ZHW / CB / AnC1 4.

Trennverfahren

4.4 Grundtypen
Die nachfolgende Zusammenstellung erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit ! Weitere Techniken sind
für spezielle Trennprobleme entwickelt worden und dauernd kommen neue dazu. Für weiterführende Lite-
ratur sei auf den Schwedt und die darin aufgelistete Primärliteratur verwiesen.

4.4.1 Flüssigchromatographie (LC)

Gemeinsamkeiten aller LC-Verfahren:
- Mobile Phase ist eine Flüssigkeit, welche aktiv (durch Pumpen) oder passiv (durch die Schwerkraft
oder Kapillarkräfte) an der stationären Phase vorbei geführt wird.
- Der Analyt muss in der mobilen Phase gut löslich sein, die stationäre Phase dagegen unlöslich.
- Die Kapazitätsfaktoren k' werden v.a. bestimmt durch Unterschiede in den Polaritäten der Analyte, der
mobilen und der stationären Phase. Bei einigen spezialisierten Verfahren (Ionenaustausch-Chro-
matographie, Gelpermeationschromatographie) spielt zusätzlich das Rückhaltevermögen der stationä-
ren Phase eine Rolle.
- Für fast alle Trennsysteme stehen heute stationäre Phasen sowohl als Platten (planare Chroma-
tographie) für die qualitative und halbquantitative Analyse oder die Methodenentwicklung, wie auch
als Füllmittel für Säulen (präparative und analytische Anwendungen) zur Verfügung.

Präparative Säulenchromatographie (Normal Phase)

Analyte: Apolare und mittel polare Organika
Station. Phase: - Kieselgel verschiedener Korngrössen, Polarität kann durch Feuchtegrad gesteuert werden
- Aluminiumoxid
Mobile Phase: Apolare und mittel polare organische Lösemittel
Gerätetechnik: Säulen verschiedenster Durchmesser (mm bis 20 cm), das Laufmittel läuft mit der Schwerkraft
durch die senkrecht montierte Säule oder wird mit Druck durch das System gepumpt (Mit-
teldruckchromatographie). Am Ausgang werden die aufgetrennten Substanzen in Fraktionen
gesammelt, die für die weitere Verwendung aufgearbeitet werden.
Prakt. Einsatz: - Reinigung von Reaktionsgemischen in der Produktion im mg bis g-Massstab
- Abtrennung von Störsubstanzen bei der Probenaufarbeitung
- Isolierung von Wirkstoffen aus komplexen Gemischen
Bemerkungen: - Da diese Methode je nach Säulendimension grosse Mengen von Lösemitteln verbraucht und
evtl. lange dauert, wird die Trennung am besten zuerst auf einer TLC-Platte mit dem glei-
chen Trennsystem optimiert und ausgetestet.

Gelpermeationschromatographie (GPC)
Analyte: Makromolekulare Substanzen (z.B. Proteine oder Polymere)
Station. Phase: - Apolare Analyte: Poröse Glas- oder Silikagel-Partikel
- Hydrophile Analyte: Polymergele
Mobile Phase: - Apolare Analyte: Organische Lösemittel
- Hydrophile Analyte: Wasser
Gerätetechnik: Säulen verschiedenster Durchmesser (mm bis 20 cm) für analytische und präparative Anwen-
dungen. Das Laufmittel läuft mit der Schwerkraft durch die senkrecht montierte Säule oder
wird mit Druck durch das System gepumpt (Mitteldruckchromatographie). Am Ausgang werden
die aufgetrennten Substanzen in Fraktionen gesammelt, die für die weitere Verwendung auf-
gearbeitet werden, oder mit einem UV- oder Brechungsindex-Detektor analysiert.
Prakt. Einsatz: - Präparativer und analytische Trennung von Proteingemischen nach molarer Masse
- Aufklärung der Kettenlängenverteilung in Polymeren und Proteinen
- Molmassenabschätzung in Makromolekülen
Bemerkungen: - Hier bildet nicht eine Nernst-Verteilung die Grundlage, sondern die Analytteilchen werden je
nach Molekülgrösse besser oder schlechter in den Poren der stationären Phase zurückgehal-
ten. Je grösser ein Molekül, desto kürzer seine Retentionszeit, weil es in den für es zu klei-
nen Poren nicht zurückgehalten wird.

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Ionenchromatographie (IC)
Analyte: Ionenaustauschchromatographie (IC): Anorganische und kleine organische Ionen
Ionenpaarchromatographie (IPC): Organische Ionen
Ionenausschluss-Chromatographie (IEC): Nichtionische Organika in wässerigen Salzlösungen
Station. Phase: IC: Kationen- oder Anionentauscherharz
IPC: RP-HPLC-Phase
IEC: Ionentauscherharz
Mobile Phase: IC: Wässerig mit ionischen Zusätzen, z.B. HCO3- (Suppressortechnik, s.u.) oder Phthalat
IPC: Wässerig mit ionischen Zusätzen (Gegenion zum Analyten)
IEC: Wässerig mit Anorg. Säuren, z.B. Salzsäure
Gerätetechnik: - Analytische Säulen: ID: 2 bis 4mm; L = 10 - 25cm), das Laufmittel wird unter hohem Druck
bei konstanter Fliessgeschwindigkeit durch das System gepumpt.
- Präparative Säulen: vgl. Präparative Säulenchromatographie
--Am Ausgang werden die aufgetrennten Substanzen mit verschiedenen Detektoren identifi-
ziert und quantifiziert, z.B. UV/VIS-Detektor, Fluoreszenzdetektor, Elektrochemischer Detek-
tor (für oxidierbare/reduzierbare Analyte), Elektrische Leitfähigkeit. Bei Verwendung eines
Leitfähigkeitsdetektors muss das im Laufmittel enthaltene Leitsalz vor dem Detektor zuerst
entfernt werden ("Chemische Supression"), oder es ist die dadurch bedingte Grundleitfähig-
keit der mobilen Phase elektronisch zu kompensieren ("Elektronische Supression").
Prakt. Einsatz: Abtrennung und Analyse ionischer (IC, IPC) und stark polarer nichtionischer Substanzen (IEC)
in wässerigen Proben.
Bemerkungen: - Aufwendige Gerätetechnik notwendig für Regelung der Fliessgeschwindigkeit und Supression
der Grundleitfähigkeit (bei Leitfähigkeitsdetektor).
- Die Säulen sind sehr anfällig auf Verstopfung durch mikroskopische Partikel; mobile Phase
und Proben müssen deshalb immer vor dem Einsatz mikrofiltriert werden. Im Laufmittel ge-
löste makromolekulare Matrixbestandteile können die stationäre Phase und Membransupres-
soren irreversibel schädigen.

Hochdruck-Flüssigchromatographie (Reverse Phase; RP-HPLC)

Analyte: Polare nichtionische Organika, organische Ionen mit Ionenpaar-Chromatographie
Station. Phase: Kieselgel verschiedener Korngrössen, auf dessen Oberfläche Alkylgruppen immobilisiert werden
(z.B. n-Octadecyl C18H37 ). Polarität kann durch Veränderung der Alkylgruppe (Länge, Verzwei-
gungen) gesteuert werden.
Mobile Phase: Polare organische Lösemittel im Gemisch mit Wasser. Während des Laufes kann die Polarität
durch Veränderung des Mischungsverhältnisses mehrerer Lösemittel programmiert verändert
werden ("Gradienten-HPLC"). Bleibt das Mischungsverhältnis während des Laufes unverändert,
spricht man von "isokratischer HPLC". k' von Säuren/Basen kann durch Zugabe von pH-Puffern
optimiert werden.
Gerätetechnik: - Säulen (ID: 0.5 bis 4mm; L = 10 - 25cm), das Laufmittel wird unter hohem Druck bei kon-
stanter Fliessgeschwindigkeit durch das System gepumpt.
--Am Ausgang werden die aufgetrennten Substanzen mit verschiedenen Detektoren identifi-
ziert und quantifiziert, z.B. UV/VIS-Detektor, Fluoreszenzdetektor, Brechungsindex, Elektro-
chemischer Detektor (für oxidierbare/reduzierbare Analyte), Massenspektrometer.
Prakt. Einsatz: Qualitative (HPLC-MS) und quantitative Analyse einer breiten Palette polarer organischer
Verbindungen
Bemerkungen: - Aufwendige Gerätetechnik notwendig für Regelung der Fliessgeschwindigkeit und Program-
mierung von Gradienten. Kopplung an Massenspektrometer dito.
- Die Säulen sind sehr anfällig auf Verstopfung durch mikroskopische Partikel; mobile Phase
und Proben müssen deshalb immer vor dem Einsatz mikrofiltriert werden. Im Laufmittel ge-
löste makromolekulare Matrixbestandteile können die stationäre Phase irreversibel schädi-
gen.

D:\Daten gae\ZHW\AnC1\Skript AnC1\SkriptTrennverfahrenII.doc Seite 15 von 29 09.01.2006/Gae

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Hochdruck-Flüssigchromatographie (Normal Phase; NP-HPLC)

Analyte: Apolare und mittel polare Organika
Station. Phase: - Kieselgel verschiedener Korngrössen, Polarität kann durch Feuchtegrad gesteuert werden
- Aluminiumoxid
Mobile Phase: Apolare und mittel polare organische Lösemittel. Während des Laufes kann die Polarität durch
Veränderung des Mischungsverhältnisses mehrerer Lösemittel programmiert verändert wer-
den ("Gradienten-HPLC"). Bleibt das Mischungsverhältnis während des Laufes unverändert,
spricht man von "isokratischer HPLC"
Gerätetechnik: - Säulen (ID: 0.5 bis 4mm; L = 10 - 25cm), das Laufmittel wird unter hohem Druck bei kon-
stanter Fliessgeschwindigkeit durch das System gepumpt.
--Am Ausgang werden die aufgetrennten Substanzen mit verschiedenen Detektoren identifi-
ziert und quantifiziert, z.B. UV/VIS-Detektor, Fluoreszenzdetektor, Brechungsindex, Elektro-
chemischer Detektor (für oxidierbare/reduzierbare Analyte), Massenspektrometer.
Prakt. Einsatz: Qualitative (HPLC-MS) und quantitative Analyse apolarer und schwach polarer organischer
Verbindungen
Bemerkungen: - Aufwendige Gerätetechnik notwendig für Regelung der Fliessgeschwindigkeit und Program-
mierung von Gradienten. Kopplung an Massenspektrometer dito.
- Die Säulen sind sehr anfällig auf Verstopfung durch mikroskopische Partikel; mobile Phase
und Proben müssen deshalb immer vor dem Einsatz mikrofiltriert werden.

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4.4.2 Gaschromatographie (GC)

Gemeinsamkeiten aller GC-Verfahren:
- Mobile Phase ("Trägergas") ist eine chemisch inaktives Gas (H2, He, N2), welches druck- oder flussge-
regelt durch die stationäre Phase geführt wird.
- Die Trennsäule wird in einem sehr präzise regelbaren Ofen thermostatisiert, der auch geregelt aufge-
heizt werden kann ("Temperaturprogrammierung", s.u.)
- Der Analyt muss im Rahmen der angewendeten Temperaturen bei Normaldruck flüchtig (Siedepunkt
höchstens 150° über der maximalen Arbeitstemperatur) und bis zu dieser Temperatur thermisch be-
ständig sein.
- Die Kapazitätsfaktoren k' werden v.a. bestimmt durch den Siedepunkt der Analyten und die Intensität
der Wechselwirkungen zwischen stationärer Phase und Analyt ("Gleiches zu Gleichem"!). Die Art des
Trägergases hat nur indirekt über seine Viskosität Einfluss auf die Trennleistung: Je viskoser ein Trä-
gergas, desto kleiner die Fliessgeschwindigkeit bei gleichem Vordruck. Damit steigen die Retentions-
zeiten bei gleichzeitig schlechter werdender Trennleistung.
- Während des Laufes kann die Flüchtigkeit der Substanzen durch Veränderung der Säulentemperatur
programmiert verändert werden ("Temperaturgradient", "Temperaturprogramm"). Wird die Temperatur
während des Laufes unverändert gehalten, spricht man von "isothermer GC".

Gaschromatographie mit gepackten Säulen

Analyte: Flüchtige, unzersetzt verdampfbare Substanzen (Sdp. höchstens 150°C über Maximaltempera-
tur der stationären Phase)
Station. Phase: Anorganische und organische feinkörnige Festkörper, die selbst als Adsorbens fungieren (s-g-
Adsorptions-GC) oder als Träger für darauf immobilisierte flüssige Phasen (l-g-
Chromatographie)
Mobile Phase: Inerte Gase: Wasserstoff (explosiv, aber billig und hohe Trennleistung), Helium (Standard),
Stickstoff (billig, aber schlechteste Trennleistung von allen drei).
Gerätetechnik: - Stahl- oder Glassäulen mit 1-2mm ID, bis 3m lang. Können fertig gekauft oder auch selber
mit stationärer Phase gefüllt werden.
- Injektion von flüssigen oder gasförmigen Proben (VP bis 10µl (Flüssig), bzw. 1ml (Gaspro-
ben) direkt auf den Säulenkopf.
- Detektoren: Flammenionisation (FID): Alle Kohlenstoff enthaltenden Substanzen
⋅ Electron Capture Detector (ECD): Für halogenierte Substanzen (hochempfindlich)
⋅ Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD): anorganische Gase, Wasser
⋅ Thermionischer Detektor (PND): Phosphor- und stickstoffhaltige Substanzen
⋅ Kopplung an FT-Infrarotspektrometer für die qualitative Analyse
Prakt. Einsatz: - Trennung einfacher Gemische
- Qualitätskontrolle in der Produktion
- Gasanalyse
- Einfache Routineanalysen
Bemerkungen: - Billige (verglichen mit Kapillar-GC) und robuste Technik für die Routineanalytik
- Tiefe Nachweisgrenzen dank grosser Injektionsmengen
- Kurze Analysenzeiten
- Nicht geeignet für die Auftrennung komplexer Gemische und sehr ähnlicher Substanzen

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Kapillar-Gaschromatographie
Analyte: Flüchtige, unzersetzt verdampfbare Substanzen (Sdp. höchstens 150°C über Maximaltempera-
tur der stationären Phase), Trennung von Enantiomeren
Station. Phase: Verschiedenste flüssige oder polymere Organika, für die Enantiomerentrennung auch optisch
aktive Phasen.
Mobile Phase: Inertes Gas, z.B. He oder H2 (Explosionsgefahr!)
Gerätetechnik: - Kapillaren aus Glas oder Fused Silica (Länge 1-100m, ID 0.2-0.5mm), an deren Innenseite
die stationäre Phase als Kapillarfilm von 0.1-10µm Dicke immobilisiert wird (sog. "Open Tu-
bular Column".
- Injektion von flüssigen oder gasförmigen Proben (VP bis 0.1µl (Flüssig), bzw. 10µl (Gaspro-
ben) mit direkter "On Column-Injektion" oder bis zu 100x grössere Volumina im sog.
"Split/Splitless-Injektor".
- Detektoren: Flammenionisation (FID): Alle Kohlenstoff enthaltenden Substanzen
∙ Electron Capture Detector (ECD): Für halogenierte Substanzen (hochempfindlich)
∙ Thermionischer Detektor (PND): Phosphor- und stickstoffhaltige Substanzen
∙ Kopplung an FT-Infrarot- oder Massenspektrometer für die qualitative und quantitative
Analyse
Prakt. Einsatz: - Qualitative und quantitative Analyse komplexer flüchtiger Gemische aller Art
Bemerkungen: - Die kleinen Messprobenvolumina sind manuell nur schlecht reproduzierbar, für die quantita-
tive Analyse muss deshalb entweder mit Autosamplern oder mit interner Kalibration (vgl.
Kap. 4.5.2) gearbeitet werden.
- Sehr hohe Trennleistungen möglich (bis 250'000 Trennstufen!), solche Trennsysteme sind
aber teuer und meistens empfindlich auf Fehlmanipulationen
- Viel kleinerer Trägergasverbrauch als bei gepackten Säulen

4.4.3 Elektrophorese (EP)

Gemeinsamkeiten aller Elektrophorese-Verfahren:

- Mobile Phase ist eine wässerige, meist pH-gepufferte Lösung, welche nicht bewegt wird. Die Vorwärts-
bewegung der ionischen Analytteilchen erfolgt durch Anlegen eines elektrischen Feldes zwischen den
beiden Enden der Trennstrecke; Anionen wandern Richtung Pluspol ("Anode"), Kationen Richtung Mi-
nuspol ("Kathode").
- Als stationäre Phase können sowohl inaktive Substanzen (sog. trägerfreie EP) (bei denen k' einer Sub-
stanz nur von der Beweglichkeit in der mobilen Phase und der Wechselwirkung mit dem elektrischen
Feld abhängt), wie auch viele der schon in Abschnitt 4.4.1 beschriebenen stationären Phasen verwen-
det werden.
- Ungeladene Moleküle können untereinander nicht aufgetrennt werden, aber die Abtrennung einer
nichtionischen Matrix von geladenen Analyten ist natürlich möglich.

Isoelektrische Fokussierung
Analyte: Amphotere Teilchen, z.B. Aminosäuren mit unterschiedlichen pKs-Werten
Station. Phase: - Trägerfreie Technik, planare Chromatographie in einer wässerigen Lösung, die einen pH-
Gradienten aufweist. Alle Teilchen wandern in diesem Gradienten gerade so weit, bis sie bei
einem pH angelangt sind, der ihrem isolelektrischen Punkt entspricht, d.h. sie sind nicht
mehr geladen und werden deshalb durch das elektrische Feld nicht mehr weiter bewegt.
Mobile Phase: Elektrisches Feld
Gerätetechnik: vgl. Schwedt
Prakt. Einsatz: Präparative und analytische Trennung von Aminosäuren untereinander und von ungeladenen
Matrices.
Bemerkungen: - Nicht sehr hohe Trennleistungen erreichbar.

D:\Daten gae\ZHW\AnC1\Skript AnC1\SkriptTrennverfahrenII.doc Seite 18 von 29 09.01.2006/Gae

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Gelelektrophorese
Analyte: Aminosäuren, Proteine
Station. Phase: - Polyamidgel mit definiertem Vernetzungsgrad, die Analyte werden aufgrund verschiedener
Molekülgrössen verschieden stark zurückgehalten (vgl. Gelpermeationschromatographie). Dies
ermöglicht - wenn alle Teilchen das gleiche Ladungszentrum aufweisen - eine Auftrennung
nach Molekülgrösse. Der Trenneffekt kann durch einen Vernetzungsgradienten in Laufrichtung
noch erhöht werden.
Mobile Phase: Elektrisches Feld
Gerätetechnik: Meistens in planarer Technik, Detektion mit UV/VIS-Densitometer nach Anfärbung. Automati-
sierte Systeme: SDS-PAGE zur Proteinanalyse
Prakt. Einsatz: - Molmassenverteilung in Proteinen
- Qualitative und quantitative Proteinanalytik
- Präparative Auftrennung von Proteingemischen
Bemerkungen: - Durch Miniaturisierung kleine Probenmengen (VP = 1µl) und kurze Analysenzeiten möglich
- Um den Einfluss unterschiedlicher Ladungszustände und pKs-Werte aufzuheben, ist meist
eine chemische Derivatisierung, z.B. mit Natriumdodecylsulfat (SDS) notwendig.

Kapillar-Elektrophorese
Analyte: Anorganische und organische Ionen, Aminosäuren, Proteine, DNS-Fragmente
Station. Phase: Quarzkapillare mit oder ohne Polyacrylamid-Beschichtung, gefüllt mit Pufferlösung
Mobile Phase: Elektrisches Feld
Gerätetechnik: Kapillaren aus Fused Silica (Länge 0.5-2m, ID 0.2-0.5mm), Detektion mit UV/VIS-Detektor
Prakt. Einsatz: - Protein- und DNA-Sequenzanalyse
- Ionenanalytik in komplexen Gemischen
Bemerkungen: - Methodenentwicklung kann sehr aufwendig sein.
- Nur sehr kleine Probenvolumina (nur ca. 1nl geht effektiv durch den Durchflussdetektor!),
deshalb nicht sehr tiefe instrumentelle Nachweisgrenzen.
- Verglichen mit andern EP-Techniken gleicher Trennleistung sehr schnelle Analytik.

4.4.4 Gerätetechnische Grundlagen

Injektion
Der Transfer der Messprobe in die erste Trennstufe eines chromatografischen Systems muss insbesondere
die folgenden Bedingungen erfüllen:
• Möglichst gute Fokussierung: Die Probe sollte nicht schon zu Beginn der Trennstrecke über meh-
rere Trennstufen verteilt sein, da dies alle Peaks unnötig verbreitert und damit die Auflösung ver-
schlechtert. Wird für die Injektion der Fluss der mobilen Phase nicht angehalten (üblich in prak-
tisch allen analytischen Anwendungen), muss die Injektion zudem möglichst schnell erfolgen. Es
gibt diverse "Tricks" zur Vorfokussierung von Proben, z.B. in der Elektrophorese (Konzentrations-
zonen in der stationären Phase) oder der Gaschromatographie (Kondensation der Probe auf dem
gekühlten Kolonnenkopf).
• Gute Reproduzierbarkeit: Bei der quantitativen Analytik geht auch das effektive Injektionsvolu-
men in die Berechnungen ein, ausser es ist während Kalibration und Probenmessung dasselbe.
Dann muss aber gesichert sein, dass dieses Volumen gut reproduzierbar ist. Eine Möglichkeit, den
Einfluss des Injektionsvolumens bei der quantitativen Analyse auszuschalten, ist die Kalibration
mit internem Standard (vgl. Abschnitt 4.5.2). Kann nicht mit internem Standard gearbeitet wer-
den, gilt
- Manuelle Injektion ist schlechter reproduzierbar als automatische (sog. "Autosampler")
- Je kleiner das Injektionsvolumen, desto grösser die Unsicherheit.
- Je polarer der Analyt, desto grösser ist die Gefahr von Adsorption an Glas- und Metall-
Oberflächen im Injektionsbereich. Damit steigt die Unsicherheit der Injektion.

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• Kein abrupter Wechsel der mobilen Phase: In der Flüssigchromatographie sollten das Lösemittel
der Messprobe und die mobile Phase ähnliche Polarität haben oder noch besser identisch sein,
damit nicht Probenbestandteile auskristallisieren. In der Gaschromatographie können nicht flüch-
tige Matrixbestandteile das Injektionssystem irreversibel verschmutzen. Hat der verwendete De-
tektor für die mobile Phase und das Proben-Lösemittel unterschiedliche Empfindlichkeiten, zeigt
sich bei der Totzeit ein riesiger Peak ("Lösemittelpeak"), der viele Informationen zudecken kann.

0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 12 14
tR [min.] tR [min.]

Technik: Ionenchromatographie Technik: Gaschromatographie

Detektion: Elektrische Leitfähigkeit Detektion: Flammenionisation
Mobile Phase: Wässeriger Puffer Mobile Phase: Helium
Lösemittel Probe: Destilliertes Wasser Lösemittel Probe: Organisches Lösemittel

In den obigen Chromatogrammen ist klar zu sehen, dass im schattierten Bereich der Lösemittel-
peak eine quantitative Analyse sehr unsicher macht, weil die Basislinie nicht linear verläuft.
Peaks, die vor tR = 2min. eluieren, werden überhaupt nicht erkannt.
Je nach Trennsystem werden sehr unterschiedliche, für die verwendete Methode optimierte Injektionsme-
thoden verwendet, deren wichtigste in den Lehrbüchern (z.B. Schwedt) beschrieben sind.

Trennsystem
Der eigentliche Trennvorgang findet im sog. Trennsystem statt. Dieses besteht aus der stationären Phase
("chromatographisches Bett") und der mobilen Phase ("Laufmittel", "Eluent", "Trägergas"). Je nach ver-
wendeteter Kombination und Anwendungszweck wurden auch hierfür wie bei der Injektion verschiedens-
te, hochspezialisierte Techniken und Geräte entwickelt. Die Länge der Trennstrecke kann z.B. von weni-
gen cm (Gel-Elektrophorese) bis zu über 100m lang sein (Kapillar-GC), die Probenvolumina variieren von
nl (Kapillar-EP) bis Liter (präparative, industrielle Aufarbeitungen), und die benötigten Mengen mobiler
Phase für eine Trennung gehen von wenigen ml bis zu hunderten von l. Deshalb sei für Details auch hier
auf die Lehrbücher und Primärliteratur verwiesen. Im Folgenden sind aber die wichtigsten Beurteilungs-
kriterien, die alle Techniken für eine befriedigende Trennung erfüllen müssen, aufgeführt.
• Gute Reproduzierbarkeit von k' und tR, bzw. RF: Wenn sich diese Parameter während einer Tren-
nung oder zwischen Kalibration und Probenmessung verändern, verschieben sich Peaks, und eine
qualitative Analyse (Indentifizierung der Peaks) kann damit verunmöglicht werden. Dies stellt u.
Umständen hohe Ansprüche an die Regelung der Fliessgeschwindigkeit der mobilen Phase. Falls
der Trennvorgang stark temperaturabhängig ist (GC!), muss das ganze System sehr präzis ther-
mostatisiert werden.
• Chemische und physikalische Robustheit: Reagiert die stationäre Phase mit irgendwelchen Pro-
benbestandteilen, verändert sie ihre Eigenschaften, damit wird meistens die Trennstufenzahl und
die Trennleistung verkleinert, die k'-Werte verändern sich und das System wird zerstört. Teure sta-
tionäre Phasen sollten viele Male ohne Qualitätsverlust benutzt werden können (GC,HPLC), "Ein-
mal-Systeme" müssen kostengünstig und in gut reproduzierbarer Qualität zur Verfügung stehen
(alle planaren Techniken).

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ZHW / CB / AnC1 4. Trennverfahren

1400
1400
Diese (und je nach Technik noch weitere) Trennstufenzahl
Trennstufenzahl
Punkte sollten in einem Analytiklabor im 1300
1300
Rahmen der Qualitätsicherung laufend
überwacht werden, indem z.B. mit einer 1200
1200
Standardlösung die wichtigsten Parameter
periodisch experimentell bestimmt und 1100
1100
aufgezeichnet werden (sog. "Qualitätskar-
ten"). Im nebenstehenden Beispiel einer 1000
1000
solchen Qualitätskarte sieht man sofort, Einzelmessung
Einzelmessung
dass die Qualität des Trennsystems (ge- 900
900 gleitender
gleitenderMittelwert
Mittelwert
messen an der experimentell bestimmten gleitende
gleitendeStd.-Abw.
Std.-Abw.
800
800
Trennstufenzahl) bis ca. 1.Februar konstant
15.09.
15.09. 15.10.
15.10. 14.11.
14.11. 14.12.
14.12. 13.01.
13.01. 12.02.
12.02. 14.03.
14.03.
bleibt, dann signifikant absinkt und ab
1.März unter dem Alarmwert von 1000 Datum
Datum
Trennstufen liegt.

Detektion
Wie für die Injektion und die Trennsysteme gibt es heute auch bei den Detektionssystemen eine Vielzahl
von Entwicklungen, die möglichst dem spezifischen Trennproblem angepasst werden. Alle Chroma-
tographiedetektoren gehören jedoch 2 Grundtypen an:
A. Kontinuierlich messende Systeme für die Säulenchroma-
tographie: Arbeiten mit einer Durchflussmesszelle, welche Zeit
am Ende des Trennsystems angebracht ist und das Detektor-
signal während des Trennvorganges als Funktion der Zeit
kontinuierlich aufzeichnet (Darstellungstyp A in Abschnitt
4.2.2). Signalverarbeitung

Sensor
Trennstrecke

B. Scanner zur Auswertung planarer Systeme: Nach Ende des

Trennvorganges, wird die Trennstrecke als Ganzes abgebildet
(qualitative Analytik, z.B. durch eine Fotografie), oder sie Weg
wird als Funktion der Wegstrecke abgetastet ("Scan-
ning").Diese Methode wird verwendet, um Chromatogramme
gemäss Typ B (Abschn. 4.2.2) darzustellen. Signalverarbeitung

Sensor

Trennstrecke

Unabhängig vom Typ müssen Detektoren bezüglich der folgenden Punkte auf ihre Eignung für eine be-
stimmte Aufgabestellung überprüft werden:
• Instrumentelle Nachweisgrenze: Sind die Detektoren imstande, die zu erwartenden Substanzmen-
gen oder Konzentrationen nachzuweisen? Ist dies nicht der Fall, müssen die Analytmengen pro
Trennung erhöht werden, z.B. durch Aufkonzentrierung der Messproben oder durch Redimensio-
nierung des Trennsystems, damit grössere Probenvolumina aufgetrennt werden können.
• Selektivität: Ist es nicht möglich, zwei Substanzen, die einzeln zu bestimmen sind, bereits im
Trennsystem zu separieren, muss dafür der Detektor die beiden perfekt unterscheiden können.
Dies ist nur mit wenigen Detektorentypen möglich (Massenspektrometer, FTIR-Spektrometer).Falls
die Selektivität nicht ausreicht, kann bestenfalls die Summe der beiden Analyte bestimmt werden
(wenn die Empfindlichkeit des Detektors für beide gleich ist).

D:\Daten gae\ZHW\AnC1\Skript AnC1\SkriptTrennverfahrenII.doc Seite 21 von 29 09.01.2006/Gae

ZHW / CB / AnC1 4. Trennverfahren

• Diskrimination des Untergrundes: Durchfliesst die mobile Phase den Detektor (Säulenchroma-
tographie) oder wird bei planarer Technik der Analyt vor dem Hintergrund der stationären Phase
gemessen, muss dieses Untergrundsignal sehr klein sein, oder es darf sich während der Analyse
nicht ändern, damit es kompensiert werden kann.
• Stabilität: Alle chromatografischen Analysemethoden sind Relativverfahren, das heisst, sie müs-
sen kalibriert werden (vgl. Abschnitt 4.5.2). Vom Beginn der Kalibration bis zum Ende des letzten
Probenpeaks darf deshalb weder die Empfindlichkeit noch die Linearität des Detektors ändern. Da
dies bei den wenigsten gängigen Chromatographiedetektoren über längere Zeit der Fall ist, insbe-
sondere, wenn sie zwischen zwei Analysen abgeschaltet werden, sollten Kalibration und Proben-
messung immer möglichst unmittelbar hintereinander (Externer Standard), oder noch besser
gleichzeitig (Interner Standard) erfolgen.
• Robustheit: Viele Detektoren, vor allem für den Spurenbereich, sind nicht sehr robust bzgl. Um-
gebungsvariablen (Leitfähigkeitsdetektoren reagieren z.B. empfindlich auf Temperaturänderun-
gen, HPLC-UV-Detektoren auf Druckschwankungen in der mobilen Phase). Ist dies der Fall, müs-
sen unter Umständen aufwendige gerätetechnische Vorkehrungen getroffen werden, um diese
Einflussgrössen konstant zu halten.

Flammenionisationsdetektor (FID)
Trennsysteme: Gaschromatographie
Funktionsprinzip: Ionisierung der Substanzen in einer Knallgasflamme, Messung des Ionenstromes.
Signal: Elektr. Strom (A), wird in der Signalverarbeitung in Spannungssignal (V) umgewandelt
Selektivität: schlecht, alle Organika werden angezeigt, nur die Trägergase und Wasser werden perfekt
diskriminert. Wenn bei hohen Temperaturen die organische stationäre Phase teilweise ver-
dampft und in den Detektor transportiert wird (sog. "Säulenbluten"), führt dies zu einer Ba-
sisliniendrift
Linearität: Sehr gut (bis 7 Zehnerpotenzen!)
Nachweisgrenze: sehr nachweisempfindlicher Detektor (0.1pg/sec)
Bemerkungen: - Empfindlichkeit für Gruppen ähnlicher Organika (z.B. Paraffine oder Aromaten) ähnlich
- nicht zerstörungsfrei, Substanzen werden im Detektor verbrannt.

UV/VIS-Detektor
Trennsysteme: HPLC, Ionenchromatographie, Kapillarelektrophorese
Funktionsprinzip:Absorption von sichtbarem oder UV-Licht bestimmter Wellenlänge in einer Durchflusszelle
Signal: Absorbance (Abs.), wird in der Signalverarbeitung in Spannungssignal (V) umgewandelt
Selektivität: Kann begrenzt über die Wahl der verwendeten Wellenlänge gesteuert werden, z.B. absorbie-
ren nur farbige Substanzen sichtbares Licht.
Linearität: Schlecht (1-2 Zehnerpotenzen!)
Robustheit: Reagiert empfindlich auf Aenderungen in der Laufmittelzusammensetzung (Gradiententech-
nik!) und auf Druckschwankungen.
Nachweisgrenze: Je nach Extinktionskoeeffizient des Analyten sehr unterschiedlich
Bemerkungen: - Nicht absorbierende Substanzen können nach der chromatographischen Trennung und vor
dem Detektor derivatisiert werden ("Nachsäulenderivatisierung"), z.B. durch chemische Ver-
kopplung mit einem Farbstoff.
- Aendert sich die Zusammensetzung der mobilen Phase während des Laufes (Gradiententech-
nik), tritt in den meisten Fällen eine Basisliniendrift auf.

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ZHW / CB / AnC1 4. Trennverfahren

Fluoreszenzdetektor
Trennsysteme: HPLC, Ionenchromatographie, Kapillarelektrophorese
Funktionsprinzip: Anregung der Analyte mit UV-Licht bestimmter Wellenlänge in einer Durchflusszelle, Mes-
sung der dadurch ausgelösten Fluoreszenzstrahlung
Signal: Fluoreszenzintensität (candela cd), wird in der Signalverarbeitung in Spannungssignal (V)
umgewandelt
Selektivität: Kann begrenzt über die Wahl der verwendeten Anregungs und Fluoreszenzwellenlänge ge-
steuert werden.
Linearität: Schlecht (1-2 Zehnerpotenzen!)
Nachweisgrenze: Je nach Fluoreszenzaktivität des Analyten sehr unterschiedlich, sehr gut für polyaromatische
Substanzen
Bemerkungen: - Nicht fluoreszierende Substanzen können nach der chromatographischen Trennung und vor
dem Detektor derivatisiert werden ("Nachsäulenderivatisierung"), z.B. durch chemische Ver-
kopplung mit einem Fluoreszenzindikator
- Optimierung der Anregungs- und der gemessenen Fluoreszenzwellenlänge kann aufwendig
sein, bietet dann aber bessere Selektivität als UV/VIS-Detektion und kaum Abhängigkeit von
Veränderungen der mobilen Phase.
- zerstörungsfrei, d.h. kann in Serie mit andern Detektoren oder zur Kontrolle präparativer
Trennungen benutzt werden.

UV/VIS/Fluoreszenz-Scanner
Trennsysteme: Planare Systeme, z.B. TLC, trägerfreie und Gel-Elektrophorese
Funktionsprinzip: Abtasten der Oberfläche des planaren Trennsystems mit monochromatischem Licht, Messung
der Intensitätsabschwächung bei der Reflektion (nicht transparente Systeme) oder beim
Durchtritt ("Transmission", z.B. Gelelektrophorese), bzw. der Fluoreszenzintensität
Signal: Absorbance (Abs.), bzw. Fluoreszenzintensität (cd), wird in der Signalverarbeitung in Span-
nungssignal (V) umgewandelt
Selektivität: Kann begrenzt über die Wahl der verwendeten Wellenlänge gesteuert werden, z.B. absorb
ieren nur farbige Substanzen sichtbares Licht
Linearität: Schlecht (1-2 Zehnerpotenzen!), bei Transmissionsmessungen etwas besser
Nachweisgrenze: Je nach Extinktionskoeffizient des Analyten sehr unterschiedlich
Bemerkungen: - Nicht absorbierende Substanzen können nach der chromatographischen Trennung und vor
dem Detektor derivatisiert werden (Anfärben der Platten), z.B. durch chemische Verkopplung
mit einem Farbstoff oder Fluoreszenzindikator. Dieses nachträgliche Anfärben ist vielfach
schlecht reproduzierbar, was bei der quantitativen Analyse zu erhöhter Messunsicherheit
führen kann.
- Umkehrtechnik: Nicht fluoreszierende Analyte sind auf einer gleichmässig mit Fluoreszenzin-
dikator belegten Platte als Negativpeaks nachweisbar.

Elektr. Leitfähigkeitsdetektor
Trennsysteme: Ionenchromatographie
Funktionsprinzip: Messung der elektrischen Leitfähigkeit in einer Durchflusszelle
Signal: Elektrischer Widerstand zwischen zwei Elektroden, wird in der Signalverarbeitung in Span-
nungssignal (V) umgewandelt
Selektivität: keine, ausser natürlich die perfekte Diskriminierung nichtionischer Substanzen
Linearität: Schlecht (1-2 Zehnerpotenzen!)
Nachweisgrenze: Abhängig von der Unsicherheit der Grundleitfähigkeit der mobilen Phase. Ultraspurenanaly-
tik nur mit chemischer Suppression (s.u.) möglich.
Bemerkungen: - Die Leitfähigkeit der mobilen Phase (wässeriger Elektrolyt) ist um ein Vielfaches grösser als
die Aenderungen, die durch einen Analyten auftreten. Sie muss vor dem Detektor entweder
stark reduziert werden, z.B. durch Entfernen der Ionen mit einer Membran (chemische Sup-
pression), oder durch elektronische Kompensation der Signale und Abdämpfung des Rau-
schens ("elektronische Suppression")
- zerstörungsfrei, d.h. kann in Serie mit andern Detektoren oder für präparative Trennungen
benutzt werden.

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Massenspektrometer, massenselektiver Detektor (MSD)

Trennsysteme: HPLC, Gaschromatographie
Funktionsprinzip: Einleiten der mobilen Phase am Säulenende in ein Massenspektrometer, das davon in kurzer
Zeit (1sec) ein Massenspektrum aufnimmt und digital abspeichert.
Signal: Qualitative Analyse: Massenspektrum eines Peaks
Quantitative Analyse: Gesamtionenstrom ("Total Ion Current" TIC) oder Häufigkeit einzelner
charakteristischer Fragmente ("Single Ion Monitoring" SIM) als Funktion der Zeit
Selektivität: Sehr hoch, ausser für Organika mit gleicher Summenformel und Funktionalität (Strukturiso-
mere)
Linearität: 103
Nachweisgrenze: Qualitative Analyse (Aufnahme ganzer Massenspektren): 100pg/sec
Quant. Analyse (SIM-Mode): 0.1pg/sec
Bemerkungen: - Kopplung technisch aufwendig: Zwischen Trennsystem und Detektor (der im Hochvakuum
arbeitet!) muss der Druck um den Faktor 108 reduziert werden.
- Dank der hohen Selektivität können auch Substanzen, die sich in der Chromatographie
nicht trennen lassen nebeneinander identifiziert und quantifiziert werden.
- Für die qualitative Analyse stehen riesige Referenzbibliotheken zur Verfügung, die online
abgesucht werden können.

Datenerfassung
Die Signalverarbeitung läuft heute bei allen Chroma- Sensorsignal
tographietechniken nach dem selben Schema ab:
Umwandlung in
1. Falls nötig, elektronische Umwandlung des primä- Spannungssignal
ren Sensorsignals in eine elektrische Spannung
2. Verstärkung oder Abschwächung ("Attenuation") Verstärkung/
Abschwächung
des Signals, bis es im Bereich der Eingangsspan-
nung des verwendeten Aufzeichnungsgerätes liegt.
Bevor das Signal auf einen digitalen Datenträger Analog-Digital-
abgespeichert und mit EDV-Hilfsmitteln ausgewer- Umwandlung
tet werden kann, muss es zudem digitalisiert wer-
den. Abspeicherung
auf digitalem
3. Ausgabe/Darstellung als Chromatogramm entweder Datenträger
auf der Zeitachse (Säulenchromatographie) oder
als Funktion der Wegstrecke (Planare Chroma- Ausgabe auf Ausgabe auf Ausgabe auf
Analogschreiber Integrator Drucker
tographie).
4. Auswertung des Chromatogrammes; beim Analog- Manuelle Auswertung Auswertung mit
schreiber muss die quantitative Auswertung ma- Auswertung elektronisch spezialisierter
Chromatographie-
nuell durch Messung der Peakhöhen erfolgen,
Software
während elektronische Integratoren und EDV-
Systeme eine Integration der Peakflächen erlau-
ben.

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4.5 Einsatz in der analytischen Praxis

Die grossen Stärken der Chromatographie liegen bei der quantitativen Analyse, während die qualititative
Analyse, also die Identifizierung einzelner Komponenten, vielfach mit grossem Aufwand verbunden und
auf Vergleiche mit reinen Referenzsubstanzen (die man zuerst einmal haben muss!) angewiesen ist. Des-
halb wird die qualitative Analyse heute vor allem mit spektroskopischen Methoden durchgeführt, die
meistens eine viel bessere Selektivität aufweisen als chromatographische Techniken. Werden hingegen
Chromatographie und Spektroskopie kombiniert, kommt man zu hochspezialisierten Analysemethoden,
welche sowohl bei der Quantifizierung wie bei der Identifizierung in komplexen Gemischen ausgezeichne-
te Ergebnisse liefern. Beispiele solcher sog. "Hyphenated Techniques" (hyphen = Bindestrich) sind
Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), GC-IR oder HPLC-MS.

4.5.1 Qualitative Analyse

In allen Chromatographiemethoden, die nicht auf einen hochselektiven Detektor zurückgreifen können,
ist die Retentionszeit tR (Säulenchromatographie), bzw. der RF-Wert (planare Techniken) einziger Para-
meter für die Identifizierung einer Substanz.
Diese Parameter sind aber extrem abhängig vom jeweiligen Trennsystem, sodass nicht einfach Datenban-
ken erstellt werden können, die es erlauben, eine Substanz anhand einer publizierten, auf einem andern
System gemessenen Retentionszeit in den eigenen Chromatogrammen sicher zu identifizieren. Uebertrag-
bar sind höchstens Reihenfolgen von Peaks, wenn die gleiche stationäre und mobile Phase verwendet
wird, liegen aber zwei Peaks nahe beieinander, oder sind sogar nur teilweise aufgelöst, muss zur sicheren
Identifizierung die nachfolgend beschriebene Methode der Aufstockung mit einer Referenz verwendet
werden.

Peakidentifizierung mit der Aufstockmethode

1. Aufnahme des Chromatogrammes der Probe.
2. Aufstocken der Probe mit einem Referenzmuster der vermuteten Substanz.
3. Aufnahme des Chromatogramms der aufgestockten Probe.
4. Wird der betrachtete Peak relativ zu andern Peaks in seiner Nähe grösser, ohne dass zusätzliche
Schultern entstehen oder seine Halbwertsbreite signifikant ändert, könnte es die gleiche Substanz
sein.
5. Der untersuchte Peak und jener der aufgestockten Referenz könnten aber auch zufällig den glei-
chen tR- bzw. RF-Wert haben, darum muss für grössere Sicherheit das Experiment auf einem mög-
lichst anderen Trennsystem, mit anderen k'-Werten wiederholt werden.

Diese Methode kann natürlich nur verwendet werden kann, wenn von der vermuteten Substanz auch eine
reine Referenz zur Verfügung steht, was vor allem im Bereich der biologischer und hochmolekularer Ana-
lyte vielfach nicht der Fall sein dürfte.

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Uebung 4g: Identifizierung von Substanzen durch Aufstocken: Ermitteln Sie aus den nachfolgenden
Chromatogrammen, welche der 5 Substanzen (A,B,C,D oder E) für den Peak mit tR = 2 min. im Proben-
chromatogramm verantwortlich ist.

5.0 Probe 5.0 Probe + Substanz A

4.0 4.0

3.0 3.0

2.0 2.0

1.0 1.0

0.0 0.0
1 2 tR [min.] 3 4 1 2 tR [min.] 3 4

5.0 Probe + Substanz B 5.0 Probe + Substanz C

4.0 4.0

3.0 3.0

2.0 2.0

1.0 1.0

0.0 0.0
1 2 tR [min.] 3 4 1 2 tR [min.] 3 4

5.0 Probe + Substanz D 5.0 Probe + Substanz E

4.0 4.0

3.0 3.0

2.0 2.0

1.0 1.0

0.0 0.0
1 2 tR [min.] 3 4 1 2 tR [min.] 3 4

Wenn das Chromatographiesystem mit einem Spektrometer gekoppelt ist, kann unter Umständen eine
Suche in einer Spektrendatenbank zum Erfolg führen. Eine Liste von Internetlinks zu solchen Datenban-
ken finden Sie auf der Linkliste der internen Homepage des Studienganges Chemie der ZHW:
www.zhwin.ch/cb/intern/Lehre/Links/

4.5.2 Quantitative Analyse

Alle chromatographischen Analyseverfahren sind Relativmethoden, d.h. sie müssen durch Messun-
gen an Referenzproben mit bekanntem Gehalt kalibriert werden.
Einzig mit der Näherungsmethode der Flächenprozentauswertung (s.u.) lassen sich ohne Kalibration halb-
quantitative Aussagen über die Zusammensetzung eines Gemisches machen.

Flächenauswertung oder Höhenauswertung ?

Streng genommen ist bei allen Chromatographie-Verrfahren die Peakfläche proportional zur Substanz-
menge, die in das Chromatographiesystem gegeben wurde. Die Peakintegration ist aber nur mit elektroni-
schen oder digitalen Integratoren möglich (Früher wurden die Peaks aus dem Schreiberpapier ausge-
schnitten und gewogen!), und wird bei schwankender Basislinie, Basisdrift, asymmetrischen oder nicht

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basisliniengetrennten Peaks schnell sehr unsicher. Teilweise Abhilfe kann da die Auswertung über die
Peakhöhe bringen. Diese ist in einem Gausspeak proportional zur Fläche und damit zur injizierten Sub-
stanzmenge, wenn die folgenden Bedingungen erfüllt sind.
Höhenauswertung ist möglich, wenn
• Peaks bei der Kalibration und bei der Probenmessung die gleiche Form
(= gleiche Halbwertsbreite und gleiche Asymmetrie) haben.
• der Fusspunkt der Höhenmessung und das Peakmaximum klar definiert sind.

Kalibration mit externem Standard

Prinzip: In separaten Injektionen von Standardlösungen wird die Empfindlichkeit E des Detektors für je-
den Analyten bestimmt und damit dann Probenchromatogramme ausgewertet.

Injektion Standard Injektion Probe

APrb.
cPrb. =
AStd. AStd. AProbe E ⋅ VPrb.
E=
VStd. ⋅ cStd. APr b. VStd.
= cStd. ⋅ ⋅
AStd. VPr b.
Injektionsvolumen: VStd. Injektionsvolumen: VProbe
Konzentration: cStd. Konzentration: cProbe (gesucht)
Vorteile: - Keine Kontamination der Probe
- Mehrpunktskalibration möglich, damit kann zusätzliche statistische Information bzgl. der
Unsicherheit der Kalibration gewonnen werden.
Nachteile: - Das Injektionsvolumen und seine Unsicherheit haben direkten Einfluss auf das Resultat und
die Wiederholbarkeit der Analyse.
- Die Kalibration erfolgt in einem matrixfreien Medium
- Wegen der schlechten Stabilität der meisten Detektoren ist für jede Messprobe eine Ka-
librationsmessung notwendig.

Kalibration mit internem Standard

Prinzip: In einer sog. Faktorlösung, welche sowohl Analyt (X) wie auch eine Referenzsubstanz enthält,
den "internen Standard" IS, werden von beiden Substanzen die Empfindlichkeiten E und deren Quotient,
der "Responsefaktor" RF, bestimmt. Die Messprobe wird mit einer bestimmten Menge IS versetzt und nach
dem Messen wird aus dem Responsefaktor und dem Peakverhältnis von Analyt und IS im Probenchroma-
togramm innerhalb der gleichen Injektion der Analytgehalt berechnet.

Injektion Faktorlösung Injektion Probe + IS

AIS
EIS AIS ⋅ cX APrb.
AX AIS RF = = AProbe cPrb. = c IS ⋅ ⋅ RF
EX AX ⋅ cIS AIS

Injektionsvolumen: VStd. Injektionsvolumen: VProbe

Konzentrationen: cStd,cIS. Konzentrationen: cIS, cPro (gesucht)

Vorteile: - Das Injektionsvolumen hat keinen Einfluss auf das Resultat und dessen Unsicherheit.
- Das Peakverhältnis und damit der Responsefaktor ist robuster als die absoluten Peakflä-
chen, deshalb können mehrere Probenmessungen mit dem gleichen Responsefaktor ausge-
wertet werden.
Nachteile: - Der interne Standard darf in der Probe nativ nicht enthalten sein (auch keine andere Sub-
stanz mit der gleichen Retentionszeit).
- IS darf weder mit dem Analyten, noch mit irgend einer Matrixkomponente reagieren.
- Die Probe wird mit IS kontaminiert.

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Näherungsmethoden
Prinzip: Da die gängigen Chromatographie-Detektoren teilweise stark substanzabhängige Empfindlichkei-
ten aufweisen, müssen für eine präzise Kalibration immer auch reine Referenzsubstanzen zur Verfügung
stehen, und zwar für jeden Peak! In komplexen Gemischen und bei Neuentwicklungen sind aber vielfach
nicht einmal alle Peaks identifiziert, und/oder es stehen keine entsprechenden Referenzsubstanzen zur
Verfügung. Trotzdem ist auch in diesem Fall manchmal noch eine halbquantitative Aussage möglich, in-
dem angenommen wird, dass alle Peaks in einem Chromatogramm (sog. "Flächenprozent-Methode") oder
in einer Gruppe verwandter Substanzen ("Gruppen-Quantifizierung") etwa die gleiche Empfindlichkeit
haben.
Beispiel für die Flächenprozentmethode: Ein organisches Lösemittel soll auf seine Reinheit geprüft wer-
den. Im GC sind mit einem FID-Detektor mehrere kleine Peaks von Verunreinigungen erkennbar, die ne-
ben dem Hauptpeak aber erst sichtbar werden, wenn das Signal entsprechend verstärkt wird:
60.0 2.0

50.0
1.5
40.0

30.0 1.0

20.0
0.5
10.0

0.0 0.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
t R [ mi n. ] t R [ mi n. ]

Dank der extrem guten Linearität des FID (vgl. Kapitel 4.4.4) kann ein Integrator aber auch derart unter-
schiedliche Flächen noch richtig auswerten und liefert die folgenden Rohdaten:

Lösemittel Störung 1 Störung 2 Störung 3 Störung 4 Störung 5

tR (min.) 1.7 2.7 3.1 4.05 4.9 9.0
Fläche (mV∙sec) 98500 465 264 314 218 424
Area-%
Nun wird angenommen, dass alle Komponenten der Probe im Chromatogramm sichtbar sind und zwar mit
der gleichen Empfindlichkeit. Die Summe aller Peakflächen stellt also 100% der Probe dar. und es ist nun
trivial, den %-Anteil des Lösemittelpeaks an dieser Summe zu berechnen. Diese Zahl wird bei käuflichen
Lösemitteln als sog. "GC-Reinheit" angegeben. Wie gross ist die GC-Reinheit im obigen Beispiel?

Vorteile: - Keine Kalibration notwendig

Nachteile: - Die folgenden Voraussetzungen müssen erfüllt sein, wenn das quantitative Resultat eini-
germassen zuverlässig sein soll:
∙ Detektorsignal muss über den gesamten Bereich von Peakflächen linear sein.
∙ Detektor muss alle Substanzen mit etwa der gleichen Empfindlichkeit anzeigen
∙ Alle in der Probe enthaltenen Substanzen müssen den Detektor erreichen.

Beispiel für die Gruppenquantifizierung: In einer Nährlösung sollen die verschiedenen Zuckerarten sum-
marisch quantifiziert werden. Die Trennung wird mittels RP-HPLC durchgeführt, als Detektor wird ein Bre-
chungsindex-Detektor verwendet. Aus Pilotexperimenten sind die Retentionszeiten der verschiedenen
Zucker bekannt. Die entsprechenden Peakflächen werden aufaddiert und mit der Methode des externem
Standards ausgewertet, als Standard wird eine Glukoselösung verwendet. Das Resultat wird folgendermas-
sen angegeben: "Zuckergehalt (gemessen als Glukose): 2.4 g/l ".

Vorteile: - Nur Kalibration mit einer Substanz notwendig

Nachteile: - Die folgenden Voraussetzungen müssen erfüllt sein, wenn das quantitative Resultat eini-
germassen zuverlässig sein soll:
∙ Detektorsignal muss über den gesamten Bereich von Peakflächen der quantifizierten
Gruppe linear sein.

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∙ Der Detektor muss alle Substanzen der Gruppe mit der gleichen Empfindlichkeit anzeigen,
oder der Standard muss innerhalb der Gruppe eine mittlere Empfindlichkeit aufweisen,
damit Streuungen um den Mittelwert wenigstens teilweise kompensiert werden.

Alte Klausuraufgaben zu Kapitel 1 - 4

Im Moodle-Kurs Analytische Chemie I finden Sie im Thema 9 einen Link zu einer PDF-Datei mit
Klausuraufgaben zu allen Kapiteln dieses Skripts und deren detaillierte Lösungen.

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