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MICROBIOLOGIA
DA FERMENTAO
LABORATRIO DE ANLISES
2007
LABORATRIO DE ANLISES
MANUAL DE MTODOS MICROBIOLOGIA DA FERMENTAO
ndice
3 Desenvolvimento Microbiano.......................................................................................19
1 Noes de Microbiologia
1.1 Introduo
Est includo tambm nesta cincia o estudo da distribuio natural dos microrganismos, suas
relaes recprocas e com outros seres vivos, seus efeitos benficos e prejudiciais sobre os
homens e as alteraes fsicas e qumicas que provocam em seu meio ambiente.
Em sua maior parte, a microbiologia trata com organismos microscpicos unicelulares. Nas formas
superiores de vida, os organismos so compostos de muitas clulas, que constituem tecidos
altamente especializados e rgos destinados a exercer funes especficas. Nos indivduos
unicelulares, todos os processos vitais so realizados numa nica clula. Independentemente da
complexidade de um organismo, a clula , na realidade, a unidade bsica da vida.
Aps sua descoberta, os microrganismos foram classificados nos dois reinos ento existentes:
animal e vegetal. Os protozorios foram includos no reino animal, os fungos e bactrias no reino
vegetal. No entanto, essa classificao no era satisfatria, visto que entre os protozorios
existem alguns grupos capazes de realizar fotossntese, enquanto que os fungos e a maioria das
bactrias, apesar de classificadas no reino vegetal, no so fotossintticas.
Em 1986 modificou-se toda a classificao dos seres vivos quando o biologista E.H. Haeckel
props a criao de um terceiro reino, o reino protista, que incluiria todos os microrganismos com
exceo do vrus.
Em um primeiro grupo teramos aqueles que s contm um tipo de cido nucleico (DNA ou RNA) e
seriam constitudos pelos vrus. Em um segundo grupo, teramos aquele, que contm dois tipos de
cidos nucleicos (DNA e RNA). Este grupo seria subdividido em dois subgrupos. O primeiro
incluiria organismos onde o material nuclear no envolvido por membrana e seria constitudo por
organismos procariticos: bactrias e algas cianofceas. O segundo seria constitudo por
organismos que possuem uma membrana envolvendo o material nuclear; nesse grupo teramos os
organismos que no tm a capacidade de formar tecidos, os eucariticos inferiores: fungos,
mixomicetos, algas superiores, protozorios e aqueles que tm capacidade de formar tecidos, os
eucariticos superiores: plantas e animais.
Segundo Haeckel, o reino protista seria subdividido em dois grandes grupos (Tabela 1.1).
Reino Protista
Protistas Inferiores (Procariticos) Protistas Superiores (Eucariticos)
Algas superiores
Bactrias Mixomicetos
Algas cianofceas Fungos
Protozorios
1.3.1 Bactrias
Quanto a forma, a maioria das bactrias pode ser classificada em trs tipos fundamentais:
bactrias esfricas, cilndricas e espiraladas (Figura 1.3).
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A reproduo nas bactrias feita, na grande maioria dos casos, pelo processo da diviso
binria simples, na qual uma clula adulta divide-se ao meio dando duas clulas-filhas iguais. Em
alguns casos a reproduo por brotamento, quando uma clula emite um broto menor que ela,
que se destaca constituindo a nova clula.
Figura 1.3 - Tipos Morfolgicos Fundamentais das Bactrias. 1-Coco Isolado, 2-Diplococo, 3-
Sarcina, 4-Estafilococos, 5-Estreptococos, 6-Bacilo, 7-Vibries, 8-Espiroqueta e 9-Espirilo.
1.3.2 Fungos
Bolores
Figura 1.4 - Hifas de Bolores: (A) No Septadas e Multinucleadas, (B) Septadas com Clulas
Mononucleadas, (C) Septadas com Clulas Multinucleadas.
Fig 1.5 - Imagem de microscopia de varredura eletrnica (cores adicionadas) de miclio fngico com
as hifas (verde), esporngio (laranja) e esporos (azul), Penicillium sp. (aumento de 1560 x).
Leveduras
Tem membrana citoplasmtica lipoprotica, cuja principal funo regular as trocas com o meio
ambiente. Possuem, tambm, uma parede celular rgida, constituda principalmente de dois
polissacardeos: manana e glucana, alm disso, contm protenas e lipdeos.
A reproduo sexuada se faz pela formao de ascosporos, isto , esporo contido no interior de
um asco.
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1.4 O Microscpio
- P ou base
- Condensador
- Platina ou mesa
- Charriot
- Estativo ou coluna
- Ocular (mono ou bi)
- Revlver
- Objetivas
- Dispositivos macro e micromtrico
E possvel melhorar o contraste, por exemplo, atravs do coramento (tingimento) do objeto (com
corantes prpura ou verde-azulados) ou atravs de campo escuro e contraste de fase.
"Poder de resoluo" a habilidade de produzir imagens separadas de partes do objeto que esto
muito prximas, isto , a habilidade de distinguir detalhes do objeto.
O Microscpio um instrumento de preciso feito com material valioso. Havendo cuidado por
parte de quem usa, ele durar longo tempo, mas um pouco de negligncia poder danific-lo.
Portanto, use-o com carinho e zelo.
Transportar com ambas as mos, apoiando numa delas a base do microscpio e segurando a
coluna do aparelho com a outra.
Quando o colocar sobre a mesa, mantenha-o distante da borda. Se houver alguma lmpada
ligada ao instrumento, cuidado com o fio. aconselhvel manter a mesa do laboratrio livre de
tudo o que no seja absolutamente necessrio.
Os microscpios devem ser colocados em superfcies isentas de vibraes e no so
recomendadas mudanas de localizao.
Evitar molhar o microscpio ao usar preparaes feitas com gua.
Nunca soprar as lentes para retirar a poeira, pois micropartculas de saliva podem se depositar
nas lentes.
Seguir rigorosamente as instrues do fabricante do equipamento quanto ao uso de solventes
para a limpeza.
Limpar o leo residual das objetivas ao final de cada uso com algodo hidrfilo, ou flanela
macia, umedecido em xilol ou em ter-acetona 1:1.
Nunca deixar os orifcios de conexo das objetivas e oculares abertos. Mant-los fechado por
plug de proteo adequado ou com as prprias oculares ou objetivas.
No tocar nas lentes com as mos.
Somente usar leo de imerso que atenda a especificao estabelecida pelo fabricante.
Nunca usar leo de imerso para trabalhos com objetivas que no sejam de imerso. Estes
leos danificam as substncias de montagem destas objetivas.
Quando acabar de usar o microscpio, encaixe a objetiva de menor aumento e cubra-o com
capa.
2 Meios de Cultura
Sabe-se que alm das caractersticas prprias dos microrganismos (se so bactrias, leveduras,
fungos,...), vrios outros fatores influenciam na cintica de crescimento celular. Entre esses
fatores um dos mais importantes o meio de cultura onde os microrganismos so colocados.
A Tabela 2.1 apresenta as composies mdias dos principais elementos que constituem as
clulas microbianas.
As formas pelas quais estes elementos devem ser fornecidos aos microorganismos so
extremamente variveis, dependendo do microrganismo e do que se deseja, porm, a maior parte
dos microrganismos crescem bem em meios compostos de substncias orgnicas complexas.
Lquidos;
Semi-slidos (Pastosos: amido, gros modos, etc.);
Slidos (batata, cenoura ou Agar, gelatina).
Extrato de carne: Preparado a partir de carne magra. Fornece substncias que ativam o
crescimento dos microrganismos.
Frmula:
Agar: Polissacardeo extrado com gua quente de algumas espcies de algas marinhas
(agarfitas): gelidium amansii.
Elementos principais : C, H, N, O
Elementos acessrios : P, K, S, Mg
Vitaminas e hormnios
"Traos de elementos"
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Costuma-se tambm usar a expresso fatores de crescimento para designar certos nutrientes
orgnicos, tais como os aminocidos e vitaminas que so incorporados diretamente estrutura
celular.
Um meio mnimo contm somente os nutrientes essenciais para o crescimento, enquanto que o
meio rico (completo) aquele no qual os nutrientes essenciais so complementados por fontes
alternativas de elementos, tais como aminocidos, vitaminas, precursores de cidos nucleicos e
outros intermedirios da sntese celular. O enriquecimento do meio de cultura pode aumentar a
velocidade de crescimento e alterar a composio enzimtica dos microrganismos. por este
fato que temos de definir o meio de cultura antes de estudar qualquer outra influncia sobre os
microrganismos.
Em geral, para iniciar o crescimento usando um inoculo pequeno necessita-se de um meio mais
rico do que quando se inocula com grandes quantidades de clulas.
Fontes de nitrognio:
As fontes de nitrognio que podem ser utilizadas pelos diferentes microrganismos incluem a
maioria, sendo todas formas orgnicas do nitrognio.
O nitrognio utilizado pelas clulas para a sntese das protenas, cidos nucleicos e
polmeros da parede celular (3 a 14% do peso seco).
Aminocidos:
O termo vitamina em geral empregado para designar os outros fatores de crescimento que
no aminocidos.
As solveis em gua so: cido ascrbico (C), tiamina, riboflavina, cido pantotnico,
piridoxina, cido nicotnico, biotina, cido para-aminobenzico, cido flico, cobalamina, cido
mevalnico colina e meso-inositol (todos estes so importantes na nutrio de microrganismos,
exceo da vitamina C).
Num meio semi-sinttico costuma-se usar extrato de carne ou de leveduras como fonte de
vitaminas.
Uma ou vrias deficincias de vitaminas podem levar a efeitos marcantes sobre o metabolismo
dos microorganismos, por exemplo, fazendo acumular subprodutos no meio ou simplesmente
permitir o crescimento dos mesmos, apesar de todos os outros elementos estarem presentes
no meio.
Fontes de fsforo
Fontes de Na e K
A maior parte de potssio celular parece estar ligado ao RNA sendo necessrio cerca de 60 g
de matria seca/gramas de potssio. Assim como o fsforo, as necessidades de potssio
variam com as variaes no RNA (temperaturas, velocidade de crescimento, etc.). Os ons de
potssio funcionam como enzimas.
Quanto ao sdio ainda no foi quantificada a sua influncia, porm, em alguns microrganismos
existem grandes quantidades de Na e por isso so chamados de haloflicos.
Fontes de Mg
Fontes de S
Em geral est presente na forma inorgnica como sulfato. utilizado na sntese de protenas.
Traos de elementos
Tomamos contato com os microrganismos praticamente em todos os instantes e locais onde nos
encontramos.
Sabemos que existem microrganismos no ar, pois muita das infeces a que somos sujeitos
provm da atividade de microrganismos que anteriormente estavam em suspenso no ar, assim
como existem microrganismos no solo, nos alimentos, etc.
Muitas vezes fcil verificar a atividade dos microrganismos, por exemplo na deteriorao dos
alimentos, na fermentao de bebidas que contm acar, na transformao do vinho em vinagre,
etc., porm quando estamos interessados em controlar a atividade destes microrganismos
necessrio quantificar o seu crescimento, atravs da medida da biomassa presente.
Na natureza esta quantificao extremamente difcil, pois esto presentes muitas espcies, o
meio onde os microrganismos se desenvolvem extremamente heterogneo, existindo muitas
substncias (substratos), que podem ser aproveitadas pelos microrganismos e existem ainda
alteraes entre as diversas espcies (ou seja, a maior ou menor quantidade de indivduos de
uma determinada espcie pode condicionar o nmero de indivduos de outras espcies).
Mesmo nos processos industriais onde se procura trabalhar com culturas puras (um s
microrganismo), a variao de condies fsicas como a temperatura, pH, presso, existncia ou
no de iluminao, entre outras, pode afetar drasticamente o desenvolvimento dos MO =
microrganismos.
Portanto, a escolha do mtodo de medida uma das mais importantes decises que devem ser
tomadas para o estudo de qualquer fenmeno onde estejam presentes organismos vivos. Os
fatores que influenciam esta escolha so:
As propriedades da biomassa;
As propriedades do meio de cultura;
A preciso requerida;
A sensibilidade requerida;
A rapidez da medida.
De uma forma geral os mtodos de medida do desenvolvimento microbiano podem ser divididos
em 4 grupos:
Contagem de microrganismos
O caldo de cana oferece condies naturais e altamente nutritivas, ricas em matria orgnica e
inorgnica, que so ideais para o crescimento de uma grande variedade de microrganismos. Por
isso, no surpresa encontrar tais microrganismos se desenvolvendo durante a extrao e o
processamento da cana, originrias do solo, os quais aderem-se aos colmos, s folhas; da
prpria flora epfita da cana; da gua de lavagem e de diluio, contaminantes do ar.
Alm dos produtos do metabolismo como os cidos e as gomas, as bactrias tambm podem
interferir no processo fermentativo por utilizar o lcool como fonte de carbono, desdobrando-o em
cido actico. Assim, as bactrias alm de consumir o acar que poder ser fermentado, afetam
o
processo lanando substncias txicas que matam as leveduras ou ainda outras substncias
que fazem com que as leveduras floculem.
Essas bactrias podem ainda ser mesoflicas ou termoflicas, isto , aquelas que crescem em
temperaturas abaixo de 45C e as que suportam tempe raturas mais elevadas, acima de 45.
5 Tcnicas em Microbiologia
5.1 Introduo
No participar do trabalho quando tiver feridas nas mos (procurar proteg-la com curativo e
luva).
Planejar cada tarefa levando em considerao o tempo para execuo e leitura da mesma,
trabalhando sempre de forma metdica e ordenada.
Anotar:
Identificao:
Tipo de amostra;
Data e hora da tomada da amostra;
Data e hora da chegada ao laboratrio;
Qualquer outra observao que se fizer necessria.
Mtodo utilizado;
Meios de cultura empregados;
Resultados obtidos, etc.
Todo o material utilizado na anlise, tais como lminas, pipetas, etc., devem ser colocados em
recipientes contendo soluo desinfetante.
1) Esterilizao (autoclave);
2) Lavar;
3) Secar;
4) Envolver em papel ou colocar em latas de inox apropriadas;
5) Esterilizar;
6) Armazenar.
Esterilizao:
De uma maneira geral, o termo esterilizao implica no uso de agentes fsicos e/ou qumicos ou
mecnicos para eliminar totalmente os organismos vivos de um material. Em contrapartida o termo
desinfeco se entende pelo uso de agentes qumicos germicidas para destruio da
infecciosidade potencial de um dado material, no implicando, portanto, na eliminao total dos
organismos vivos.
Assepsia o conjunto de meios usados para impedir a presena de germes em local que no os
contenha.
Calor mido:
Os meios de cultura devero estar em frascos erlenmeyer ou tubos de ensaio tampados com
algodo e cobertos por papel de embrulho (kraft).
Os frascos vazios devero estar tampados e cobertos com papel alumnio ou papel kraft.
Calor seco:
A esterilizao segura pelo calor seco requer uma temperatura de 170C por 2 horas em
estufa de esterilizao ou forno Pasteur.
A esterilizao por calor seco normalmente usada para vidraria (placas de petri, pipetas) e
metais, os quais devero estar devidamente acondicionados em caixas ou latas de inox
apropriadas.
Radiao ultravioleta:
Filtrao
Todo dispositivo de filtrao mais a membrana devem ser esterilizados em autoclave antes do
uso.
5.5.3.1 Ao bactericida
O agente qumico tem a propriedade de matar as bactrias, uma ao irreversvel porque mesmo
que o agente qumico seja removido, a bactria morta no mais capaz de se reproduzir.
5.5.3.2 Ao bacteriosttica
O agente qumico tem a propriedade de inibir a multiplicao das bactrias, mas quando o agente
qumico removido a multiplicao retomada.
Metanol-etanol;
Compostos fenlicos;
Glutaraldedo;
Iodforos;
lcoois;
Quaternrio de amnio;
Composto de cloro;
Formaldedo gs;
Beta propielatone;
xido de etileno;
Organo sulfuroso.
Em locais de difcil acesso a amostragem deve ser auxiliada por um recipiente provido de cabo
ou cordo para atingir o produto, sendo que a primeira amostragem seria para "lavar" o frasco
coletor e a segunda seria coletada no frasco estril.
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As amostras de diferentes produtos lquidos podem ser acondicionadas em frascos de vidro com
tampas autoclveis e com volume de aproximadamente 500 mL.
Para facilitar a homogeneizao, o volume coletado no deve ser superior metade do frasco.
Os frascos devem ser previamente esterilizados em autoclave 121C por 15 minutos tende a
regio da tampa coberta por papel alumnio ou papel Kraft.
Nestas condies, amostras podem ser mantidas por algumas horas sem o perigo de alterao
sensvel nas contagens microbianas.
Quando a lavagem de cana feita por um sistema aberto, a amostragem deve ser feita antes e
depois do lavador. No sistema fechado a diferena da qualidade microbiolgica da gua, antes
e depois do lavador, reduzida. A amostragem convenientemente feita depois do lavador.
Caldo m isto
Amostras de caldo misto podero ser recolhidas antes ou depois do cush-cush. Para
amostragem homognea recomendado retirar as amostras na sada da caixa.
Mosto
O grau de contaminao microbiana no mosto depende dos componentes que formam esse
produto. Propores e condies microbiolgicas de caldo, xarope, melao e outros
ingredientes so essenciais na composio da flora do mosto. Quando a sua contagem
microbiana estiver
elevada, desejvel proceder a contagem dos componentes do mosto a fim de localizar a sua
fonte.
P-de-cuba
As amostras das dornas em fermentao, durante diferentes etapas do ciclo, nos permitem
acompanhar o processo.
Dornas m ortas
Leite de leveduras
Amostras do leite podem ser retiradas na sada da centrfuga ou na entrada dos tanques de
levedura.
Vinho centrifugado
gua de diluio
Amostras da gua utilizada para preparo no mosto podem ser obtidas em qualquer ponto de
adio desse ingrediente: dornas, tanque de preparo do p-de-cuba, etc.
Caldo clarificado
rea de trabalho
Balco com tampa de superfcie plana, ampla e limpa. Sala bem iluminada, com boa ventilao,
mas sem poeira e sem corrente de ar . A densidade microbiana do ar deve ser inferior a 15
colnias por placa, aps exposio por 15 minutos.
Autoclave
Pode ser horizontal ou vertical devendo ter boa exausto do ar e permitir a operao a 121C.
Balana semi-analtica
Pode-se usar qualquer tipo com capacidade para 1 a 2 kg e preciso de pelo menos 0,1g.
Para pesagem dos antibiticos seria desejvel uma preciso de 0,01g.
Potencimetro para pH
De tamanho suficiente para evitar superlotao nas operaes de esterilizao das vidrarias.
Aconselha-se operar com mximo de 50 a 75% da capacidade para aquela de convico
natural e 90% para a de convico mecnica forada.
Incubador
O incubador deve ser adequadamente construdo para que a temperatura no varie alm de
1C daquela ajustada. O tamanho deve ser suficiente para permitir um espao maior que 2,5
cm entre as camadas adjacentes das placas, e destas parede interna do incubador.
Incubador refrigerado
Contador de colnias
Contador manual
Pipeta de transferncia
Porta-pipetas
Tubos de diluio
Porta-tubos
Placas de petri
Porta-placas
Composio
Infuso de Batatas : 4,0 g
D (+) - glicose : 20,0 g
Agar : 20,0 g
gua destilada : 1.000 mL
Antes do uso deve-se adicionar soluo de cido tartrico, utilizar 1 mL de soluo de cido
tartrico para cada 100 mL de meio de cultura. O cido usado para inibir bactrias.
Melao : 50,0 g
Sacarose (acar branco) : 75,0 g
Peptona : 1,0 g
Extrato de levedura : 1,0 g
K2HPO4 : 1,0 g
(NH4)2S4 : 1,0 g
Agar : 20,0 g
gua destilada : 1.000 mL
Deve-se adicionar (100 ppm) de actidione ao meio, ou seja, prepara-se uma soluo de 0,1g
de actidione + 9,9 mL de gua destilada estril, de onde se transfere 1 mL para cada 100 mL
de meio derretido e resfriado a 45C, pouco antes d e colocar nas placas.
D - Meio de melao / sacarose slido (MSS) + CaCO3 (para contagem de bactrias produtoras de
cido)
Deve-se adicionar 100 ppm de actidione e 10,0 mL de soluo de CaCO3 10% para cada 90,0
mL de meio.
O CaCO3 solubilizado pelo cido produzido pela bactria, formando-se um halo claro em
torno da mesma.
Composio
Triptona : 10,0 g
Extrato de levedura : 5,0 g
Sacarose : 100,0 g
Glicose : 10,0 g
Agar : 20,0 g
gua destilada : 1.000 mL
Deve-se adicionar 100 ppm de actidione e 1,0 mL de soluo de azida sdica 1% para cada
100 mL de meio.
Deve-se agregar 100 mg/l de actidiona no meio derretido e resfriado a 45C, pouco antes da
colocao nas placas.
Meio bsico para leveduras, que evidencia as diferentes morfologias das colnias e a
produo de cido pelas mesmas, atravs da viragem do indicador verde de Bromocresol.
cido nalidxico: Inibe sntese de DNA de bactrias.
Ampicilina: Inibe sntese de parede celular.
Composio
Glicose 5,0000 g
KH2PO4 0,0550 g (a)
KCl 0,0425 g (b)
CaCl2 2H2O 0,0125 g (c)
MgSO4 7H2O 0,0125 g (d)
FeCl2 6H2O 0,2500 mg (e)
MnSO4 4H2O 0,2500 mg (f)
Casena hidrolisada enzimaticamente 0,5000 g
Extrato de levedura 0,4000 g
Agar 2,0000 g
Verde de Bromocresol 0,0022 g (g)
cido nalidxico 5,0000 mg (h)
Ampicilina 5,0000 mg (i)
Procedimento
Para inibir o crescimento bacteriano que prejudicaria os resultados, o meio WLN sofre a adio
dos antibiticos, cido nalidxico e ampicilina.
Usar 1 mL para cada 100 mL de meio de forma a obter 50 ppm (50 microgramas/mililitro). A
soluo de cido nalidxico autoclavvel, podendo ser acrescentada ao meio antes da
esterilizao.
Todo material seco, exceto material contendo plstico (placas de petri, pipetas, esptulas),
pode ser esterilizado em estufa temperatura de 170C. Antes de colocar em estufa, esse
material deve ser protegido contra a recontaminao utilizando-se porta-pipetas, porta-placas,
papel de embrulho ou outro mecanismo protetor. Para assegurar a completa esterilizao
deve-se deixar pelo menos 2 horas na temperatura de 170C.
Os meios de cultivo, a gua de diluio e outros lquidos estveis ao calor devem ser
esterilizados na autoclave a 121C (1 Atm.) por 15 minutos no mnimo. Para preparo dos meios
de cultivo os ingredientes so adicionados gua destilada e aquecidos temperatura de
ebulio em bico de gs, agitando-se freqentemente. Aps a completa solubilizao, restitui-
se o volume evaporado e distribui-se em recipientes apropriados (frascos erlenmeyer de 250
ou 500 mL), em quantidades nunca superiores a 150 mL cada. Fecha-se com tampo de
algodo e cobre-se com papel de embrulho antes de esterilizar na autoclave.
Antes de iniciar a tarefa de diluio agite bem os frascos das amostras especialmente as de leite,
p-de-cuba e das dornas em fermentao, para que se tenha uma perfeita homogeneizao.
Cuidado especial deve ser tomado para aquelas com leveduras ativas por causa do aumento da
presso interna por agitao. Nestes casos deve-se intercalar a agitao com afrouxamento da
tampa para aliviar a presso.
A transferncia da amostra para tubos de diluio feita com pipeta de 1 mL tomando os devidos
cuidados de assepsia. Algumas amostras, como leite e p-de-cuba, podem apresentar dificuldade
na transferncia, devido evoluo de gs e viscosidade. Nestes casos, deve-se pipetar ou
pesar 1g da amostra e transferir para o tubo de diluio. Para facilitar essa pesagem
assepticamente, recomenda-se pesar o tubo com gua de diluio, e agregar quantidade
suficiente da amostra sem retirar o tubo da balana semi-analtica o que facilita sobremaneira
essa operao.
Aps a colocao das amostras, os tubos devem ser agitados vigorosamente para obter
completa homogeneizao. A diluio decimal maior preparada transferindo-se 1 mL dessa
amostra diluda em um outro tubo de diluio, agitando-se em seguida.
Numa diluio adequada obtm-se, aps plaqueamento, entre 30 e 300 colnias por placa.
6.2.5 Inoculao
Liquefao do meio
O meio que foi mantido lquido por mais de trs horas deve ser eliminado. A reesterilizao do
meio pode causar precipitao parcial dos ingredientes e deve ser evitada.
Selecione as amostras a serem semeadas em placas em uma srie, de modo que o tempo
decorrido entre a diluio da primeira amostra e a colocao da ltima placa da srie seja
menos de 20 minutos. (Quando necessitar de semeadura contnua por meio de um grupo de
operadores, deve-se planejar o trabalho de modo que o tempo entre a colocao da amostra
no primeiro diluente; ou diretamente em placa, e a colocao na ltima placa daquela amostra
no seja superior a 20 minutos). Introduz-se 12 a 15 mL do meio derretido e resfriado a 44 -
46C em cada placa levantando-se cuidadosamente a t ampa da placa de petri o suficiente para
a introduo da pipeta ou colocao do meio. Cuidadosamente evite o espalhamento do meio
para fora da placa ou na parte interna da tampa. Logo aps a colocao do meio nas placas,
misture bem o meio com a amostra na placa (tomando-se cuidado para no borrifar o contedo
nas paredes) por meio de rotao do mesmo, primeiro em um sentido e em seguida em sentido
contrrio, ou por meio de rotao e inclinao das placas ou pelo uso de agitador mecnico
adequado. Tendo assim distribudo a mistura uniformemente na base da placa, deixe o meio se
solidificar (dentro de 5 a 10 minutos) numa superfcie plana. Aps a solidificao as placas
so invertidas e colocadas prontamente no incubador.
Incubao
Incube as placas a 32C 1C por 48 horas, 3 horas para a contagem de bact rias totais e
contagem de bactrias produtoras de cido.
Para contagem de fungos e leveduras as placas devem ser incubadas a 25C 1C por
perodo de 3 a 5 dias. No geral, as contagens so bastantes prximas de modo que para
anlise de rotina pode-se usar apenas s contagens aps 3 dias de incubao. O meio usado
para essa contagem o meio PDA acrescido de 1% de soluo de cido tartrico.
Conte as colnias com auxlio de lente de aumento, sob iluminao uniforme e adequadamente
controlada. Rotineiramente, use o contador de colnias tipo quebec, de preferncia o modelo
de campo escuro, equipado com uma placa guia quadriculada em 1 cm2, ou outros dispositivos
que ofeream condies equivalentes de iluminao. Conte o total de colnias usando o
contador manual. Evite o erro de contar as partculas insolveis do meio ou material precipitado
na placa com colnias puntiformes.
Conte todas as colnias das placas selecionadas aps a incubao. Se for impossvel contar
prontamente, armazene as placas (aps o perodo de incubao necessrio) temperatura de
aproximadamente 5C por um perodo nunca superior a 24 horas, mas evite isso na prtica
rotineira. Quando contar colnias nas placas de amostras individuais, observe as
recomendaes abaixo. Tambm registre no relatrio de cada lote os resultados do teste de
esterilizao dos materiais (gua de diluio, meio de cultivo e placas) feitos na ocasio do
plaqueamento. Anote estes eventos para o grupo de placas, como descrito acima.
Selecione as placas sem espalhamento com 30 a 300 colnias. Conte todas as colnias,
incluindo aquelas puntiformes, registre a diluio usada, e relate o nmero de colnias.
(1) Se mais de uma placa de uma certa diluio for preparada, mas somente uma placa
contm 30 a 300 colnias, conte tambm a outra placa duplicata, a no ser que seja
excluda pelos itens (IV) e (VII) e considere a mdia aritmtica. (2) Quando uma ou mais
placas repetidas de diluies decimais consecutivas forem contadas, determina-se a
contagem mdia das diluies antes de proceder como no item (III).
IV)Espalhamento
Se no tiver placas com 30 a 300 colnias e uma ou mais placas com mais de 300 colnias,
use a placa contendo o nmero mais prximo de 300 colnias, conte e avalie o nmero de
colnias por placa como indicado no item (III).
Se todas as placas de uma determinada amostra: (1) mostrarem ausncia de colnias; (2)
tiverem excesso de colnias espalhadas; (3) apresentarem contaminao ou (4) no forem
satisfatrias, relate da seguinte forma: "sem colnias" (SC); "espalhamento" (Esp.);
"acidente de laboratrio", (AL) ou "inibidores de crescimento" (IC). Nas placas que no
houver crescimento ou que mostrar proporcionalmente menos crescimento em diluies
menores, o analista dever suspeitar da presena de materiais inibidores na amostra
examinada, mas tais resultados no devem ser interpretados como evidncia da presena
de inibidores. A presena de inibidores deve ser determinada por um teste apropriado
designado especialmente para detectar tais agentes.
Para calcular a contagem por mL, multiplica-se o total de colnias, ou a mdia, ou o nmero
avaliado pela recproca da diluio usada. Quando apresentar os resultados, no use mais
que os dois primeiros dgitos.
Quando a contagem de colnias espalhadas for inevitvel conte cada um dos 3 tipos distintos
como uma colnia. O primeiro a cadeia de colnias, no distintamente separadas, que parece
resultar da desintegrao de um aglomerado de bactrias quando a placa agitada para
misturar o agar com gua de diluio. Se houver apenas uma dessas cadeias, conta-se como
uma nica colnia. Se uma ou mais cadeias parecem ser oriundas de fontes separadas conte
cada fonte como uma colnia. No conte cada ponto dessas cadeias como colnias
separadas.
O segundo tipo o espalhamento que se desenvolve no filme de gua entre o agar e o fundo
da placa. O terceiro tipo aquele que forma no filme da gua, nos cantos sobre a superfcie de
agar.
Os dois ltimos tipos aparecem por causa do acmulo de umidade no ponto onde se origina o
espalhamento. Quando a gua de diluio for inferiormente distribuda, a bactria raramente
forma colnias espalhadas. Qualquer laboratrio com 5% das placas com mais de 1/4 coberto
por colnias espalhadas deve tomar providncia imediata para eliminar esse problema. Quando
o espalhamento cobrir mais da metade da placa considerar para registros dos resultados como
acidentes de laboratrio.
Erros pessoais
Para facilitar a anlise dos resultados de contagem microbiana conveniente dividir a anlise em
dois setores: (1) setor da extrao e tratamento de caldo e (2) setor de fermentao e destilao.
O nmero de microrganismos presentes nas amostras de caldo, mosto, leite e outro material na
usina variam em torno de alguns milhes a bilhes de indivduos por mililitro ou por grama do
produto.
Os resultados das contagens variam muito, de acordo com as condies da matria-prima, dos
equipamentos e processos utilizados na usina. Assim sendo, os limites tolerveis s sero
perfeitamente vlidos se forem estabelecidos para cada caso particular.
A concentrao de leveduras vivas nas diferentes etapas de fermentao varia de acordo com a
adequao s condies de fermentao. Tambm, a concentrao de bactrias lcticas varia
consideravelmente de acordo com o grau de infeco.
7 Anlises Microscpicas
7.1 Viabilidade
O mtodo proposto uma modificao daquele tradicionalmente utilizado, uma vez que padroniza
a concentrao de corante, o pH, o meio e o tempo de "tingimento" das clulas e leveduras,
visando melhorar o controle da fermentao.
Pontos de moagem
Mtodo de amostragem
As amostras devem ser coletadas em frascos limpos e secos, mergulhando estes diretamente
com as mos. Deve-se evitar a anlise aps 1 hora da coleta.
Material :
Reagentes:
Tcnica:
Exemplo:
Observaes:
Podemos utilizar como critrio para distinguirmos uma clula de um broto o tamanho do
broto, admitindo que um broto seja menor que a metade do tamanho da clula-me.
Quanto diluio da amostra, esta deve ser feita com a soluo corante visando conseguir
uma mdia de 40 - 100 clulas por campo, indiferente da origem da amostra (vinho, leite, p-
de-cuba, etc).
Bactrias: Os bastonetes podem ser contados simultaneamente s leveduras, porm com
uma preciso menor.
Uma cmara de contagem tpica consiste de uma depresso central de superfcie conhecida,
permitindo determinar a concentrao celular da amostra.
Assim, a cmara de contagem consiste de uma lmina espessa de vidro, de forma retangular,
atravessada transversalmente por 4 sulcos e um central (formando um H central) que
delimitam 3 reas de nveis diferentes. A plataforma central, que dividida transversalmente
por um sulco, possui uma rea reticulada em cada lado e exatamente 0,1 mm mais baixa que
as duas plataformas laterais, onde se apia a lamnula, deixando, portanto, um espao com 0,1
mm de profundidade.
A cmara de contagem e a lamnula so polidas para garantir o bom contacto entre ambas e
devem ser limpas com gua, lcool ou sabo neutro e secas com papel para lentes (sem
silicone).
No modelo moderno aqui descrito (Neubauer), h linhas separatrias que dividem o quadrado
central em 5 grupos de quadrados mdios, de 0,2 mm de lado ou superfcie 0,04 mm2. Estes
quadrados mdios subdividem-se, cada um, em 16 quadradinhos de 0,0025 mm2 de superfcie
cada, sendo os quadrados mdios separados por linhas trplices, chegando-se assim, aos 400
quadradinhos. Ver esquema na Figura 7.4.
Para evitar contar as clulas duas vezes devemos usar como regra a contagem das clulas
que esto sobre as linhas, apenas aquelas do lado esquerdo e no topo. Tambm para evitar
parcialidade do operador na escolha dos quadradinhos a contar devemos fixar como regra a
contagem das clulas somente nos 4 quadrados dos cantos e no central do reticulado.
A Figura 7.2 mostra uma planilha de clculo dos ndices mais importantes que deve ser usada
para tornar os critrios homogneos. Observar que nesta planilha existe um "gabarito" para
identificao dos objetos a serem contados.
Fig 7.1- Determinao da viabilidade celular de leveduras com soluo de Azul de Metileno.
As clulas incolores so clulas viveis e as clulas coradas de azul so clulas mortas.
7.2.1 Introduo
O mtodo de Gram se baseia no fato de que quando certas bactrias so coradas pelo cristal
violeta e depois tratadas pelo iodo (lugol), forma-se um composto entre o corante e o iodo, o qual
to fortemente retido pela clula bacteriana que no removido pelo tratamento subsequente
com lcool: so as bactrias Gram positivas, que se coram de azul roxeado. As bactrias Gram
negativas se deixam descorar facilmente pelo lcool.
Portanto, se aps o tratamento com lcool fizermos uma colorao de fundo com safranina, as
bactrias Gram negativas aparecero vermelhas. O mecanismo da colorao de Gram ainda ,
at hoje , bastante discutido, mas sabe-se sem dvida que est relacionado com as diferenas de
permeabilidade da parede celular.
A camada de peptoglicano mais grossa nas bactrias Gram positivas, permitindo a reteno do
corante cristal - violeta e corando-se assim de azul roxeado. As bactrias Gram negativas no
retm esse corante e assim exibem a colorao vermelha do contracorante safranina. Alm
disso, a concentrao de lipdeos nas bactrias Gram negativas maior que nas Gram positivas.
7.2.2 Metodologia
Soluo 1:
Cristal violeta - 2,0 g
Etanol 95% - 20,0 mL
Soluo 2:
Oxalato de amnio - 0,8 g
gua destilada - 80,0 mL
Misturar 1 e 2. Estocar 24 horas antes de usar e filtrar com papel de filtro num frasco de
estoque.
B) Soluo de Lugol: Misturar 1,0 g de iodo metlico com 2,0 g de iodeto de potssio e transferir
para um Graal. Adicionar alguns mL de gua e moer. Adicionar + gua at completa dissoluo
(at 300 mL). Transferir a soluo para um frasco mbar.
Faa uma suspenso celular (no muito espessa) e faa um esfregao na lmina.
Fixar no calor da chama do bico de bunsen ( tomando cuidado para no aquecer
demasiadamente ). Esfriar.
Cobrir o material com o corante cristal violeta (soluo 1 e 2) durante 1 minuto.
Lavar em gua corrente para retirar o excesso de corante.
Cobrir o material com a mistura I2 e KI (Lugol) durante 1 minuto.
Lavar em gua corrente e descolorir com a mistura lcool - acetona at retirar todo o excesso
de corante, isto , at que o solvente permanea incolor (30 minutos).
Lavar em gua corrente.
Cobrir com safranina por 10 segundos.
Lavar em gua, inclinar a lmina para escorrer o excesso de gua e deixar secar ao ar.
Examine ao microscpio sob imerso.
Resultado :
Material:
Bquer de 250 mL
Proveta de 100 mL
Banho-maria
Bureta
pHmetro
Reagente:
NaOH 1N
H3PO4
Tcnica:
Resultado:
Quanto menor for o pH ou maior a acidez de uma amostra, maior ser seu grau de contaminao.
Meio A
Glicose 40 g/l
Etanol 40 g/l (colocar depois de estril)
Extrato de levedura 5 g/l
pH 5,0 (com H2SO4)
Colocar 1 mL de soluo de Verde de Bromocresol (0,22 g/100 mL) para cada 100 mL do meio.
Esterilizar 11 tubos de ensaio com tampa rosquevel e colocar 4 mL do meio A em cada tubo.
Preparar a amostra (vinho) a ser analisada:
Bater por 2 horas (agitao); deixar decantar por 2 horas ou mais; centrifugar o sobrenadante
por 2 a 4 minutos a 4.000 rpm.
Acertar o pH do sobrenadante para 5,0 (verificar se no existe levedura, deve conter apenas
bactrias).
A viragem do indicador do meio de verde para verde claro ou amarelo indica o crescimento de
bactrias.
10 Referncias Bibliogrficas
LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugnio; BORZANI, Walter. Tecnologia das fermentaes.
So Paulo: Edgard Blucher, 1975. 285 p. (Biotecnologia, 1).