INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLGICAS

LABORATORIO DE GENTICA MICROBIANA

PRCTICA 6:
CARACTERIZACIN FENOTPICA Y FSICA DE DNA
RECOMBINANTE

Alumnos:
Acua Vzquez Elia Gabriela
Amaro Beatriz Uriel
Grupo: 5QV2
Equipo 1
Seccin: 1

Profesores:
Esteva Garca Martha Elena
Espaol Espaol Francisco Javier
Mora Ramrez Sergio
Prez Enrquez Vernica
 Fecha de entrega: 06/12/2016

OBJETIVOS
Obtener DNA de doble cadena de los plsmidos recombinante y no
recombinante derivados del PCR2.1 TOPO.
Obtener clulas competentes de E. coli y transformarlas.
Diferenciar un vector recominante de uno no recombinante por pruebas
feotpicas y de restriccin.

RESULTADOS

Posterior al aislamiento de DNA plsmidico, recombinante y no recombinante a

partir de la cepa Escherichia coli DH10 por el mtodo de la lisis alcalina, ste fue
utilizado para la transformacin de las clulas competentes obtenidas de acuerdo
al protocolo establecido adicionando X-gal para evidenciar la naturaleza de las
clulas transformadas, se obtuvieron los siguientes resultados:

Tabla 1. Efecto de la transformacin de clulas de E. coli DH10 con

plsmidos PCR 2.1 TOPO (no recombinante) y PCR 2.1-TOPO-ape
(recombinante).
 Estas fueron las colonias observadas:

Figura 1. Caja 1. Figura 2. Caja 2.

Medio Luria con Medio Luria con
clulas competentes ampicilina con
clulas competentes

Figura 4. Caja 4. Medio

Figura 3. Caja 3. Medio
Luria con ampicilina con
Luria con ampicilina con
clulas competentes y
clulas competentes y
DNA no recombinante
DNA no recombinante

Figura 5. Caja 5. Medio Luria con Figura 6. Caja 6. Medio Luria con
ampicilina con clulas competentes y ampicilina con clulas competentes y
DNA recombinante (3L) DNA recombinante (5L)
 As mismo tras la restriccin del DNA de los plsmidos utilizados, con las
enzimas Bam HI y Eco RI, se realiz un electroferograma; para ello
utilizamos 2 marcadores distintos y M1Kbp, que podemos observar en la
imagen siguiente
pCR2.1-TOPO pCR2.1-TOPO-
ape
M1kp Bam HI Eco S S Eco Bam HI M
b RI D D RI

23.1
1 9.42
3
08 6.56
6
5 4.36
4
3
2 2.32
1.
51
0.
5

Se tomaron
Figura 7.en cuenta las distancias
Electroferograma recorridas
obtenido. donde
Las flechas se encontraban
indican cada uno al que
el tamao molecular
de los fragmentos
refieren condeellas
cada una fin bandas
de interpolar posteriormente
proporcionadas endos
por los las marcadores,
grficas de cada
las cuales
marcador dicho valor
se utilizaron comoycomparacin
as conocer el valor
para dardel
unatamao molecular
aproximacin delde cada de
tamao uno.
cada
fragmento obtenido tras la restriccin con enzimas.
Tabla 2. Resultados y clculos obtenidos en la electroforesis con respecto al
marcado 1kpb.
BANDA Distancia log pb
(cm) Tamao
molecular
1 3.8 4 10000
2 4.5 3.9030899 8000
87
3 4.7 3.7781512 6000
5
4 5 3.6989700 5000
04
5 5.4 3.6020599 4000
91
6 5.6 3.4771212 3000
55
7 5.8 3.3979400 2500
09
8 6.2 3.3010299 2000
96
9 6.8 3.1760912 1500
59
10 7.5 3 1000
11 8.5 2.8750612 750
63
12 9.2 2.6989700 500
04

PCR2.1 TOPO BAMHI

1 5.3 3.6 4016.0
PCR2.1 TOPO ECORI
1 5.3 3.6 4016.0
PCR2.1 TOPO SD
1 3.2 4.1 13367.
8
2 4.9 3.7 5049.8
3 6.1 3.4 2540.0

PCR2.1 TOPOAPESD
1 3.1 4.2 14155.
7
2 4.3 3.9 7120.2
3 5.5 3.6 3581.4
 PCR2.1
TOPOAPEECOR1
1 5.4 3.7 4973.7
2 7.4 3.2 1552.7
PCR2.1TOPOAPEBA
MH1
1 5.2 3.7 5587.8

4.5
4
3.5
3
2.5
Log Tamao Molecular pb 2
1.5
1
0.5
0
0 2.2 4.4 6.6 8.8 11

Distancia (cm)

M1Kpb PCR 2.1 TOPO BAM H1 PCR2.1TOPO ECOR1

PCR2.1 TOPO SD1 PCR2.1 TOPO SD2 PCR2.1TOPO SD3
PCRTOPOAPE SD PCR TOPO APE SD 2 PCRTOPO APE SD 3
PCRTOPOAPEECOR11 PCRTOPOAPEECOR1 2 PCRTOPOAPEBAMH1

Figura 8. Grfico que muestra la relacin entre el logaritmo del tamao

molecular de los fragmentos del DNA de M1kpb contra la distancia de
migracin de los mismos.
Tabla 3. Resultados y clculos obtenidos en la electroforesis con respecto al
marcador .

BANDA Distancia LOG pb

(cm) TAMAO
MOLECULAR
1 3.3 4.36754227 23310
2 4 3.97386645 9416
3 4.6 3.81670518 6557
4 5.4 3.63958609 4361
5 7 3.36772855 2332

PCR2.1TOPO BAMHI
1 5.3 3.7 5271.8
PCR2.1TOPO ECORI
1 5.3 3.7 5271.8
PCR2.1 TOPO SD
1 3.2 4.3 17899.5
2 4.9 3.8 6654.0
3 6.1 3.5 3309.2

PCR2.1TOPOAPESD
1 3.1 4.3 18972.3
2 4.3 4.0 9435.4
3 5.5 3.7 4692.5
PCR2.1TOPOAPEECOR1
1 5.4 3.7 4973.7
2 7.4 3.2 1552.7
PCR2.1TOPOAPEBAMH1
1 5.2 3.7 5587.8
 5
4.5
4
3.5
3

Log Tamao Molecular pb 2.5

2
1.5
1
0.5
0
2.2 4.4 6.6 8.8

Distancia (cm)

MLambda pcrtopobamHI pcrtopoecor1

pcrtoposd1 pcrtoposd2 pcrtoposd3
pcrtopoapesd1 pcrtopoapesd2 pcrtopoapesd3
pcrtopoapeecor1 pcrtopoapeecoR1-2 pcrtopoapebamHI

Figura 9. Grfico que muestra la relacin entre el logaritmo del tamao

molecular de los fragmentos del DNA de M contra la distancia de
migracin de los mismos.
DISCUSIN

El procedimiento de lisis alcalina, descripto por Birnboim & Doly constituye la base
del mtodo utilizado en nuestra prctica para la extraccin de ADN plasmdico.
Para la extraccin de ADN plasmdico se lisaron las clulas por el agregado de un
detergente (SDS) el cual degrad la membrana y NaOH. As mismo las
condiciones alcalinas desnaturalizan por completo las molculas lineales de ADN,
pero no las molculas circulares covalentemente cerradas (las cuales sufren una
desnaturalizacin parcial). El ADN cromosmico se obtuvo as mayoritariamente
en forma fragmentada (mltiples moleculas lineales) y el plsmido que en relacin
es ms pequeo, se mantuvo cerrado. Cuando el extracto celular fue neutralizado
(con cido actico glacial) bajo condiciones de alta concentracin salina (acetato
de potasio), el ADN cromosomal precipit; obedeciendo a la reasociacin
inespecfica de las largas cadenas de ADN simple cadena, que ocurre en mltiples
sitios formando una masa insoluble. Tambin precipitan algunas protenas debido
a que la reaccin se realiza en presencia de SDS y alta fuerza inica, pero la
extraccin mayoritaria de las protenas se realiz posteriormente con una mezcla
de fenol:cloroformo:alcohol isoamlico. Finalmente, el ADN purificado se concentr
mediante precipitaciones alcohlicas. El cambio de polaridad del medio que
genera el agregado de alcohol, y la disminucin de la temperatura volvieron
insoluble al ADN, lo que nos permiti recuperarlo as en un precipitado tras
centrifugarlo 2.
Posteriormente el DNA plasmdico recombinante y no recombinante fue tratado
con las enzimas de restriccin Bam H1 y EcoR1, respectivamente. Como sabemos
tanto el DNA recombinante (pCR2.1-TOPO-ape) como el DNA no recombinante
(pCR2.1-TOPO) poseen un perfil de restriccin distinto, con sitios de corte
especficos para cada una de las enzimas utilizadas. (Figuras x y z)
Figura x. Perfil de restriccin de Figura z. Perfil de restriccin de
vector pCR2.1-TOPO no vector pCR2.1-TOPO-ape
recombinante recombinante

Conociendo dichos perfiles de restriccin, procedimos a realizar una electroforesis

despus del tratamiendo con las enzimas Bam HI y EcoRI, en un gel de agarosa,
que como sabemos es una tcnica muy utilizada para separar molculas o
fragmentos de molculas de cidos nucleicos. El gel se coloc en la cubeta de
electroforesis, con un regulador de carga a pH 8. De esta forma, las molculas de
DNA sometidas a la electroforesis se desplazaron al polo positivo ya que a pH
superiores a 5 poseen carga negativa. El gel de agarosa se comport como un
tamiz molecular y permiti separar molculas cargadas en funcin de su tamao y
forma. As, molculas de DNA de diferente tamao, emigraron de forma distinta en
el gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA es
inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular, por ello realizamos
las distintas
grficas con los
resultados
obtenidos en la
electroforesis,
para ello es
importante
resaltar la
utilizacin de
marcadores de
tamao conocido
como fueron
M1Kpb y plos
que nos permitieron calcular los pesos
moleculares de las muestras de DNA plasmdico recombinante y no recombinante
tratados con las enzimas de restriccin y sin digerir.

Para poder observar los resultados de nuestra electroforesus de forma adecuada

el gel tena aadido bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases
del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la
electroforesis, visualizamos el gel con una lmpara de luz UV, observamos las
bandas correspondientes a las muestras de DNA plasmdico aplicado y los
marcadores de peso molecular 3.
Para analizar los resultados obtenidos de la electroforesis es importante conocer
los fragmentos que cada una de nuestras enzimas de restriccin pueden generar,
para ello se agregan las tablas siguientes:

Tabla 4. Fragmentos (pb) Tabla 5. Fragmentos (pb)

generados por EcoRI generados por BamHI
Analizaremos los pesos moleculares obtenidos nicamente comparndolos con el
marcador de 1kpb, puesto que dicho marcador demostr un mejor corrimiento as
como el tamao molecular de sus fragmentos permite interpolar de manera ms
certera los fragmentos ocasionados por nuestras enzimas de restriccin y en
general el tamao molecular de nuestros plsmidos que como observamos en las
Figuras x y z no poseen un tamao tan grande como los fragmentos que posee el
marcador , as mismo analizaremos nicamente la muestras de nuestro equipo
que fueron corridas en la parte superior del electroferograma ya que presentan
mayor calidad de visualizacin y mejor claridad en cada banda. Ahora bien para
comparar los tamaos moleculares de los fragmentos de inters como ya
habamos mencionado realizamos una grfica con relacin entre el logaritmo del
tamao molecular del marcador contra la distancia recorrida, la cual fue medida
proporcionalmente por cada uno de los equipos que trabajamos la prctica, para
ello fue necesario realizar una curva tipo con respecto al logaritmo del tamao
molecular en pares de bases de los fragmentos correspondientes al marcador y
las distancias recorridas de cada uno de los fragmentos observados (Tabla 2), en
la cual interpolamos las distancias obtenidas para cada uno de nuestros
fragmentos. (Figura 8)
Procediendo al anlisis de los resultados, como observamos en la Figura 7, en el
primer carril se corri nuestro marcador de inters (M1kpb), seguido del DNA
plasmdico no recombinante (pCR2.1-TOPO), el segundo carril representa dicho
DNA tratado con la enzima de restriccin BamHI, la cual genera en este vector un
fragmento de 3,908 pb, evidentemente observamos una sola banda
correspondiente a este fragmento; realizamos la medicin de su distancia
recorrida y obtuvimos que sta fue de 5.3 cm (Tabla 2), procedimos a su
interpolacin en la grfica del marcador M1kpb (Figura 8) y observamos que
posea un logaritmo de tamao molecular de 3.6 que al convertirlo nos dio
finalmente un resultado de 4016 pb, muy cercano al resultado esperado de 3,908
pb, esto ya que como mencionamos anteriormente es un resultado aproximado,
sin embargo el comportamiento coincide con el tamao molecular.
En el tercer carril, encontramos a pCR2.1-TOPO tratado con la enzima EcoRI, la
cual genera dos fragmentos: uno correspondiente a 17 pb y el otro a 3,891 pb
(Tabla 4). Como podemos inferir el primero no resulta visible por su tamao tan
pequeo, para nosotros poderlo visualizar requeriramos realizar una extensin de
nuestro gel, sin embargo el segundo es comparable con la banda obtenida en el
electroferograma (Figura 7), con una distancia recorrida de 5.3 cm al igual que en
el caso anterior, obteniendo un resultado de 4016 pb, que tambin se aproxima al
esperado de 3,891 pb, por lo que referimos que dicha banda corresponde a este
fragmento.

El cuarto y quinto carril muestran a los vectores con DNA no recombinante y

recombinante respectivamente sin digerir, si bien en esto carrriles esperbamos
una sola banda correspondiente a 3,908 pb y 5,108 pb respectivamente
observamos una serie de bandas en cada uno, para dar explicacin a esto es
importante mencionar que durante la extraccin, la preparacin y la conservacin
del DNA plasmdico, es frecuente que tengan lugar algunos cortes en una sola
hebra de las molculas superenrolladas. El plsmido se desenrolla
inmediatamente, debido a la tensin acumulada en los superenrollamientos, dando
la forma circular relajada. El DNA purificado no se puede superenrollar de nuevo,
puesto que no hay topoisomerasas presentes. Por otra parte, si se produce el
corte en las dos hebras de algunas molculas de plsmido, se convertirn en
molculas lineales de longitud completa.
Las tres formas del plsmido que no se ha cortado con enzimas de restriccin,
todas de la misma longitud (n de pb) y misma masa molecular, no se comportan
del mismo modo durante la electroforesis. Debido a que las molculas
superenrolladas son ms compactas, su volumen es menor, se mueven con ms
facilidad a travs del gel, y las encontramos ms lejos del punto de origen, el pozo
1
.
Las molculas circulares relajadas y las molculas lineales de longitud completa
avanzan ms lentamente que las superenrolladas. Habitualmente, las molculas
lineales avanzan un poco ms rpido que las circulares relajadas pero,
dependiendo del plsmido concreto y de las condiciones experimentales (por
ejemplo, si se ha aadido o no bromuro de etidio al gel antes de la electroforesis),
la forma lineal puede avanzar igual o menos que la relajada.
Es por esto que en ambos carriles donde se coloc el DNA plasmdico sin digerir
se observan diferentes bandas (Figura 8), en el caso de pCR2.1-TOPO sin digerir
son tres, con tamaos moleculares de 13367.8, 5049.7 y 2539.9 pb (Tabla 2)
respectivamente siendo esta ltima la que ms se aproxima al tamao molecular
del plsmido de 3,908 pb. Por otro lado en el quinto carril pCR2.1-TOPO-ape sin
digerir, muestra 3 bandas correspondientes a 14155.6, 7120.1 y 3581.3 pb (Tabla
2) respectivamente, siendo la segunda antes mencionada la que se aproxima de
forma ms cercana al tamao del plsmido de 5,108 pb.

CONCLUSIONES

Se llev a cabo una correcta extraccin de DNA plasmdico recombinante y

no recombinante con respecto al mtodo propuesto por Birnboim & Doly de
lisis alcalina.
El tratamiento realizado con las enzimas de restriccin Bam HI y EcoR1,
funcion de forma adecuada, generando los fragmentos esperados en
ambos vectores, lo que se comprob con una electroforesis en gel de
agarosa, a partir de la que se realiz la grfica correspondiente a logaritmo
del tamao molecular con relacin en la distancia recorrida, utilizando como
referencia el marcador de 1Mkpb, lo que nos permiti conocer el tamao
molecular de los fragmentos obtenidos con las enzimas de restriccin as
como del DNA plsmidico sin digerir.
BIBLIOGRAFA
1. Formas de un plsmido en gel de agarosa
http://biomodel.uah.es/an/plasmido/2/5-3formgel.htm
Consultado 05/12/2016.

2. Aislamiento de DNA
https://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp4.pdf
Consultado 05/12/2016

3. Brcena Ruiz; Garca Alfonso; Padilla Pea, et. al.

Electroforesis de cidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y
caracterizacin electrofortica de DNA plasmdico
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES
%20AGAROSA.pdf
Consultado 5/12/2016