TRABAJO PRCTICO N6:

Medida del crecimiento

bacteriano en un fermentador
batch
Efecto del agregado de
antibiticos
Microbiologa Industrial (76.55)

Alumnos:
Mackinnon, Camila (95412)
Souto Latapie, Ma. Magdalena
(95390)
Pellegrini, Carlos ()
Arballo, Luciana ()
Turno: 2

Introduccin:

El objetivo del trabajo prctico es medir la concentracin celular

en funcin del tiempo de Escherichia coli en un medio ptimo para su
desarrollo. Conociendo esta informacin podr determinarse su curva de
crecimiento. Para calcular la concentracin celular en funcin del tiempo
se utilizan los siguientes mtodos: recuento en placa y medida de la
densidad ptica.
Por otra parte, se busca observar el efecto de antibiticos sobre los
cultivo, en lo que respecta al crecimiento y viabilidad. Los antibiticos
que se utilizan son: gentamicina, cloranfenicol y penicilina, cada uno con
un efecto distinto.

La penicilina es un bacterioltico, es decir, provoca la lisis de las

clulas ya que inhibe la sntesis de pptidoglucano. Esta inhibicin
impide la formacin y reparacin de la pared celular, por lo cual la clula
se disuelve en el medio volcando su contenido.

La gentamicina es bactericida, por lo cual provoca la muerte de las

bacterias, pero no la destruccin de las mismas. Este antibitico se une
a los ribosomas y as interfiere en la biosntesis de protenas y
consecuentemente la muerte de los microorganismos.

El cloranfenicol es bacteriosttico. Acta tambin inhibiendo la

sntesis de protenas en los ribosomas, pero su efecto se revierte por
dilucin imposibilitando la formacin del enlace peptdico. Esto genera
que la bacteria sea incapaz de reproducirse. Detiene completamente el
crecimiento de la poblacin.

Desarrollo e informe de resultados:

En primer lugar, se coloca el inculo adecuado para el desarrollo

de la especie en un fermentador de 4 lt que previamente contiene 3 ml
del medio de cultivo estril termostatizado a 37C. Cada media hora se
extraen muestras de 2 ml, sobre las cuales se determina la
concentracin en funcin del tiempo de incubacin.

1 MTODO: Para realizar el recuento en placa se realizan varias

diluciones de cada muestra tomada. Luego, en cada caja de Petri se
 siembran 100 l de cada dilucin sobre la superficie del gar (se realizan
por duplicado para evitar prdida de resultados en caso de una siembra
fallida y, adems, para poder ponderar los resultados obtenidos). Una
vez realizada la siembra, se incuban durante 48 hs. a 37C y,
posteriormente, se procede al recuento de colonias.

2MTODO: Para el segundo mtodo, se mide la densidad ptica

de las muestras tomadas utilizando un espectrmetro.

La segunda parte del trabajo consiste en observar los efectos de

los antibiticos sobre el cultivo. Para ello, se toman muestras durante la
etapa exponencial del crecimiento bacteriano y se las incuba a 37C con
agitacin magntico en cuatro tubos de ensayo, tres de ellos
conteniendo cada uno un antibitico distinto y uno utilizado de control.
Se toman de los tubos muestras cada media hora y se realizan
recuentos de placas y se mide la densidad ptica al igual que con el
cultivo original sin agregado de antibiticos.

A continuacin se muestran los resultados obtenidos durante la

prctica.

Para recuento en placa:

Se cuenta la cantidad de colonias formadas en las cpsulas de

Petri a distintos tiempos y concentraciones. Para cada tiempo y dilucin
se obtiene la concentracin celular en UFC/ml, Unidades Formadoras de
Colonias por Mililitro, realizando el siguiente clculo:

UFC/ml = N de colonias observadas x 50 x factor de dilucin

y se tabulan los valores obtenidos en funcin del tiempo:

T Curva a
Recuento 1 Recuento 2 DO
(hs) ajustar
CONTRO CONTR CONTR ln(UF
Clf G P Clf G P Clf G P UFC
L OL OL C)
3,90E+0 - - - 7,40E+ - - - - - - 3,90E+ -
0 0,118
8 08 08
6,00E+0 - - - 5,00E+ - - - - - - 6,00E+ -
0,5 0,198
8 08 08
5,00E+0 - - - 4,80E+ - - - - - - - -
1 0,363
9 09
3,60E+0 6,40E+ 2,10E+ 4,00E+ 5,00E+ 2,50E+ 0,30 0,45 4,00E+
1,5 0 0 0,690 0,411 22,11
9 09 06 09 09 06 7 5 09
6,00E+1 6,00E+ 6,10E+ 2,00E+ - 3,50E+ 0,29 0,49 6,00E+
2 0 0 1,452 0,428 24,82
0 09 06 11 06 5 0 10
2,21E+1 3,60E+ - 2,00E+ 8,60E+ - 0,20 0,49 2,00E+
2,5 0 0 2,500 0,420 28,32
2 09 12 08 7 5 12
 - 4,90E+ - 1,00E+ 4,80E+ - 0,20 0,50 - -
3 0 0 3,610 0,420
08 12 08 0 8
- - - - 3,00E+ - - 2,00E+ - 3,49 - 3,00E+ -
3,5 4,010
13 09 0 13

Graficando logaritmo de las UFC/ml en funcin del tiempo,

podemos comparar los distintos efectos de los tres antibiticos sobre la
muestra:

Recuento 1
control Clf P G

Recuento 2
control Clf P G

Anlisis de los resultados obtenidos:

 Debe aclararse, en primer lugar, que el mtodo de recuento en
placa brinda informacin acerca de la concentracin en funcin del
tiempo de los microorganismos viables, es decir, aquellos capaces de
reproducirse y formar colonias.

Respecto a los valores obtenidos para la muestra control, podemos

asegurar que hubo errores durante la realizacin del sembrado en placa
o durante el conteo de las colonias ya que, sin la aplicacin de
antibiticos, el cultivo debera crecer exponencialmente y as, dar como
resultado en el grfico una recta. En cambio, la concentracin baja a
ciertos tiempos (1,5hs), lo que se contradice con lo esperado
tericamente.

Respecto a la muestra que contiene gentamicina, los valores

obtenidos coinciden con la teora que predice una concentracin nula a
partir de la aplicacin del antibitico ya que el mismo tiene un efecto
bactericida. Lo mismo es de esperarse para el ensayo con penicilina
debido a que esta tiene un efecto bacterioltico, aunque los resultados
obtenidos son incongruentes.

Finalmente, el cloranfenicol tiene un efecto bacteriosttico, por lo

que era de esperarse que el contaje viable se mantenga constante luego
de su aplicacin; sin embargo, los valores muestran que las unidades
formadoras de colonias fueron reducindose lentamente.

Para medida de la densidad ptica:

En este caso, se utiliza un espectrmetro para medir la densidad

ptica de las muestras a distintos tiempos. Se utilizan los datos de la
tabla anterior.

Graficando la densidad ptica en funcin del tiempo de incubacin,

podemos comparar los diferentes efectos de os tres antibiticos
 utilizados durante la prctica:

DO
clf
g
p

Anlisis de los resultados obtenidos:

En primer lugar, debe aclararse que este mtodo brinda

informacin acerca del conteo total de los microorganismos, es decir,
todos los presentes en la solucin analizada ya sean viables o no.

Para la curva de crecimiento de la muestra control, se obtuvieron

buenos resultados ya que, se observa en la representacin grfica que la
curva concuerda con lo esperado tericamente para la fase exponencial
de crecimiento.

En cuanto a la penicilina, el resultado esperado es la disminucin

inmediata de la densidad ptica ya que, adems de provocar la muerte
de las bacterias, tambin produce su destruccin. En cambio, lo que se
observa durante la experiencia es un leve aumento de la DO, por lo que
es posible que se haya cometido algn error.

Para la gentamicina, tampoco se obtuvieron resultados esperados.

La curva de conteo total se debera mantener constante luego del
aplicado del antibitico ya que, slo se produce la muerte de las
bacterias por lo que las mismas no pueden seguir reproducindose, pero
a pesar de ello, al no destruirlas el nmero total de clulas presentes
debera ser constante. Sin embargo, en la experiencia podemos ver que
la curva desciende a medida que el tiempo pasa.

Por ltimo, para la muestra que contiene cloranfenicol, los

resultados esperados son los mismos que para la gentamicina debido a
que este antibitico tambin impide la reproduccin de las clulas por lo
que detiene el crecimiento. En este caso podemos ver que ni bien se tira
el antibitico, la curva aumenta levemente pero luego se mantiene
constante tal como se esperaba.

Curva de crecimiento de la Escherichia coli:

curva de crecimiento

Se utilizan en este caso, los valores obtenidos a parir del mtodo

de medicin de densidad ptica.

Para obtener los parmetros correspondientes a la curva de

crecimiento de la Escherichia coli, se toma la parte recta de la curva, es
decir, la que representa la fase exponencial de la misma:
 Fase exponencial

f(x) =
R = 0

La velocidad especfica de crecimiento obtenida del grfico es la

pendiente de la recta ajustada, es decir:

=1,2916

Y se calcula tambin el tiempo de duplicacin de la poblacin

como:

ln ( 2)
t D= =0,54 h s
1,29

Como podemos ver, el tiempo de duplicacin est en un rango esperable

tratndose de una bacteria.