enzima e inhibidores.

51
Temperatura

Las velocidades de las reacciones qumicas aumentan al incrementar


la temperatura, originando aumento en la energa cintica y en las veloci-
dades medias de las molculas con el resultado de una mayor probabilidad
de colisiones efectivas. Sin embargo, las enzimas se inactivan y desnatu-
ralizan a temperaturas elevadas. La mayor parte de las enzimas tienen una
temperatura ptima, en la cual catalizan con una velocidad mxima.

PH

La actividad de la mayora de las enzimas depende del pH, debido a la


+
participacin de iones H o de iones HO en las reacciones, adems de que
se afecta la de los grupos funcionales. La mayora de las enzimas tienen un
pH ptimo en el cual su actividad es mxima.

Concentracin de la enzima

La velocidad de una reaccin aumenta en proporcin directa a la con-


centracin de la enzima que la cataliza. La interaccin enzima-sustrato
cumple la Ley de Accin de Masas. Se emplea con frecuencia la velocidad
de una reaccin como medida de concentracin de la enzima manteniendo
fija la concentracin de sustrato.

Concentracin de sustrato

Si se trabaja con una concentracin fija de enzima la velocidad inicial


de reaccin aumenta al incrementar la concentracin del sustrato, hasta que
se alcanza un mximo y la adicin de ms sustrato ya no influye sobre la
velocidad, ya que la enzima se ha saturado.

PARTE EXPERIMENTAL
Nota: Recuerde la necesidad de lavar el material de vidrio y de enjuagar
con agua destilada.

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD


ENZIMATICA

La velocidad de cualquier reaccin cambia al modificarse la temperatu-


s
ra, debido a los cambios de energa cintica. Generalmente por cada 10 C
de cada aumento en la temperatura se duplica la velocidad, esto se conoce
como la relacin de Van't Hoff, o coeficiente de temperatura QT10=2.

52
Sin embargo, debido a la constitucin protenica de las enzimas, las
temperaturas altas producen desnaturalizacin y una marcada disminucin
en la actividad cataltica.
Para la gran mayora de enzimas de animales homotermos, la tempera-
tura ptima est alrededor de 37C; cerca de 60C. l mayor parte de las
enzimas se inactivan.

EXPERIMENTO 1.
Se prepara una serie de siete tubos como se indica:

1 2 3 4 5 6 7

Sustrato Almidn 8 mg/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5


Solucin reguladora de
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
fosfatos 0.02M pH == 7.0
Agua 5 3 3 3 3 3 3
fi B fi a a a a
Preincubar 5 minutos a: 25 5 25 40 50 60 92
Enzima (Sol. de amilasa
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
salival)*

*La solucin de amilasa salival se prepara diluyendo 0.25 mi de saliva


en 19.75 mi de H2O destilada.

Esta solucin (1:80) debe prepararse utilizando material perfectamente


limpio y usarse inmediatamente, ya que las enzimas en soluciones diluidas
se inactivan con facilidad. Conservar esta solucin en bao de hielo.
Todos los tubos se agitan muy bien y se colocan en sus respectivos baos
dejndolos durante 15 minutos al final de los cuales se les agrega, inclu-
yendo al tubo No.1 o testigo, 1ml del reactivo 3,5 dinitro saliclico (este
reactivo desarrolla un color rojo caoba en presencia de azcares reductores).
Se agitan bien y se colocan en bao mara, a ebullicin por 5 minutos, des-
pus de lo cual se enfran y se leen en el fotocolormetro Klett a 540 nm.
usando filtro verde. Se emplea el tubo No. 1 como blanco.

RESULTADOS:

Temperatura (C) 5 25 40 50 60 92
D.O.

a) Con los datos obtenidos trace una grfica anotando la densidad p


tica en las ordenadas y la temperatura en las abscisas.
b) Interprete la grfica obtenida.

53
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

El pH es uno de los factores que ms afecta la actividad de las enzimas,


ya que afecta la estabilidad de la molcula por desnaturalizacin, o bien
afecta su carga elctrica. Muchos de los grupos ionizables presentes en la
molcula de la enzima pueden ser necesarios para la catlisis y los cam-
bios de pH afectan el grado de ionizacin.
Para que se realice la unin en el complejo enzima-sustrato es necesa-
ria una adecuada distribucin de cargas en ambas molculas. El pH ptimo
es aquel en el cual ciertos grupos funcionales poseen la carga apropiada
para asegurar la formacin del complejo ES en las mejores condiciones.
Adems, como ya se mencion, los pH extremos provocan desnatura-
lizacin de la molcula enzimtica y por tanto, inactivacin de la misma.
Cada enzima posee un pH ptimo en el cual su actividad es mxima;
para la mayora de las enzimas la actividad ptima se encuentra entre los
valores de pH de 6 a 8. Sin embargo existen excepciones, por ejemplo, para
la pepsina del jugo gstrico es mxima a un pH de 1.5 que es muy cido, o
para la fosfatasa alcalina que se encuentra en huesos y otros rganos cuyo
pH ptimo es de 9.5.

EXPERIMENTO 2

Prepare una serie de 8 tubos de ensayo, siguiendo las instrucciones de


la siguiente tabla:

1 2 3 4 5 6 7 8
Sustrato (Sol. de
almidn 8mg./ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Sol. Reguladora
al pH indicado: pH=7
pH=3 4pH=5 4pH=6 4pH=7 4pH=8 4pH=9 4 H=10 4
mi:
Enzima (sol. de 5
amilasa salival) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
mi:

e
Mezclar e incubar a 40 C por 15 minutos.

Terminado este lapso se aade a todos los tubos 0.5 mi de NaOH 2N,
se agitan y se les agrega 1 mi de reactivo de cido 3,5 dinitrosaliclico.
Colquelos en un bao de agua a ebullicin durante 5 minutos, este reactivo
desarrolla un color rojo caoba en presencia de azcares reductores.

Determinar la concentracin del azcar reductor liberado, leyendo la


densidad ptica en un colormetro espectrofotmetro a 540 nm. (puede
ser necesario diluir la mezcla reaccionante 1 a 6 veces con agua destilada
antes de leer),empleando el tubo No. 1 como blanco.

54
RESULTADOS:
pH
D.O.

a).- En base a sus resultados diga Cul es el pH ptimo de la amilasa


salival?
b).- Cul es el azcar que se libera en la hidrlisis de este polisacrido?
c).- Con los datos obtenidos trace la grfica correspondiente a D.O.
contra pH. d).- Interprete la
grfica obtenida.

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LA ENZIMA Y DEL


SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIN

Actualmente se acepta que la reaccin enzimtica se efecta a travs


de la formacin de un complejo enzima-sustrato, lo cual puede represen-
tarse en forma simplificada asi:

Si [E] es la concentracin total de enzima y [ES] es la enzima combinada,


entonces [E - ES] es la concentracin de enzima libre. Recordando la Ley
de Accin de Masas, tenemos:

La velocidad de formacin (Vf) del complejo [ES] depende de v, mien-


tras que la velocidad de degradacin (Vd) depende de v2+v3. Por lo tanto en
el equilibrio tenemos:

Sustituyendo sus valores nos queda:

Dividiendo ambos miembros entre K, y [ES] nos queda:

55
La constante de Michaelis-Menten se utiliza como una medida de la afini-
dad entre la enzima y el sustrato, aunque no es propiamente la constante de
afinidad. La KM se define como la concentracin de sustrato cuando la reac-
cin adquiere la mitad de su velocidad mxima. Cuando sto sucede:

y por lo tanto, sustituyendo:

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO

Si en una reaccin enzimtica se mantiene constante la concentracin


de la enzima y todos los dems factores que puedan modificar la actividad,
se observa experimentalmente que al aumentar la concentracin del
sustrato, aumenta progresivamente la velocidad de la reaccin hasta llegar
a un mximo (velocidad mxima) despus del cual ya no se afecta la ve-
locidad aunque se utilicen concentraciones ms altas de sustrato. En algu-
nas enzimas se observa incluso una disminucin en la actividad si se au-
menta demasiado la concentracin de sustrato.
EXPERIMENTO 3

Prepare una serie de 8 tubos de ensaye como se indica en la siguiente


tabla:

1 2 3 4 5 6 7 8

Sustrato (sol. 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 7.5 0.0
almdn)8mg/ml
Sol. reguladora 0.02 7.0 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5 0.0 8.0
M.PO4 pH=7.0
Preincubar 5 minutos
Sol. enzima (amilasa 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
salival)
a
Mezclar bien e incubar a 40 C. durante 15 min.

Transcurrido este tiempo se aade a todos los tubos con objeto de


detener la reaccin enzimtica, 1 mi del reactivo del cido 3,5 Dinitrosaliclico;
calentar por 5' en bao mara a ebullicin. Enfriar y leer cada tubo en el,
fotocolormetro a 540 nm con filtro verde empleando el tubo No. 8 como
blanco.

56
RESULTADOS:
[S] mg/ml
D.O.

a) En base a sus resultados, trace la grfica correspondiente a D.O.


contra concentracin de sustrato en mg/ml
b) Determinar el valor de la KM para el sistema almidn/amilasa en es
tas condiciones.

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LA ENZIMA.

Durante mucho tiempo se pens que los catalizadores eran sustancias


que actuaban por presencia debido a que presentaban actividad a concen-
traciones muy pequeas y a que podan recuperarse inalterados al final de
la reaccin.
Sin embargo.se sabe que la velocidad de reaccin de acuerdo a Ley de
Accin de Masas, depende de su concentracin, de tal manera que la velo-
cidad es directamente proporcional a la concentracin de enzima, lo que se
expresa como:
V = K[E]

La grfica que se obtiene al expresar la velocidad de reaccin en fun-


cin de la concentracin de enzima es una recta con pendiente positiva.

EXPERIMENTO 4

Prepare una serie de 6 tubos siguiendo las indicaciones de la siguiente


tabla:

1 2 3 4 5 6
Sol.sustrato de almidn
8mg/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Sol.reguladora fosfatos
1 1 1 1 1
0.02M pH=6.9
Agua 5 4.9 4.8 4.6 4.2 3.4
a
Preincubar a 40 durante 5
minutos
Sol.enzima (amilasa
salival). 0 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6

57
Despus de mezclar el contenido de los tubos, se colocan a bao mara
9
a 40 C. por 15 minutos. Pasado este tiempo aada a cada tubo 1 mi del
reactivo de cido 3,5 dinitrosaliclico. Se colocan los tubos en bao mara
a ebullicin por 5 min. Enfriar y leer la intensidad del color como densidad
ptica en el fotocolormetro a 540 nm. (filtro verde), empleando el tubo No.1
como blanco.
RESULTADOS:

[E]ml
D.O.

a) En base a sus resultados trace una grfica con los valores de D.O.
en las ordenadas y la concentracin de enzima expresada en mi en
las abscisas.
b) Interprete la grfica obtenida.

58
OXIDACIONES BIOLGICAS
De todas las propiedades que posee un ser vivo, quiz la ms caracte-
rstica es su capacidad para utilizar y transformar la energa del medio
ambiente. Todos los procesos qumicos y fsicos que estn relacionados con
la obtencin de la energa en un ser vivo se denomina respiracin. Sin
embargo, este trmino se utiliza para designar simplemente la entrada y
salida de aire de un compartimiento a otro. Un trmino que cada da se uti-
liza ms como sinnimo bioqumico de respiracin es bioenergtica, aun-
que este trmino es ms amplio que respiracin, ya que quedan incluidos
los procesos fotosintticos.
Todos los procesos qumicos que constituyen la respiracin conducen
a la oxidacin de substancias denominadas metabolitos, hasta CO2 y H2O.
Por regla general todas las reacciones de oxidacin son reacciones
exergnicas, es decir, liberan energa cuando se efectan; en ocasiones
toda la energa se libera como calor, como ocurre cuando se quema u oxida
un pedazo de madera.
Sin embargo, un organismo viviente no es una mquina trmica y, por
tanto, debe poseer un mecanismo enzimtico que le permita capturar y al-
macenar la energa liberada en los procesos de oxidacin. La utilizacin o
captura de la energa involucra la participacin de enzimas especficas,
capaces de catalizar la conversin del ADP en ATP (reaccin endergnica).

AUMENTOS ADP + P

PROCESOS
[OJ -ENERGIA- -ENERGIA-

ENDERGONICOS

CO2 + H2O ATP

REACCIONES DE OXIDO-REDUCCION

Un compuesto qumico puede oxidarse de diferentes maneras. La oxi-


dacin tpica es aquella en la cual el oxgeno se une a un compuesto
(oxigenacin). Otra forma de oxidacin es la prdida de hidrgeno
(deshidrogenacin). Tambin se oxida un compuesto cuando pierde elec-
trones, o cuando gana valencias positivas.

59
Siempre que se efecta una oxidacin, simultneamente se efecta una
reduccin. Es decir, cuando un compuesto se oxida, otro forzosamente debe
reducirse. Como son fenmenos que ocurren simultneamente se denomi-
nan fenmenos de xido-reduccin o reacciones REDOX.

OXIDACIN POR PERDIDA DE ELECTRONES

EXPERIMENTO 1
Coloque en un matraz provisto de tapn con vlvula de Bunsen, 0.5g de
fibra de fierro (Fe) y 5 mi de H2SO4 al 10%. Caliente a ebullicin y observe
la disolucin parcial del Fe. Deje enfriar y diluya el sulfato ferroso (FeSO4)
obtenido con 50ml de agua destilada.
La vlvula ha dejado escapar el hidrgeno, pero ha impedido la entra-
da de aire evitando as la oxidacin de la sal ferrosa formada mediante la
siguiente reaccin:
0
Fe + H2SO4 => FeSO4 + H2 T

Para comprobar la presencia de sales ferrosas se coloca en una cpsula


de porcelana 1 mi de solucin de sulfato ferroso y unas gotas de
ferricianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]). La obtencin de una coloracin o pre-
cipitado azul indicar la presencia de sales ferrosas.
En otra cpsula de porcelana coloque 1 mi de la solucin de sulfato
ferroso y unas gotas de solucin de sulfocianuro de potasio (KSCN) al 0.5%.
La aparicin de un color rojo intenso indicar la presencia de sales frricas.
A continuacin se oxidar la sal ferrosa a sal frrica, para lo cual se
colocarn en un matraz erlenmeyer 10 mi de la solucin de sulfato ferroso
y 3 mi de H2SO4 al 10%, caliente a ebullicin y, en caliente, agregue gota a
gota una solucin de permanganato de potasio (KMnO4) 0.1 M hasta que
persista un color rosa plido.
Para comprobar el paso de sal ferrosa a sal frrica, repita las reaccio-
nes con ferricianuro de potasio al 0.5% y sulfocianuro de potasio 0.5%.

a) Resuma sus resultados en la siguiente tabla.

Soluciones de: K3( Fe(CN)6) KSCN


Sulfato ferroso
Sulfato Frrico

60
b) Escriba las reacciones de identificacin que se han efectuado en
cada caso.
c) Si el KMnO4 es capaz de oxidar al sulfato ferroso. Qu compuesto
se reduce?.
d) Escriba la reaccin de oxido-reduccin que se ha efectuado.

OXIDACIN POR DESHIDROGENACION

EXPERIMENTO 2

La accin de una sustancia reductora como el hidrosulfito de sodio


(NaHSO3), forma leucobases (incoloras) cuando acta sobre colorantes
(oxidados) como el azul de metileno (indicador de xido-reduccin). El
proceso inverso ( oxidacin por perdida de hidrgeno) se puede realizar
en diferente condiciones y determinar el tiempo de reaccin.
Prepare una serie de cinco tubos de ensaye y numrelos. Aada a
cada uno 5 mi de una solucin diluida de azul de metileno. A todos los
tubos agregeles gota a gota una solucin recin preparada de
hidrosulfito de sodio y cuente el nmero de gotas necesario para
decolorar completamente la solucin de azul de metileno.
El tubo nmero 1 quedar como testigo en reposo, el tubo nmero 2
se colocar en bao mara a ebullicin y se anotar el tiempo necesario
para recuperar su color azul. El tubo nmero 3 se agitar enrgicamente
a temperatura ambiente hasta que recupere su color. Al tubo nmero 4,
sin agitarlo y a temperatura ambiente, se le agregarn gotas de perxido
de hidrgeno (H2O2) al 0.4 % y finalmente, al tubo nmero 5 se le
agregarn gotas de cloruro frrico (FeCI3) al 1 % contando el nmero de
stas, necesario para reoxidar al azul de metileno.

a) Resuma sus resultados en la siguiente tabla.

2 3
1 Calor Temp. 4H2O2 5FeCI
Tubo numero: Amb.
Testig 3
Tiempo de re-oxidacin del azul
de metileno nmero de gotas:

b) Escriba la reaccin qumica que se ha efectuado en cada caso.

REACCIONES DE OXIDO-REDUCCION BIOLGICAS

La importancia del estudio de los fenmenos de oxido-reduccin en


Biologa, se debe a que la mayor parte de energa que utilizan los seres
vivos deriva de los procesos de oxidacin, considerando a la vida como
una

61
combustin constante. Es decir, desde el punto de vista qumico, la vida es
simplemente una cadena de oxidaciones y, en cada oxidacin se desprende
una determinada cantidad de energa que el organismo aprovecha para rea'
lizar las funciones vitales y para efectuar fenmenos sintticos endergnicos.
Todas las oxidaciones biolgicas se caracterizan por su rapidez y por la
suavidad con que se realizan, todas se llevan a cabo en medio acuoso, a
pH generalmente neutro y a bajas temperaturas. Esto hace pensar que to-
dos estos procesos son catalizados por enzimas.
Warburg fue uno de los primeros investigadores que trat de explicar
las oxidaciones biolgicas suponiendo una activacin del oxgeno. Comprob
que la velocidad de oxidacin de varios aminocidos era aumentada si aa-
da al sistema "carbn de sangre", pero no, si agregaba "carbn vegetal".
Posteriormente pudo comprobar que el hierro que llevaba como impureza
el carbn de sangre era el responsable de la catlisis. Su teora fue demos-
trada plenamente al lograr aislar una enzima que contiene hierro.Actualmente
se sabe que en los tejidos existe un sistema de enzimas que contienen hie-
rro, mediante el cual el oxgeno molecular se activa y acta como un agen-
te oxidante.
Wieland observ que la activacin del oxgeno era insuficiente para
explicar las oxidaciones tisulares. Consideraba que el proceso bsico en la
oxidacin de los metabolitos es la activacin del hidrgeno por la accin de
enzimas denominadas deshidrogenasas, las cuales transportan el hidrgeno
a diferentes aceptares que pueden ser el oxgeno u otros agentes oxidantes.
Szent Gyrgyi concilio las dos teoras al suponer que es necesaria la
activacin del hidrgeno y tambin la del oxgeno. Keillin supuso que inter-
viene, como eslabn intermediario, el citocromo.
Sin embargo.las oxidaciones biolgicas no son tan sencillas, pues se
ha comprobado que en la oxidacin de cada metabolito intervienen una gran
cantidad de aceptores de hidrgeno.
La glucosa es el ms comn de los metabolitos, debido a que es una
molcula altamente reducida. Cuando se oxida y pierde sus hidrgenos, la
liberacin de energa de oxidacin no se realiza en forma brusca, sino que
intervienen varios transportadores de hidrgeno, y se inicia por la accin de
una deshidrogenasa especfica que no reacciona directamente con el ox-
+
geno, sino que requiere de intermediarios como el NAD , flavoprotenas y
citocromos.
En esta prctica estudiaremos tres complejos enzimticos; dos que
actan como deshidrogenasas (LDH y DHS) y una oxidasa (citocromo-
oxidasa). Se ver tambin el efecto de los inhibidores y de cofactores que
actan sobre estas protenas con actividad cataltica. La demostracin de
la actividad de las deshidrogenasas se basa en la reduccin del azul de
metileno (aceptar de electrones), simultnea a la oxidacin del sustrato
correspondiente.

62
DESHIDROGEENASA LCTICA

EXPERIMENTO 3

Se mata una rata, se disecan los msculos de las patas traseras 8 g;


+
4 g para la enzima (LDH) y 4 g. para la coenzima (NAD ) adems se extrae
el hgado y se mantiene en hielo hasta el momento de utilizarlo en otro
experimento.

+
3a).-PREPARACION DE LA COENZIMA ( NAD )

Se colocan en un matraz erlenmeyer de 125 mi 4 g. de msculo de las


patas traseras (cortados en fragmentos pequeos) y se agrega agua desti-
lada en proporcin de 1 a 6 ; enseguida se hierve durante 5 minutos, colo-
carlos en un mortero y triturar perfectamente.
Se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 15 minutos. Recoger el sobrenadante
+
etiquetarlo como coenzima NAD y desechar el precipitado .

3b).-PREPARACIN DE LA ENZIMA DESHIDROGENASA


L C T I C A ( LD H)

En un mortero, que previamente se ha mantenido en hielo, colocar los


otros 4 g. de msculo de las patas de la rata. Triturar perfectamente agre-
gando una solucin fra de NaCI al 0.9% en proporcin de 8 mi por gramo
de tejido. Este homogenado se transfiere a un vaso de precipitados y se
deja reposar en fro durante 30 minutos.
Posteriormente centrifugar en fro a 3000 r.p.m durante 15 minutos; el
sobrenadante se recupera y se etiqueta como deshidrogenasa lctica (LDH),
el precipitado se desecha.
Para este experimento se emplea como aceptor de electrones un colo-
rante oxidado (azul de metileno), el cual al reducirse se decolora (leucobase);
esta observacin podr hacerse de manera cuantitativa.

63
DEMOSTRACIN DE LA ACTIVIDAD DE LDH

PROCEDIMIENTO: Preparar una serie de tubos como se indica a con-


tinuacin:

1 2 3 4
KCN 0.5 % 1.0 1.0 1.0 1.0
LACTATO1% 1.0 1.0 0 1.0
AZUL DE METILENO
0.002 M 0.3 0.3 0.3 0.3
AGUA DESTILADA 0 1.0 1.0 1.0
SOBRENADANTE
+
"COENZIMA NAD " 1.0 0 1.0 1.0
SOBRENADANTE
"ENZIMA LDH" 1.0 1.0 1.0 0

MEZCLAR BIEN EL CONTENIDO DE CADA TUBO.


VASELINA 0.5 0.5 0.5 | 0.5

Una vezagregada la vaselina, no agitar el contenido de los tubos e in-


a
cubar en bao mara a 37 C y hacer las observaciones en los tiempos indi-
cados; anote en el cuadro siguiente el "grado de coloracin" con "cruces"
(de una a tres).

a).- RESULTADOS

1 2 3 4

0
10
20
30

b) Explique sus resultados en base al contenido de cada tubo.

DESHIDROGENASA SUCCINICA (DHS).

La deshidrogenasa succnica cataliza la siguiente reaccin:

64
OBTENCIN DE LA FRACCIN MITOCONDRIAL DEL
HGADO DE RATN.

EXPERIMENTO 4
Cuando el tejido heptico se dispersa en soluciones isotnicas, el n-
cleo y las mitocondrias permanecen relativamente Inalterados y pueden
separarse con facilidad por centrifugacin diferencial.
A la rata recin sacrificada se le extrae el hgado y se mantiene en hielo
hasta el momento de utilizarlo. Pese el hgado obtenido y fraccinelo fina-
mente con las tijeras y prepare cuidadosamente un homogeneizado en un
mortero previamente enfriado, aadiendo 9 volmenes de cloruro de potasio
(KCI) 0.15 M fro, por cada gramo de hgado. Realice sto dentro de una
cuba de hielo para mantener la temperatura de la preparacin a 4C.
Centrifugue el homogeneizado en fro a 500 rpm por 15 minutos, separe el
sobrenadante y nuevamente centrifugue ste ahora a 3000 rpm por 15 mi-
nutos, separe el sobrenadante y consrvelo en fro anotando en la etiqueta
"SOBRENADANTE DE HGADO". El residuo se suspende en 10 mi de KCI
0.15 M y se conserva tambin en fro, anotando en la etiqueta correspon-
diente "SUSPENSIN DE HGADO"

PROCEDIMIENTO:
Prepare una serie de tubos de ensaye, numrelos y aada los reactivos
correspondientes, de acuerdo con las instrucciones de la tabla siguiente:

TUBOS No.^>
1 2 3 4 5 6
REACTIVOS EN mil
AZUL DE METILENO
0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
0.002 M
SUCCINATO DE SODIO
0.0 0.5 0.5 0.0 0.5 0.5
0.1 M
MALONATO DE SODIO
0.0 0.0 0.5 0.0 0.0 0.5
O.1 M
AGUA DESTILADA 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
SUSPENSIN DE HGADO 0.5 0.5 0.5 0.0 0.0 0.0
SOBRENADANTE DE
0.0 0.0 0.0 0.5 0.5 0.5
HGADO
MEZCLAR BIEN EL CONTENIDO DE CADA TUBO
[VASELINA | O.erTO-5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5

65
Una vez agregada la vaselina no agitar el contenido de los tubos e incu-
bar en bao mara a 37C y hacer lecturas en los tiempos sealados, anotan-
do en el siguiente cuadro el grado de coloracin, con cruces (de una a tres).

a) Resultados

1 2 3 4 5 6

0
10
20
30

b) En cul de las fracciones de hgado deben encontrarse las mitocon-


drias y por qu?
c) Describa cmo acta el malonato de sodio en esta reaccin.
d) Explique sus resultados en base al anlisis del contenido de cada tubo.

LOCALIZACION Y DEMOSTRACIN DE LA ACTIVIDAD


DE CITOCROMO-OXIDASA.

La citocromo-oxidasa es la ltima enzima de la cadena respiratoria y es


la responsable de la "activacin del oxgeno" para oxidar a los citocromos.
Tanto los citocromos como la citocromo-oxidasa son metalo protenas
(porfirinas). La citocromo-oxidasa se caracteriza por su elevada sensibili-
dad al cianuro (CN) y al monxido de carbono (CO).
En el ao de I885 Ehrlich report la reaccin del indofenol. Observ que
inyectando alfa naftol y dimetil-para -fenilendiamina en animales se forma-
ba en los tejidos una sustancia azul, llamada azul de indofenol. La enzima
se denomin indofenol-oxidasa, pero posteriormente se ha podido compro-
bar que esta enzima slo oxida al citocromo c, el que a su vez oxida al
indofenol; por lo que ahora se le conoce como citocromo- oxidasa.

EXPERIMENTO 5

Prepare una serie de tubos de ensaye y numrelos. Aada a cada uno


los reactivos de acuerdo a las instrucciones de la tabla siguiente:

66
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Sol.alfa-naftol
0.15%enetanolal 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
10%
Sol. dimetil- para
fenilen-diamina 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
0.15%
H2O 1.0 1.5 1.5 2.0 0.5 1.0 1.5 1.5 2.0 0.5
Sol. *KCN 0.01%
0.5ml = 10 gotas 0.5 0.5
Sobrenadante de
hgado 1.0 1.0 1.0 1.0
Suspensin de
hgado 1.0 1.0 1.0 1.0

* No pipetear.

Agite los tubos ocasionalmente, observe la aparicin del azul de ndofenol


y anote sus resultados en la siguiente tabla.

a)Resultados:

TUBO
No->
TIEMPO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
(mn)
0
10
20
30

b) Escriba la reaccin de formacin del azul de indofenol.


c) Explique por qu no se us vaselina en este experimento?
d) Explique sus resultados en base al anlisis del contenido de cada tubo.

67
CIDOS NUCLEICOS
Una de las principales caractersticas de un ser vivo es la forma tan orde-
nada como realiza sus funciones. El control de todos los procesos vitales
que realiza una clula, como son la transformacin de energa en sus dife-
rentes formas, la sntesis de molculas propias, la degradacin de los
metabolitos, el transporte de diferentes materiales a travs de sus mem-
branas, la formacin de nuevas clulas, la diferenciacin celular, la crea-
cin de nuevos seres, etc., se puede explicar debido a la existencia de pro-
tenas especficas, fundamentalmente las enzimas, sin embargo, es
indispensable saber cmo se producen las enzimas y cmo se controla su
produccin y su actividad. Se han descrito unas melculas presentes en
todos los seres vivos, que son las que poseen la informacin necesaria para
controlar la biosntesis de protenas y, por lo tanto, controlar todos los pro-
cesos vitales. -Ms an, rompiendo la mxima bioqumica de que "todas
las enzimas son protenas", se descubri (1982-1983) que algunos RNA
pueden funcionar como enzimas.- Estas molculas son los llamados ci-
dos nucleicos.es decir, el cido desoxirribonucleico (DNA) y el cido
ribonucleico (RNA).
Los cidos nucleicos reciben este nombre debido a que el ao de 1871,
el qumico suizo, Friedrich Miescher, logr aislar del ncleo celular una sus-
tancia que llam nuclena, la cual debido a su carcter cido se denomin
posteriormente "cido nucleico". Sin embargo, existen otros tipos de cidos
nucleicos. El cido desoxirribonucleico se encuentra fundamentalmente en
el ncleo y es el que posee la informacin gentica, trasmite esta informa-
cin al citoplasma y por ser capaz de replicarse puede trasmitir la informa-
cin de padres a hijos. En la clula normalmente existen 3 tipos de cidos
ribonucleicos, que son: el cido ribonucleico ribosomal (RNAr), el cido
ribonucleico mensajero (RNAm) y el cido ribonucleico soluble o de
trasferencia (RNAt). El RNAr se encuentra en los ribosomas y su P.M es de
2 000 000. El RNAm tiene un P.M de 300 000, se forma en el ncleo y lleva
la informacin al citoplasma. El RNAt tiene un P.M de 25 000 a 30 000 y se
encuentra disuelto en el citoplasma. El DNA es una de las biomolculas ms
grandes que se conocen hasta ahora y su peso molecular va 1.000.000 a
1000.000.000.
Tanto el DNA como el RNA se encuentran asociados con protenas fuerte-
mente bsicas (histonas o protaminas) formando las llamadas nucleoprotenas.
La estructura qumica es similar en todos los cidos nucleicos, todos estn
constituidos por bases pricas, bases pirimdicas, un azcar y un cido fosfrico.
El DNA tiene como bases pricas adenina y guanina, como bases pirimdicas
citosina y timina, como azcar la 2-desoxirribosa y cido fosfrico

68
Los cidos ribonucleicos tienen como bases pricas la adenina y guanina,
como bases pirimdicas uracilo y citosina, como azcar D-ribosa y cido
fosfrico.
Los cidos nucleicos son macrornolculas formadas por la unin de
varios nucletidos. Un nucletido se puede considerar como un ster
fosfrico de un nuclesido, que es la unin de una base prica o pirimdica
con un azcar. Los mononucletidos se unen entre s por medio de un en-
lace fosfodister 3'- 5', formando los polinucletidos.

En esta prctica se aislar DNA de bazo y se estudiarn algunas de las


principales propiedades tanto del DNA como del RNA.

PARTE EXPERIMENTAL

OBTENCION DE DNA DE BAZO.

Cuando se desea purificar una sustancia se deben seleccionar las clu-


las o tejidos que se van a utilizar como materia prima. En el caso de DNA
esta seleccin es en especial importante porque el contenido del DNA es
pequeo en la mayor parte de las clulas. La clula ideal es aquella que
tenga una relacin ncleo/citoplasma alta, como en los linfocitos y clulas
del tumor asctico de Ehrlich. Sin embargo, no es fcil obtener este tipo de
clulas, por lo que, frecuentemente se usan rganos tpicamente linfoides,
como el timo y el bazo.
El primer paso en la extraccin de DNA es la homogeneizacin del te-
jido. Este paso puede degradar en parte, la molcula del DNA si no se to-
man las precauciones necesarias, aunque en este experimento la degra-
dacin no es importante. La solucin reguladora es de citrato 0.01 M y NaCI
0.14M, el pH 7.2 - 7.4; la fuerza inica de esta solucin hace insoluble a la
desoxirribonucleoprotena. Si se centrifuga este homogeneizado, en el se-
dimento quedarn los residuos celulares y las desoxirribonucleoprotenas
insolubles. En el sobrenadante se escontrarn todos los compuestos solu-
bles, entre ellas la mayor parte de los cidos ribonucleicos.
Al homogenizar el tejido se liberan varias enzimas de los lisozomas, entre
ellas la DNAasa, la cual es capaz de destruir por despolimerizacin el DNA.
++
Se sabe que el Mg es indispensable para la actividad de esta enzima:si
++
en la solucin existe citrato, ste se une al Mg e impide la accin de la
DNAasa. Otra forma de evitar la accin hidroltica de la enzima es trabajar
a temperaturas bajas (0 a 2C).
El siguiente paso en la purificacin est basado en que las desoxirribo-
nucleoprotenas y el DNA son solubles en soluciones salinas concentradas,
mientras que la mayor parte de las protenas precipitan en estas condicio-
nes. Si el residuo se suspende en solucin cte NaCI 2.6M y se centrifuga, el
residuo insoluble estar formado fundamentalmente por protenas, mien-

69
tras que el DNA permanecer en solucin. Este DNA se puede precipitar
selectivamente por la adicin de 2 volmenes de alcohol etlico al 95% for-
mndose un precipitado blanco fibroso, el cual se puede recoger por rota-
cin de un agitador de vidrio con pequeas salientes.

EXPERIMENTO 1.

Se utilizar en este experimento bazo, el cual debe recolectarse inmedia-


tamente despus de la muerte del animal y colocarse en una solucin
reguladora de citrato 0.01 M - NaCI 0.14M pH 7.2 heleda. Despus de 30
minutos se corta en pedazos de aproximadamente 3 cm., se congela a -20C
y se mantiene en esas condiciones hasta el momento de iniciar la extraccin.

Nota: Antes de iniciar la homogeneizacin compruebe que las solucio-


nes de citratos - y NaCI estn fras y consrvelas en bao de hielo a tempe-
Q
ratura de 2 C durante el experimento.

Tome una muestra del bazo congelado y anote su peso exacto (10-15 g).
Coloque aproximadamente 150 mi de la solucin reguladora de citrato 0.01 M
NaCI 0.14M, pH 7.2 fra, en una licuadora cuyo vaso haya sido previamente
enfriado. Haga funcionar la licuadora a baja velocidad y vaya aadiendo los
trozos de bazo congelado uno a uno, esperando a que se macere completa-
mente el primero antes de aadir el segundo y asi sucesivamente. Una vez
terminada la adicin contine homogeneizando por 30-60 segundos ms. Se
coloca el homogeneizado en tubos de centrifuga apropiados teniendo cuida-
do de tarar perfectamente los tubos opuestos (consulte a su maestro),.se
centrfuga por 15 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante se desecha. El resi-
duo soluble se lava con 50ml de citrato 0.01 M-NaCI 0.14M, pH 7.2, agitando
con ayuda de una varilla de vidrio hasta volver a homegeneizar. Se vuelve a
centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos. El sobrenadante se desecha. Al sedi-
mento insoluble que contiene el DNA y residuos celulares se le aaden 50 mi
de NaCI 2.6M fro y se homogeneiza por agitacin o con ayuda de la licuadora
a baja velocidad, por 1 minuto. El cido desoxirribonucleico es soluble en esta
solucin mientras que la mayor parte de las protenas son insolubles,
centrifugar a 1000 rpm durante 20 minutos. El lquido sobrenadante contiene
el DNA en solucin y el sedimento,que contiene restos celulares y protenas
insolubles, se desecha. La solucin salina sobrenadante se coloca en un vaso
de precipitados y se aaden lentamente 2 volmenes de alcohol etlico al
95% , procurando que la fase alcohlica quede en la parte superior. Se
deber observar la formacin de un precipitado blanco, denso.en la nterfase.
Utilizando un agitador con pequeas salientes agite esta mezcla lentamen-
te procurando enrollar sobre el agitador las fibras del DNA precipitadas. En
esta forma recolecte todo el DNA que pueda y transfiralo a un frasco que
contenga 100 mi de agua. El DNA debe disolverse. Conserve esta solucin
para los otros experimentos.

70
a) Explique por qu se utiliz bazo como materia prima y no otro rgano
cualquiera

b) Sera conveniente utilizar solucin reguladora de fosfatos para la


extraccin del DNA, por qu ?

c) Por qu es conveniente trabajar durante toda la extraccin a baja


temperatura?

CARACTERIZACIN Y ANLISIS CUANTITATIVO DEL DNA.

Existen varios mtodos para identificar y cuantificar a los cidos nucleicos.


El mtodo ms utilizado es el espectrofotomtrico, el cual est basado en que
tanto el DNA como el RNA absorben a 260 nm. La absorbancia es proporcio-
nal a la concentracin del cido, por lo tanto, el medir la absorbancia es un
mtodo cuantitativo muy sensible y sencillo, pero no distingue entre DNA y
RNA. Es de gran utilidad cuando las muestras estn puras.
Una reaccin muy utilizada para identificar y cuantificar DNA es la lla-
mada reaccin de Dische, la cual est basada en que el reactivo de
difenilamina, reacciona especficamente con el DNA dando una coloracin
azul cuya intensidad es proporcional a la concentracin del DNA. En reali-
dad, la especificidad de esta reaccin no es absoluta, ya que la difenilamina
es un reactivo especfico para las 2-desoxipentosas en general, pero en
condiciones normales la cantidad de azcares capaces de interferir son
despreciables.

EXPERIMENTO 2.

Prepare una serie de 6 tubos de ensaye numrelos del 1 al 6. Mida con


una pipeta cuidadosamente 2 mi de solucin patrn. Esta solucin tiene una
concentracin de DNA de 1mg/ml colquela en el tubo No.1. Aada a los
tubos No. 2, 3, 4 y 5; 2ml de agua destilada. Agregue al tubo No. 2, 2ml de
la solucin patrn; mezcle perfectamente y transfiera 2 mi de esta mezcla
al tubo No.3;se mezcla el contenido y se transfieren 2 mi al tubo No.4. De
este tubo se toman 2 mi yse desechan. El tubo No.5 ser el blanco y en el
tubo No.6 se colocan 2ml de la solucin de DNA problema. Aada a todos
los tubos 4 mi del reactivo de Dische y agite vigorosamente y coloque los
tubos en bao mara a ebullicin por 10 minutos. Inmediatamente despus
coloque los tubos en un bao de hielo-agua durante 5 minutos con objeto
de enfriar su contenido rpidamente.

Los tubos con DNA desarrollan una coloracin azul caracterstica con
un mximo de absorcin a 600 nm. La intensidad de la coloracin se puede

71
determinar cuantitativamente en el espectrofotmetro. Determine la
absorbancia a de todos los tubos utilizando el tubo No.5 como blanco.

a) Resuma sus resultados en la siguiente tabla:

TUBO CONCENTRACIN DE DNA ABSORBANCIA A 600 nm.


1 1 mg / mi
2 0.5mg / mi
3 0.25 mg / mi
4 0.125 mg/ml
5 0
6 Problema

b) Con los datos de la tabla anterior construya la curva tipo, absorbancia


contra mg de DNA ).

c) Interpolando la absorbancia del tubo No.6 encuentre la concentracin


de DNA (mg/ml) y calcule la cantidad total de DNA en su problema

CARACTERIZACIN Y ANLISIS CUANTITATIVO DEL RNA.

El RNA puede ser cuantificado por espectrofotometra, como ya se ex-


plic. Sin embargo, la reaccin ms utilizada para identificar y cuantificar el
RNA es la reaccin del orcinol, la cual se caracteriza por dar una coloracin
verde en presencia de cualquier RNA. La reaccin del orcinol es una modi-
ficacin de la reaccin de Bial para pentosas y es, por lo tanto, poco espe-
cfica. Sin embargo, cuando se trata de muestras con cierto grado de pure-
za, esta reaccin puede ser utilizada para anlisis cuantitativos.

EXPERIMENTO 3.

Prepare una serie de 6 tubos de ensaye y numrelos del 1 al 6. Aada


a los tubos, 2,3,4 y 5; 3 mi de agua destilada; al tubo No.1, 3 mi de la so-
lucin patrn de RNA que contendr 0.300 mg de RNA/ml. Aada 3 mi de
la misma solucin patrn al tubo No.2, mezcle bien el contenido y trans-
fiera 3 mi de esta solucin al tubo No.3;mezcle el contenido del tubo No.3
y aada 3 mi de esta solucin al tubo No.4, mezcle bien el contenido y
tome 3 mi de esta solucin y deschelos. El tubo No.5 ser considerado
como blanco y al tubo No.6 se le aade 3 mi de solucin problema. Aada
a todos los tubos 6 mi del reactivo de orcinol cido y 0.4 mi del reactivo
del orcinol-alcohol. Se mezcla el contenido y se colocan en bao mara a
ebullicin por 20 minutos. Una vez fros se determina la absorbancia de
cada tubo a 660 nm.

72
a) Resuma sus resultados en la siguiente tabla:

tubo No. Concentracin de RNA mg/ml Absorbancia a 660 nm


1 0.300
2 0.150
3 0.075
4 0.0375 __ u

5 0
6 Problema

b) Con los datos de la tabla anterior trace la curva tipo, absorbancia


contra mg de RNA
c) Interpole los valores de absorbancia de su problema y determine la
concentracin real en mg/ml.

DETERMINACIN DEL FOSFATO TOTAL.

Los fosfatos son uno de los constituyentes tanto del DNA como del RNA,
ya que a stos se unen una base nitrogenada y azcar para dar los
nucletidos correspondientes esterficndose los (OH) del fosfato con los
(OH) del azcar en posicin 3' o 5'.

EXPERIMENTO 4.

Para efectuar la determinacin colorimetrica con el molibdato de amonio


se emplear una muestra que ha sido previamente digerida.

73
Preparar una serie de 6 tubos como se indica en la siguiente tabla:

1 2 3 4 5 6
Acetato 0.1 M 1 mi 1 mi 1 mi 1 mi 1 mi 1 mi
Buffer acetato
0.1MapH4.0 7 mi 7 mi 7 mi 7 mi 7 mi 7 mi
Reactivo molib-
dato (2.5%) 0.5 mi 0.5 mi 0.5ml 0.5 mi 0.5 mi 0.5 mi
Agua destilada 2 mi - - - - -
Sol. Vit. C 1 %
Reciente 0.5 mi 0.5 mi 0.5 mi 0.5 mi 0.5 mi 0.5 mi
Sol.tipo
1nM/ml - 2 mi - - - -
Sol. tipo
2.5nM / mi - - 2 mi - - -
Sol. tipo
5^M / mi - - - 2 mi - -
Problema DNA - - - - 2 mi -
Problema RNA - - - - - 2 mi

Dejar los tubos en reposo a temperatura ambiente durante 30 min y leer


la absorbancia a 660 nm, tomando como blanco el tubo No.1

a) Con los datos obtenidos con las soluciones tipo, construya la curva
tipo para fosfato.( D:O contra concentracin en umol / mi).
b) Interpolando la densidad ptica contra los pobiemas de RNA y DNA
calcule la cantidad total de fosfatos en sus muestras.
c) Cmo afecta el medio cido al enlace 3'- 5' -dister fosfato?
d) Cmo afecta el medio alcalino al enlace 3'- 5'-dister fosfato?

74
GLUCIDOS

Los glcidos o carbohidratos se definen como derivados aldehdicos o


cetnicos reales o en potencia de alcoholes polivalentes que poseen en su
molcula uno o ms carbonos asimtricos. Estos compuestos se encuen-
tran presentes en todos los seres vivos, en cantidades variables, desempe-
ando importantes funciones estructurales y energticas.
Debe recordarse que todas las propiedades qumicas de los glcidos
dependen de sus grupos funcionales, o sea, grupo alcohlico, y grupo
carbonilo (aldehdico o cetnico).
Los glcidos se clasifican, segn el nmero de compuestos hidrocarbo-
nados simples que los constituyen, en 3 grupos: monosacridos, oligosa-
cridos y polisacridos. Los monosacridos son aquellos que por hidrlisis
no se pueden desdoblar en compuestos ms sencillos, a su vez se
subdivden,segn el nmero de carbonos que contengan, en: triosas,
tetrosas, pentosas, hexosas, etc.
Los oligosacridos son aquellos glcidos que por hidrlisis dan pocas
molculas de monosacridos. En la naturaleza existen varios disacridos
(sacarosa, lactosa, maltosa, etc.), unos cuantos trisacridos, tetrasacridos
y pentasacridos libres. Se pueden obtener por sntesis qumica en el labo-
ratorio o por degradacin hidroltica de polisacridos. Los oligosacridos
poseen propiedades fsicas similares a las de los monosacridos.
Los polisacridos son aquellos que por hidrlisis dan muchas molcu-
las de monosacridos. Desde el punto de vista fisiolgico se dividen en dos
grupos; polisacridos estructurales y polisacridos nutrientes o de reserva.
Entre los primeros tenemos en vegetales, la celulosa, cidos pcticos, y
hemicelulosas. En los animales los ms importantes son los llamados
mucopolisacridos, tales como el cido hialurnico, condroitin sulfato, abun-
dantes en varios tejidos y lquidos como el cuerpo vitreo del ojo, cordn
umbilical, lquido sinovial, tendones, cartlagos, etc. Entre los polisacridos
nutrientes o de reserva los ms importantes son, en los vegetales, almido-
nes e inulina y en los animales, glucgeno.

OBTENCIN DE GLUCIDOS DE FUENTES NATURALES.


Por regla general las propiedades fsicas y qumicas de los polisacri-
dos son lo suficientemente diferentes de las otras sustancias presentes en
los organismos lo cual permite una rpida y fcil separacin. La mayor par-
te de los otros componentes como protenas y cidos nucleicos en presen-
cia de cido tricloroactico precipitan, mientras que los polisacridos per-
manecen en solucin; esta propiedad y la de ser poco solubles en alcohol
se utilizan para separarlos de otras sustancias hidrosolubles.

75
PARTE EXPERIMENTAL
OBTENCIN DE GLUCGENO HEPTICO DE RATA.

EXPERIMENTO 1.
Se matan dos ratones por descerebracin ,uno excitndolo previamente
durante 10 minutos y otro sin excitacin .En ambos casos se diseca el
hgado y se coloca sobre hielo molido. Una vez fro, se pesa lo ms exacto
posible y se anota el peso. Se corta en pequeos pedazos y se coloca en
un mortero previamente enfriado que contenga 1 mi. de cido tricloroactico
al 10% por cada gramo de tejido. Se muele, con precaucin, hasta obtener
una pasta homognea. Este homogeneizado se coloca en un tubo de cen-
trfuga teniendo cuidado de vaciar completamente el contenido. Se centr-
fuga a 4000-5000 r.p.m. durante 5 minutos (recuerde la necesidad de tarar
con el tubo opuesto). El lquido sobrenadante se decanta en otro tubo, el
residuo se desecha.
Aada lentamente 2 volmenes de alcohol etlico al extracto del cido
tricloroactico, agitando constantemente. Deje reposar la mezcla hasta que
observe un precipitado. (Si no hay precipitado aada un poco de cloruro de
sodio en cristales y caliente ligeramente el recipiente).Pese un tubo de cen-
trfuga vaco y reciba el precipitado formado, centrifugue por 5 minutos a
5000 r.p.m. Elimine el liquido sobrenadante y lave su precipitado con 3 mi.
de alcohol etlico al 95%, (agitando enrgicamente) vuelva a centrifugar y
elimine el sobrenadante, repita el lavado con 3 mi. de alcohol etlico abso-
luto y centrifugue finalmente con 3 mi. de ter etlico. Deje secar el precipi-
tado al aire. Una vez seco, pese el tubo nuevamente y por diferencia deter-
mine el peso del glucgeno obtenido, anote sus resultados en la tabla
siguiente. (Guarde el glucgeno obtenido para la prueba de lugol). (Experi-
mento 12)

DATOS RATN NO EXCITADO RATN EXCITADO


Peso del hgado
Peso del
glucgeno seco
% de glucgeno

a) Por qu es necesario enfriar el hgado y los reactivos en las prime


ras etapas de la purificacin?
b) Compare y discuta los resultados obtenidos.
c) Por qu cree usted que escogimos como material hgado y no otro
rgano?

76
PROPIEDADES FSICAS DE LOS GLCIDOS.

Los glcidos reciben este nombre debido a que la mayor parte de ellos
se caracterizan por tener sabor dulce. Sin embargo, esta propiedad la pre-
sentan solamente los monosacridos y los oligosacaridos, ya que los poli-
sacridos generalmente son inspidos. Otras propiedades que nos permi-
ten diferenciar glcidos de bajo peso molecular (monosacridos y
oligosacaridos) de los de elevado peso molecular (polisacridos), es su
solubilidad en agua y su capacidad para cristalizar.

SABOR

EXPERIMENTO 2.
Determinar cuidadosamente el sabor de los siguientes glcidos: gluco-
sa, maltosa, almidn y celulosa.

a) Qu glcidos tienen sabor dulce?


b) Cuales son inspidos?
c) Cmo explica esta diferencia?

SOLUBILIDAD

EXPERIMENTO 3.
Determine la solubilidad a temperatura ambiente y en caliente (en bao
mara a ebullicin) de glucosa, sacarosa, almidn y celulosa en los siguien-
tes solventes: agua, alcohol etlico y benceno.

Anote sus resultados en la siguiente tabla:

AGUA T.Amb. ALCOHOL BENCENO

Calor T Amb Calor T Amb Calor


GLUCOSA
SACAROSA
ALMIDN
CELULOSA

77
ESTRUCTURA CRISTALINA.

EXPERIMENTO 4
Examine al microscopio los siguientes glcidos: glucosa, sacarosa, al-
midn y celulosa y haga los esquemas correspondientes:

a) Cules de estos glcidos tienen estructura cristalina, por qu?

PROPIEDADES QUMICAS DE LOS GLCIDOS.

Las propiedades qumicas de los glcidos dependen de sus grupos fun-


cionales. Todos los glcidos poseen en su molcula grupos alcoholes y
grupos carbonilos, ya sean, aldehdico o cetnico. Sin embargo, en algu-
nos glcidos estos grupos pueden estar bloqueados y, por lo tanto, su
reactividad qumica estar ausente. Una caracterstica qumica de los
aldehidos y cetonas es su carcter reductor, todos los monosacridos ,
oligosacridos y polisacridos que tengan libre el grupo aldehdico o cetnico
sern reductores,mientras que los oligosacridos y polisacridos que ten-
gan bloqueados estos grupos sern no reductores.
Todos los glcidos formados por varios monosacridos (oligo o polisacri-
dos), se pueden hidrolizar por accin enzimtica o de cidos, dando como pro-
ducto final los monosacridos y liberando los grupos reductores bloqueados.
Existen varias reacciones qumicas que se utilizan para la identificacin
de los glcidos, algunas son generales y otras son especficas para deter-
minado tipo o incluso especficas para cada azcar. Entre las ms utiliza-
das tenemos:

REACCIN DE MOLISCH-UDRANSKY.

Es una reaccin general para todos los glcidos, debido a que el cido
sulfrico concentrado que contiene el reactivo hidroliza y deshidrata a los
azcares obtenindose furfural o hidroximetilfurfural como producto final y
estas sustancias son capaces de reaccionar con el oc-naftol formando un
compuesto color violeta en la interfase.
Esta prueba es una de las mas sensibles, la dan positiva soluciones de
glucosa al 0.001 % y soluciones de sacarosa al 0.0001%. Sin embargo, la
reaccin no es especfica, ya que la dan positiva los aldehidos, las cetonas
y algunos cidos orgnicos tales como frmico, oxlico, lctico, ctrico, etc.

EXPERIMENTO 5.

Colocar en una gradilla 6 tubos de ensaye, poner en cada uno 3 mi. de


una de las siguientes soluciones:

78
Tubo No. Solucin Clasificacin Resultado
1 formaldehdo
2 glucosa
3 fructosa
4 arabinosa
5 sacarosa
6 almidn

Aadir a todos los tubos, 3 gotas del reactivo de Molisch (solucin de


cc-naftol al 0.5% en alcohol). Mezclar bien. Posteriormente aadir a todos
los tubos lentamente 1 mi. de cido sulfrico concentrado, estratificando (in-
clinando el tubo y dejando resbalar el cido por las paredes). La reaccin
es positiva si aparece en la interfase un anillo de color violeta.

a) Diga cul de estas soluciones da positiva la reaccin.


b) Se puede considerar como una reaccin til para diferenciar un
glcido de otro? Por qu?
c) Qu utilidad puede tener la reaccin de Molisch-Udransky?
d) Escriba la reaccin que se efecta:

REACCIN DE FEHLING

La mayor parte de las pruebas para el anlisis cualitativo y cuantitativo


de azcares se basa en su propiedad reductora, aunque esta propiedad no
sea especfica de ellos.Se sabe que los azcares reductores son capaces
de reducir diversos iones metlicos como el cobre, bismuto, mercurio, pla-
ta, etc., cuando se encuentran stos en solucin alcalina.
Este tipo de reacciones son muy empleadas porque los reactivos son
estables, existe poca interferencia con otras sustancias, las reacciones son
sensibles y puede usarse la misma reaccin para un anlisis cualitativo o
cuantitativo.

EXPERIMENTO 6.
En 5 tubos de ensaye se colocan 2 mi. de la solucin A y 2 mi. de la
solucin B del reactivo de Fehling, y a cada tubo se le agregan 3 gotas de
los siguientes azcares:

Tubo No. Solucin Clasificacin Resultado


1 glucosa
2 fructosa
3 arabinosa
4 sacarosa
5 almidn

79
Se colocan en bao mara los tubos a ebullicin y se mantienen por 3
minutos, al cabo de los cuales se dejan enfriar (no deben enfriarse con agua
fra) y se observan.
El mecanismo de la reaccin se lleva a cabo debido a que algunos com-
puestos orgnicos que contienen uno o ms grupos alcohol en su molcu-
la, en este caso el tartrato de sodio, reaccionan en solucin alcalina con los
hidrxidos metlicos, formando un ion complejo soluble, el cual se disocia
muy poco, pero los iones que deja en libertad son suficientes para que se
produzcan las reacciones de coloracin. La formacin de este complejo es
esencial para que se produzca un precipitado con la mayor parte de los
metales pesados.

a) Qu azcares dan positiva la reaccin de Fehling?


b) Explique por qu algunos azcares dan negativa la reaccin?
c) Mencione 3 sustancias que usted considere puedan dar positiva la
reaccin de Fehling y no sean azcares:
d) Escriba la reaccin que se efecta:

REACCIN DEL ACIDO PICRAMICO.

Esta reaccin tambin la dan positiva todos los azcares reductores y


tiene como base la reduccin del cido pcrico, de color amarillo intenso, a
cido picrmico, de color rojo caoba.

EXPERIMENTO 7.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE GLUCOSA EN ORINA.

Colocar 1 mi. de orina normal en un tubo de ensaye. En otro tubo 1 mi.


de orina de diabtico. Aadir a los 2 tubos 1 mi. de solucin de cido pcrico
y 0.5 mi. de NaOH al 5%. A continuacin se aaden 5 gotas de acetona al
50% y se colocan los tubos en bao mara a ebullicin por 12 minutos y se
observa la coloracin en los tubos.
Se puede hacer la determinacin cuantitativa del azcar comparando la
intensidad de la coloracin con patrones previamente controlados.

a) Cmo explica la diferencia de coloracin en las muestras de orina


utilizadas?
b) Es especfica esta reaccin para glucosa?
c) Escriba la reaccin que se efecta

d) Qu otras sustancias presentes en orina son reductoras?

80
REACCIN DE BARFOED.

El reactivo de Barfoed es una solucin de acetato cprico en cido ac-


tico, y, una vez ms, se determina la. capacidad de los azcares para redu-
cir el n cprico a cuproso (Cu20).
Esta reaccin sirve para diferenciar un monosacrido de un disacrido,
ya que los primeros a los 3 minutos reducen el reactivo y los disacridos
necesitan mas tiempo para que se lleve a cabo la reaccin de reduccin,
mas o menos unos 15 minutos.

EXPERIMENTO 8.
Se colocan 4 tubos de ensaye y a cada uno se le agregan 3 mi. del
reactivo de Barfoed y 1 mi. de una de las siguientes soluciones de glucidos:

Tubo No. Sustancia Clasificacin Resultado


1 Glucosa
2 Arabinosa
3 Lactosa
4 Maltosa

Se colocan en bao mara observando y anotando el tiempo que tarda


en aparecer el precipitado de xido cuproso rojo.

a) Escriba la reaccin que se efecta:

REACCIN DE BIAL

Esta reaccin sirve para diferenciar pentosas de hexosas, este reactivo


consiste en una solucin de orcinol en HCI concentrado con una pequesi-
ma cantidad de FeCI3. El fundamento de esta reaccin, igual que la reac-
cin de Molisch, la de Seliwanoff y otras, se basa en la produccin de furfural
o hidroximetil furfural cuando se calienta con cidos concentrados y la con-
densacin de stos con otras sustancias dando productos coloridos, en este
caso las pentosas dan color azul y las hexosas dan color amarillo o caf.

EXPERIMENTO 9.

En tubos de ensaye se colocan 3 mi. del reactivo de Bial. PRECAUCIN!.


Adale 0.2 mi. de las siguientes soluciones:

Tubo No. Sustancia Clasificacin Resultado


1 Glucosa
2 Arabinosa
3 Agua

81
Caliente los tubos ligeramente sobre la flama del mechero, hasta que se
inicie la ebullicin, retire de la flama, diluya cada tubo con 10 mi. de agua y
agregue 2 mi. de butanol. Agite los tubos, deje reposar y haga su observacin.

a) Explique las diferencias observadas

REACCIN DE SELIWANOFF

Esta reaccin sirve para diferenciar aldosas de cetosas. Las cetosas


reaccionan rpidamente mientras que las aldosas lo hacen lentamente. El
reactivo es una solucin de resorcinol al 0.05% en HCI l:3 recin prepara-
do. Este compuesto es el que se condensa con el furfural o sus derivados
dando productos coloridos.

EXPERIMENTO 10.

En 3 tubos de ensaye se coloca 1 mi. de los azcares que se mencio-


nan abajo y agregue a cada tubo 0.5 mi. del reactivo y caliente en bao a
ebullicin exactamente 60 segundos. Anote sus resultados y contine ca-
lentando y observando el cambio de color a intervalos de 1 minuto durante
5 minutos.

Tubo No. Sustancia Clasificacin Resultado


1 Glucosa
2 Fructosa
3 Agua

Las cetosas dan una coloracin rojo fuego y las aldosas la dan muy dbil
y muy lentamente.

a) Observ alguna diferencia en las soluciones?


b) Escriba la reaccin que se efecta:

FORMACIN DE OSAZONAS.

Esta reaccin es una de las de mayor utilidad para la identificacin de


azcares por ser especfica para cada azcar. La dan positiva tanto los
monosacridos como los disacridos reductores, sirviendo para identificar-
los el tiempo que tardan en formar la osazona correspondiente, la forma
cristalina de ellas, la solubilidad en caliente o en fro y los puntos de fusin

82
EXPERIMENTO 11.
Se colocan en un tubo de ensaye 0.1 g. de un carbohidrato, 0.2 g. de
clorhidrato de fenilhidracina, 0.3 g. de acetato sdico anhidro y 2 mi. de agua,
se agita, se tapa el tubo con un tapn de papel procurando que no quede
muy cerrado, se coloca en bao mara a ebullicin, agite ocasionalmente,
observe el tiempo que tardan en aparecer los precipitados y si lo hacen en
fro o en caliente.
La glucosa, fructosa y galactosa precipitan en caliente, pero la maltosa
y la lactosa en fro por lo que despus de 20 minutos de calentamiento se
deben retirar del fuego.

a) Observe al microscopio los cristales de la osazona preparada por


usted y las preparadas por sus compaeros de grupo.
b) Haga un esquema de los cristales.

c) Por qu la glucosa, la maosa y la fructosa dan la misma osazona?


d) Escriba la reaccin que se efecta:

REACCIN DE LUGOL

El reactivo de lugol es una solucin de yodo en yoduro de potasio. Este


reactivo reacciona con algunos polisacridos como los almidones, glucgeno
y ciertas dextrinas formando un complejo de inclusin termolbil que se
caracteriza por ser colorido, dando color diferente segn las ramificaciones
que presenta la molcula.

EXPERIMENTO 12

En un tubo de ensaye se colocan 2 mi. de solucin de almidn, en otro


se colocan 2 mi. del glucgeno que obtuvo en el experimento 1, disolviendo
20 mg. en 2 mi. de agua calentando ligeramente, aada una gota de lugol y
anote el color producido en cada uno de los tubos. El tubo que contiene el
almidn se calienta a ebullicin y se deja enfriar nuevamente observando
lo que ocurre con la coloracin.
a) Por qu el complejo almidn-yodo es termo|bil?
b) Se puede considerar la reaccin del lugol caracterstica para cual
quier polisacrido?

83
HIDRLISIS ACIDA DE POLISACARIDOS.

La celulosa es un polisacrido muy abundante en los vegetales, se en-


cuentra principalmente en la pared celular. La celulosa es una glucosana
formada por cadenas de glucosa unidas en posicin p (1 -4), debido a lo cual
no pueden ser utilizadas por el hombre como alimento, ya que carece de
enzimas capaces de hidrolizarla.
Algunos microorganismos que constituyen la flora bacteriana de herb-
voros poseen una enzima denominada celulasa capaz de hidrolizarla hasta
glucosa. La celulosa tambin puede ser hidrolizada por cidos y lcalis bajo
condiciones enrgicas.

EXPERIMENTO 13.

Coloque en un vaso de precipitados de 250 mi. de capacidad unos tro-


zos de papel filtro y aada 5ml de H2SO4 concentrado (PRECAUCIN!)
agite cuidadosamente hasta que el papel se haya disuelto. Se aaden len-
tamente 50 mi. de agua destilada PRECAUCIN !. La reaccin es fuerte-
mente exotrmica. .
Se toman 2 mi. de esta solucin y se colocan en un tubo de ensaye, se
neutraliza con NaOH al 10% usando papel indicador para comprobarlo. Se
aade un mililitro de la solucin "A" y un mililitro de la solucin "B" del reactivo
de Fehling y se calienta en bao mara a ebullicin hasta que se forme el
precipitado rojo de Cu2O.

a) Escriba la reaccin que se efecta:

b) Mencione otros mtodos por los cuales se puede hidrolizar un,


polisacrido.

84
FENMENOS DE INTERFASE Y SISTEMAS DISPERSOS

INTERFASE

Se conoce como interfase a la superficie de contacto entre dos fases,


las molculas que forman la interfase son suficientemente diferentes de las
del seno o cuerpo de cada fase, de manera que forman una'"zona interfasial".
Existen varios tipos de interases dependiendo del estado fsico en que
se encuentran las dos fases adyacentes.
Cada partcula o conjunto de partculas de materia, sea una clula o un
organismo superior, posee una interfase en el lmite de sus alrededores,
por lo que los fenmenos interfasiales son tema de importancia evidente y
factor significativo en: penetracin de molculas a travs de membranas
biolgicas, dispersin de partculas insolubles en el medio extracelular,
adsorcin de frmacos, intercambio gaseoso, etc.
Por conveniencia estas combinaciones se pueden dividir en dos grupos:
las llamadas interfases lquidas (lquido-gas o bien lquido-lquido) y las
interfases slidas (slido-gas y slido-lquido).

INTERFASES LIQUIDAS

TENSIN SUPERFICIAL Y TENSIN INTERFASIAL.

En la superficie de contacto entre un lquido y un gas se han observado,


experimentalmente, fenmenos similares a los que se presentan donde
existe una membrana tensa. La explicacin de sto la tenemos suponiendo
que podemos ver las molculas del lquido y analizamos una que se en-
cuentre en el seno del mismo; sta se halla interactuando con las dems
molculas que la rodean y el resultado es que no hay fuerza vectorial que la
desplace hacia ningn lado. En cambio, una molcula situada en la super-
ficie, slo interacta con las que estn situadas a los lados y debajo de la
misma, arriba, las molculas de gas o vapor ejercen poca interaccin. El
resultado es que cada una de las molculas de la superficie sufre atraccio-
nes abajo y a los lados constituyendo una resistencia o tensin. Esta fuerza
se denomina tensin superficial, (T.S,).
Debido a esta tensin, que es una manifestacin de la energa de su-
perficie, las gotas de un lquido o las burbujas de un gas tienden a contraer-
se y ocupar el menor espacio posible, la forma esfrica es la que tiene el
mnimo de superficie para un volumen dado.

85
Por otro lado la tensin interfasial es la fuerza por unidad de longitud
existente en la interase entre dos lquidos inmiscibles.
Invariablemente las tensiones interfasiales son menores que las tensio-
nes superficiales debido a que las fuerzas de adhesin en la interase
lquido-lquido, son mayores que en la interfase lquido-gas.

ACUMULACIN DE MOLCULAS EN INTERFASES LIQUIDAS

El agua posee, despus del mercurio, el valor ms alto de tensin su-


perficial de todos los lquidos pero cuando disolvemos en ella diferentes
sustancias, este valor (72.8 dinas/ cm) se modifica.
Ciertas molculas insolubles como los cidos grasos, los cidos
sulfnicos, y las sales alcalinas de cidos grasos (jabones), cuando se dis-
persan en el agua, an a concentraciones bajas, se mueven hacia la
interfase; su concentracin es mayor en la superficie que en el seno del l-
quido, por lo que el valor de la tensin superficial del agua disminuye. A los
iones o molculas que se concentran en la interfase, debido a su naturale-
za antiptica, se les denomina agentes tensoactivos negativos.
Otras sustancias como los electrolitos fuertes, alcaloides (cafena, nicoti-
na, etc) y la sacarosa, al ser disueltos en el agua, se concentran en el seno
de sta, aumentando la tensin superficial (aunque no de manera importan-
te). A estas sustancias se les denomina agentes tensoactivos positivos.

PARTE EXPERIMENTAL
OBSERVACIN DE LA TENSIN SUPERFICIAL

EFECTO DE SUSTANCIAS TENSO ACTIVO NEGATIVAS.

EXPERIMENTO 1

a) Tome un vaso de precipitados de 250 mi. y llnelo con agua. En la


superficie de sta deposite, por una de sus caras, una navaja de afeitar lim
pia y seca. Observe primero la depresin que ocasiona sobre la superficie
del lquido y luego, con un estilete, trate de hundir la navaja.

Qu observa al tratar de hundir la navaja ?

b) Repita a continuacin el experimento slo que, antes de colocar la


navaja, disuelva en el agua 100 mg de detergente en polvo, procurando que
no se formen burbujas. Si se formaran, destruyalas con un pedazo de pa
pel filtro. Coloque entonces con suavidad la misma navaja limpia y seca.
Observe lo que ocurre.
c) Repita el experimento agregando previamente al agua solucin de
bilis al 1 %.

86
1) Qu efecto tienen la bilis y el detergente sobre la tensin superficial?
2) Qu agente tensoactivo negativo tiene mayor efecto?

FUERZAS DE ADHESIN Y FUERZAS DE COHESIN


Para una mejor compresin de las fuerzas moleculares que determinan
la T.S. es conveniente observar, prcticamente, dos factores que determi-
nan la tendencia de los lquidos a presentar el rea mnima en un determi-
nado volumen: las fuerzas de adhesin (fuerzas de atraccin entre molcu-
las de diferente naturaleza) y las fuerzas de cohesin (fuerzas de atraccin
entre molculas de la misma naturaleza).

FUERZAS DE ADHESIN.

EXPERIMENTO 2
Sumerja en agua, un tubo de vidrio limpio y otro cubierto con parafina y
observe en cul se adhiere el lquido, es decir, cul se moja.

a) En qu tubo se eleva el agua en contra de la gravedad?


b) Existe alguna relacin entre adhesin y T.S.?

FUERZAS DE COHESIN

EXPERIMENTO 3

Coloque una gota de agua entre dos portaobjetos y trate de separarlos.

c) Qu observa?

Repita el experimento anterior utilizando una gota de los siguientes sol-


ventes: alcohol etlico, ter etlico, cloroformo y benceno.

d) Qu concluye de sus observaciones?

MEDIDA DE LA TENSIN SUPERFICIAL

La tensin superficial es la fuerza por unidad de longitud que debe ser


aplicada paralelamente a la superficie para contrarrestar la atraccin de las
molculas hacia dentro del lquido y se expresa en dinas/ cm. Termodin-
micamente la tensin superficial puede considerarse como la tendencia de
un lquido a disminuir su superficie hasta que su energa de superficie po-
tencial sea mnima.

87
Como se refiri anteriormente, la tensin superficial es una de las pro-
piedades fisicoqumicas que tiene coeficiente trmico negativo, es decir, que
al aumentar la temperatura, el valor de la tensin superficial disminuye.
Existen varios mtodos para conocer la tensin superficial como son:
del tensimetro, del capilar, del anillo de Du Nouy y el estalagmomtrico.

MTODO ESTALAGMOMTRICO

El mtodo estalagmomtrico ( medida de las gotas ) consiste en hacer


fluir un lquido por un tubo de dimetro estrecho. Algunos lquidos dan go-
tas muy pequeas que fluyen rpidamente, otros en cambio dan gotas gran-
des. La gota que aparece por el extremo del tubo (pipeta) se detiene por la
membrana tensa que resiste la accin de la gravedad . Si la gota aumenta
de tamao, llega un momento en que su peso vence a la tensin superfi-
cial, se rompe la membrana y la gota cae.
As, contando el nmero de gotas que hay en determinado volumen se
puede calcular su tensin superficial, comparando con un lquido de ten-
sin superficial conocida, generalmente el agua (72.8 dinas/cm, a 20C),
segn la siguiente frmula:

donde:

T.S.H2o = Tensin superficial del agua. T.S


prob. = Tensin superficial del problema. V, y
D, = Volumen y densidad del agua. V2 y D2 =
Volumen y densidad del problema.

Para calcular el volumen de la gota, se divide el volumen total que se


utiliza entre el nmero de gotas, que se obtienen. Si se emplea 1 mi el vo-
lumen de la gota ser:

As tenemos:

despejando T.S.prob, nos queda:


EXPERIMENTO 4
Para medir la tensin superficial por este mtodo debe emplearse la
misma pipeta en todas las determinaciones, lavndola cuidadosamente al
terminar cela valoracin.
Mida exactamente 1 mi de las sustancias a determinar, en el orden in-
dicado en la siguiente tabla, cuente el nmero de gotas que se forman al
vaciar la pipeta.
No desperdicie el solvente, vace las gotas al frasco !

DENSIDAD g TENSIN SUPERFICIAL


LIQUIDO
errv3 (dinas/ cm)
Agua 1.000
Alcohol etlico (95) 0.816
ter etlico 0.719
Cloroformo 1.484
Benceno 0.878

ADSORCIN

Toda superficie contiene una cierta cantidad de energa que puede ser
fcilmente transformada en trabajo. Ese trabajo puede manifestarse cuan-
do se concentran en las interfases iones o molculas en solucin, o sea,
cuando aparece el fenmeno de adsorcin. En este fenmeno intervienen
las fuerzas de cohesin intermoleculares, las valencias residuales y la car-
ga elctrica.
La adsorcin tiene numerosas aplicaciones, tanto en la industria como
en los laboratorios de investigacin, siendo una de estas aplicaciones la
cromatografa en sus diversas formas como son: en papel, en capa fina,
de intercambio inico, de lquidos de alta resolucin etc.; tcnicas de gran
utilidad en mtodos de separacin, purificacin y anlisis cualitativo y
cuantitativo.
La adsorcin cromatogrfica permite la separacin de los componentes
de una mezcla, dependiendo del grado en que los solutos adsorbidos son
intercambiados entre la solucin original (fase mvil) y una segunda fase
slida o lquida (fase estacionaria). El grado de separacin depender de
las propiedades polares, afinidad, estricas (conformacin espacial), etc.
de los solutos en relacin al adsorbente.
La relacin entre cantidades de gas adsorbido por un slido y la presin
o concentracin, a temperatura constante se denomina isoterma de
adsorcin.

ADSORCIN EN IIMTERFASE SOLIDA.

La adsorcin de materiales slidos o gaseosos sobre la superficie de


slidos es semejante en muchos aspectos a la adsorcin en interfases l-

89
quidas. Este tipo de adsorcin puede ser considerada como la tendencia a
reducir la energa libre de superficie del slido.

INTERFASE SOLIDO - GAS.

El grado en que un gas es adsorbido por un slido depende de la natu-


raleza qumica del adsorbente (sustancia usada para adsorber el gas ) y
del adsorbato (sustancia a ser adsorbida), el rea del adsorbente , la tem-
peratura y la presin parcial del gas adsorbido.
La adsorcin puede ser de tipo fsico, asociada a fuerzas de Van der
Waals, reversible o bien de tipo qumico en la que establecen enlaces qu-
micos fuertes y por lo tanto irreversibles; en general la adsorcin qumica
es ms especfica que la adsorcin fsica.

ADSORCIN EN FUNCIN DE LA CONCENTRACIN.

La relacin entre la concentracin de una sustancia adsorbida (x) por


un slido y la concentracin de la sustancia puesta en contacto (c) con el
adsorbente (m), a temperatura constante, se le denomina isoterma de
adsorcin de Frendlich.
Cuando se desee medir la adsorcin o poder adsorbente de una sus-
tancia se puede emplear, la isoterma de Frendlich:
1/n
x/m = KC
donde:
x = miligramos de sustancia adsorbida, m = miligramos de
sustancia adsorbente. C = concentracin molar del soluto o
sustancia que se va a
adsorber.
K = constante de adsorcin especfica para cada sustancia,
n = constante arbitraria, generalmente igual a 0.5.

Al graficar esta ecuacin obtendramos una parbola, indicndonos que


la velocidad de adsorcin aumenta al aumentar la concentracin. Sin em-
bargo, llega un momento en que por ms que se aumente la concentracin,
no aumenta la sustancia adsorbida y esto ocurre en la saturacin.
Si se desea obtener una grfica lineal, es necesario transformar la
ecuacin de Frendlich a su forma logartmica.

log x/m = 1/n log C + log K

Esta ecuacin se parece a la forma general de la ecuacin de la recta:


y = ax + b y nos indica que el logaritmo de la concentracin en la superficie
x/m es funcin lineal de la concentracin de soluto (C) en la solucin.
Las superficies slidas pueden tambin adsorber sustancias en solu-
cin, esta adsorcin sigue por lo general, los mismos lineamientos que en
el caso de los gases y es afectado por los mismos factores; incluso la
ecuacin de Frendlich parece trabajar mejor que en el de los gases.

90
EXPERIMENTO 5
Tome cuatro matraces Erlenmeyerde 125 mi y numrelos. En cada uno
de ellos deposite 0.5 gr de carbn activado en polvo. En seguida agregue a
cada matraz, solucin de cido oxlico.en las siguientes concentraciones:
matraz 1 solucin 0.05 N; matraz 2 solucin 0.2 N; matraz 3 solucin 0.4N
matraz 4 solucin 0.8 N; un volumen igual a 50 mi en cada matraz.
Agite fuertemente durante 3 minutos todos los matraces y luego djelos
en reposo por 10 minutos. A continuacin filtre.
Tome 10 mi de cada filtrado y adicione 2 gotas de solucin de fenoftalena.
Titule por separado cada alcuota con NaOH 0.2 N y anote la diferencia entre
la cantidad de NaOH 0.2N que debi gastarse y la que realmente gast.
Esta diferencia ser la cantidad de cido oxlico que qued adsorbida
al carbn.
Calcule la cantidad de cido oxlico adsorbido en miligramos en cada
caso. Utilizando la ecuacin de Frendlich, construya la grfica correspon-
diente colocando en las ordenadas los valores de x/m y en las abscisas los
valores de C.

a) Qu tipo de curva se obtiene?


b) Cules son los valores de K y n obtenidos en la grfica?
c) Qu caractersticas debe tener el adsorbente (carbn) utilizado en
este experimento?

ADSORCIN PREFERENTE O SELECTIVA

En ocasiones las superficies slidas se recubren de capas slidas, l-


quidas o gaseosas, representando un problema la eliminacin de estas
sustancias, para lo cual se emplean frecuentemente agentes tensoactivos
que por adsorcin preferente logran desplazarlas.

EXPERIMENTO 6

Coloque en un tubo de ensaye, 5 mi de solucin de azul de metileno


diluida y agregue 0.5 gramos de carbn en polvo. Agite la mezcla y filtre.
Coloque en otro tubo de ensaye, 2 mi. de una solucin concentrada de
fenol, 5 mi. de agua y 0.5 mi. de vaselina, de manera que formen 3 capas
separadas. A continuacin tome con un agitador un poco de carbn reteni-
do en el papel que utiliz para filtrar y hgalo descender por el tubo que
contiene las capas de fenol-agua- vaselina.

a) Qu aspecto tiene el filtrado?


b) Qu ocurre cuando las partculas de carbn atraviesan la capa
acuosa?
c) Qu sucede al entrar en contacto las partculas de carbn con la
capa fenlica?

91
d) Explique el fenmeno de adsorcin en base a las caractersticas ob-
servadas en el filtrado.

ADSORCIN ELCTRICA

Se ha denominado as al fenmeno mediante el cual la acumulacin de


las sustancias en la superficie depende de su carga elctrica y no de la
energa de superficie. Este fenmeno se diferencia de la adsorcin propia-
mente dicha, en que es un fenmeno irreversible y en que no es afectado
por la temperatura. Se puede demostrar en el laboratorio estudiando el com-
portamiento de superficies de carga elctrica negativa, como el papel filtro,
frente a colorantes. Un colorante electropositivo, es adsorbido fuertemente
y no puede ser lavado.
En cambio, un colorante electronegativo, por tener la misma carga que
el papel no es fijado, se extiende en una mayor superficie y puede ser fcil-
mente separado por lavado con agua.

ADSORCIN DE COLORANTES

DETERMINACIN DE LA CARGA ELCTRICA

Los colorantes son sales disociables que se clasifican segn la carga


elctrica de sus iones cromforos. Los que tienen carga positiva se deno-
minan colorantes bsicos y los que tienen carga negativa se denominan
colorantes cidos.

EXPERIMENTO 7.
Para determinar la carga elctrica de un colorante, utilice cuadros de
papel filtro de 3 x 3 cm y deposite en el centro una gota de colorante proble-
ma. Observe la extensin de la mancha y luego lvelos en un recipiente
con agua de la llave.
Para tener un patrn de comparacin, observe el comportamiento de
dos colorantes, uno positivo y otro negativo. Como colorante bsico (posi-
tivo) utilice solucin diluida de azul de metileno y como colorante cido (ne-
gativo) use fucsina acida.

a) Relacione el grado de extensin de la mancha y su comportamiento


al lavado, con la carga elctrica, en ambos colorantes. Tomando
como base este comportamiento, determine la carga elctrica de los
colorantes rojo neutro y safranina.

92
b) Carga elctrica del rojo neutro, e)
Carga elctrica de la safranina.

SISTEMAS DISPERSOS, CARACTERSTICAS Y


PROPIEDADES.

Los sistemas dispersos estn formados por partculas de materia que


constituyen la fase dispersa, distribuidas en un medio continuo o fase de
dispersin. De acuerdo al dimetro de las partculas del material disperso,
dichos sistemas se clasifican en: dispersiones moleculares (ej. soluciones
de glucosa, de sales, ter); sistemas coloidales (ej. polmeros naturales y
sintticos, soluciones de protenas); y, suspensiones groseras.

PREPARACIN DE UN SISTEMA COLOIDAL Y


OBSEVACION DEL FENMENO DE TYNDALL-FARADAY

EXPERIMENTO 8
En un tubo de ensaye coloque 10 mi. de agua destilada y aada 2 o 3
gotas de una solucin de brea en alcohol al 3 %.
Agite vigorosamente la mezcla; describa su apariencia y observe el fe-
nmeno de Tyndall-Faraday, comparndolo con una solucin verdadera (por
ejemplo, de NaCIO.IN).

a) Enuncie diferentes mtodos de preparacin de coloides.


b) Cul de estos mtodos emple en la preparacin del coloide de brea
en agua?
c) Explique brevemente a qu se debe el fenmeno de Tyndall-Faraday.
d) Es posible observar el fenmeno de Tyndall-Faraday en las solu
ciones verdaderas?

CARACTERSTICAS DE LOS SISTEMAS COLOIDALES

Tamao de las partculas. El tamao de las partculas coloidales vara


entre 0.1 - 0.0001 |i Cuando el tamao de la micela se aproxima a 0.1 JJ. de
dimetro las propiedades del sistema son similares a las de las suspensio-
nes groseras y cuando son de 0.0001 n son comparables a las soluciones
verdaderas. El tamao de la partcula es responsable de las principales pro-
piedades de los sistemas coloidales, tales como la estabilidad, propieda-
des catalticas y propiedades pticas.
Stokes ha demostrado que la velocidad de sedimentacin es proporcio-
nal al cuadrado del radio de la partcula, por lo tanto, entre ms pequeo

93
sea el radio de la partcula, menor ser su velocidad de sedimentacin y
mayor su estabilidad.
Las propiedades catalticas de algunos sistemas coloidales dependen
tambin de la superficie que presentan las partculas dispersas, la cual es
mayor entre menor sea el tamao de las partculas.
A simple vista, algunos sistemas coloidales presentan cierta turbidez y
una ligera coloracin azul o violeta; sto se debe a que los rayos de luz se
refractan y se dispersan al chocar con las partculas. Debido a sto, es
posible observar en ciertos sistemas coloidales el paso del rayo de luz en
forma de cono. Este fenmeno se conoce como fenmeno de Tyndall
Faraday.

Carga elctrica. Todas las partculas coloidales poseen carga elctrica,


la cual puede estar dada en algunos sistemas coloidales por grupos qumi-
cos ionizables presentes en la propia molcula, como en las protenas. O
bien, pueden adquirir la carga por adsorcin de iones que existan en la
solucin, como en los coloides liofbicos.
La estabilidad de las soluciones coloidales depende en gran parte de la
carga elctrica de las partculas.

Capa de hidratacin o de solvatacion. Los sistemas coloidales se pue-


den dividir en lifilos o hidrfilos y lifobos o hidrfobos.
Los sistemas lifilos (entre los que se encuentran las protenas y algu-
nos polisacridos) son mas estables que los lifobbs y para precipitar ne-
cesitan cantidades mayores de electrolitos.
La estabilidad de los sistemas lifilos depende de la carga elctrica de
sus partculas y adems de su capa de solvatacion, mientras que los coloides
lifobos carecen de esta capa y su estabilidad est dada slo por la carga
elctrica de sus partculas. Si la carga se neutraliza totalmente o se reduce
por debajo de cierto valor crtico, las partculas se agrupan y precipitan.

ACCIN PROTECTORA DE LOS SISTEMAS


COLOIDALES LIOFILICOS.

El hecho de que los sistemas liof licos posean adems de la carga elc-
trica una capa de solvatacion les confiere mayor estabilidad, a tal grado que
se utilizan en la industria alimenticia, en la industria qumico-farmacutica,
etc., para proteger o estabilizar un sistema coloidal liofbico o una emulsin.
El poder protector de un sistema coloidal lioflico se puede cuantificar me-
diante el llamado nmero de oro, que se define como "la cantidad, en
miligramos, de un sistema lioflico seco necesario para impedir que 10 mi.
de coloide de oro se alteren cuando se agrega 1 mi. de solucin de NaCl al
10%."

94
EXPERIMENTO 9
En un tubo de ensaye coloque 2 mi. de solucin de gelatina al 3% y aada
2 mi. de solucin de nitrato de plomo (Pb(NO3)2) 0.1 M. En otro tubo de
ensaye coloque 2 mi. de solucin de almidn al 3% y agregele 2 mi de la
misma solucin de Pb(NO3)2 0.1 M.
En un portaobjetos coloque una gota de cada una de las mezclas ante-
riores y una gota de solucin de Pb(NO3)2 0.1 M.
Deposite en el borde de cada una de las tres gotas anteriores, con ayu-
da de un gotero, una gota de solucin de dicromato de potasio (K2Cr207)
0.2M.

Observe la magnitud y velocidad de precipitacin en cada caso.

a) De las sustancias empleadas identifique los coloides lioflicos protec-


tores y explique su accin sobre el dcromato de plomo obtenido.

EMULSIONES

Una emulsin es un sistema termodinmicamente inestable formado por


dos lquidos inmiscibles, uno de los cuales est disperso en forma de gotas
en el otro lquido. El tamao de las partculas dispersas puede o no corres-
ponder al tamao de las micelas coloidales pero, generalmente, el estudio
de las emulsiones est asociado al de dichos sistema, puesto que la esta-
bilidad de las emulsiones depende de la presencia de un agente emulsifi-
cante de naturaleza coloidal.
El que dos lquidos inmiscibles permanezcan mezclados se explica por
el hecho de que las fuerzas de cohesin entre las molculas de cada lqui-
do individual o separado, son mayores que las fuerzas de adhesin entre
los dos lquidos.
Cuando un lquido es disgregado en pequeas gotitas, el rea interfasal
de los glbulos constituye una superficie enormemente mayor que la su-
perficie original del lquido, por lo tanto la energa libre de superficie tam-
bin se incrementa.

95
Tipos de emulsiones. Invariablemente uno de los lquidos que partici-
pan en la emulsin es de naturaleza polar (por ej. agua) y el otro es relativa-
mente no polar (por ej. aceite). Cuando el aceite es dispersado en forma de
glbulos en una fase acuosa continua, el sistema es considerado como una
emulsin aceite en agua. Cuando la fase oleosa es la fase continua, la
emulsin es de agua en aceite. Muchas emulsiones de uso medicinal para
administracin oral son emulsiones del tipo aceite en agua que requiere de
un agente emulsificante como gelatina, goma de acacia, goma de tragacanto,
etc. Sin embargo, algunas emulsiones de consumo comn como la mante-
quilla y salsas para ensaladas son emulsiones del tipo de agua en aceite.
El tipo de emulsin depender de varios factores tales como concentracin
de cada fase, tipo de emulsificador, tensin superficial de cada lquido, etc.
Los agentes emulsificantes ms eficaces para todo sistema que con-
tenga agua, son los que ms activamente disminuyen la tensin superficial
de ella.
Bancroft demostr que si se emulsiona aceite y agua en presencia de
un jabn de sodio, las emulsiones resultantes son de tipo aceite en agua,
pero cuando se emplean jabones de calcio, las emulsiones son de agua en
aceite. Esto se debe segn Bancroft, a que el jabn de sodio es ms solu-
ble en agua y disminuye su tensin superficial en grado suficiente para
permitir emulsionar grasa.
Adems de los jabones de sodio, otras sustancias como monoacilglic-
ridos, sales biliares, etc, favorecen la emulsin de grasa, y en estas condi-
ciones, son ms fcilmente atacadas por las lipasas cuando se encuentran
en el intestino para ser hidrolizadas. As tambin las vacunas son ms efec-
tivas en la produccin de anticuerpos cuando se encuentran emulsionadas,
ya que son englobadas mejor las partculas antignicas por los macrofagos
(primera fase en la formacin de anticuerpos).

PREPARACIN E IDENTIFICACIN DE EMULSIONES


DE ACEITE EN AGUA

IDENTIFICACIN DEL TIPO DE EMULSIN

Son varios los mtodos empleados para determinar el tipo de emulsin,


entre los que podemos mencionar:
1.- Mtodo de Briggs. Se coloca una gota de emulsin en un portaobjetos
y se agrega una gota de agua; si se observa una mayor dispersin, la
emulsin ser de aceite en agua, pero si se observa una aglutinacin la
emulsin es de agua en aceite.
2.-Mtodo de Robertson. Se coloca una gota de la emulsin en un
portaobjetos y se agrega Sudn III en polvo, colorante de grasas. Con ayu-

96
da de un agitador de punta delgada se mezcla bien la emulsin hasta que
la coloracin sea uniforme. Si se observan slo puntos de color rojo en fon-
do sin colorear, la emulsin es de aceite en agua; s la emulsin toma una
coloracin roja y slo permanecen pequeos puntos sin teir, la emulsin
es de agua en aceite.

EXPERIMENTO 10

a) Emulsin de aceite en agua.

En un tubo de ensaye con 9 mi. de agua destilada, disuelva poco a poco


1 g de goma arbiga y 1 mi de aceite de algodn. Homogeneice esta mez-
cla (es necesario agitar enrgicamente para que la emulsin de aceite en
agua que se ha preparado sea estable). Conservarla para su identificacin.

b) Emulsin de agua en aceite.

En un tubo de ensaye coloque 1.0 g de goma arbiga, 1.0 mi de agua


destilada y 9.0 mi de aceite de algodn. Agite perfectamente esta mezcla
hasta conseguir que la emulsin sea estable. Consrvela para su identifi-
cacin.

c) Identifique el tipo de emulsin por los mtodos de Briqgs y


Robertson.

1.- Observe la diferencia existente en ambos sistemas por los mtodos


utilizados.
2.- Haga un juicio crtico a los mtodos y diga cul considera usted el
ms efectivo.

97
LIPIDOS

Este grupo de compuestos esenciales para los organismos y que tam-


bin se encuentran en los productos naturales, son un conjunto heterogneo
de molculas orgnicas de cuyas propiedades, lo que mejor las relaciona
entre s, es su insolubilidad en agua y solubilidad en solventes no polares
como el benceno, cloroformo, ter, etc. Por lo que este grupo incluye sus-
tancias de muy diversa estructura. Suelen ser molculas de nmero relati-
vamente alto de tomos de carbono e hidrgeno y bajo en tomos de ox-
geno; ciertos lpidos tambin poseen tomos de fsforo, nitrgeno, y azufre
en su molcula.
Cualquier clasificacin presenta sus limitaciones y la nomenclatura puede
producir falsas interpretaciones ya que idntica terminologa ha sido em-
pleada por diferentes autores para denominar a distintos grupos de lpidos.
De los lpidos ms recientemente estudiados son por ejemplo: prosta-
glandinas, tromboxanos, leucotrienos, etc, ya que este tipo de sustancias
hasta hace poco se consideraban muy complejas y de poco inters.
Las funciones de los lpidos son muy variadas y las ms aceptadas ac-
tualmente son las siguientes:
1. Funcin estructural, principalmente en las membranas celulares.
2. Actan como material de energtico y de reserva.
3. Intervienen en ei transporte de algunos compuestos energticamente
activos y, como precursores de otros.
, 4. Algunos lpidos actan como componentes protectores de la pared
celular de ciertas bacterias, plantas, insectos y vertebrados.
5. Dentro de los lpidos se encuentran sustancias de gran actividad bio
lgica como vitaminas y hormonas. Las cuales se consideran como
verdaderos reguladores metablicos.
6. La capa de tejido subcutneo, abundante en lpidos, sirve como aislante
trmico y como proteccin alrededor de determinados rganos.

PROPIEDADES FSICAS DE LOS LIPIDOS


ESTADO FSICO.

Los acilgliceroles se pueden encontrar en la naturaleza en forma slida


(grasas) o en forma lquida (aceites). Esto depende fundamentalmente del
tipo de cidos grasos, los aceites generalmente contienen cidos grasos de
bajo peso molecular o cidos insaturados; las grasas, por el contrario, po-
seen principalmente cidos grasos de elevado peso molecular y saturados.

98
PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO 1.
Describa el estado fsico de los siguientes lpidos:

LIPIDO: ESTADO FSICO:


Aceite de algodn.
Grasa de algodn.
Mantequilla
Acido esterico.

a) Cules son los cidos grasos ms abundantes en el aceite de


algodn?
b) En qu difieren el aceite y la grasa de algodn?

SOLUBILIDAD

Los grupos principales de los lpidos, tienen caractersticas de solubilidad


diferentes y esta propiedad se utiliza en la extraccin y purificacin de los
mismos a partir de materiales biolgicos.

EXPERIMENTO 2
Determinar la solubilidad en fro, a temperatura ambiente y en caliente
(en bao mara a ebullicin) de los lpidos utilizados en el experimento an-
terior con los solventes indicados:
SOLVENTE -> AGUA ALCOHOL CLOROFORMO BENCENO
LIPIDO-i temp. a caliente temp. a caliente temp. a caliente temp. a caliente
Aceite de algodn
Mantequilla
Grasa de algodn
Acido esterico

EMULSIFICACION DE LAS GRASAS


La mayora de los lpidos son solubles en etanol 95% v/v pero forman
una emulsin de gotas pequeas cuando se les agrega agua. Esto da a la
suspensin una apariencia lechosa caracterstica y constituye una prueba
muy sensible para grasas.

99
Las grasas y los aceites de los alimentos no son solubles en agua, por
lo tanto, para que puedan ser absorbidos tienen que ser hidrolizados o fina-
mente emulsificados. Las sales biliares desempean una funcin muy im-
portante ya que por ser tensoactivas negativas favorecen la formacin de
emulsiones.

PREPARACIN E IDENTIFICACIN DE EMULSIONES

EXPERIMENTO 3.
En un tubo de ensaye coloque 1 mi. de aceite de algodn y 5 mi. de
agua. Agite fuertemente hasta formar una emulsin.
En otro tubo de ensaye coloque 1 mi. del mismo aceite, 5 mi. de agua y
1 mi. de solucin de bilis al 1%. Agite fuertemete y observe.

a) Qu diferencia observa en los dos tipos de emulsin?

TINCIN DE LAS GRASAS

El sudan III es un colorante especfico de grasas, por lo que se usa


genereralmente para su anlisis cualitativo. Esta prueba es de gran utilidad
en el anlisis de heces y gracias a ella se pueden descubrir trastornos de la
digestin.

EXPERIMENTO 4

Coloque en un portaobjetos una pequea gota de emulsin estable del


esperimento anterior, aada unos cuantos cristalitos de Sudan III y observe
al microscopio.

a) Qu tipo de emulsin identific en cada caso?


b) Haga su esquema

MANCHA TRANSLCIDA.

Formacin de la mancha translcida en papel. Los lpidos, en general,


tienen la propiedad de manchar el papel dejando una mancha translcida
caracterstica y duradera.

100
EXPERIMENTO 5
Coloque una gota de aceite de algodn sobre un papel filtro, y observe
el tipo de mancha que se produce. Repita el experimento utilizando indis-
tintamente cualquier compuesto no lpido, por ejemplo: agua, alcohol etlico,
ter, acetona, etc.
a) Explicar si observa alguna diferencia entre los compuestos no lpidos
y los lpidos.
b) Qu utilidad cree que pueda tener esta propiedad de ios lpidos?

OBTENCIN DE LPIDOS DE PRODUCTOS NATURALES

La separacin de los diferentes lpidos que se encuentran constituyendo un


tejido, es aparentemente una operacin sencilla basada en el uso de sol-
ventes selectivos. Sin embargo, es necesario tomar en cuenta varios facto-
res que pueden complicar la purificacin:

1. La mayor parte de los lpidos que se encuentran en los organismos


no se encuentran libres, sino formando complejos con protenas y polisa-
cridos. Estos complejos se pueden romper para liberar los lpidos, pero
generalmente son menos estables.

2. Muchos lpidos presentan gran afinidad para combinarse con mate


rial no lpido y sto dificulta la purificacin.

3. Los lpidos que contienen cidos grasos insaturados pueden presen


tar el fenmeno de auto-oxidacin y esto modifica sus propiedades y por !o
tanto dificulta su separacin.

4. Los solventes de grasas tienden a formar emulsiones con el agua de


los tejidos. En ocasiones se recomienda secar antes de la extraccin, pero
los rendimientos disminuyen considerablemente.

5. Por regla general en los tejidos existen enzimas capaces de hidrolizar


los lpidos, y es posible que se degrade un lpido durante su purificacin si
no se inactivan previamente.

6. Los solventes que se utilizan para la extraccin poseen diferentes


afinidades segn el tipo de lpido. Por esto se recomienda utilizar varios
solventes o mezclas de ellos si se desea una extraccin completa.

Un solvente muy til para la extraccin de lpidos es la acetona, debido


a que produce una rpida deshidratacin de los tejidos y extrae las grasas,
esteres de esterles y otros lpidos simples. Los lpidos complejos, son re-
lativamente insolubles en acetona. El ter y hexano, extraen casi totalmen-
te los fosfolpidos (glicerofosftidos), el alcohol caliente extrae los esfingo-
lpidos, etc.

101
EXTRACCIN DE LIPIDOS DE CEREBRO.

EXPERIMENTOS
Pese 5 g de cerebro y tritrelos perfectamente en un mortero con 30 mi
de una mezcla (200:100:1) de cloroformo metanol-ac. clorhdrico por 10
minutos. Una vez obtenido el homogenizado agregue 3 mi de HCI 1N.,
mezcle y centrifugue a 2000 rpm por 10 minutos. Separe el paquete celular,
la fase clorofrmica y la metanlica.
Se obtienen dos fases:

a) Clorofrmica, que se usar para la identificacin de colesterol,


la separacin cromatogrfica de fosfolpidos y la formacin de
membranas.

b) Metanlica que servir para la identificacin de cerebrsidos.

REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE LIPIDOS

IDENTIFICACIN DE CEREBRSIDOS

EXPERIMENTO 7
Utilizando 1 mi del extracto metanlico obtenido en la extraccin de
lpidos de cerebro, trate de demostrar la presencia de cerebrsidos utilizando
la reaccin de Molisch-Udransky cuya tcnica y fundamento ya han sido
descritos anteriormente.

IDENTIFICACIN DE ACILGLICEROLES

REACCIN DE LA ACROLEINA

Una de las reacciones ms usadas para la identificacin de acilglicridos,


es la formacin de la acrolefna o aldehido acrlico, el cual se puede obtener
por deshidratacin del glicerol o de cualquier glicrido y se reconoce fcil-
mente por su fuerte olor acre caracterstico.

EXPERIMENTO 8

Coloque en dos tubos de ensaye secos, un poco de bisulfato de potasio


y aada 3 o 5 gotas de glicerina en uno de los tubos y en el otro 5 gotas de

102
aceite de algodn, crtamo o girasol. Caliente cuidadosamente y huela los
vapores PRECAUCIN!

a) Se puede considerar esta reaccin general para cualquier lpido?


Porqu?
b) Escriba la reaccin que se ha efectuado.

REACCIN DE HANUS

El grado de insaturacin de los cidos grasos que forman parte de un


lpido es uno de los factores determinantes en sus propiedades fsicas,
qumicas y fisiolgicas. Se ha observado que aparecen ms dobles enla-
ces en los triacilgliceroles de almacenamiento y en los lpidosestructurales
cuando la temperatura ambiente disminuye, los dobles enlaces disminuyen
el punto de fusin por lo que se cree que sea un mecanismo del organismo
para impedir la cristalizacin de los lpidos en los tejidos.
El reactivo de Hanus es una solucin de yodo y bromo que nos permite
determinar el grado de insaturacin de un lpido, midiendo la capacidad que
tiene para fijar halgenos en su molcula.

EXPERIMENTO 9

Coloque en 3 tubos de ensaye limpios y secos 6 mi. de soluciones cloro-


frmicas al 10%,de aceite de algodn, aceite de crtamo y monoestearilgli-
cerol. Aada a cada tubo 5 gotas del reactivo de Hanus y agite vigorosamen-
te. Anote cada 30 min. el grado de decoloracin de cada tubo protegindolos
de la luz.

a) Anote sus resultados en la siguiente tabla:

30 min. 60 min. 90 min. 120 min.

Aceite de Algodn
Aceite de Crtamo
Monoestearilglicerol

103
REACCIONES DE IDENTIFICACIN
DEL COLESTEROL

REACCIN DE SALKOWSKY

Cuando una solucin clorofrmica de colesterol se mezcla con H2SO4


conc, se produce una serie de colores caractersticos. Hasta la fecha se
desconoce el mecanismo de la reaccin y la naturaleza qumica del pro-
ducto o de ios productos coloridos que se forman. Sin embargo es probable
que el color se deba a la formacin de dobles enlaces conjugados en el
ncleo del colesterol, o bien, a la conjugacin de dos molculas de colesterol,
para formar bi-esteroides.

EXPERIMENTO 10

Prepare una serie de 3 tubos de ensaye. Aada al tubo No. 1, 3 mi. de


cloroformo (servir como testigo); al tubo No. 2,3 mi. de solucin clorofrmica
de colesterol puro, y al tubo No. 3,3 mi. de extracto clorofrmico de colesterol
obtenido en la extraccin de lpidos de cerebro (exp. 6). Agregue a cada
tubo 1 mi. de H2SO4 conc, resbalndolo lentamente por las paredes del tubo.

a) Observe y describa los cambios de coloracin que se producen

REACCIN DE LIEBERMANN-BURCHARDS

El anhdrido actico se puede condensar con los grupos -OH, en posi-


cin 3 de esterles como el colesterol y dar los correspondientes esteres.
Si el esterol tiene un doble enlace en posicin 5, se produce adems una
epimerizacin y una deshidratacin en presencia de H2SO4 conc, dando
como resultado una serie de compuestos de estructura desconocida que
se caracterizan por tener colores que van del rojo al azul y del azul al verde.
Esta reaccin es especfica, por lo tanto, paro todos los esterles que ten-
gan un grupo -OH en posicin 3 y un doble enlace en posicin 5.

EXPERIMENTO 11

Prepare 2 tubos de ensaye. En el tubo No. 1 coloque 3 mi. de solucin


clorofrmica de colesterol puro y en el tubo no. 2, 3 mi. de solucin
clorofrmica de colesterol obtenido en la extraccin de lpidos de cerebro
(exp. 6). Aada a los 2 tubos, 1 mi. de anhdrido actico y mezcle bien,
aada lentamente, resbalndolo por las paredes del tubo, 1 mi de H2SO4
concentrado.

a) Observe y describa los cambios de coloracin que se producen.

104
IDENTIFICACIN DE FOSFOLIPIDOS DE CEREBRO
POR CROMATOGRAFA EN PLACA FINA
Como una aplicacin del fenmeno de adsorcin, que se estudia en la prc-
tica de fenmenos de interfase, se desarrollar la tcnica de cromatografa
en placa fina, para separar los diferentes fosfolfpidos extrados del cerebro.

EXPERIMENTO 12

Diluya 1:1 con cloroformo, un volumen pequeo (0.5 a 1ml.) del extrac-
to clorofrmico obtenido en el experimento No. 6. Utilizando una pipeta
Pasteur, aplique 1 gota de esta dilucin en 3 puntos equidistantes, en una
cromatoplaca previamente preparada, aproximadamente a 2 cm de altura
de la base.
Permita que el cloroformo se evapore y entonces introduzca la placa en
una cubeta de vidrio que contenga como solvente de elucin, una mezcla
de cloroformo-metanol-c. actico-agua (65:25:8:4). Deje desarrollar el
cromatograma hasta el frente del solvente ya marcado; saque la placa de
la cubeta y djela secar.
En esta forma se tendrn 3 cromatogramas idnticos en la misma pla-
ca, los cuales se van a revelar con diferentes reactivos. Esto se puede ha-
cer cubriendo con una placa de vidrio los cromatogramas que no se deseen
revelar.
Se revelar un cromatograma con el reactivo de molibdato, este reac-
tivo revela todos los fosfolpidos. Otro cromatograma se revelar con el
reactivo de bismuto, ste es especfico para fosfolpidos que contengan co-
lina. Otro cromatograma se revelar con ninhidrina y pondr de manifiesto
a los fosfoaminolpidos. Las dos primeras reacciones ocurren a temperatu-
e
ra ambiente y la tercera debe calentarse a 100 C. por 10 minutos.

PERMEABILIDAD DE LA BICAPA LIPIDICA

En este captulo de lpidos no podemos dejar de mencionar a las mem-


branas ya que hacen posible la existencia de organismos complejos, por
que separan las clulas en el interior de los tejidos y los organelos celula-
res dentro de las clulas, formando compartimentos con propiedades
fsico-qumicas diferentes, lo que permite una diferente organizacin; y cada
compartimento se vuelve una parte individual de un conjunto ms comple-
jo. Se ha comprobado que las membranas son complejos lipoproteicos que
contienen 60% - 75% de protena y 25% - 40% de lpidos.
En este experimento usaremos monocapas lipdicas como modelos de
membrana. Al estratificar butanol sobre agua y adicionar un lpido, ste se
situar en la interfase, orientndose la parte polar lipdica a la fase acuosa,
y la parte hidrofbica a la fase orgnica. Si ahora se coloca un colorante se
puede observar la difusin pasiva a travs de la membrana.

105
EXPERIMENTO 13
Preparar 4 tubos de ensaye como se indica en la siguiente tabla colo-
cando las soluciones con mucho cuidado resbalando por las paredes del
tubo para estratificar.

1 1 2 3 4

Agua 5 5 5 5
Azul de metileno en butanol ms 2 ;

monoesterato de glicerilo
Azul de metileno en butanol ms 2
fosfolpidos*
Azul de metileno en butanol ms 2
colesterol
:
Azul de metileno en butanol 2

* 2.0 m de! extracto clorofrm'ico obtenido en el experimento 6 se eva-


pora a sequedad (cuidando que no se queme), el residuo se redisuelve
con 2.0 mi de azul de metileno en butanol y agregue este contenido al tubo
No. 2 de la serie.

Dejar los tubos en reposo procurando moverlos lo menos posible y ha-


cer observaciones a las 2, 4 y 24 horas.

a) Observ el paso del colorante en todos los tubos?


b) Explique a qu se debe la diferencia.

106
DIGESTIN

Los seres vivos para subsistir requeren un suministro continuo de energa


libre, por tres razones principales;

1) Para la sntesis de molculas y macromleculas de importancia bio


lgica, a partir de compuestos ms simples.

2) Para mantener la distribucin inica y el transporte activo de iones y


molculas a travs de las menbranas de las clulas que las constituyen.

3) Para realizar trabajo mecnico, tal como el desarrollado en el movi


miento de los organismos unicelulares y la actividad muscular de los
animales superiores.

Esta energa la obtienen los seres vivos, invariablemente de oxidacin


o de combustin de los alimentos, que son generalmente compuestos qu-
micos procedentes de otros animales o de vegetales, tales como; prote-
nas, lpidos y glcidos los cuales se caracterizan por ser de elevado peso
molecular y de estructura muy compleja; por lo que la mayor parte de ellos
no pueden ser absorbidos directamente. Para que puedan ser asimilados
por el organismo deben ser degradados a sus componentes ms sencillos
es decir: las protenas a aminocidos, los oligo y polisacridos a monosa-
cridos y los lpidos a alcoholes y cidos grasos. Todo el conjunto de proce-
sos hidrolticos y mecnicos que sufren los alimentos para que puedan ser
asimilados se denomina "Digestin" sta puede ser extra o intracelular. En
la mayor parte de los organismos inferiores la digestin es intracelular ,no
as en los organismos superiores en los que es extracelular y se realiza en
un tubo digestivo.
Todos los cambios qumicos que ocurren durante el proceso de diges-
tin se efectan con ayuda de enzimas, las cuales se encuentran distribui-
das en diferentes zonas del aparato digestivo. Uno de los factores que ms
afectan la actividad de las enzimas es el pH. Cada enzima presenta su
mxima actividad a un determinado valor de pH (pH ptimo), valores ms
cidos o ms alcalinos disminuyen notablemente la actividad de la enzima;
considerando que en el tubo digestivo existen zonas con pH muy diferen-
tes, en esta prctica se efectuarn los diferentes experimentos necesarios
para confirmarlo.

107
PARTE EXPERIMENTAL

DETERMINACIN DE pH EN DIFERENTES REGIONES


DEL APARATO DIGESTIVO

EXPERIMENTO 1
Se utilizarn como animales de experimentacin conejos adultos, los
cuales se sacrificarn por descerebracin. Se abrir el abdomen y se ex-
pondr el aparato digestivo "in sit'. Con todo cuidado se har una incisin
en el esfago, en el estmago, en diferentes niveles del intestino delgado
(duodeno, yeyuno e leon), intestino grueso y recto. En caso necesario re-
tire los restos de alimento presente en la regin de estudio. Con ayuda de
un gotero terminado en capilar se tomar una pequea cantidad del lquido
presente en cada zona y se depositar sobre un pedazo de papel pH, te-
niendo cuidado de lavar el gotero muy bien, antes de cada determinacin.
Se puede tambin hacer la determinacin introduciendo un pequeo peda-
zo de papel pH, con ayuda de unas pinzas en cada parte mencionada ante-
riormente, teniendo cuidado de no tocar lquidos de otras zonas.

a) Resuma sus resultados en la siguiente tabla:

CAVIDAD pH
Boca
Esfago
Estmago

duodeno
Intestino
yeyuno
delgado
ileon
Intestino grueso
Recto

DIGESTIN EN LA BOCA.

La digestin en los organismos superiores, como el hombre, se inicia


en la boca con la masticacin de los alimentos transformndolos en una
papilla ntimamente mezclada con saliva. La saliva desempea una doble
funcin, por una parte el agua y las mucinas lubrican el bolo alimenticio, por
otra, las enzimas que contiene inician la digestin. Sin embargo, en condi-
ciones normales, debido al poco tiempo que permanecen los alimentos en

108
la boca, el proceso hidroltico no es completo y debe ser terminado en otras
zonas del tubo digestivo.
La saliva es un lquido viscoso que contiene un 99.5% de agua aunque
este valor puede variar. El pH es 6.8 - 7.2 y posee varias enzimas entre otras
est la amilasa, que hidroliza los almidones hasta maltosa, la fosfatasa
alcalina que hidroliza algunas uniones de ster fosfrico, una lipasa que
hidroliza cidos grasos de bajo peso molecular en posicin alfa y que tra-
baja a pH ligeramente cido.

EXPERIMENTO 2

Colecte aproximadamente 10ml de saliva y diluyala con 30 mi de agua


destilada fra; si la solucin est turbia filtre a travs de un pedazo de gasa
limpia. Con el filtrado, que se conservar en hielo para las determinaciones
enzimticas, efecte los siguientes ensayos.

a) Determinacin del pH, puede hacerla con el potencimetro o con pa


pel pH.

b) Determinacin de cloruros, en un tubo de ensaye se colocan 3 mi de la


dilucin de saliva y se les aade 1 mi de solucin de AgNO3 0.1 N. la apari
cin de turbidez o un precipitado blanco nos indicar la presencia de cloruros.

c) Determinacin de protenas, en un tubo de ensaye se colocan 3 mi


de saliva diluida, se aade 1 mi de NaOH 10% y una gota de solucin de
sulfato de cobre 1%. La reaccin ser positiva si en no ms de 20' aparece
una coloracin rosa o violeta.(reaccin de biuret).

d) Eliminacin de cloruros por dilisis, tome 15 mi de la solucin de sa


liva diluyala con 28 mi de agua destilada , tome 10 mi y colquelos en un
tubo de dilisis. Guarde el resto en hielo. Dialice contra agua destilada (este
es un proceso lento, debe iniciar la prctica con este experimento y dejar
lo), cambiando el agua del vaso cada 30 minutos para que pueda observar
una diferencia significativa. El contenido del saco de dilisis se conserva
en hielo para el experimento g.

e) Inhibicin de fosfatasa y amilasa por calentamiento, coloque en un


tubo de ensaye 5 mi de la dilucin salival y caliente a ebullicin por 3 minu
tos (con precaucin para que no se derrame).

f) Determinacin de fosfatasa, prepare dos tubos de ensaye de la siguien


te manera:

109
BLANCO PROBLEMA

Saliva hervida (inciso e) 1


Saliva recin emitida 1
Sustrato para fosfatasa 0.1 0.1
(Bioxon)
Solucin amortiguadora 1 1
Colocar en bao mara
a37C15'
Reactivo desabollador 4 4
de color p/fosfatos
Deje en reposo 10'
compare sus resultados

g) determinacin de amilasa, prepare una serie de ocho tubos de ensa-


ye y numere, para estas determinaciones se usar la saliva que se diluy
en el experimento d (dializada y sin dializar), siguiendo las instrucciones de
la siguiente tabla:
1 2 3 4 5 6 7 8

reguladora PO4;pH=3.0 4
reguladora PO4;pH=7.0 5 4 4 3 4 3
reguladora PO4;pH=10.0 4
sustrato de almidn al 1% 5 5 5 5 5 5 5 5
dilucin de saliva s/ dializar (d) 1 1 1 1
dilucin de saliva dializada (d) 1 1
dilucin de saliva hervida (e) 1
solucin de NaCI 1 % 1 1

Mezcle el contenido y coloque los tubos en bao mara a 40C. Cada 3


minutos tome una gota de cada tubo de ensaye y coloquela sobre un mo-
saico blanco; aada luego una gota de lugol y, de acuerdo a la coloracin,
determine el grado de hidrlisis. Suspenda el anlisis en cualquier tubo que
d negativa la reaccin de lugol (color amarillo paja).

a) Resuma sus resultados en la siguiente tabla, indicando con Una (+)


la reaccin positiva y con el signo (-) si es negativa (puede indicar el color
que se obtiene en cada caso).

110
Reaccin de lugol

TUBO NO 'j 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo en 3
minutos 6
i 9
12
15
18 1

b) Indique en qu tubos hubo hidrlisis y explique en cada caso el resul-


tado.

DIGESTIN EN EL ESTOMAGO.

Una vez que el bolo alimenticio ha sido preparado, como ya se mencio-


n en digestin en la boca, pasa al estmago a travs del esfago, al llegar
al estmago se mezcla con el jugo gstrico, esta mezcla se denomina quimo.
El estmago sirve como almacn de alimentos, acta como zona anti-
sptica, bactericida y adems, desempea un papel importante en la diges-
tin. En l se encuentra el jugo gstrico, el cual en un organismo normal es
secretado de 1 a 3 litros al da, aunque se reabsorbe una gran cantidad.
La enzima original del jugo gstrico es una proteasa, la pepsina, que es
secretada como una proenzima y para activarse sufre una protelisis par-
cial. Esto constituye un mecanismo de control de la actividad, tpico de las
enzimas digestivas y de las que participan en la coagulacin de la sangre.
Esta proteasa por encontrarse en el estmago trabaja a pH muy cido
(1 a 3), en contraste con la amilasa y fosfatasa salivales que lo hacen a pH
casi neutro.

111
HIDRLISIS DE LA LECHE POR LA PEPSINA.

Para determinar la actividad de la pepsina se emplear un mtodo


simple.el mtodo de Ball y Hoover (aglutinacin de la leche)

EXPERIMENTO 3

Prepare una serie de 4 tubos como se indica en el cuadro siguiente:


1 2 3 4

Sustrato (leche) 5 5 5 5
Agua 0.8 0.6 0.4 0.2
Preincubacin a 40C por 5 min.
* Pepsina al 1 % en Buffer pH3 0.2 0.4 0.6 0.8
Incubacin a 40 C

* Despus de agregar la pepsina agite muy bien para que se redisuelvan


los pequeos grumos que se hayan formado ya que nos encontramos a un
pH por debajo del punto isoelctrico de la leche.
Con ayuda de un cronmetro, mida el tiempo desde el momento en que
se agreg la enzima al momento en que aparezcan grumos en la leche, lo
que nos indicar la accin de la pepsina.
Grafique la inversa del tiempo en las ordenadas contra la concentracin
de enzima en las abcisas e indique el orden de la reaccin

DIGESTIN INTESTINAL.

El tiempo que permanecen los alimentos en el estmago es variable,


pasando luego al intestino donde son sometidos a la accin de 3 secrecio-
nes digestivas: el jugo intestinal, el jugo pancretico y la bilis.
El jugo pancretico es un lquido transparente y viscoso de pH 7.5 a 8,
contiene una gran cantidad de enzimas entre las que se encuentran:el
tripsingeno que pasa a su forma activa, tripsina, por accin de la entero-
quinasa del jugo intestinal; quimotripsingeno y precarboxilasa que pasan
a quimotripsina y carboxilasa por efecto de la tripsina; amilasa y lipasa
pancretica, sta ltima acta sobre las grasas siempre y cuando estas sean
previamente emulsionadas por la secrecin biliar. Existen adems exopep-
tidasas, ribonucleasas, desoxirribonucleasas, colagenasa y colesteroleste-
rasas, que se complementan con las enzimas que contiene el jugo intesti-
nal. Este ltimo adems de la enteroquinasa contiene carboxipolipeptidasas,
polipeptidasas, aminopolipeptidasas, dipeptidasas, sacarasa, maltasa,
nucleosidasas y lecitinasas, entre otras.
Para comprobar la digestin a nivel intestinal veremos nicamente
la pancreatina. Antiguamente se crey que era una sola enzima y ahora

112
se sabe que es una mezcla de enzimas, nosotros comprobaremos su acti-
vidad lipoltica y proteoltica.

HIDRLISIS DE LIPIDOS POR LIPASA.

Debido a que las grasas no son solubles en agua, las enzimas deben
actuar en la interfase lpido-agua, por lo que se requiere de agentes
emulsificantes como las sales biliares que favorecen la accin hidroltica,
porque aumentan dicha interfase.

EXPERIMENTO 4.

a) En un matraz Erlenmeyer de 250 mi coloque 100 mi de alcohol; a


dales 4 a 5 gotas de fenoltaleina y titule con KOH 0.01 M hasta vire rosa.
Esta solucin se denominar alcohol neutro.
b) Prepare una serie de 4 tubos de ensaye como se indica en la siguien
te tabla:

1 2 3 4 5 i

Aceite vegetal 1 1 1 1 1
pancreatina 1% 1.5 1.5
Pancreatina 1% 1.5
Hervida
Bilis 6% 1 1 1

Se agitan bien para lograr una mezcla homognea y se colocan en bao


mara a 40C durante 60 minutos agitando de vez en cuando. Pasado este
tiempo se transfiere el contenido del tubo No.1 a un matraz Erlenmeyer de
250 mi enjuagando el tubo con 20 mi de alcohol neutro preparado previa-
mente en el inciso (a) para favorecer la solubilidad. Agregue 2 a 3 gotas de
fenolftalena como indicador y titule el contenido del matraz con solucin de
KOH 0.01 M agitando enrgicamente despus de cada adicin del lcali hasta
que vire. Repita el mismo procedimiento con los dems tubos de la serie.

c) A los mililitros de KOH gastados en los tubos 2, 3 y 4 rsteles los


mililitros gastados en el tubo 1 (testigo).
d) Hubo hidrlisis en los tubos con la enzima?
e) Observ diferencia en los tubos donde emple la bilis?

113
HIDRLISIS DE LA GELATINA POR LA PANCREATINA.

Las enzimas proteolticas, en general, catalizan la siguiente reaccin.

Entre mayor sea el nmero de enlaces peptdicos hidrolizados, mayor


ser el nmero de grupos carboxilo y amino libres. Por lo tanto es posible
determinar la magnitud de la hidrlisis de una protena midiendo el incre-
mento de grupos amino o carboxilo libres. Lo cual se puede cuantificar blo-
queando los grupos amino con formol en exceso y titulando con una base
los grupos amino con el pKa modificado, (titulacin de Srensen).

EXPERIMENTO 5
a) Coloque 150 mi de formol en un matraz Eriermeyer de 250 mi.
Aada 5 gotas de fenolftalena y titule con KOH 0.01 M hasta vire rosa.
Esta solucin se denominar formol neutro. En dos matraces Eriermeyer
de 125 mimi da exactamente 15 mi de esta solucin (matraz 1 y matraz
2).Coloque 100 mi de solucin de gelatina al 3% (disuelta en una solu
cin reguladora de carbonato sdico 0.1 M pH 7.5) en un matraz
Eriermeyer de 250 mi y ponga el matraz en un bao a temperatura
constante de 40C.
Una vez que la solucin alcance esta temperatura aada 10 mi de
solucin de pancreatina al 2%, mezcle, inmediatamente tome 2 muestras
de 10 mi y colquelas en los matraces con formol neutro que quedaron
listos en el inciso
(a), agregue 3 a 4 gotas de fenolftalena como indicador. Titule con
KOH 0.01 M y anote sus resultados.
b) Repita lo anterior cada 20 minutos tomando cada vez dos muestras
de 10 mi de la mezla y titulando con KOH 0.01 M.
c) Resuma sus resultados en la siguiente tabla:
TIEMPO KOH 0.01 M mi Promedi Promedio Enlaces
, gastados o de 1 y2 menos hidrolizados,
minutos Matraz 1 Matraz 2 tiempo mM/100ml
cero
0
20
40
60
80

e) Calcule el nmero de milimoles de enlaces peptdicos hidrolizados


en cada tiempo en la muestra total (mi gastados x 0.01 = mmoles para los
10 mi x 10 = mmoles/100 mi) de gelatina.

114
METABOLISMO

Para que exista un funcionamiento armnico del organismo, es necesa-


rio que subsista buena interrelacin y coordinacin metablica entre los
diferentes rganos y tejidos.
En la prctica mdica diaria, se puede apreciar la importancia del conoci-
miento de los factores que participan en las interrelaciones metablicas, que
por lo general se reflejan en la composicin de los lquidos corporales, como
la sangre y la orina que a travs de los cambios en su composicin orientan
a un diagnstico oportuno para un tratamiento efectivo de la enfermedad.
Uno de los rganos que juega un papel primordial en el metabolismo es
el hgado; por lo que ser el rgano a utilizar en nuestra prctica.

METABOLISMO HEPTICO

Como ya mencionamos el hgado es uno de los rganos que juega un


papel importante en el metabolismo y es interesante recalcar que se en-
cuentra en una posicin estratgica, donde recibe todos los nutrientes,
adems esta misma ubicacin entre las circulaciones portal y general, no
slo permite que absorba, transforme y almacene los nutrientes resultan-
tes de la digestin, sino que tambin protege al resto del cuerpo de los
metabolitos txicos producidos en los intestinos, como el amoniaco (NH3) o
presentes en la dieta, al convertirlos en sustancias no txicas antes de que
entren a la circulacin general.

Entre algunas de la funciones del hgado podemos encontrar las si-


guientes:

a) metablicas
b) de destoxificacin y protectora
c) excretora
d) de almacenamiento
e) circulatorias

Al observar esta lista de funciones del hgado nos damos idea de la gran
cantidad de enzimas que contiene, algunas de las cuales son, en cierto
modo, especficas de este tejido. Por lo que un incremento o disminucin
de sus niveles en el plasma constituye una evidencia de dao en las clu-
las hepticas.

115
Las enzimas que ms se consideran para este fin son las transaminasas:
transaminasa glutmica oxalactica (TGO) y transaminasa glutmica
pirvica (TGP) aunque existen algunas otras.
Nosotros estudiaremos una de las enzimas que se usan para la
desintoxicacin, la arginasa. Ya que a lo largo de nuestro curso hemos em-
pleado el hgado como base para observar algunas otras funciones de l como
la obtencin de glucgeno heptico, reacciones de oxidoreduccin biolgi-
cas, localizacin de citocromo-oxidasa y de la deshidrogenasa succnica.

PARTE EXPERIMENTAL

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE ARGINASA

Todos los organismos requieren como alimento sustancias nitrogena-


das, generalmente aminocidos, ya sea para la biosntesis de protenas o
para la sntesis de otras sustancias nitrogenadas no protenicas, indispen-
sables en la regulacin del metabolismo como algunas hormonas. Una parte
de estos compuestos nitrogenados se metabolizan con objeto de utilizar la
energa potencial que contienen y, en esta degradacin se elimina el nitr-
geno, el cual puede excretarse en diferentes formas.
En forma de amoniaco (NH3) por los animales que viven en el agua
(amoniotlicos), en forma de cido rico por aves, reptiles etc. (urcotlicos).
La mayor parte d los animales terrestres eliminamos el nitrgeno en forma
de urea, compuesto muy soluble y poco txico, estos animales se denomi-
nan ureotlicos.
La urea se descubri en la orina desde el ao de 1773 por Robelle, en
un principio l crey que se formaba por la unin directa del bixido de car-
bono (CO2) y del amoniaco, segn la siguiente reaccin:

Kossel y Dakin (1904), comprobaron que la urea se formaba a partir de


un nitrgeno de la arginina, el cual es hidrolizado catalticamente por ac-
cin de una enzima especfica denominada arginasa.

116
La omitira acta como "aceptar de NH3 y CO2" para transformarse en
citrulina, este aminocido reacciona con el cido asprtico, el cual se trans-
forma en fumrico y la citrulina en arginina. Es decir, la formacin de urea
es un proceso cclico que se conoce como ciclo de la urea o de Krebs-
Hensseleit, y se puede resumir de la siguiente forma:

Enzimas:
1. Carbamilfosfato sintetasa 4. Argininosuccnico sintetasa
2. Ornitina transcarbamilasa 5. Arginasa
3. Argininosuccnico sintetasa

Determinacin de arginasa
EXPERIMENTO 1.
a) Preparacin del homogeneizado de hgado de ratn.

Se utilizar para este propsito un ratn blanco adulto, el cual se sacri-


ficar por descerebracin, se le extrae el hgado y se pesa lo ms rpido
posible, se aade la cantidad de agua helada necesaria para que la solu-
cin quede al 2%. Se homogeneiza y se centrifuga a 2000 rpm, por 20 mi-
nutos. El sobrenadante se utilizar como fuente de enzimas. El residuo se
deshecha. Dicha fuente de enzimas deber conservarse en hielo hasta el
momento de usarse.

b) Preparacin de la serie enzimtica.

117
Prepare una serie de 5 tubos de ensaye que contengan lo siguiente:
1 2 3 4 5

MnCI20.01M 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25


Sol. reg. 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
glicina 0.1 M
pH9.5
Sol. reg. L- 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
arginina 0.5M
pH9.5
Agua 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
9
Preincubar a 37 C durante 5 minutos
Homogeneizado 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
de hgado de
ratn al 2%
fi
Incubar a 37 C a los: 5' 10' *&' 20' 25'

Concluido el tiempo indicado para cada tubo se les aade 3 mi de cido


perclrico (HCIO4) 0.5M para detener la reaccin.

c). Preparacin de la serie colorimtrica.

Para desarrollar el color se prepara una serie de 5 tubos que contengan lo


siguiente:
1 2 3 4 5

Agua 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5


Mezcla enzim- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
tica del pro-
cedimiento an-
terior (conser-
vando el orden)
Mezcla acida 2 2 2 2 2
Isonitroso propiof 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
enona 1 %
Colocar en bao mara a ebullicin durante 60 minutos
Restablecer el
volumen en cada
tubo y leer a 540
nm (Anotar
lectura)

118
d) Trace una grfica que relacione la actividad de la enzima contra tiem-
po de incubacin.

DETERMINACIN CUANTITATIVA DE TRANSAMINASAS

El tejido heptico es rico en una gran variedad de enzimas entre las que
destacan arginasa, transaminasa glutmico pirvica (TGP) y glutmico
oxalactica (TGO).
El tejido heptico contiene ms TGP que TGO, por lo que una elevacin
es un indicador ms especfico del dao heptico. La TGO est ligeramen-
te elevada en la necrosis cardiaca. La TGO y TGP estn normalmente pre-
sentes en el plasma humano, bilis, lquido cefalorraqudeo y saliva, pero
ninguna se encuentra en orina, a menos que el rion presente una lesin.
En hepatitis viral y otras enfermedades asociadas con necrosis hepti-
ca, las concentraciones de ambas enzimas se elevan; an antes de que
aparezcan los sntomas clnicos.
En cncer heptico, cirrosis, ingestin de alcohol, despus de la adminis-
tracin de algunos medicamentos (opiceos, salicilatos, ampicilina), varan
las concentraciones de transaminasas segn el proceso de que se trate.
Este tipo de enzimas cataliza la transferencia de un grupo amino (-NH2)
de un a-aminocido a un a-cetocido, formndose un nuevo aminocido y
un nuevo cetocido.
Se han porpuesto nombres ms lgicos para estas enzimas, por ejemplo:
Para la transaminasa glutmico oxalactica (TGO o GOT) se ha pro-
puesto el nombre de aminotransferasa de aspartato y para la transaminasa
glutmico pirvica (TGP o GTP) aminotransferasa de alanina; sin embargo
los nombres antiguos son los ms usados.
La reaccin que cataliza la TGO (E.C. 2.6.1.1.): L-aspartato; 2 oxoglu-
tarato aminotransferasa, es la siguiente:

119
Determinacin de TGO. Existen varios

mtodos para cuantificar estas transaminasas, por ejemplo:

Karmen introdujo la cuantificacin de la enzima con espectrofotmetro


ultravioleta, la cual se considera hoy en da como el mtodo de referencia
general. No obstante, el procedimiento cintico se considera como el me-
jor, an y cuando se han investigado mtodos que permiten el empleo de
fotmetros de filtro.
En la tcnica de Rietman y Frankel, mtodo a utilizar en este experimento,
se determina directamente el cido oxalactico como dinitrofenilhidrazona.
En la reaccin que se efecta, tanto el cido a-cetoglutrico como el cido
oxalactico forman hidrazonas pero, la absorbancia de la hidrazona del
segundo es muy superior a la del primero. Dado que consecutivamente a la
accin enzimtica se produce un incremento del cido oxalactico, as como
una disminucin del cido a-cetoglutrico, entonces, el incremento resul-
tante en la absorbancia del color de la hidrazona es proporcional a la can-
tidad de cido oxalactico formado.

Mtodo fotocolorimtrico de Rietman y Frankel.

EXPERIMENTO 2
a) Se extraen 5 mi de sangre del pliegue del brazo con una jeringa est
ril y se deposita en un tubo de ensaye para centrfuga. Se deja reposar para
que se forme el cogulo, una vez formado se separa de las paredes cuida
dosamente con un aplicador de madera, evitando la hemolisis. Se centrifuga
a 3 000 rpm por 10 minutos, el suero obtenido se utilizar como fuente de
enzimas.
b) Determinacin cuantitativa de TGO

120
En dos tubos de ensaye colocar:
Problema Blanco

Sustrato para TGO en sol. reg. 0.5 0.5


(BIOXON)
Preincubar durante 5 minutos
a
en bao mara a 37 C
Suero de reciente obtencin 02 -
Mezclar, incubar durante 60 minutos
e
en bao mara a 37 C
Reactivo desabollador de color 0.5 0.5
2,4-dinitrofenilhidracina
Suero de reciente obtencin - 0.2
Mezclar, dejar en reposo 20 minutos a
temperatura ambiente
NaOH 0.4N 5.0 5.0

Mezclar bien, dejar en reposo por 5 minutos, medir la absorbancia del


problema contra el blanco e interpolar en la curva tipo para obtener U.l/ml

c) preparacin de la curva tipo para TGO

Preparar una serie de 5 tubos de ensaye, siguiendo las instrucciones


de la siguiente tabla:

1 2 3 4 5

Agua destilada 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2


Piruvato de sodio 2mM - 0.05 0.1 0.2 0.3
(patrn)
Sustrato para TGO (Aspartato 1.0 0.95 0.9 0.8 0.7
+ ct-cetoglutarato
Reactivo desarrollador de color 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
(2,4-dinitrofenilhidracina 1.5 mM)
Unidades de TGO Ul/ml 0 11 22 55 95

Mezclar bien todos los tubos y dejar en reposo por 20 minutos a tempe-
ratura ambiente. Despus de este tiempo agregar 5 mi. de NaOH 0.4N.
Mezclar, dejar en reposo por 5 minutos. Medir la absorbancia a 505 nm con
filtro verde. Trazar una grfica en papel milimtrico con la lectura de densi-
dad ptica (D.O.) contra las unidades internacionales anotadas en la tabla
anterior.

121
Determinacin de TGP
La transaminasa glutmico pirvica es similar a la TGO y es determina-
da por los mismos mtodos excepto que el sustrato contiene L-alanina en
vez de cido asprtico y el producto intermedio es cido pirvico en lugar
de cido oxalactico.

Mtodo colorimtrico de Rietman y Frankel.

EXPERIMENTO 3.
a) Determinacin cuantitativa de TGP

El procedimiento es el mismo que para TGO excepto que se usa el


sustrato para TGP y que el tiempo de incubacin es de 30 minutos, en lugar
de una hora.
Prepare dos tubos de ensaye, siguiendo las mismas indicaciones que
en el experimento anterior, cambiando los reactivos, en esta ocasin para
TGP y modificando el tiempo de incubacin.
b) Preparacin de la curva tipo.
1 2 3 4 5

Agua destilada 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2


Piruvato de sodio 2mM _ 0.05 0.1 0.2 0.3
(solucin patrn)
Sustrato para TGP 1.0 0.95 0.9 0.8 0.7
(alanina + a-ceto-
glutarato)(BIOXON)
Reactivo desabollador 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
de color (2,4-
dinitrofenilhi-dracina).

Unidades de TGP Ul/ml 0 12.5 25 50 85

122
Mezclar bien todos los tubos y dejar en reposo por 20 minutos a tempera-
tura ambiente. Despus de este tiempo agregar 5 mi de NaOH 0.4N. Mez-
clar, dejar en reposo por 5 minutos. Medir la absorbancia a 505 nm con
filtro verde. Trazar una grfica en papel milimtrico con las lecturas de den-
sidad ptica (D.O.) contra Ul/ml anotadas en la tabla anterior.
Los resultados de la lectura del blanco y el problema se interpolan en la
curva tipo para TGP.

123
Esta obra se termin de imprimir en el mes
de junio de 1996, en los talleres de Edicupes, S.A. de C.V.,
en Mxico D.F.

125