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DETERMINACIN DE LOS PRODUCTOS DE GLUCLISIS

OBJETIVO: Determinar algunos de los productos formados en la fermentacin de la glucosa y de una
muestra biolgica por accin de la levadura y del lactobacillus.

FUNDAMENTO:

La glucosa por accin de la levadura de saponificacin saccharomyces cerevisiae es capaz de

degradarse en condiciones anaerbicas hasta etanol, en el proceso conocido como fermentacin
alcohlica. La misma glucosa, por accin de Lactobacillus del yogurt, se transforma en cido lctico,
proceso conocido como fermentacin lctica. En ambos casos hay una serie de reacciones comunes a
ambos procesos, que van desde la glucosa hasta el cido pirvico. Identificando la presencia de cido
pirvico, acetaldehdo y etanol se comprueba que se est realizando una fermentacin alcohlica. De
Forma similar, al identificar la presencia de cido lctico y cido pirvico se puede comprobar que se
est llevando a cabo una fermentacin lctica

Glucosa

Fermentacin Alcohlica Fermentacin Lctica

Etanol Acetaldehdo cido Pirvico cido Lctico

El cido pirvico, por ser un metabolito intermediario se va a encontrar en muy baja concentracin.
Igual cosa sucede con el acetaldehdo, un metabolito intermediario en la fermentacin alcohlica. Para
lograr detectarlos es necesario impedir que se transformen en otros compuestos, lo cual se puede lograr
bloqueando, mediante inhibidores, las enzimas que catalizan la conversin de stos compuestos.
Tambin se pueden cambiar las condiciones fisiolgicas para que la enzima funcione a una velocidad
muy por debajo de su actividad mxima o, por ltimo, se puede usar un agente que atrape el
intermediario y que forme un compuesto que no pueda metabolizarse, como los de sta prctica.

La enzima piruvato descarboxilasa (2-oxocido carboxi-liasa, 4.1.1.1 ), que cataliza la conversin de

cido pirvico en acetaldehdo, no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el
piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reaccin con nitroprusiato de sodio o 2,4
dinitrofenilhidrazina.

Para atrapar el acetaldehdo se aade a la mezcla sulfito de sodio. La presencia de acetaldehdo se

puede demostrar por el color azul producido por la reaccin con nitroprusiato de sodio y piperidina. Al
demostrar la presencia de acetaldehdo, que es un intermediario de la fermentacin alcohlica, se puede
comprobar la realizacin de ste proceso.

En forma similar, al detectar la presencia de cido lctico se puede comprobar que ocurri
fermentacin lctica.
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MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo Cinta de enmascarar

Bao Mara Termmetro de 0- 100C
Embudos de vidrio Papel de filtro
Pipeta Pasteur Solucin de glucosa al 10%
Levadura de cerveza al 10% en agua Yogurt o leche
Suspensin de levadura al 10% en Na2HPO4 0.2M Sulfato de amonio slido
Muestra de Carbohidratos (jugo de fruta, o zumo de papa )
Solucin de cido tricloroactico al 10% Nitroprusiato de sodio al 5%
Solucin de 2,4 dinitrofenilhidrazina al 0.2% en HCl 2M Amoniaco concentrado
Hidrxido de sodio al 10% Piperidina al 3%
Carbonato sdico finamente pulverizado cido pirvico al 2%
cido lctico al 2% Acetaldehdo al 5 %
Eter etlico Etanol al 10%
Carbn activado vidrio de reloj
Solucin de yodo-yoduro: 4 g de yoduro de potasio y 2 g de yodo en 50 ml de agua destilada.
Solucin sulfocrmica diluida: 1 g de dicromato de potasio en 50 ml de cido sulfrico 0.5N.
Solucin de cloruro frrico al 0.3%

PROCEDIMIENTO:

Rotule 8 tubos de ensayo como A, Am, B, Bm, C, Cm, D, Dm y agregue los reactivos que se detallan
a continuacin:

Reactivos Tubos
A Am B Bm C Cm D Dm
Muestra Biolgica - 5 ml - 5 ml - 5 ml - 5ml
Glucosa 10% 5ml - 5ml - 5 ml - 5ml -
Levadura en agua 5ml 5ml 5ml 5ml - - - -
Levadura en Na2HPO4 - - - - 5ml 5 ml - -
Yogurt - - - - - - 5 ml 5 ml
Sulfito Sdico - - 0.5 g 0.5 g - - - -
Calentar todos los tubos a 35 40C durante dos horas o mas
cido Tricloroactico 2 ml 2 ml - - 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Mezcle bien y filtre el contenido de cada tubo. Deseche el residuo y con el filtrado haga las siguientes
pruebas.

Determinacin de Etanol:

Tome 2 tubos de ensayo y agregue respectivamente 2ml de filtrado de los tubos A y Am y otro tubo
con 2 ml de etanol al 5% que servir de patrn. Agrgueles 0.1 g de carbonato de sodio. Una vez
disuelto, coloque los tubos en un bao mara, mantenido a 70C y aada lentamente gotas de solucin
de yodo-yoduro hasta que ya no desaparezca el color del yodo. Una vez llegue a este punto, se dejan
los tubos durante unos tres minutos ms en el bao mara y luego enfrelos con agua. Aparecer un
precipitado amarillo de yodoformo de olor caracterstico cuando hay presencia de etanol.
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La presencia de etanol se puede observar tambin mediante su oxidacin con cido sulfocrmico a
acetaldehdo. Tome en sendos tubos 1 ml del filtrado de los tubos A y Am y 1 ml de etanol al 5% en
otro tubo, se les aaden 0.5 ml de solucin sulfocrmica diluida. Despus de mezclar bien el conjunto,
se calientan en un bao mara; aparece un intenso color verde, percibindose el olor caracterstico del
acetaldehdo. Esta reaccin es bastante sensible pero no es tan especfica del etanol como la del
yodoformo

Determinacin de acetaldehdo:

Tome tres tubos de ensayo y adicione 2 ml de filtrado del tubo B al primero y 2 ml del tubo Bm al
segundo y 2 ml de acetaldehdo 5% al tercero que servir de testigo. Luego agregue 0.5 ml de solucin
fresca de nitroprusiato de sodio y 2 ml de piperidina acuosa a cada tubo y agite. Si hay acetaldehdo
presente, se observa una coloracin azul.

Determinacin de la presencia de piruvato:

Con nitroprusiato de sodio:

En un tubo de ensayo hierva 2 ml del filtrado del tubo C, en otro 2 ml del tubo Cm y en otro 2 ml de
cido pirvico como patrn. Una vez hervidos agregue inmediatamente a cada tubo 1 g de sulfato de
amonio slido. Adicione dos gotas de solucin de nitroprusiato de sodio, mezcle vigorosamente y deje
deslizar por las paredes del tubo, amoniaco concentrado hasta que se formen dos capas. Si hay
piruvato, se formar un anillo verde o azul en la interfase de los dos lquidos. La formacin de un anillo
rosado transitorio en la interfase, indica la presencia de grupos tioles y con frecuencia se observa antes
de la coloracin azul o verdosa caracterstica de la reaccin de piruvato.

Con 2,4-dinitrofenilhidrazina:

Tome 2 ml de filtrado del tubo C, lo mismo que 2ml del tubo Cm y en otro tubo con 2 ml de cido
pirvico, agregue a cada uno, 1 ml de solucin saturada de 2,4 dinitrofenilhidrazina, mezcle
fuertemente, coloque tres gotas de la mezcla en un tubo de ensayo, agregue 1 ml de solucin de NaOH
al 10% y diluya con agua destilada hasta 5 ml. La formacin de un color rojo indica la presencia de
piruvato.

Determinacin de cido lctico:

Tome tres tubos de ensayo y agregue 1 ml de filtrado del tubo D en uno, 1 ml del tubo Dm en otro tubo
y 1 ml de cido lctico al otro, el cual servir de testigo. Adicione a cada tubo 1 ml de ter etlico y
agite intensamente. Al formarse dos fases en los tubos, se recoge la fase etrea (parte superior) en otros
tubos y a stos se les aade un volumen igual de solucin de cloruro frrico. El lactato frrico que se
forma confiere al conjunto un intenso color verde amarillento, que indica la presencia de cido lctico.
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RESULTADOS:

1. Llene la siguiente tabla de acuerdo con sus resultados:

Prueba realizada Tubo de muestra Tubo de glucosa Tubo de patrn

cido pirvico
- Con nitroprusiato
- con dinitrofenilhidrazina

Acetaldehdo

Etanol
- Con yodo-yoduro
- con cido sulfocrmico

cido lctico

2. Con base en sus resultados determine si ocurri fermentacin alcohlica o fermentacin lctica.

3. En caso de no producirse resultados positivos, que pudo ocurrir en la muestra?

4. Consulte las reacciones que ocurren en cada una de las pruebas realizadas.