Ensayos inmunolgicos

Los ensayos inmunolgicos se basan en la especificidad de la unin Ag.- Ac.

En base a esta unin podemos dosar y caracterizar toda sustancia que pueda generar anticuerpos especficos contra
ella.

Antgenos (Ag)

Se denomina antgeno (Ag.) a toda sustancia que, introducida en un organismo competente, provoque una
respuesta inmunitaria, estimulando la produccin de anticuerpos o de clulas sensibilizadas.
Se trata en general de molculas complejas con grupos determinados, los cuales constituyen zonas restringidas que
determinan la especificidad, estas zonas se denominan determinantes antignicos o epitopes.
Dado que en una molcula antignica existen varios epitopes diferentes, de ah que se diga que un
Ag. es polivalente , la inoculacin de sta originar en el receptor anticuerpos con distinta especificidad, cada uno
de los cuales provendr de un clon celular distinto ( respuesta policlonal)
El nmero de determinantes antignicos constituye la valencia del Ag.
Esta puede ser: valencia total = n total de epitopes
valencia funcional = n de epitopes expuestos, es decir disponibles para ser captados por el
sistema inmune del huesped.
Los Ag. tienen 2 caractersticas bsicas:

1 Inmunogenicidad: capacidad de generar Ac.

2 Especificidad : capacidad de unirse a ellos.
Existen molculas que no son inmunognicas por s mismas pero s son capaces de unir especficamente Ac, estas
molculas se denominan Haptenos ( ej. para aminobenceno, dinitro fluor benceno y Ac. sulfanlico).

Caractersticas de las que depende la antigenicidad:

-PM: debe ser mayor de 10KD, sin embargo hay molculas como la de la insulina
( PM:6KD) y el glucagon (PM: 3.8KD) que pueden generar RI si son inoculadas con un adjuvante.
Otras sustancias de bajo PM como es el caso de los haptenos en cambio, deben inyectarse acopladas a una
molcula inmunognica llamada carrier para transformarse as en antignicas.
- Inmunogenicidad de especie: por ej. los polisacridos neumococcicos son buenos inmungenos para el hombre
pero no para el conejo.
-Relacin propio-no propio: para ser inmungeno, un Ag. no debe pertenecer a la especie animal de la cual se
pretende obtener la respuesta inmune hacia l.
-Grupos qumicos: - los radicales cidos o bsicos fuertes en las protenas las hace mas inmunognicas
(principalmente los cidos).
- la presencia de aminocidos como tirosina o fenilalanina, ( la gelatina no los posee y por ello solo es antignica
cuando se inyecta con adyuvante).
-Rigidez de la molcula: las largas cadenas de las molculas de los hidratos de carbono son fcilmente
distorsionables y por lo tanto no generan una buena respuesta inmune. La alta especificidad de los grupos
aromticos en los aminocidos de sntesis es debida a la rigidez del benceno. A su vez la posicin de estos grupos
tambin es significativa para la especificidad dado que los derivados D o L pueden diferenciarse serolgicamente.
La mayora de los antgenos son protenas de alto PM, con aminocidos particulares (sobre todo con grupos
aromticos) y estructura definida.
En los hidratos de carbono la antigenicidad esta dada por la condensacin de 2 o ms grupos de hexosas.
Los cidos nuclecos se tornan antignicos s se les rompe la doble hlice por ej. por calentamiento y enfriamiento
rpido.
Los cidos grasos no son antignicos pero si los son los lpidos complejos sobre todo los asociados a glcidos y
protenas ( ej. lipopolisacridos).
En orden de antigenicidad tendramos:
1 protenas
2 hidratos de carbono
3 lpidos ( principalmente fosfo y gluco-lpidos) y cidos grasos.

Ag. bacterianos :
- Pueden ser la parte constitutiva del microorganismo:- protenas frecuentemente situadas en la membrana
celular y el espacio periplsmico.
- Hidratos de carbono, los cuales constituyen sobre
todo los Ag. de superficie. En el caso de las enterobacterias son complejos glcido-fosfolpidos que constituyen la
pared celular y se denominan endotoxinas, su toxicidad se pone en evidencia cuando se produce una masiva
destruccin bacteriana dentro del huesped.
Otro tipo de Ag. bacteriano lo constituyen las exotoxinas, estas son generalmente protenas antignicas con
marcado poder txico que son volcadas al medio por el microorganismo. Son Ag. eficaces a pequeas dosis y
pueden ser neutralizados por los Ac. que genera, ( toxina botulnica, toxina tetnica) .

Anticuerpos (Ac.)

Los anticuerpos son protenas sricas pertenecientes al grupo de las gamma-globulinas o inmunoglobulinas,
constituidas por la asociacin de cuatro cadenas polipeptdicas unidas entre s mediante puentes disulfuro, dos
cadenas se denominan pesadas y las otras dos ligeras. A su vez, cada una de las cadenas ligeras y pesadas, incluye
una regin variable, cuya secuencia de aminocidos es peculiar de cada anticuerpo, y una regin constante, con la
misma secuencia en todos los anticuerpos.
Existen 5 clases: IgM; IgG; IgA; IgD e IgE

La estructura bsica de un Ac. Se puede esquematizar con la estructura de la IgG

( Fig.1):

Fig.1
Los sitios de unin al Ag. son 2 por eso se dice que un Ac. es bivalente y se denominan paratopes, estos se ubican
en la zona variable de la molcula .

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro.

La unin antgeno-anticuerpo depende de la complementaridad entre ambas molculas. En el sitio del

determinante antignico y en el de combinacin del anticuerpo hay estructuras que se corresponden (modelo
llave-cerradura), cada anticuerpo reconoce y se une al antgeno que le dio origen. Esta complementaridad o
especificidad no slo est dada por la estructura primaria de la molcula sino tambin, en algunos casos, por la
secundaria y terciaria.
Las fuerzas de esta unin no son de tipo covalente sino ms lbiles (uniones electrostticas, puentes
de hidrgeno , fuerzas de Van der Waals) , de manera que permiten, en ciertas condiciones, la disociacin de los
complejos.

En la interaccin in vitro de un Ag. con su correspondiente Ac. se distinguen 2 etapas:

1 Interaccin primaria: es la mera unin de un Ag. y su correspondiente Ac. No es visualizable directamente y

no es demasiado influenciada por la temperatura, la concentracin salina o la fuerza inica ni la agitacin. Slo
depende de la complementaridad ya que cuando mayor sea sta mayores sern las fuerzas de unin
( afinidad) y menores sern las fuerzas de repulsin (ej. repulsin estrica).
Los ensayos inmunolgicos basados en la interaccin primaria son, por ej. ELISA, RIA (radioinmunoensayo), IF
(inmunoflorescencia).
En estos ensayos la visualizacin del complejo se hace marcando uno de los reactivos
( Ag. o Ac.), con alguna sustancia detectable.
En el caso del ELISA ( Fig.2), la marcacin se realiza con una enzima como por ej. la peroxidasa, de manera que
al agregar un cromgeno y el sustrato de dicha enzima, se
puede calcular la cantidad de complejos formados midiendo la intensidad del color producido.
Fig 2

En el RIA, (Fig. 3) la marcacin es por un istopo radiactivo, de manera que en este caso medimos radiacin
asociada al complejo.

Fig. 3
En IF (inmuno fluorescencia) marcamos con una sustancia fluorescente.
Podemos hacerlo directamente sobre un corte de tejido, impronta etc. y la observacin se realiza directamente
con microscpio de fluorescencia.
Tambin podemos marcar una suspencin celular, en cuyo caso la medicin se har por ej. por citometria de
flujo, esta tcnica se usa actualmente en clnica para cuantificar clulas inmunes en el monitoreo del HIV,
Todas las tcnicas de interaccin primaria pueden ser Directas : marcamos uno de los reactivos del complejo.
Iindirectas: la marca estar en un 2 Ac. dirigido contra alguno
de los componentes del complejo.Esta es mas sencible que la anterior ya que al aumnetar el tamao del sistema
podemos detectar menores cantidades.

2 Interaccin secundaria: sigue a la anterior, los complejos iniciales que se forman rpidamente y sobre los
cuales la temperatura y la concentracin salina no tienen demasiada influencia, se agregan para dar diferentes
fenmenos visibles cuya caracterstica depender principalmente de la naturaleza del antgeno.
Esta etapa se acelera con la temperatura, la agitacin y es dependiente de la concentracin de electrolitos.

Las reacciones de interaccin secundarias son:

Para Ag. solubles:

Precipitacin:
En este caso el antgeno es una molcula soluble y al ponerse una solucin del mismo, en contacto con los
anticuerpos que origin, se forman complejos Ag-Ac que al insolibilizarse en su mayor parte, dan una reaccin de
precipitacin.
Esto se da en 2 etapas, la primera se desarrolla rpidamente formndose los complejos Ag-Ac, esta etapa es
influenciada muy poco por la temperatura, la concentracin de electrlitos y la agitacin.
En la 2 etapa los complejos se agregan formando micelas o redes que al alcanzar determinado tamao precipitan.
Esta etapa se acelera con el aumento de la T (se la lleva a cabo normalmente a 37C) y es adems dependiente de
la concentracin de electrolito ( se usa generalmente ClNa 0,15M) . Es mucho ms lenta que la anterior.
La formacin de estas redes esta dada por la bivalencia del Ac. y la polivalencia del Ag., esta polivalencia se debe,
como ya mencionamos, a la presencia de distintos determinantes antignicos.
Los sueros inmunes obtenidos de animales inoculados con este tipo de Ag. poseen una mezcla de Ac. cada uno de
los cuales interacciona con un epitpe distinto (antisuero policlonal). Con Ac. monoclonalesen general no se
produce precipitacin, esto es porque en la mayora de los casos estn dirigidos contra un nico epitope de manera
que para el caso el Ag. ser monovalente, y solo se evidencia el fenmeno cuando se trata de Ag. con epitopes muy
repetidos.
Con haptenos monovalentes o Ag. que posean un solo determinante antignico, o cuando los
Ac. son funcionalmente monovalentes como es el caso de los anticuerpos asimtricos tampoco se formar
precipitado.
Como se dijo anteriormente, la aparicin de precipitado se produce cuando las redes de complejos Ag.
Ac. alcanzan un determinado tamao.
Si en una serie de tubos colocamos cantidades constantes de uno de los reactivos ( por ej. el Ac. y en cada uno
cantidades variables del otro ( en este caso Ag.) veremos que se producen distintas cantidades de precipitado en
cada tubo, existiendo en algunos de ellos la mxima cantidad posible para el caso.
Esto se da porque la formacin de una red ptima depende de la relacin molecular entre Ag. y Ac. y esto va a
depender de la cantidad de determinantes del Ag., ya que los Ac. siempre son bivalentes.

Fig.5 Curva de precipitacin:

Como vemos en la curva a medida que aumentamos la cantidad de Ag. aumenta la cantidad de precipitado,
llegando a una zona donde este es mximo; esta es la llamada zona de equivalencia y representa la proporcin
molecular ptima de cada reactivo, necesaria para generar la red de mayor tamao.
Al seguir aumentando la concentracin de Ag. que la cantidad de precipitado vuelve a disminuir, esto es porque,
otra vez, abandonamos la relacin de equivalencia y los complejos tienen menores tamaos.
Hay que tener en cuenta que si en una mezcla existen ms de un sistema Ag-Ac los precipitados de cada uno de
ellos se encontrarn juntos en el fondo del tubo siendo imposible distinguir uno de otro; lo que vamos a notar es
que el pico de la curva en estos casos ser menos neto ya que se van a solapar distintas zonas de equivalencia.

Los tipos de reacciones de precipitacin son:

a) En medio lquido:
Cualitativa: se usa poco ya que existen mejores mtodos para detectar
presencia o ausencia, adems, debido a lo que mencionamos antes sobre la posible existencia de mas de un
complejo en la mezcla, para utilizar este mtodo debemos asegurarnos de que uno de los reactivos este puro.
Semicuantitativa: tampoco se usa, constituye un mtodo poco prctico.
Cuantitativa: esta es la primera tcnica que permiti medir en masa la
cantidad de Ag. o Ac. presente en una solucin.
Por ej. queremos medir la masa de Ac. anti neumocccico en un suero.
Disponemos del polisacrido purificado (esto es importante para asegurarnos de tener un solo sistema
reaccionante). Se colocan en una serie de tubos cantidades crecientes del antisuero y constantes del polisacrido,
se incuba la mezcla 1hr a 37C y luego se centrifuga, lavamos el precipitado para eliminar las protenas
contaminantes y lo resuspendemos, finalmente medimos la cantidad de protenas por ej. por absorbancia a 280nm.
En este caso como el Ag. no es proteico, la medida obtenida corresponder solo a los Ac. presentes en el suero.
Si ambos reactivos fueran proteicos, el clculo se hara restando la cantidad agregada del reactivo conocido.
Para obtener la masa debemos tener una curva de calibracin: masa de protena vs DO y, a partir de la DO medida
en nuestros tubos, obtenemos la masa incognita.
La medicin de DO se realiza en el tubo de mximo precipitado, donde sabemos que todo el
Ag. y Ac. presentes formar parte del mismo.

b) En medio slido ( precipitacin en gel) :

Se usa como soporte de la reaccin un gel de manera que las molculas difundirn libremente a travs de l de
manera que, a lo largo del recorrido se ir formando un gradiente de concentraciones que har que en un
determinado punto los reactivos se encuentren en su relacin de equivalencia, en ese punto se producir un
precipitado que sobre el gel se ver como una ntida banda blanca que permanece estable mientras un mayor flujo
de reactantes no provoque su re disolucin.
Como se recordara, en la precipitacin en medio lquido no era posible distinguir en el precipitado la presencia de
ms de un sistema reaccionante, en el caso de que las molculas estn disueltas en un medio gelificante sumamos a
los fenmenos de la precipitacin, los de la difusin simple, de manera que aquellos complejos cuyos coeficientes
de difusin sean distintos formaran bandas en distinta posicin. De esta manera podemos resolver la existencia de
ms de un complejo reaccionante en la mezcla. Sin embargo no podremos separar complejos con igual coeficiente
de difusin, y decimos que cada banda que se forme estar compuesta por lo menos por 1 sistema .
Como soporte se usan medios semi slidos como agar blando (agar 1% en solucin salina) agarosa 0,5% etc.
Todos aquellos que permitan una libre difusin de macromolculas.

La precipitacin en gel puede ser:

Cualitativa: existen diferentes esquemas que nos permiten detectar la presencia de

un Ag. o un Ac. (segn el caso).
 - Difusin simple monodimensional ( mtodo de Oudin): Se coloca en un tubo de ensayo agar fundido
mezclado con un vol. igual del antisuero a analizar (en este caso queremos detectar la presencia de un Ac.)
Se deja solidificar y se aade la solucin de Ag., este va a difundir por el agar formando, como dijimos, un
gradiente de concentracin decreciente hacia el fondo del tubo, significa que en determinada zona
Ag. y Ac. alcanzarn la relacin de equivalencia, formndose ah la banda de precipitado.
Se formarn tantas bandas como sistemas haya, siempre que la velocidad de difusin sea distinta para cada uno de
ellos.
Se ha intentado utilizar este sistema con fines cuantitativos, ya que la distancia a la que se forma la banda es
directamente proporcional a la concentracin del reactivo que difunde, entonces mediante distintas frmulas
matemticas se puede calcular la concentracin en funcin de la distancia recorrida.
- Difusin doble monodimensional ( mtodo de Oakley Fulthorpe): En este caso colocamos en la parte inferior
del tubo un vol. de agar 1% fundido, mezclado con un vol. igual del antisuero, dejamos solidificar y agregamos
igual vol. de agar 0,5%, dejamos solidificar y por ultimo agregamos agar 1% donde se encuentra disuelto el Ag.
Tanto el Ag. como el Ac. migrarn hacia la zona media de menor concentracin, de manera que, otra vez, se
formarn gradientes que harn que en deteminado punto los reactivos estn en equivalencia y precipiten.
Vemos ac, que si la concentracin de Ag. y Ac. estn en relaciones ptimas (equivalentes) la banda se formar en
un punto intermedio del tubo, mientras que si, por ej. la cantidad de Ag. esta en exceso necesitar recorrer una
mayor distancia para alcanzar una dilucin tal que se encuentre en equivalencia con el Ac. y as la banda se
formar ms cerca del fondo. Lo contrario ocurrir cuando la cantidad de Ac. sea la que esta en exceso.

Fig. 6

- Difusin doble bidimensional (mtodo de Ochterlony) : Constituye un mtodo muy completo ya que permite
obtener mas informacin que los anteriores.
Consiste en colocar en una placa de Petri agar 1,5% al cual luego de solidificar se le realizan perforaciones en
forma de pocillos a distancia conveniente y en dichas perforaciones se colocan pequeas cantidades de Ag. y Ac.
En este caso los reactivos difunden en forma radial a partir del pocillo generando bandas de precipitacin cuyas
caractersticas dependern de varios factores.

Fig.7
Igual que en el caso anterior, cuando las concentraciones colocadas en los pocillos estn cerca de la de quivalencia
la banda se formar a mitad de distancia entre ellos.
Adems, nos permite tener idea de los PM de cada reactivo ya que al tratarse de una difusin radial, la
concavidad de la banda estar hacia el lado del pocillo donde se halla colocado el reactivo de mayor PM, y
viceversa, si ambos PM son semejantes la banda ser recta.
Por otro lado, la posibilidad de hacer varios pocillos en una placa permite obtener informacin sobre similitud de
los Ag. reaccionantes.
Recordemos que las macromolculas antignicas tienen en su superficie zonas llamadas determinantes antignicos
y que son los sitios reconocidos por el Ac.
As, dos Ag. emparentados ( por ej. dos albminas de distinta espcie) tendrn probablemente determinantes
antignicos comunes a ambos.
Mediante la tcnica de Ouchterlony podemos determinar la existencia o no de determinantes comunes entre
Ag. segn las caractersticas de las bandas formadas.

Fig.8
La reaccin de identidad (I), corresponde a los Ag. que comparten todos los determinantes antignicos, es decir
que estamos ante la misma molcula, en la de no identidad (II), ningn determinante es compartido y por lo tanto
son Ag. distintos mientras que en la identidad parcial ( III), hay determinantes en comn, o sea que hablamos de
Ag. emparentados, esto se ve como un espoln dirigido hacia el pocillo con menos determinantes reactivos. Notese
que en este caso ltimo, ab es una sola molcula
Ac, otra vez nos referimos a un sistema reaccionante con un determinado coeficiente de difusn. En caso de que
los sistemas sean varios tendremos tambien distintas bandas segn las velocidades de difusin de cada uno. Esto
nos va a permitir determinar la pureza de una solucin antignica, recordando siempre que cada banda
corresponder a, por lo menos, un sistema.

Fig.9

En este esquemas vemos, en el caso I, que en el pocillo ac , hay 2 sistemas reaccionantes (a y c) uno de los cuales
( a) presenta reaccion de identidad con el otro pocillo a (ya que se trata del mismo Ag.), mientras que el sistema c
da una banda separada ( es decir que su concentracin y su coeficiente de difusin son distintos, por lo tanto es
otra molcula antignica).
En el caso II, se enfrenta la solucin ab con la solucin b, ac vemos la banda de no identidad correspondiente a
los Ag a y b de cada pocillo, y la banda de identidad correspondiente a b, presente en los dos. La diferencia con el
caso I radica en que en II, a esta en mayor concentracin relativa de lo que esta c en el I.
En el esquema III, vemos la identidad parcial de ab y b, y las bandas c y d que no presentan identidad ni con a ni
con b. Notese que en este ltimo caso ab es tambien una sla molcula.

Evaluacn de los pasos de purificacin de albumina srica humana.

Fig. 10
Otra utilidad de este mtodo es la de testear los pasos de purificacion por ej. de una protena , a partir del material
a purificar ( 1) vemos la desaparicin de bandas en los distintos pasos, asi el resultante del 1 paso, pocillo 2,
presenta una banda menos que el 1, y en el pocillo 3 ya vemos solamente la banda continua correspondiente a la
albmina, es decir que el paso 4 no sera necesario. En el pocillo central debemos colocar un antisuero total que
nos revele todas las protenas del suero a purificar. En este ejemplo ser antisuero humano total.
Como control debemos colocar un pocillo con albumina humana purificada para verificar su identidad con la
banda presente en el ultimo paso de purificacin. La banda de albumina esta representada por la linea continua
que rodea el pocillo central.

Semicuantitativo:En este tipo de pruebas se busca determinar la cantidad de un

determinado reactivo .
Cuando la cuantificacin es relativa, el resultado depende del mtodo usado, los reactivos empleados etc., entonces
hablamos de ensayos semicuantitativos.
En inmunologa el resultado de estos ensayos se expresan como ttulo.
El ttulo se define como la inversa de la ltima dilucin que da resultado positivo.
La metodologa empleada consiste en colocar sobre un porta objetos, agar 1,5% en sol. fisiolgica y sobre l
realizar perforaciones delimitanto pocillos en los que se colocarn los reactivos, uno de ellos en concentracin
constante y el otro, el que se va a cuantificar, en diluciones crecientes.
Cuantitativo: En estos casos la cuantificacin se realiza en masa, es decir que el resultado obtenido no debe variar
de una tcnica a otra ya que representa una medida absoluta.
La tcnica de precipitacion usada en este caso es una difusin simple en placa o inmunodifusin
radial ( Mancini ).
Consiste en una placa de agar o agarosa al 3% en solucin salina, en el que se encuentra disuelto el Ac.Sobre el
agar se realizan perforaciones en las que se colocan las muestras a dosar.
Como mencionamos en prrafos anteriores, la distancia a la que difunde un Ag. hasta alcanzar la relacin de
equivalencia con su correspondiente Ac. y precipitar, es proporcional a la concentracin del mismo. Entonces,
cuando los sistemas son equivalentes, aparece alrededor del pocillo un circulo de precipitacin.
Debido a que la concentracin del reactivo disuelto en el agar es constante, el dimetro del crculo descripto por la
banda de precipitacin ser directamente proporcional a la concentracion del reactivo que difunde.
Para realizar el ensayo, se colocaran en una serie de pocillos cantidades conocidas de un estandar del Ag. a dosar y
en los otros la o las muestras incgnitas.
Luego se incuba la placa a temperatura ambiente hasta que el dimetro de los halos no se modifique (48-72 hs).
Se mide el dimetro de los halos y con aquellos correspondientes a los estandares se construye una curva de
calibracin relacionando la superficie de los mismos (el r2 o d2) con la concentracin. Con la medida de los halos
de las muestras incgnitas y mediante esta curva, se calcula la concentracin de las mismas.
Este mtodo, en el cual el precipitado alcanza su punto de equilibrio y ya no se modifica, constituye la
llamada determinacin de alta precisin.
Se puede realizar una determinacin rpida de orientacin en la cual se incuba la placa entre 16 y 20 hs. y se
grfica dimetro vs. log de la concentracin de Ag.

Fig. 12 Curva de calibracin

Existen kits comerciales que traen la placa con el Ac. ya incluido en ella , un estandar de concentracin conocida y
una tabla de concentracin en funcin de los dimetros o radios; de manera que slo sembramos ese estandar y
nuestras muestras. Al cabo de la incubacin medimos el halo del estandar para verificar que corresponda a la
concentracin establecida y, si es as, slo medimos los halos de nuestras incognitas y con esto obtenemos la
concentracin en la tabla adjunta.

Para antgenos particulados:

Aglutinacin:
En la reaccin de aglutinacin, los principios son los mismos que en la precipitacn, la diferencia radica en que en
este caso el Ag. no es soluble sino particulado ( ej. bacterias, clulas, glbulos rojos etc.)
La formacin de las redes dar como consecuencia agregados en forma de grumos en el fondo del tubo. El
Ag. no se encuentra en solucin sino en suspensin y al ser una partcula grande, se formen o no los agregados,
sedimentar; la diferencia entre una reaccin negativa, donde lo que vemos en el sedimento es slo el Ag. y una
positiva, donde se forman los complejos, esta dada por la caracterstica visual del sedimento que, en el primer
caso ser un botn homogeneo de clulas y en el segundo sern grumos.

Cuando el anticuerpo est dirigido contra antgenos constitutivos de la partcula, se trata de una aglutinacin directa,
por ejemplo la determinacin de grupos sanguneos o la deteccin de Ag. bacterianos, mientras que la interaccin del
anticuerpo con un antgeno soluble cualquiera acoplado a una partcula inerte o a una clula, como por ej. un glbulo
rojo, se denomina aglutinacin pasiva. Esta es ms sensible que la directa debido a la posibilidad de regular la
densidad de los determinantes sobre la superficie de la partcula.

La aglutinacin puede ser:

Cualitativa: es la tpica reaccin de determinacin de grupo sanguneo, donde
se ponen en contacto la sangre a determinar con sueros de distintos grupos, y se considera la produccin o no de
aglutinacin.

Fig. 14
 Cuantitativa: no es muy usada, al igual que en la precipitacin cuantitativa,
consiste en medir protenas en el aglutinado; se puede utilizar por ej. para determinar los mg de anticuerpo contra
un Ag. particulado, presente en un suero inmune.
Para esto, se determina por micro Kjeldahl, el nitrgeno proteico correspondiente a un volumen determinado de
antgeno puesto en contacto con el suero inmune y por otro lado, el nitrgeno correspondiente al mismo volumen
de Ag. puesto en contacto con un suero normal de la misma espcie animal. La cantidad de protena
correspondiente al Ac. especfico sera la diferencia entre ambas mediciones multiplicada por el factor de
conversin 6,25.
Como en el caso de la precipitacin, previo a la medicin de N, hay que lavar el aglutinado para eliminar toda
protena no fijada especficamente y adems, como se trata de clulas se coloca EDTA para inhibir la fijacin de
complemento.

Semicuantitaviva: esta tcnica se realiza normalmente en microtubos o placas de

fondo en U y consiste, al igual que en el caso de la precipitacin, en colocar concentraciones constantes de uno de
los reactivos en contacto con concentraciones variables del reactivo a determinar. Asi, obtenemos el ttulo, que
ser, igual que en todo ensayo semicuantitativo, la inversa de la mayor dilucin que da un resultado positivo.
Debemos recordar que se trata de una medicin relativa y no absoluta, por lo cual puede variar de laboratorio en
laboratorio y siempre debe ir acompaada de un control positivo y otro negativo, realizado en el mismo laboratorio
y por el mismo mtodo.
Es una tcnica muy til, rpida y econmica para determinar Ag. bacterianos y de hecho, se la us para clasificar
serolgicamente enterobacterias como por ej. las del gnero Salmonella.

Fig. 15
En todos los pocillos se coloca la suspensin bacteriana a concentracin constante y a continuacin en las filas
A,B,C, etc. Se colocan diluciones crecientes al medio de los antisueros anti bacteria que se quieren dosar.
Debemos colocar como control negativo un suero normal ( no inmune) de la misma especie en la que se hizo el
antisuero para comprobar que la reaccin que se produce no es una aglutinacin inespecfica. (Fila E).
Como vemos en la figura 15, el antisuero de la fila A da reaccin de aglutinacin hasta el pocillo N7, si
comenzamos en el 1 con concentracin tal cual, el 7 seria 1/64, es decir que el ttulo sera 64.
El antisuero B da un ttulo de 4 y el C, de 8.
El antisuero D no tiene anticuerpos contra dicha bacteria.

La reaccin de las enterobacterias frente a antisueros especficos depende de 3 tipos de Ag.:

H: Ag. flagelar: es una protena fibrosa del tipo de la miosina.
O : Ag. somtico: est formado por un polisacrido especfico, una protena y un fosfolpido. Se presenta como
una masa de barbas de longitud variable cada una de las cuales se une al lpido A a travs de una cadena nuclear.
Vi: Tambin conocido como de virulencia, se trata de una capa externa de polisacridos, sta no es tan densa
como una cpsula y no llega a cubrir completamente al Ag. O. La presencia del este Ag. permite la absorcin y
neutralizacin con los sueros anti-O, pero la aglutinacin slo ser posible con sueros ant-H o anti-Vi.

Esquema de la membrana celular de las bacterias gram negativas

El LPS es la porcin de la menbrana celular de las bacterias gram negativas que se conoce como endotoxina.
Puede extraerse de las clulas intactas y ser separado por hidrlisis en un lpido A y un
polisacrido ( constituyente del Ag.O ) que es el responsable de la especificidad antignica. En las enterobacterias,
el LPS proporciona centenares de Ags. O diferentes de importancia diagnstica y cuya variacin constituye la base
principal para la clasificacin de las Salmonellas.

El polisacrido contiene colectivamente una gran variedad de azcares, cinco de ellos son comunes a todos los
tipos salvajes de Salmonella. Estos azcares comunes forman un centro polisacrido nuclear constante al que se
aaden los residuos O especficos.

La especificidad esta dada por los distintos azcares solos o combinados que forman as el determinante
antignico, cada uno de los cules se indica con un nmero arbico, por ej. una manosa +una galactosa forman el
determinate 15.

Cada Ag. O de Salmonellas poseen 2 o 3 determinantes especficos, cada uno de los cuales es compartido por otros
Ags. O, uno de ellos, llamado determinante principal, es el de reaccin mas fuerte y en base a ste se divide a las
Salmonellas en grupos:
Ej. grupo C (Ag. O=6,7) determinante principal=6

Grupo E (Ag. O= 3,10) det. principal=3

Mediante los determinantes de menor importancia (de reaccin mas dbil) de pueden establecer divisiones dentro
de cada grupo.
Clasificacin de las Salmonellas segn Kauffmann-White:

Si tenemos por ej. dos cepas de Salmonella, a y b, y el antisuero preparado ante cada una de ellas (anti-a y anti-b)
y enfrentamos la suspensin de cada una de ellas con esos antisueros y con los mismos antisueros despus de ser
absorbido con la suspencin heterloga, obteniendo los siguientes resultados :

Antisuero Organismos

a b

Anti-a no absorbido 4+ 2+

Anti-b no absorbido 2+ 4+

Anti-a absorbido con b 2+ 0

Anti-b absorbido con a 0 2+

Conclumos que a y b son diferentes pero comparten determinantes antignicos.

Podramos decir, por ej., que a tiene los determinantes 1 y 2, y b, los determinantes 2 y 3.

Al absorber un antisuero con una suspensin de bacterias lo que hacemos es capturar los

Ac. que se unan a dicha suspensin y separarlos del resto del antisuero.

Si cada cepa fuera capaz de eliminar todos los Ac. aglutinantes para la otra, concluriamos que son
antignigamente idnticas, y en ese caso los ttuos de cada cepa con cada antisuero seran iguales.

Bibliografa:

- Inmunologa e inmunoqumica. Ricardo Margni.

- Tratado de Microbiologa. David Dulbecco.