ESCUELA

DE MICROBIOLOGA MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL

Manual de prcticas Ingeniera Gentica

PRCTICA 6. PREPARACIN DE UN PLSMIDO RECOMBINANTE

1. INTRODUCCIN
Los plsmidos son molculas de ADN circular, de doble cadena, autorreplicativas y
extracromsomicas que se han encontrado en una amplia variedad de especies
bacterianas. El tamao de los plsmidos es muy variable y es posible encontrarlos desde 1
kb hasta 200 kb. Los plsmidos presentan generalmente un rango de hospederos estrecho
y pueden ser mantenidos solo en un grupo limitado de especies relacionadas; se
comportan como unidades genticas accesorias que se replican y son heredadas
independientemente del cromosoma bacteriano.

Los plsmidos empleados en ingeniera gentica contienen un sitio mltiple de clonacin

(SMC) o polylinker, el cual presenta las secuencias de reconocimiento para una amplia
variedad de enzimas de restriccin. Las secuencias que flanquean el polylinker son tiles
para la manipulacin o anlisis del ADN insertado. Generalmente el sitio mltiple de
clonacin se encuentra al interior del gen de la - galactosidasa, lo anterior para fines de
seleccin de transformantes y recombinantes. Adems, stos plsmidos presentan un
origen de replicacin (ORI), para asegurar la supervivencia del plsmido al interior de la
clula. Tambin es posible encontrar otro origen de replicacin derivado de un fago con
DNA monocatenario (M13, F1), que permite producir fagos filamentosos con copias
monocatenarias del DNA clonado, tiles para secuenciacin, mutagnesis, etc. Los
plsmidos tambin presentan marcadores de seleccin, los cuales son genes que
codifican para enzimas que confieren resistencia a antibiticos como ampicilina,
kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol y/o eritromicina. Los plsmidos utilizados para
realizar expresin de protenas presentan adems promotores de fagos (T7, SP6) previos
al sitio mltiple de clonacin, tiles para la transcripcin/traduccin in vitro del DNA
clonado, o para su expresin regulada in vivo si el plsmido recombinante se introduce en
bacterias que expresan la RNA polimerasa viral.

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De acuerdo a las caractersticas de los plsmidos estos pueden utilizarse como
vectores de clonacin, insercin o expresin. Los plsmidos usados como vectores eran de
origen natural, pero en la actualidad se utilizan plsmidos modificados en los que se han
insertado secuencias y genes necesarios para fines de clonacin.

Para clonar un fragmento de ADN en un vector plsmidico debe tenerse en cuenta

algunos parmetros como son:
c Tamao del inserto y sistema de clonacin
c Caractersticas del vector:
o Mapa de vector
o Formas de seleccin de los transformantes y/o recombinantes
o Sitios de restriccin en el sitio mltiple de clonacin
o Origen de replicacin compatible con las clulas hospederas
c Sistema de ligacin
c Cepa de E. coli para la propagacin del plsmido recombinante

Existen diversas formas de clonar un fragmento de ADN en un vector dependiendo de los
fragmentos generados por la digestin con enzimas de restriccin. El procedimiento inicia
con la digestin o restriccin del ADN a insertar (inserto) y el vector con las mismas
enzimas de restriccin, sea una o dos. El vector lineal presenta los extremos cohesivos a
cada lado y de esta manera es posible ligar el inserto al vector.
Una vez generados los extremos cohesivos en cada extremo tanto en el vector como en el
inserto de manera independiente, se procede a mezclarlos, para que por
complementacin se formen los puentes de hidrgeno. Finalmente se adiciona una
enzima T4 ligasa, que cataliza la formacin del enlace fosfodiester entre dos cadenas de
ADN (vector, inserto), generando de esta as una molcula circular.
De sta manera, el producto de esta reaccin de ligacin se utiliza como DNA
transformante y se introduce en clulas de E. coli competentes y las clulas
transformantes y recombinantes son identificadas mediante los marcadores de seleccin
que presenta el vector.

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2. OBJETIVOS
Objetivo General
Construir un plsmido recombinante utilizando el vector pCR 2.1

Objetivos especficos
- Identificar los diferentes sistemas de clonacin de fragmentos a vectores de
clonacin
- Reconocer las caractersticas y aplicaciones de los vectores de clonacin

3. MATERIALES Y EQUIPOS
Inserto Producto de PCR (250 ng/ l)
Vector pCR2.1 (25 ng/l)
Enzima de restriccin EcoRI
Buffer 10X para la enzima EcoRI
Fosfatasa alkalina de intestino de ternero (CIAP)
Buffer 10X de la enzima CIAP
Agua desionizada estril
Micropipetas de 10 l
Puntas para micropipetas estriles
Incubadora a 37C
Nevera -20C

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4. METODOLOGA
4.1. Inserto

El inserto fue amplificado previamente con los primers especficos (contienen los sitios de
restriccin para la enzima EcoRI tanto al 5 como al 3) mediante PCR con la enzima Taq
polimerasa, de acuerdo al programa que se muestra en la siguiente tabla.

Programa para la amplificacin del inserto

Paso N ciclos Temperatura Tiempo

Desnaturalizacin inicial 1 95C 6 min
Desnaturalizacin 40 94C 30 seg
Hibridizacin 40 55C 20 seg
Elongacin 40 72C 1.2 min
Elongamiento final 1 72C 5 min
Almacenamiento 1 4C Indefinido

Se confirm la amplificacin del producto en una electroforesis en gel de agarosa 1%.

4.2. Vector pCR 2.1

El vector es el plsmido pCR 2.1 el cual presenta un tamao de 3.9 Kb.

4.3. Generacin de Extremos cohesivos en el inserto y vector

Realice la digestin del vector y el inserto con la enzima EcoRI de la siguiente manera:

Vector Volumen Inserto Volumen

Buffer 10X 1 ul Buffer 10X 1 uL
Enzima EcoRI 1 uL Enzima EcoRI 1 uL
Vector 8 uL Inserto 8 uL
Volumen final 10 uL Volumen final 10 uL

Incube las reacciones a 37 C por 12 horas.

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Realice los controles necesarios para demostrar que el vector est completamente
digerido.

4.4 Defosforilacin del vector

Dado que la clonacin del inserto se debe de realizar empleando nicamente un solo sitio
de restriccin, EcoRI, se hace necesario defosforilar el vector para asegurar el xito de la
colacin del fragmento. La defosforilacin de los extremos 5 se realizar con la enzima
Fosfatasa alcalina de intestino de ternero ( del ingles Calf Intestinal Alkaline Phosphatase
(CIAP). Realice la defosforilacin del vector, una vez se haya corroborado que el vector
est completamente digerido. Realice la defosforilacin del vector de la siguiente
manera:

Volumen
Vector digerido con enzima EcoRI 8 uL
Buffer 10X de la Enzima CIAP 1 uL
Enzima CIAP 1 U/ul 1uL
Volumen final 10uL

Incube la reaccin a 37 C por 2 horas.

Realice los controles necesarios para demostrar que el vector est completamente
defosforilado, listo para ser utilizado para los procedimientos de clonacin.

Una vez el vector est listo (digerido y defosforilado) para llevar a cabo una clonacin,
realice el procedimiento para ligar el inserto al vector, de la siguiente manera:

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Volumen
Inserto digerido con extremos cohesivos (EcoRI) 7 uL
Vector linearizado con extremos cohesivos (EcoRI) y defosforilado con 1 uL
fosfatasa alkalina (CIAP)
Buffer ligasa 10X 1 uL
T4 DNA Ligasa 1 uL
Volumen final 10 uL

Incubar la reaccin de ligacin a 4C durante toda la noche. Almacene la reaccin a esta

misma temperatura hasta que lleve a cabo la transformacin de las clulas competentes.

5. PREGUNTAS
Porque es importante conocer claramente que tipo de extremos se generan en el
vector lineal y en el inserto para la reaccin de ligacin?
Por que es necesario defosforilar el vector antes de llevar a cabo la ligacin del inserto
a un vector utilizando slo una enzima de restriccin?

6. REFERENCIAS
Ausbel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman J.G., Smith J.A. and Struhl,
K. Current protocols in molecular biology. 1994-20051 - USA 5 vols. Different Chapter.
Primrose S.B, Twyman R.M. Principles of gene manipulation and genomics. Edition 17.
Blackwell Publishing.2007.
Sambrook, J.F. & Rusell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3 edition Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA. 2001; vol 1.
http://www.protocol-online.org