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Synthetic Biology
Una vez que se secuenciaron los genomas, se dej de tener tanto inters en
el hecho de secuenciar, convertido casi en un proceso automtico. Es por
ello que se plante la idea de crear vida sinttica llevndonos a otro
concepto: cul es el genoma mnimo para que un organismo pueda vivir?
Este problema aparentemente sencillo es realmente complejo, porque
determinar qu genes son prescindibles y cuales obligatorios supone saber
qu es lo que hace cada uno de los genes y como interacta con los dems.
Asimismo plantea muchas ventajas: la capacidad de definir qu es lo
necesario para la vida y a partir de esto, poder modularla. Este aspecto es
muy interesante, puesto que tiene que ver con la biotecnologa: podemos
disear el organismo que queramos con las caractersticas que queramos.

El primer problema que surgi fue con qu organismo empezar; es decir,

cul era el organismo ms simple. Una vez decidido que tiene que tener,
solo hay que elaborarlo, lo que permite su patentacin.

The big picture

Sabemos que hay muchas bacterias que llevan a cabo muchos procesos,
pero algunos de estos procesos no nos interesan, de forma que si
pudiramos eliminar lo que no nos interesa y seleccionar lo que s, podra
resultar muy interesante. Entonces, lo que se hizo fue empezar a partir de
genomas simples de organismos muy sencillos e irlos reduciendo. Para ello,
necesitamos una tecnologa que nos permita realizar este tipo de ensayos
que tratan de eliminar genes de una forma muy especfica sin afectar a
otros y adems saber con exactitud qu genes hemos eliminado.

Primeros esfuerzos
Desde hace tiempo se han intentado sintetizar genomas, pero hay un
problema puramente tecnolgico cuando hacemos una sntesis qumica:
cuanto ms larga es la secuencia de DNA que sintetizamos, mayor numero
de errores cometemos (a partir de 60 bases se acumulan errores)

- En 1979 se sintetiza un gen supresor del tRNA de la tirosina de 207

bp (Khorana et al)
- En 1990 se sintetiza un cluster de genes para un polictido de 32 kb
(*metabolitos secundarios de bacterias, hongos, plantas y animales
sintetizados por polimerizacin de subunidades de acetilo y
propionilo)
- En 2002 se consigue la sntesis completa del virus de la polio.
- En 2003 Venter sintetiza un bacterifago

Cmo definimos el genoma mnimo?

Es el nmero mnimo de elementos genticos suficientes para construir un
organismo de vida libre (Mushegian). En otras palabras, es el set de genes
esencial para la supervivencia.

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Prerequisitos

Lo primero que necesitamos para abordar esto es:

- Conocer los genomas existentes de muchas especies para saber cul

es el genoma ms sencillo
- Definir la lista mnima de elementos clave mediante un anlisis
comparativo. Todos estos anlisis se hacen en un laboratorio seco
es decir, en un ordenador.
- Tenemos que definir los genes. En el caso de las bacterias es ms
fcil definirlos porque carecen de intrones y exones, Adems muchos
son policistronicos, es decir, que se encuentran en bloques que se
transcriben bajo el mismo promotor.
- Necesitamos conocer las similitudes entre las secuencias de protenas

En definitiva, vemos que la homologa es el concepto bsico para cualquier

anlisis evolutivo.

Este artculo, firmado por Craig Venter muestra la primera idea de cmo
abordaron la vida sinttica:

El genoma de Mycoplasma genitallum un genoma muy pequeo, el ms

pequeo de los organismos que pueden ser crecidos en cultivo puro.
Adems, tiene un metabolismo muy sencillo y muy poca redundancia
genmica. Es por ello que se espera que su genoma sea una buena
aproximacin del set mnimo de genes necesarios para que la vida
bacteriana sea posible y as ver qu era redundante. El primer problema fue
cmo abordar este sistema, es decir, saber cules eran los genes
redundantes y eliminarlos. Emplearon una tcnica de mutagnesis por
transposones: ponemos el transposn en contacto con Mycoplasma y se

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inserta en el genoma y como el genoma es bastante denso, donde se
inserte rompe la secuencia. Adems son transposones que slo se insertan
una sola vez en el genoma, de forma que se consigui mutantes con 100
genes distintos interrumpidos. Por otro lado, podemos saber en qu parte
del genoma se ha insertado, ya que si se inserta en mitad de una secuencia
y secuenciamos del transpn hacia los lados, sabemos en qu punto exacto
se ha insertado y as conocemos qu gen se ha mutado.

Una vez determinados cuales eran los genes esenciales, se plante ir un

paso ms all. No solo queran saber cul era el genoma mnimo, sino que
quisieron sintetizarlo qumicamente para que fuese totalmente patentable.
Para ello, se defini una clula sinttica como aquella que es capaz de
operar con un genoma sintetizado qumicamente.

El concepto que est detrs es que una clula puede compararse con un
sistema computacional, de forma que tiene un
hardware (citpplasma) y un software (genoma). Al igual
que sabemos que a un ordenador podemos cambiarle
el sistema operativo, a una bacteria podemos
cambiarle el genoma (software). Esto no es lo mismo
que la clonacin donde a una clula le introducamos
un genoma de otra clula pero de la misma especie. Aqu lo que planteamos
es que a una clula le introducimos el genoma de otra clula de otra
especie y vemos que se transforma en la especie del genoma donante.

Tenemos que tener en cuenta las siguientes consideraciones:

- El citoplasma contiene todas las partes (protenas, ribosomas..etc)

necesarias para expresar la informacin contenida en el genoma
- El genoma contiene toda la informacin necesaria para generar el
citoplasma y envolturas de la clula y para replicarse.
- Cada una de las partes carece de valor sin la otra

El fundamento es el siguiente: se
sintetizan las secuencias de
aproximadamente 60 bases, se
introducen en cassettes que se
introducen en una clula receptora y
se transforman en una clula
sinttica. Sin embargo, aunque
aparentemente muy sencillo, tiene
una complejidad subyacente.
Eliminar el genoma de una clula y
aadirle otro en principio nos genera otra especie, pero tal vez no.

Esto es lo que hizo el equipo de Craig Venter. Se extrajo el genoma entero

de Mycoplasma mycoides sin romperlo con todos los genes completos y lo
introdujeron en una clula de otra especie (clula receptora, Mycoplasma
capricolum). Aparentemente es sencillo pero es un proceso complejo. Lo que

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vieron es que cuando extraen el genoma donador y lo insertan en otra
clula consiguiendo su transformacin, las clulas receptoras al cabo de
unas divisiones tenan todos los marcadores y caractersticas de la especie
donadora del genoma.

Lo siguiente que se hizo fue sintetizar un genoma completo: no lo disearon,

sino que lo copiaron y lo sintetizaron. Fueron capaces de sintetizar a partir
de fragmentos de 6 kbases un genoma de un milln de bases. No
sintetizaron nada que no existiera. Sin embargo, no pudieron conseguir el
genoma completo puesto que a partir de un tamao determinado se
requera un organismo ms grande para el clonaje del genoma de
Mycoplasma mycoides

Un ao ms tarde, sintetizaron todo el genoma empleando levaduras para el

clonaje, luego lo extrajeron y lo pusieron en otra especie.

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Al final a lo que queremos llegar es a crear bacterias con las caractersticas
especificas que nosotros queramos. Por ejemplo, en la imagen tenemos una
bacteria que queremos que sea gram +, que tenga un tipo de divisin dada
y un metabolismo peculiar. Esto es muy til para todas las empresas
biotecnolgicas que quieren llevar a cabo un proceso que se d de una
manera determinada, es decir, una biofactora. Adems podemos
determinar cmo controlarlas, ya sea con genes suicidas o marcadores
auxotrficos.

Por qu Mycoplasma?

- Mycoplasma es un mollicute, un grupo inusual de bacterias que se

caracteriza entre otras cosas por no tener pared
- Su evolucin ha estado orientada hacia una disminucin masiva del
genoma
- Es un parasito obligado
- Es el genoma ms pequeo que se conoce en un organismo de vida
libre capaz de ser cultivado en cultivo puro (axnico)
- No tiene redundancias en el genoma

What do we mean by minimal bacterial cell?

Se considera que una clula bacteriana es minima si contiene solamente los

genes que son necesarios y suficientes para asegurar su crecimiento
continup bajo condiciones ideales de laboratorio entendiendo condiciones

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ideales aquellas en las que le vayamos a suplir con todos los sustratos que
necesite.

Why make a minimal cell

- Para definir el set mnimo de funciones genticas esenciales para la

vida bajo condiciones ideales de laboratorio
- Para descubrir el set de genes de funcin desconocida que son
esenciales para la vida y as poder determinar su funcin
- Para tener un sistema simple que nos permita modular la clula
completa
- Para generar mdulos de genes implicados en cada proceso celular
(traduccin, replicacin, produccin energtica..etc) y disear una
clula con dichos mdulos. Nos interesa conocer y modular y agrupar
genes por funciones para luego generar un software que nos permita
seleccionar cules queremos y situarlos en un casette que nos
permita su transcripcin simultnea.
- Para construir clulas ms complejas aadiendo nuevos mdulos
funcionales

What bacterial cell will we minimize?

Como ya hemos dicho antes, se eligi Mycoplasma mycoides syn1.0, una

versin sinttica de Mycoplasma mycoides porque:

- Tiene un genoma pequeo (1.08 MB)

- Puede crecerse en laboratorio
- Podemos realizar una sntesis qumica de su genoma y clonarlo en
levaduras como YCp.
- Podemos aislar el genoma sinttico de la levadura y devolverlo a la
vida transplantndolo en el interior de una clula receptora de
mycoplasma
- Se ha diseado un conjunto de herramientas para modificar
genticamente su genoma

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Hemos dicho que Mycoplasma no tiene redundancias, esto quiere decir que
todos son esenciales para su vida? La respuesta es no.

El punto de partida para la generacin de una clula mnima fue el genoma

sinttico de M.mycoides JCVI-syn1.0. Hay dos tcnicas distintas:

- Top down: consiste en empezar con el genoma completo de M.

mycoides JCVI syn2.0 e ir eliminando genes y agrupaciones de genes
de uno en uno (o unos pocos) mediante mutagnesis asegurndonos
que la mutacin rompa el gen. En cada etapa, se vuelve a testar la
viabilidad de la bacteria y slo se contina hasta la siguiente etapa
en caso de que la construccin anterior sea viable y el tiempo de
replicacin sea ms o menos normal
- Bottom up: consiste en hacer una composicin terica del genoma
mnimo y sintetizarla. Craig Venter denomin este proceso como el
santo grial del genoma.

Ambas tcnicas suponen que tenemos que tener una informacin muy
exacta del genoma del organismo: tenemos que identificar qu genes no
son esenciales y por tanto son candidatos para ser eliminados, debemos
conocer la funcin de cada uno de los genesetc Ser capaz de saber todas
estas cosas es complicado, ya que hay genes que realizan una cosa y la
contraria en funcin de la concentracin. Podemos obtener esta informacin
mediante tres tcnicas:

Identificar genes que normalemente desempean funciones no

esenciales como elementos IS (insertion sequence), sistemas RM
(restrinction-modification), elementos integrativos y conjugativosetc

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 Llevar a cabo una mutagnesis global mediante transposones para
identificar los genes individuales que pueden ser interrumpidos sin
que el organismo pierda su viabilidad.

Tn5 puromycin
En la imagen vemos el genoma de
Mycoplasma mycoides y podemos ver
donde se introdujeron transposones:
mediante la tcnica Ilumina consiguieron
insertar 10902 inserciones nicas. De esta
forma vieron que 754 genes eran
esenciales y encontraron 160 mutaciones
que eran NO esenciales, esto quiere decir,
que cuando eliminaban uno de ellos por
genoma, el organismo poda continuar
viviendo (no que se puedan eliminar 160 a
la vez). Esto se explica porque hay genes
que no son necesarios para la
supervivencia, pero que si faltan dos de
ellos el organismo puede morir, porque
ambos se encargan de la misma funcin
por vas diferentes, de forma que al
eliminar los dos ya no hay redundancia
funcional. As vemos que a pesar que realizar un genoma mnimo parece
sencillo la combinatoria posible de los 160 genes cogidos al azar de dos en
dos haciendo permutaciones, empieza a complicarlo.

Aproximacin top down. Reducin progresiva del genoma

La aproximacin bottom up: diseo y sntesis del genoma santo

grial

El sistema Tn5 contado anteriormente es poco eficiente, porque hay

muchas combinaciones, de manera que queremos definir cules son los
elementos necesarios. Para ello, se emplea el mapa de datos obtenido de la
mutagnesis tn5 pero adems tener un amplio conocimiento de las
funciones de los genes que nos permita determinar qu combinacin de

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genes es la "ganadora". Queremos crear todo el genoma, no ir eliminando
genes sino irlos metiendo hasta conseguir el organismo vivo.

Hail mary; la construccin del genoma mnimo

Si diseamos nosotros los genes que queremos, lo mejor es hacerlo en

cassettes. Ya que lo hacemos nosotros, podemos hacerlo de forma modular
y ordenada. En el caso de que lo que hagamos sea quitar genes, tenemos
que adaptarnos a como est. En la imagen ,cada uno de los colores est
asociado a una funcin y todos los genes asociados a una funcin, estn
contenidos en paquetes o casettes.

Los genes del santo grial agrupados por categora funcional

Hay distintos formas de minimizar el genoma, como por ejemplo quitar

todos los genes implicados en la sntesis de aa, debido a que si se los
suministramos no necesitan genes para ello. La idea es tener un mnimo,
que vamos a transformar con distintos sustratos para convertirlo en una
biofactora que haga un proceso de inters.

Como ya hemos dicho, se plante el diseo de un genoma modular, esto es

que los genes implicados en las mismas funciones apareciesen agrupados
en mdulos. Sin embargo, esto supone problemas puesto que en el genoma

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salvaje no se encuentran ordenados, por lo que no sabemos si estando
ordenados van a expresarse de la misma forma.

La gran promesa

La generacin de biofactorias supone generar grandes promesas (algunas

de ellas ya son reales, como por ejemplo organismos capaces de
alimentarse de fuel para eliminar manchas de petrleo)

- La obtencin de fuentes de fuel renovables

- Organismos capaces de generar frmacos
- La detoxificacin qumica
- El control del medio ambiente
- Y la generacin de organismos beneficiosos, por ejemplo para la
salud. Es el ejemplo de una bacteria con un gen que genere
antibitico y que est silenciado de forma que lo ingerimos y se
mantiene as hasta que padezcamos una enfermedad, de forma que
le demos algo que se active

Lo ltimo de lo que han sido capaces es generar organismos que e

alimentan de plstico, puesto que es un contaminante muy importante.

Todo esto est regulado puesto que es probable que la naturaleza se revele.
El peligro es muy evidente. Es para ello que se accede al aislamiento de
estas clulas:

- Aislamientos fsicos: se trata de establecer barreras fsicas, tales

como bnkeres donde se encuentren.
- Aislamiento biolgico:
Cambiar el cdigo gentico, es decir, sintetizarlas con uno distinto
al que usan los seres vivos, de forma que no pueda combinarse
con otros.
Generar dependencia de algunos nutrientes, de forma que si no se
los suministramos no puedan sobrevivir.
Programar su muerte celular
gorilas (gorilas referidos a porteros de bar, por ejemplo)
microbianos: es decir, elementos que controlen su proliferacin.
Eliminacin de elementos genticamente mviles.

Es por ello que entra en juego la biotica: no necesariamente tenemos que

hacer todo lo que se puede hacer.

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