Manual Me Dios de Cult Ivo

Autores:
Alfredo Guilln, Nora Bravo
2008
Preparacin de Medios de Cultivo y Reactivos
PREPARACION DE MEDIOS DE
CULTIVO Y REACTIVOS PARA EL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
CLINICA
AUTORES
Alfredo Guilln Oneeglio

Mdico Cirujano
Profesor Asociado
Facultad de Tecnologa Mdica, Universidad Nacional Federico Villarreal.
Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Alas Peruanas
Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Peruana Los Andes
Jefe de Microbiologa, Laboratorio, Clnica San Borja.
alfredo_guillen@yahoo.com
Nora Bravo Cruz

Biloga
Profesor Asociado
Facultad de Ciencias Naturales y Matemtica, Universidad Nacional Federico Villarreal
Cubierta: Foto de una placa de agar TCBS con un cultivo de Vibrio cholerae
Lima, Marzo del 2008

1ra Edicin.
Pag 1
TABLA DE CONTENIDO
Pag. Pag.
Introduccin 3 Caldo peptonado alcalino 38
Medios de cultivo 4 Caldo peptonado con cloruro de sodio 39
Componentes de los medios de cultivo 7
Clasificacin de los medios de cultivo 9 Caldo tripticasa soya 40
Preparacin de medios 10 Caldo urea segn Stuart 41
Criterios de calidad de los medios de Medio de Mueller Hinton 42
Cultivo 14 Medio de transporte de Amies 43
Descripcin de los medios de cultivo 16 Medio de transporte de Cary y Blair 44
Agar azul de bromotimol - lactosa - Medio MR VP (rojo de metilo y Voges
cistina (Brolacin o Cled) 17 Proskauer) 45
Agar almidn 18 Medio OF (oxidacin/fermentacin)
Agar bilis esculina 19 segn Hugo y Leifson 46
Agar chocolate 20 Medio SIM (sulfuro, indol, movilidad) 47
Agar citrato de Simmons 21 Preparacin de reactivos y colorantes 48
Agar DNAsa 22 Colorantes de Gram 49
Agar EMB (eosina - azul de metileno) 23 Colorantes para Ziehl Neelsen 50
Agar lisina fierro (LIA) 24 Estndar de turbidez Escala de
Agar Mac Conkey 25 Mc Farland 51
Agar Mac Conkey Sorbitol 26 Prueba de oxidasa 52
Agar manitol salado 27 Reactivos para MR VP 53
Agar nutritivo 28 Bibliografa 54
Agar Saboraoud glucosa 4% 29
Agar sangre 30
Agar sangre azida 31
Agar SS (Salmonella Shigella) 32
Agar TCBS (tiosulfato, citrato, bilis,
sacarosa 33
Agar tripticasa soya (TSA) 34
Agar urea segn Christensen 35
Agar XLD (xilosa, lisina, desoxicolato) 36
Caldo infusin cerebro corazn (BHI) 37
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INTRODUCCION
El laboratorio de microbiologa clnica necesita para el procesamiento de muestras

preparar medios de cultivo que permitan el desarrollo de un gran nmero de
bacterias diferentes y adems necesita medios para la identificacin, pruebas de
patogenicidad y determinar la susceptibilidad antibitica de lo que han aislado.
Para la preparacin de medios y reactivos necesitan contar con manuales de
procedimientos que describan paso a paso como deben hacer para que el medio
resultante sea el adecuado para la muestra o microorganismo investigado, pero
tambin debe ser preparado siguiendo reglas estrictas que garanticen un buen
desempeo y que el resultado no pueda ser alterado.
Existen una serie de manuales, disponibles tanto en formato fsico como electrnico,
orientados para laboratorios de microbiologa generales, con muchos medios
descritos para la parte clnica, farmacutica, industrial, alimentos, etc. Este manual
describe los medios mas utilizados en la parte clnica, en los cuales los laboratorios
necesitan solo unos pocos que le permitan un adecuado diagnstico y pruebas
complementarias. Se ha incluido la preparacin del medio de hemocultivo.
Esta primera edicin no esta completa, faltan algunos medios y reactivos que se
aadirn en las prximas ediciones.
En la bibliografa se estn colocando los libros sobre medios de cultivo mas
utilizados en nuestro medio.
Pag 3
MEDIOS DE CULTIVO
1. GENERALIDADES
Las necesidades nutricionales de las bacterias varan considerablemente; mientras que algunas slo
requieren de sustancias simples por lo que son llamadas bacterias no exigentes, otras necesitan de
sustancias complejas como la sangre, el suero, la albmina o plasma y se les llama bacterias
exigentes.
Los medios de cultivos son sustancias o compuestos nutritivos que permiten el desarrollo microbiano
en el laboratorio, el pH est generalmente entre 6,8 a 7,6 en el caso de medios usados en
microbiologa clnica. Estos medios nos van a permitir lo siguiente:
Aislamiento de microorganismos.
Identificacin y clasificacin de bacterias.
Conservacin de cultivos.
Obtencin de toxinas, enzimas, antibiticos y otros metabolitos.
Realizar pruebas especiales, como la susceptibilidad antimicrobiana.
Crecimiento y recoleccin para la preparacin de antgenos usados como diagnstico o
tratamiento (vacunas).
2. ASPECTOS HISTRICOS
El siglo XIX fue una poca de grandes cambios en la historia de la microbiologa, uno de ellos fue el
descubrimiento de los agentes infecciosos que causaban enfermedades, y un paso importante fue el
aislamiento de las bacterias de los tejidos y fluidos biolgicos. Lus Pasteur (1822-1895) y Roberto
Koch (1843-1910) fueron las mayores figuras en el establecimiento de la ciencia de la microbiologa,
identificando los agentes causales de una gran cantidad de enfermedades infecciosas bacterianas en
el siglo XIX.
2.1. Roberto Koch - El Padre de los medios de cultivo
Los xitos de Koch en bacteriologa estuvieron basados en su tcnica de usar medios de cultivo que
eran slidos y transparentes para cultivar las bacterias y separarlas en colonias de organismos para
posterior identificacin. Su primer xito fue el aislamiento de Bacillus anthracis, el reconocimiento de
la espora como forma de resistencia del organismo y la prueba de especificidad patolgica, causando
la enfermedad del ntrax en animales experimentales despus de varios pasajes del organismo a
travs de cultivos artificiales. Este ltimo paso estableci los postulados de Koch-Henle, los cuales
fueron publicados en 1882: el organismo debe ser constantemente asociado con la enfermedad; este
debe ser aislado y crecer en cultivo puro y el cultivo puro debe mostrar que induce la enfermedad
cuando es inoculado dentro de animales experimentales.
El trabajo con ntrax fue emprendido usando portaobjetos cubiertos, sellados con aceite. Los lquidos
de cultivo usados fueron suero estril de vaca o humor acuoso tomado del ojo de un buey. Koch ide
el primer microscopio con "platina caliente" y de esta manera incub los cultivos mientras observaba
directamente el desarrollo del crecimiento bacteriano y la esporulacin.
La importancia de los postulados de Koch fue demostrada cuando obtuvo cultivos de bacilos similares
al ntrax del profesor Ferdinand Cohn en el Instituto de Fisiologa de Plantas en Breslau. Estos
organismos no eran patognicos en animales de experimentacin y fueron ms tarde clasificados
como Bacillus subtilis. Lo ms importante fue que los postulados de Koch establecieron la
especificidad del organismo y enfermedad. Sin el cuidadoso trabajo con cultivos puros, no podra
haberse establecido la bacteriologa clnica.
2.2. El Desarrollo de los Medios Slidos
Aunque su trabajo, publicado en 1876, fue el comienzo de la fama de Koch como bacterilogo, l
supo que la tcnica que us requera una meticulosa preparacin y no garantizaba obtener cultivos
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puros. El buscaba un mtodo simple y confiable que pudiera ser fcilmente llevada a cabo en un
laboratorio bacteriolgico.
Koch tena conocimiento de los intentos anteriores de investigadores para hacer crecer organismos
en una superficie slida; Bartolomeo Bizio haba publicado en 1832 la aparicin de "manchas de
sangre" sobre el pan y obleas comunes y fue capaz de subcultivar el organismo sobre otra superficie
de pan en cultivo puro y ponerle el nombre a una bacteria que actualmente se conoce como Serratia
marcescens. Schroeter en 1872, llev a cabo un trabajo similar en bacterias cromognicas,
hacindolos crecer sobre varios sustratos slidos tales como papa, albmina de huevo coagulado,
pasta de almidn y carne.
Aunque satisfactoria para organismos comensales cromognicos, el mtodo fall cuando se intent
con organismos patgenos no pigmentados. Koch observ que pocos organismos patgenos crecan
sobre papa y la opacidad de los otros substratos disponibles evitaba la adecuada inspeccin de las
colonias que crecan. Luego se dedic a describir varios caldos, los cuales podan soportar el
crecimiento de bacterias patgenas y un medio slido que era la gelatina nutritiva.
La tcnica de Koch fue verter gelatina nutritiva preesterilizada sobre placas de vidrio estriles y
permitir la formacin de un gel transparente y claro, bajo una campana o jarra protectora. El gel fue
inoculado con un asa cargada estriando la superficie y luego llevado a una incubadora. Despus de la
incubacin, las colonias aisladas de organismos eran cultivados sobre otras placas o en la base o
pico de gelatina en tubos que tenan un tapn con algodn.
Koch se dio cuenta que su tcnica era aplicable tambin para valorar el nmero y grupo de
microorganismos hallados en el aire, agua, tierra, alimentos, etc. En 1881 demostr el mtodo en el
Congreso Mdico Internacional en Londres, ante una audiencia que inclua a Luis Pasteur y Joseph
Lister.
2.3. La Placa de Agar
Aunque la placa de gelatina nutritiva fue el mayor avance sobre cualquier sistema precedente, la
gelatina tena dos desventajas: cambiaba de gel a sol por encima de los 25 C, imposibilitando que
este sea incubados a 37 C y era hidrolizado por la gelatinasa, una enzima producida por la mayora
de bacterias proteolticas.
Este problema fue resuelto por la sustitucin de la gelatina por agar. El crdito para el uso del agar en
bacteriologa debe otorgarse a Fanny Eilshemius (1850-1934) quien naci en New Jersey. Fanny
viaj a Europa en 1874 y se cas con Walter Hesse (1846-1911), un doctor de distrito en
Schwartzenberg, Sajonia. El Dr. Hesse estaba experimentando con la bacteriologa del aire y uso
medios con gelatina para revestir las superficies interiores de tubos de vidrio. Al igual que otros
investigadores, el observ que la gelatina se disolva a altas temperaturas ambientales y se licuaba
en presencia de enzimas bacterianas. Frau Hesse, quien fue tambin la tcnica e ilustradora de
Walther, sugiri el uso del agar, que ella y su madre usaban para preparar jaleas de fruta segn la
recomendacin que le fue dada por unos amigos holandeses que vivieron en Java. El agar haba sido
usado por generaciones como agente gelificante, satisfactorio para climas clidos.
El agar es un polisacrido derivado de algas rojas. Sus temperaturas de disolucin (85-90C) y
gelificacin (34-42C) lo hicieron ideal para los medios de cultivo. El Dr. Hesse hall este agente
gelificante estable al calor y enzimas, slido, transparente y fcilmente esterilizable, altamente
satisfactorio para sus estudios del aire. Cuando l visito a Koch durante unas semanas en su nuevo
laboratorio en el Imperial Health Agency a finales de 1881, le pas esta informacin. Koch ensay el
agar y estuvo igualmente impresionado con su rendimiento en los medios de cultivo. El lo us en sus
investigaciones sobre el bacilo tuberculoso y lo mencion en el subsecuente manuscrito en una corta
oracin. Hesse public su reporte sobre la bacteriologa del aire en 1884 pero no fue hasta 1939 que
Fanny Hesse recibi pblicamente el crdito que se mereci por su contribucin a la bacteriologa,
cinco aos despus de su muerte.
La simple creacin de una placa de agar, transparente y estril, el cual poda ser incubado a
temperaturas de hasta 60 C, que an as pueda ser inoculado en fro y en estado licuado a 40 C
para obtener conteos de unidades formadoras de colonias de bacterias, persisten como las bases de
la bacteriologa prctica.
En 1887 Richard Petri, otro investigador que trabajaba con Koch, modific la placa plana de vidrio y la
campana en la placa, por placas dobles de 10-11 cm de dimetro y 1-1,5 cm de altura. La
contribucin de Petri permanece hasta nuestros das como un ejemplo de buen diseo funcional el
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cual no ha sido alterado, excepto que ahora puede estar hecho de plstico descartable.
2.4. El desarrollo comercial de los medios de cultivo
Koch y sus contemporneos usaron infusiones o extractos de carne como el lquido nutritivo base
para el crecimiento de organismos. El extracto de carne fue bien conocido en Alemania, siguiendo el
trabajo de Justus von Liebig y su "extractum carnis", un extracto concentrada de res. Este producto
era tambin muy caro para ser producido comercialmente en Europa pero George Giebert estableci
la produccin a gran escala en Fray Bentos en Uruguay.
Aunque el extracto de carne es una fuente valiosa de factores de crecimiento de la bacteria, este no
tiene suficientes nitrgeno para dar un crecimiento ptimo. Frederick Loeffler, cuando estaba
investigando Corynebacterium diphtheriae, adicion peptona y cloruro de sodio a la infusin de carne,
elevando a la vez los niveles de nitrgeno y presin osmtica a concentraciones satisfactorias para el
crecimiento de las bacterias.
La peptona, descrita por Lehmann en 1849 que era un derivado de la digestin enzimtica de la
carne, fue producida en el siglo XIX como un producto farmacutico y prescrito para desrdenes
nutricionales. E. Merck de Damstadt report en 1892 la elaboracin de peptona para ser usada en la
preparacin de los medios de cultivo. Entre 1912 y 1913 E. Merck describi peptonas producidas a
partir de la digestin de albmina srica y de casena.
2.5. Produccin de medios deshidratados
Por tradicin los extractos de carne fueron preservados por concentracin por lo que el agua
disponible (aw) inhiba el crecimiento de cualquier organismo contaminante. Peptonas y otras
protenas hidrolizadas fueron preservadas, a escala comercial, por desecamiento del producto final en
vaco para producir un grnulo grueso. Ms tarde, un mtodo ms eficiente y menos daino fue
usado, la liofilizacin.
En Inglaterra el pionero en este campo fue Frederick Chopping, quien demostr los medios de cultivo
deshidratados en 1910 en una reunin de la Sociedad Microscpica. El expandi la produccin de
medios deshidratados en el stano de su casa y ms tarde se traslad a una pequea fbrica local
durante la Primera Guerra Mundial.
Doerr manifiesta en el "Hanbuch der Mikrobiolgischen Technik" de Kraus y Uhlenjut que l haba
preparado medios en polvo en 1909 secndolos sobre un cristal. W.D. Frost en 1910 presenta en una
reunin de "Society of American Bacteriologists" muestras de sus medios deshidratados. La
aplicacin prctica de la deshidratacin de medios de cultivo fue iniciada y preparada por
Laboratorios Difco de USA en 1915, bajo la direccin del Dr. J.W. Bunker.
Existen actualmente muchas compaas que producen medios deshidratados, y tambin medios
listos para ser inoculados lo cual hace que la bacteriologa y la micologa hayan llegado a un grado
muy grande de desarrollo.
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COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Roberto Koch reconoci que no exista un medio de cultivo universal, el cual pudiera soportar el
crecimiento de todas las bacterias, por lo que empezaron a aparecer diferentes frmulas y
modificaciones de estas. En 1930 Levine y Schoenlein describieron 2543 medios publicados, no se
conoce el nmero actual de medios existentes.
La expansin de la microbiologa de la medicina a la agricultura, procesamiento de alimentos y
aplicaciones industriales ha sido responsable del incremento de los medios de cultivo. As como el
desarrollo de medios indicadores, diferenciales y selectivos, que contienen sustancias inhibitorias
tales como qumicos, antimicrobianos y colorantes, en diferentes concentraciones y combinaciones.
Sin embargo el laboratorio de Microbiologa Clnica no puede tener una amplia gama de medios, por
lo general tiene 10 a 20 medios de uso comn, y algunos medios especiales que son utilizados solo
cuando el mdico solicita alguna prueba especial, el aislamiento de determinados agentes por la
naturaleza de la enfermedad que tiene el paciente.
Un examen de los catlogos de los productores de medios de cultivo revelara muchas frmulas
diferentes de los medios. Ellos varan de unos pocos constituyentes a largas listas de componentes
cuya funcin en el medio podra no ser obvia. Es posible, sin embargo, identificar una estructura
comn en cada frmula y deducir la funcin de sus ingredientes. De esta manera los componentes
podran caer dentro de una o ms de las siguientes categoras:
1. Nutrientes aminados y nitrogenados: Relativamente pocos organismos pueden utilizar protenas
calentadas y desnaturalizadas como fuente aminada y nitrgenada porque necesitan depender de la
excrecin de enzimas proteolticas extracelulares. Por lo tanto, es necesario suplementar con
peptonas, protenas predigeridas por hidrolisis cida, extractos o infusiones acuosas de materiales
proteicos.
2. Factores de crecimiento: Una serie de diversos complejos, como sangre, suero, vitaminas, NAD,
a menudo sustancias termolbiles, esenciales para el crecimiento de microorganismos fastidiosos o
particularmente exigentes, los cuales no se presentan en medios no suplementados. Estos factores
no solo cumplen un rol nutricional, por ej. la sangre completa en medios de cultivo para el aislamiento
de Bordetella, Neisserria, Campylobacter y Legionella sino tambin actan como un agente protectivo
contra radicales txicos.
3. Fuente de Energa: Usualmente glucosa, lactosa o algn carbohidrato similar que puedan ser
fcilmente utilizadas con la intencin de suministrar una fuente fcilmente accesible de energa.
Existen medios sin carbohidratos, y en su lugar tienen peptonas o sustancias similares, como citrato,
como fuente de carbono y energa.
4. Sales tamponadas: por ej. Sales de fosfato, acetatos y citratos, que si bien pueden dar una fuente
de energa, sirven para mantener la estabilidad del pH si se produce fermentacin de los
carbohidratos. Debe notarse, sin embargo, que los tampones salinos comunes usados en los medios
de cultivo podran tambin quelar metales esenciales.
5. Sales minerales y Metales: como fosfatos, sulfatos, Ca+ +, Mg+ +, Fe+ + +, Mn+ + y trazas de metales
que pueden ser adicionadas en macro (mg/l) o micro (g/l) niveles para mejorar el crecimiento. Los
metales esenciales estn normalmente presentes como contaminantes en otros componentes del
medio, en adecuados niveles para el crecimiento microbiano. Los suplementos especficos a menudo
estn ausentes, a menos que sean para superar los efectos quelantes de componentes competidores
en el medio. Una comn razn para el uso de estos aditivos es el mejoramiento e identificacin de
una reaccin bioqumica particular. En estas circunstancias ellas actan como sustancias indicadoras,
por ej. Fe+ + y sulfitos.
6. Agentes selectivos: que pueden ser agentes qumicos, antibiticos, colorantes inhibidores, etc.
Una amplia variedad de sustancias inhibidoras han sido usadas en los medios de cultivo. Los agentes
qumicos tradicionales son menos precisos que los antibiticos y colorantes, sin embargo, se debe
tener en cuenta que en un medio selectivo no todos los organismos no deseados podran ser
inhibidos, ni todos los organismos deseados podran crecer. La selectividad de qumicos y colorantes
es afectada por la cantidad y tipo de sustancias nutrientes presentes que pueden disminuir o mejorar
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la selectividad.
7. Colorantes indicadores: como el Rojo de fenol, rojo neutro, prpura de bromocresol. Estos
colorantes son adicionados para indicar cambios en el pH del medio, durante y despus del
crecimiento de microorganismos, particularmente cuando se ha aadido azucares a la frmula. Estos
colorantes pueden ser txicos para algunos organismos de manera que la cantidad presente es
crtica y se debe realizar un adecuado control de calidad con organismos conocidos.
8. Agentes gelificantes: El agar es el agente gelificante predominante usado debido a sus ventajas
naturales. No es, sin embargo, un agente inerte; es un extracto de algas y contribuye con metales,
minerales, sulfato, piruvato, etc., as como ejercer un efecto significante sobre la unin con el agua.
Tambin se puede utilizar gelatina o alginato.
Cuando los constituyentes individuales de los medios son colocados en una o ms de las categoras
arriba mencionadas, la explicacin de la frmula puede ser advertida.
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CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo pueden ser clasificados en:

1. Por su estado fsico en:
Slidos cuando contiene entre 1,2 a 1,5% de agar
Semislidos, que tienen entre 0,3 a 0,8% de agar
Lquidos, llamados caldos, cuya concentracin de agar es 0 a 0,1%
2. De acuerdo a su aplicacin en:
Medios comunes o simples: que permiten el desarrollo de la mayora de las bacterias sobre todo
las no exigentes, como el caldo peptonado, el caldo nutritivo o el agar nutritivo.
Medios especiales: que se forman a partir de un medio simple y se les aade diversas sustancias
de acuerdo a la finalidad deseada:
Medios de enriquecimiento: permiten el crecimiento de un mayor nmero de bacterias, se
utiliza cuando el inculo o muestra tiene un nmero reducido de ellas, ej. caldo tripticasa
soya, caldo selenito, medio de hemocultivo.
Medios enriquecidos: cuando se les adiciona sustancias de mayor contenidos nutritivo como
sangre de carnero, sangre de conejo, sangre de caballo, huevo, extracto de levadura, etc.,
permitiendo cultivar bacterias que son exigentes en sus necesidades nutricionales, Ejs.: Agar
sangre de carnero para el desarrollo de Streptococcus; Medio de Ogawa para el aislamiento
de Mycobacterium tuberculosis; Agar chocolate para el crecimiento de Neisseria.
Medios selectivos: tienen la finalidad de favorecer el desarrollo de un tipo de bacterias y al
mismo tiempo inhibir el crecimiento de otras. Para esto se les aade al medio de cultivo
sustancias llamadas inhibidores, como pueden ser las sales biliares, colorantes, sustancias
qumicas e inclusive antibiticos. Ejemplos con el agar SS para el aislamiento de Salmonella
y Shigella, Agar TCBS para el cultivo de Vibrio cholerae, y el agar Mac Conkey donde solo
crecen enterobacterias.
Medios diferenciales: son los que permiten identificar y/o clasificar a las bacterias,
observando la actividad del microorganismo frente a uno o ms substratos y observando su
actividad viendo el crecimiento, o el cambio de un indicador de pH. Ejemplos son el agar
Triple Sugar Iron (TSI), el Lysine Iron agar (LIA) y el agar Citrato de Simmons, que se utilizan
en la identificacin de enterobacterias.
Medio de Transporte: se utiliza para trasladar las muestras desde el sitio de obtencin de la
muestra hasta el laboratorio para ser procesado. Ejemplos: Medio de Amies con Carbn y el
medio de Cary y Blair.
En muchas veces, se combinan las caractersticas de cada uno de estos tipos de medios y tener uno
que puede ser, por ejemplo, enriquecido y selectivo a la vez como el Medio de Thayer Martin, que es
un agar chocolate al cual se aadido un suplemento de antibiticos que permite aislar Neisseria
gonorrhoeae y evitar la flora bacteriana acompaante.
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PREPARACIN DE MEDIOS
1. Los pasos generales

Corrientemente para la preparacin de un medio de cultivo se siguen los siguientes pasos:
Pesado del medio en polvo.
Rehidratacin con agua destilada.
Disolucin completa (con ayuda del calor en el caso de que se trate de un medio que
contenga agar).
Distribucin en frascos o tubos (si es necesario, dependiendo del tipo de medio).
Esterilizacin, que puede ser en la autoclave a 121C, a 15 libras de presin y por 15 minutos
o por filtracin. Algunos medios que son sensibles al calor pueden ser solo calentados y
luego distribuidos en placas (plaquo).
Enfriar a 50 55 C.
Adicionar suplementos de enriquecimiento (sangre, plasma u otros) o suplementos selectivos
(antibiticos, sustancias qumicas).
Plaquo o distribucin en tubos.
Estos pasos varan dependiendo del tipo de medio, por lo que siempre se debe seguir las
indicaciones que se encuentran en la etiqueta del frasco o en los manuales de los fabricantes y los de
preparacin de medios.
2. Los medios deshidratados
Los medios deshidratados son higroscpicos y sensibles a la humedad, el calor y la luz. Se deterioran
con los cambios bruscos de temperatura. Las condiciones de conservacin se pueden encontrar en la
etiqueta del producto. Se deben seguir las siguientes indicaciones:
Escribir en la etiqueta el nmero de orden de acuerdo a una base de datos o registro donde
se coloquen las caractersticas del frasco.
Escribir en la etiqueta la fecha de recepcin en el laboratorio.
Conservar como se indica en la etiqueta, usualmente por debajo de 25C, en un lugar seco,
al abrigo de la luz solar, autoclaves, hornos u otra fuente de calor. Cuando se indique guardar
de 2 a 8C.
Comprobar la fecha de vencimiento en la etiqueta, no se debe utilizar frascos vencidos.
Utilizar ordenadamente cada lote. No se debe abrir un nuevo envase hasta que el anterior
este vaco.
Despus de utilizar un frasco, asegurar que el envase est bien cerrado y devolverlo a su
lugar de almacenamiento.
Solicitar el medio en envase de tamao adecuado de acuerdo a las necesidades normales del
laboratorio. Un medio en un recipiente grande que se abre y cierra repetidas veces se
deteriora.
Por lo general, los medios granulados son ms resistentes a la humedad que los medios en
polvo.
Si solo se dispone de un envase grande (500 g), es conveniente en algunos casos trasvasar
a un envase pequeo (de aproximadamente 100 mL), que tenga tapa hermtica, como en el
caso de agar XLD o el caldo selenito, los cuales con las condiciones de humedad que hay en
algunas ciudades como Lima y las cantidades que se utilizan, pueden deteriorarse
rpidamente. La mayor parte de manuales de medios de cultivo indican que no se debe
subdividir los frascos pues se puede producir alteraciones por efecto del ambiente, por lo que
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se debe considerar hacerlo solo en casos muy especiales.

Desechar un medio si el polvo no se mueve libremente, si ha cambiado de color o si el
aspecto del medio rehidratado es anormal.
3. Preparacin de los medios de cultivo
Pesado de los ingredientes
El material de vidrio debe estar completamente limpio y libre de sustancias detergentes.
El matraz a utilizarse debe tener un volumen superior a la cantidad de medio a prepararse, es
decir si vamos a preparar 150 mL de medio de cultivo, el recipiente debe ser por lo menos de
250 mL. No debe llenarse el frasco debido a que al momento de esterilizar, el agua hierve y
puede derramarse o ser absorbida por el tapn de algodn.
Para preparar el medio de cultivo a partir de sus ingredientes, estos se debern pesar
exactamente uno a uno y colocarlos en el baln.
Para preparar utilizando un medio comercial deshidratado, se debe leer cuidadosamente las
instrucciones del fabricante y tomar exactamente la cantidad indicada, teniendo cuidado de
cerrar hermticamente el frasco inmediatamente despus de haberlo utilizado.
Agregar el volumen de agua destilada o desmineralizada necesaria, preferentemente en dos
partes, primero la mitad del volumen y se agita suficientemente para conseguir una
suspensin homognea. Despus se incorpora la cantidad restante, aprovechando de esta
para desprender las partculas de medio de cultivo que pudieran quedarse adheridas a la
pared interna o en la boca del recipiente .
Foto 1. Se observa un matraz que contiene una cantidad de medio que es la mitad del
volumen del frasco, como todava no se ha calentado se puede observar la presencia de
partculas de agar en la pared del frasco
Disolucin
Si el medio contiene agar o gelatina, es necesario disolverlo con ayuda del calor. Este
calentamiento se puede realizar en un bao Mara, en un mechero con ayuda de una rejilla o
utilizando un horno microondas, hasta que se alcance su completa disolucin, esto se
reconoce cuando al agitar no se adhiere ninguna partcula de agar a la pared interna del
recipiente. No debe olvidarse que todos los medios de cultivo son sensibles al calentamiento,
por este motivo no debe calentarse ms de lo estrictamente necesario. Los medios de cultivo
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que no contienen agar o gelatina son solubles en agua fra.

Es necesario que el medio de cultivo se encuentre al pH indicado. Con los medios
comerciales y utilizando agua destilada neutra no es necesario su medicin, pero cuando se
prepara por componentes es necesario realizarla, para lo cual se utiliza un potencimetro o
papel indicador de pH que tenga un rango til de 4,0 a 10,0. El valor de pH se ajusta a los
intervalos previstos con la adicin de gotas de cido clorhdrico 1N o hidrxido de sodio 1N.
Preparacin de medios en tubos
Si se utilizan medios semislidos, estos deben ser distribuidos en los tubos que se van a
utilizar antes de esterilizarlos, despus de ella dejarlo enfriar en posicin vertical.
Cuando se quieren colocar medios slidos en tubos igualmente se les debe distribuir en sus
envases finales y luego de autoclavar dejarlos enfriar en posicin inclinada o semi inclinada.
Esterilizacin
Antes de la esterilizacin es conveniente repartir el medio de cultivo en porciones pequeas,
de ser posible en los recipientes definitivos en los que posteriormente se llevara a cabo el
trabajo (a excepcin de las placas Petri).
Si las instrucciones del fabricante no indican otra cosa, la esterilizacin se lleva a cabo en la
autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Vertido en placas o plaquo
Antes de verter el medio de cultivo en las placas Petri es necesario que el medio se
encuentre a una temperatura de 45 a 55C para evitar que se formen gotas de agua de
condensacin en la tapa de las placas. En la prctica a esta temperatura es posible sostener
el frasco con el medio con la mano desnuda sin quemarse.
Se puede aadir los suplementos nutricionales o selectivos que deben estar a temperatura
ambiente, mezclar bien el medio.
Se agita el recipiente que contiene el medio de cultivo en forma circular para asegurar que
halla una mezcla uniforme y flameando previamente la boca del recipiente se agregar el
medio de cultivo a las placas Petri que se encuentran cerca del mechero, aproximadamente
16 a 18 mL a cada una.
Si se forma burbujas de aire en la superficie del medio, estas se pueden eliminar flameando
rpidamente la superficie con la llama del mechero de Bunsen.
Se debe dejar que se enfre el medio de las placas a temperatura ambiente. Si la superficie
del medio quedara hmeda, puede colocarse las placas en estufa a 37C, dejando las tapas
ligeramente abiertas y con el lado que contiene el medio hacia arriba por 30 minutos.
Luego que el medio este listo, puede colocarse en la refrigeradora si no se va a usar de
inmediato. Una placa de cada lote preparado deber colocarse en la estufa a 37C para
verificar su esterilidad.
Guardar las placas en posicin invertida en el refrigerador hasta el momento de usar.
Precauciones
Se debe evitar volver a disolver los medios o dejarlos ms de 3 horas en bao Mara (50C),
sobre si el medio tiene pH cido, lo que produce una hidrlisis del agar y no se gelifica.
En el caso del agar chocolate se debe volver a calentar el medio a 80C y dejarlo por 10 a 30
minutos, hasta que el medio adquiere el color chocolate. Una temperatura ms elevada
deteriora el medio. Luego se deja enfriar a 55C para plaquear.
4. Conservacin de medios preparados.
La vida de los medios preparados vara considerablemente. Algunos medios en envases
hermticos pueden durar hasta 6 meses a baja temperatura.
Se debe tener en cuenta de que los colorantes y algunas sustancias inhibitorias son sensibles
a la luz y el calor por lo que es importante conservar todos los medios preparados fuera de la
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luz. NO se deben congelar los medios. Los medios recin preparados son superiores los
conservados.
Se deben examinar los medios preparados antes de ser inoculados. Observar si hay
presencia de contaminacin, cambios en el color, hemlisis o signos de deshidratacin como
retracciones, fisuras o cambios de volumen. Desechar cualquier placa o tubo defectuoso.
No se debe incubar las placas toda la noche como prueba de esterilidad, es conveniente
secar las placas en la incubadora por 10 a 30 minutos antes de inocular, esto es importante
sobre todo cuando se inoculan muestras de heces, en los cuales la presencia de Proteus
puede dar un crecimiento en velo que impide realizar el diagnstico de enteropatgenos.
Algunas bacterias son sensibles al cambio de temperatura, por lo que una preincubacin es
importante para tener los medios a una temperatura adecuada.
Foto 2: Conservacin de medios diferenciales en tubos de vidrio con tapn de jebe
5. Rendimiento del medio de cultivo en diferentes envases

Cantidad de medio preparado
100 mL 250 mL 500 mL 1L
Tubos con 2 mL 50 125 250 500
Tubos con 2.5 mL 40 100 200 400
Tubos con 3 mL 33 82 165 330
Tubos con 4 mL 25 62 125 250
Tubos con 5 mL 20 50 100 200
Placas 100 x 15 5-6 12-15 25 - 30 50-60
Placas medio Mueller Hinton 4-5 10-12 24 48-50
100 x 15
En el caso de las placas, si obtenemos un nmero mayor del especificado, indica que el medio que
hemos preparado esta muy delgado y no le estaremos ofreciendo a la bacteria los nutrientes
suficientes para su desarrollo o si es un nmero menor indicara que el medio es muy grueso y
estamos desperdiciando material. Esto es crtico sobre todo en el agar Mueller Hinton que se utiliza
para los antibiogramas debido a que la norma indica que debe tener una profundidad de 4 mm.
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CRITERIOS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS
Como cualquier reactivo o procedimiento de laboratorio, los medios de cultivo deben pasar controles
de calidad para asegurar que en la preparacin o conservacin de los medios se han seguido los
pasos necesarios para que el producto no sea alterado y evitar resultados que pueden conducirnos
hacia un diagnstico errado.
Para eso se debe utilizar medios de casas comerciales que cumplan normas de calidad, buenas
prcticas de manufactura y una adecuada distribucin que garantice sus productos.
En el laboratorio se debe contar con un programa de control de calidad que es parte del sistema de
aseguramiento de la calidad del laboratorio.
1. Control de calidad de los medios preparados
El laboratorio de microbiologa deber realizar el control de calidad para comprobar si las
caractersticas del medio estn dentro de la especificacin y si la metodologa de preparacin del
medio resulta satisfactoria. Cada lote de medio debera someterse a un programa mnimo de
ensayo que asegure su aceptacin:
pH: Comprobar el pH del medio preparado al final cuando este alcance la temperatura
ambiente (25C), que debe coincidir con lo sealado en la etiqueta.
Esterilidad: Se toma una muestra representativa de cada lote, que es incubado de 2 a 5 das.
Despus de la incubacin no debe haber desarrollo microbiano. Las muestras deben ser
descartadas.
Capacidad de crecimiento y presencia de reacciones tpicas: sembrar el medio con cepas
conocidas o cepas de referencia como las ATCC.
Estabilidad: el medio preparado debe mantener por un tiempo razonable (dependiendo del
tipo de medio) sus caractersticas siempre que se guarde de una manera apropiada.
Si el medio no rene las condiciones deseadas, se debe anotar la naturaleza del problema, el
mtodo de preparacin, el nmero de lote y la fecha de recepcin y comunicarse con el
departamento de Servicio Tcnico del proveedor.
2. Control de calidad de la conservacin de medios preparados
Los medios preparados deben descartarse cuando se observen cualquiera de estas
caractersticas. Es importante investigar porque se han producido pues en algunos casos se
puede remediar en la preparacin de los siguientes lotes.
Rajadura de las placas: se han colocado demasiadas placas una encima de otra o se ha
ejercido un aumento de peso sobre ellas.
Rajadura en la superficie del medio: medio se ha conservado demasiado tiempo o ha estado
en algn lugar con una temperatura alta.
Variaciones en el volumen del medio: el medio se ha secado.
Hemlisis: tiempo de conservacin muy prolongado.
Cristales en el medio.
Presencia de burbujas: contaminacin.
Presencia de cogulos de agar: temperatura de plaqueo muy baja.
Cambio de color normal.
Contaminacin.
Falla en la inhibicin de microorganismos saprofitos.
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3. Fallas y causas en la preparacin de medios de cultivo:

Valor de pH incorrecto:
o Medir el pH por encima de los 25C.
o Sobrecalentamiento en la esterilizacin, vuelta a fundir o calentamiento prolongado a
50C.
o Solucin incompleta del medio.
o Mala calidad del agua.
o Recipiente mal lavado o con residuos qumicos.
o Mala conservacin del medio deshidratado o vencido.
Turbidez o precipitacin:
o Mala calidad del agua.
o Sobrecalentamiento.
o pH incorrecto.
o Solucin incompleta.
Oscurecimiento:
o Solucin incompleta.
o Alteracin del pH.
Foto 3. Se observa dos tubos de agar lisina hierro de diferentes marcas, una de ellas es de
color violeta mientras que el otro presenta un color rojizo que dificulta la observacin de las
reacciones bioqumicas.
Gel blando:
o Bajo porcentaje de agar en el medio.
o Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos.
o Mala homogenizacin del medio.
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o Exceso de agua.
Crecimiento bacteriano pobre:
o Exceso de calentamiento.
o Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente.
o Alteracin en el pH.
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DESCRIPCION DE LOS
MEDIOS DE CULTIVO
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AGAR AZUL DE BROMOTIMOL LACTOSA CISTINA

(BROLACIN O CLED)
Aplicacin
Es un medio con lactosa y cistina, deficiente en electrolitos. Se utiliza para el aislamiento,
identificacin presuntiva y recuento del nmero de bacterias en orina; favorece el crecimiento de
todos los MO existentes en orina y proporciona una buena diferenciacin morfolgica de las distintas
colonias.
Frmula (en gramos por litro)
Extracto de carne 2g Peptona 7g
L-cistina 0,128 g Extracto de levadura 2g
Lactosa 10 g Azul de bromotimol 0,03 g
Agar 12 g
pH final = 7.3 aprox. a 25 C
Preparacin
1. Se suspenden 33g en un litro de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio
completamente.
2. Se esteriliza en la autoclave a 121C durante 15 minutos. Se mezcla bien antes de verter en
placas.
3. Las placas con medio son de color azul verdoso y claras.
4. Marcar las placas con BR o CLED
Fundamento
El medio favorece el crecimiento de las bacterias existentes en orina por no contener sustancias
inhibidoras y por los nutrientes que contiene. La lactosa permite diferenciar organismos
fermentadores de lactosa, que al degradarla viran el indicador de azul verdoso a amarillo; las lactosa
negativas alcalinizan el medio produciendo un viraje a verde o azul intenso. La deficiencia de
electrolitos del medio evita el crecimiento en velo o "swarming" de especies de Proteus. El
crecimiento de Streptococcus se puede visualizar si se aade suero o plasma al medio.
Interpretacin:
Se realiza a las 18 a 24 h. de incubacin a 37 C. teniendo en cuenta que las bacterias lactosa
positivas dan colonias amarillas y las lactosa negativas son azules; los estreptococos y
Staphylococcus dan colonias amarillas pequeas.
Control de calidad
Cepas de Ensayo % de recuperacin Viraje
Escherichia coli >70% Amarillo
Proteus mirabilis >40% Azul
Pseudomonas aeruginosa >70% Azul
Staphylococcus aureus >70% Amarillo
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AGAR ALMIDON
Aplicacin
El agar almidn es utilizado para cultivos de organismos que se analizan para determinacin de
hidrlisis del almidn para su identificacin o para estudios comparativos.
Extracto de carne 3g Almidn soluble 10 g
Agar 12 g
pH final: 7.5
Preparacin
1. Se suspenden 25 gramos en un litro de agua destilada
2. Calentar hasta ebullicin para disolver completamente.
3. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121C.
4. Repartir en placas Petri 100 x 15.
5. El color del medio preparado es mbar claro ligeramente opalescente.
6. Marcar las placas como ALM
Interpretacin:
Se realiza a las 18 a 48 horas y se le aade una solucin de Lugol al medio, las bacterias que
hidrolizan el almidn presentarn un halo claro alrededor de la colonia.
Control de calidad
Cepas de ensayo Hidrlisis Recuperacin
Bacillus subtilis + Buena
Escherichia coli - Buena
Staphylococcus aureus - Buena
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AGAR BILIS ESCULINA
Aplicacin Es un medio diferencial para aislamiento e identificacin presuntiva de Streptococcus del

grupo D.
Extracto de carne 3g Peptona 5g
Bilis de buey 40 g Esculina 1g
Citrato Frrico 0,5 g Agar 15 g
pH final = 6.6 aprox.
Preparacin
1. Disolver 64,5 g en 1 L de agua destilada.
2. Calentar hasta disolver completamente.
3. Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min. a 15 lb de presin.
4. Vertir en placas o tubos inclinados segn se desee.
5. El medio preparado es mbar medio oscuro a oscuro, ligeramente opalescente, el medio con
esculina tiene un tinte azulado.
6. Marcar los tubos o placas con BE
Fundamento
Los estreptococos del Grupo D pueden crecer sobre agar con bilis e hidrolizar la esculina,
impartiendo al medio un color marrn oscuro dado por el citrato frrico. Las bacterias Gram positivas
diferentes a los Streptococos grupo D son inhibidos por las sales biliares. Algunos Streptococos de
otros grupos pueden crecer sobre el medio con bilis pero no hidrolizan la esculina por lo que no
jmparten color al medio.
Interpretacin:
Se incuba de 18 a 24 h. A 35-37C.
Pueden crecer bien en el medio Streptococcus del grupo D y bacilos gramnegativos. Estreptococos
del grupo D y que hidrolizan la esculina dan al medio alrededor de las colonias un tinte marrn
oscuro.
Control de calidad
Cepas de Ensayo Crecimiento Hidrlisis Esculina
Proteus mirabilis Bueno -
Streptococcus bovis Bueno +
Enterococcus faecalis Bueno +
Enterococcus faecium Bueno +
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AGAR CARBON DE JONES KENDRICK
Aplicacin
Es un medio selectivo para el aislamiento de Bordetella pertussis a partir de muestras clnicas como
hisopado nasofaringeo. Es util para el trabajo en el campo con pacientes sospechosos de pertussis y
en los cuales se obtiene la muestra, se cultivo y es enviada al laboratorio para su procesamiento.
Almidn solubre 10 g Extracto de levadura 3,5 g
Caldo infusin de corazn 25 g Agar 20 g
Carbn 4g
Suplemento antibitico
Cefalexina 40 mg
Preparacin
1. Se disuelven los ingredientes excepto el carbn en un litro de agua destilada.
2. Mezclar bien y calentar agitando frecuentemente, hasta que hierva un minuto para disolver
completamente los ingredientes.
3. Agregar el carbn, mezclar bien y autoclavar a 121 C por 15 minutos
4. Enfriar hasta 50 a 60 C, agregar en forma asptica el antibitico y agitar para obtener una
mezcla uniforme del agar y el carbn.
5. Dispensar 20 mL en placas Petri o 10 mL en frascos de 50 mL tipo penicilina.
6. Inclinar los frascos para dar la superficie de diseminacin mas amplia posible, sin que se extienda
hasta el cuello de la botella.
7. Controlar la esterilidad durante 24 h. a 37 C
8. Sellar las placas (gutapercha) antes de almacenarlas en refrigeracin o colocar tapones de jebe
en los frascos.
9. La viabilidad de los medios en estas condiciones es de 2 a 3 meses.
10. Marcar los frascos o placas con ACJK.
11. Tambin se puede mantener el medio estril en frascos con tapa rosca y aadir el suplemento
antibitico cuando se necesita el medio.
Fundamento
El medio de ACJK permite el aislamiento de B. pertussis, el uso de carbn evita el uso de sangre
permitiendo un medio con un mayor tiempo de vida. La cefalexina es superior a la penicilina y otros
antibiticos para inhibir la flora acompaante.
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AGAR CHOCOLATE
Aplicacin
Para el aislamiento de microorganismos exigentes. Es efectivo para el aislamiento de Neisseria y con
adicionamiento de ciertos suplementos (por ej. Suplemento B ver Medio de Thayer-Martin y/o agar
Columbia) para el crecimiento de Haemophilus influenzae.
Frmula
Se utiliza como base cualquier agar nutritivo sin inhibidores: por ej. Agar tripticasa soya, Agar
Columbia base, Medio GC base, Agar Brucella, etc. al cual se le adiciona 5% de sangre desfibrinada
estril.
Preparacin
1. Disolver y esterilizar el medio base segn sea el caso.
2. Enfriar hasta 50 a 60C y agregar 5-10% de sangre desfibrinada estril de carnero.
3. Colocar en un bao Mara a 75 a 80C y mantener a esta temperatura por 10 a 20 minutos
agitando constantemente.
4. El medio va a cambiar a un tono pardo (chocolate).
5. Enfriar hasta 50C.
6. Repartir en placas o tubos segn se desee.
7. Marcar los tubos o placas con CHOC
Fundamento
El medio base no tiene inhibidores por lo que permite el crecimiento de cualquier microorganismo.
Para lograr el crecimiento de microorganismos que necesitan factor X (hematina) y factor V (NAD) se
hace hemolizar a los eritrocitos por accin del calor, para que se libere estos factores al medio. La
adicin de suplementos o aditivos enriquecen ms an el medio, de acuerdo al fin buscado.
Opcionalmente, la adicin de suplementos antibiticos inhibe la flora acompaante no deseada. La
temperatura del bao Mara no debe exceder los 80 C porque sino el agar pierde los factores
nutricionales.
Control de calidad
Cepa de ensayo Recuperacin del agente
Neisseria gonorrhoeae Buena
Neisseria meningitidis Buena
Haemophilus influenzae Buena
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AGAR CITRATO DE SIMMONS
Aplicacin
Para la diferenciacin e identificacin de Enterobacteriaceas sobre las bases de utilizacin del Citrato
como nica fuente de Carbono.
Sulfato de magnesio 0,2 g Fosfato amnico de sodio 0,8 g
Fosfato de amonio dihidrato 0,2 g Citrato de sodio, tribsico 2g
Cloruro de sodio 5g Azul de Bromotimol 0,08 g
Agar 15 g
pH final: 6.8
Preparacin
1. Se suspende 23 g en 1 L de agua destilada
2. Hervir hasta disolver el medio por completo.
3. Distribuir 2.5 mL en tubos de 12 x 75 con tapn de algodn.
4. Esterilizar en la autoclave a 121C durante 15 minutos y 15 lb de presin.
5. Dejar enfriar los tubos en forma inclinada de tal manera que se obtenga un buen plano inclinado y
poco fondo.
6. Cambiar los tapones de algodn por tapones de jebe.
7. El medio preparado es verde.
8. Marcar los tubos con CIT
Fundamento
Organismos que son capaces de utilizar el citrato (como nica fuente carbonada) pueden crecer en
este medio. La degradacin del Citrato da lugar a la alcalinizacin del medio de cultivo el medio, el
cual vira a un color azul oscuro por el indicador Azul de Bromotimol.
Control de calidad
Cepas de ensayo Color del medio Recuperacin
Enterobacter aerogenes Azul Bueno
Escherichia coli Verde Crecimiento Inhibido
Shigella flexneri Verde Crecimiento Inhibido
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AGAR DNAsa
Aplicacin
Se utiliza para la demostracin de desoxirribonucleasa (DNasa) formada por microorganismos.
Triptosa 20 g Cloruro de sodio 5g
Acido desoxirribonucleco (DNA) 2g Agar 15 g
pH final: 7.3
Preparacin
1. Se suspenden 42 g en 1 L de agua destilada.
2. Hervir hasta disolver completamente el medio.
3. Esterilizar en autoclave por 15 min. a 121 C.
4. Repartir en placas.
5. Las placas con medio son ligeramente opalescentes.
6. Marcar las placas con DNA
Fundamento
Las colonias formadoras de DNasa hidrolizan a su alrededor el ADN contenido en el medio de cultivo
hasta una mezcla de mono y polinucletidos. Luego de la incubacin se acidifica el medio con HCl
1N, el que reacciona con el DNA, formndose un precipitado turbio, las colonias DNasa positivas
presentan un halo claro alrededor, debido a que en dichas zonas ya no existe DNA pues ha sido
degradado.
Control de calidad
Cepas de ensayo DNasa
Staphylococcus aureus Positivo
Staphylococcus epidermidis Negativo
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AGAR EMB (EOSINA, AZUL DE METILENO)
Aplicacin
Para deteccin y aislamiento de Enterobacterias.
Peptona 10 g Lactosa 5g
Sacarosa 5g Fosfato dipotsico 2g
Eosina Y 0.4 g Azul de Metileno 0,065 g
Agar 13,5 g
Preparacin
1. Suspender 39 g en 1 L de agua destilada y calentar hasta disolver completamente.
2. Esterilizar en autoclave por 15 a 121 C y 15 lb de presin.
3. Luego agitar suavemente para oxidar el azul de metileno (reducido por la esterilizacin), despus
verter a placas.
4. El color final del medio es prpura.
Fundamento
Los colorantes eosina Y y el azul de Metileno actan como inhibidores de la microorganismos Gram
positivos y como indicadores para diferenciar las bacterias fermentadoras de las no fermentadoras de
lactosa. La sacarosa sirve para detectar ciertos miembros del grupo coliforme que la fermenten ms
fcilmente que la lactosa. As, las bacterias que fermenten la lactosa y/o sacarosa precipitarn los
colorantes en su entorno por lo que las colonias se apreciarn negro-verdosos con brillo metlico, las
que no fermenten la sacarosa ni la lactosa no precipitarn los colorantes por lo que se apreciarn
transparentes e incoloras.
Interpretacin:
Las placas se siembran por estra y se incuban 24 h. a 37C.
Colonias Microorganismos
Transparentes, de color mbar. Salmonella, Shigella, patgenos intestinales no
fermentadores de lactosa ni sacarosa.
Verdosas con brillo metlico a la luz reflejada, 2 Escherichia coli.
a 3 mm de dimetro, centro negroazulado a la
luz transmitida.
Ms grandes que las de E. coli, mucosas, Enterobacter, Klebsiella y otros.
confluentes, con el centro pardo-grisceo a la luz
transmitida.
Control de calidad
Cepas de ensayo Crecimiento Color de colonias Brillo metlico
Escherichia coli Bueno Violeta +
Klebsiella pneumoniae Bueno Rosa, centro oscuro -
Salmonella typhimurium Bueno Incoloro, transparente -
Bacillus cereus Nulo/Ligero Incoloro -
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AGAR LISINA HIERRO (LIA)
Aplicacin
Este medio, basado en la decarboxilacin y desaminacin oxidativa de la lisina, la fermentacin de la
glucosa y la formacin de sulfuros, se usa para diferenciar las especies de Salmonella y Shigella de
especies de Citrobacter.
Peptona de gelatina 5g Extracto de levadura 3g
Glucosa 1g Lisina 10 g
Citrato de hierro y amonio 0,5 g Tiosulfato de sodio 0,04 g
Prpura de bromocresol 0,02 g Agar 13 g
pH final: 6.7 0.2
Instrucciones
1. Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15
minutos.
2. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolucin
completa.
3. Distribuir 2,5 ml en tubos de 13 x 100 con tapa rosca.
4. Esterilizar a 121C durante 15 minutos con las tapas parcialmente abiertas.
5. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la puncin.
6. Marcar los tubos con LIA
Fundamento
La lisina presente en el medio es decarboxilada a cadaverina y dixido de carbono; en el proceso
interviene la lisina decarboxilasa y el medio aumenta de pH haciendo virar el indicador hacia el
prpura, en la totalidad del tubo. En aquellas cepas en que el proceso es de desaminacin (Proteus,
Providencia, Morganella spp.) se produce un color rojo sobre el pico de flauta, por el uso de las
peptonas. Los organismos que no decarboxilan la lisina, producen una zona alcalina en la zona
inclinada y una zona cida en el fondo del tubo. El hidrgeno sulfurado producido ennegrece el
medio.
Siembra Por puncin profunda con aguja de inoculacin.
Incubacin 24 horas a 35C.
Control de calidad
Bacteria Reaccin Indol
Shigella flexneri K/A -
Salmonella paratyphi B K/K -
Proteus mirabilis R/A -
Escherichia coli K/K +
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AGAR MAC CONKEY
Aplicacin
Para aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos y diferenciacin entre enterobacterias
fermentadoras y no fermentadoras de la lactosa. Se usa tambin para el recuento de coliformes y
para aislamiento de bacterias patgenas en agua, aguas residuales, productos alimenticios, etc.
Peptona 17 g Proteosa peptona 3g
Lactosa 10 g Sales Biliares 1,5 g
Cloruro de Sodio 5g Rojo Neutro 0,03 g
Cristal Violeta 0,001 g Agar 13,5 g
pH final = 7.1
Preparacin
1. Se suspende 50 g en 1 L de agua destilada.
2. Se hierve hasta disolver por completo.
3. Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 minutos y 15 lb de presin.
4. Se deja enfriar hasta 50 a 55 C y se distribuye en placas.
5. La superficie de las placas debe estar seca antes de sembrar.
6. El medio preparado es claro y de color rojo parduzco.
7. Marcar los tubos o placas con MC
Fundamento
Las colonias que fermentan la lactosa producen una acidificacin del medio, lo cual hace que el
indicador Rojo Neutro acte impartiendo un color rojo a la colonia. Las que no fermentan la lactosa
no varan de color y por lo tanto las colonias se apreciarn incoloras. Las sales biliares y el cristal
violeta inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas.
Control de calidad
Cepas de ensayo Color de colonias Recuperacin
Escherichia coli ATCC 25922 Rojo Buena
Shigella sonnei Incoloras Buena
Staphylococcus aureus ATCC Nula
25923
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AGAR MAC CONKEY SORBITOL
Aplicacin
Para el aislamiento selectivo de Escherichia coli O157 que tiene la propiedad de ser sorbitol negativo
mientras que E. coli de otros serotipos son sorbitol positivo. La nica diferencia con el agar de Mac
Conkey es la presencia del sorbitol en lugar de lactosa y se le puede aadir Cefixime y telurito de
potasio para hacer al medio ms inhibidor
Peptona 17 g Proteosa peptona 3g
Sorbitol 10 g Sales Biliares 1,5 g
Cloruro de Sodio 5g Rojo Neutro 0.03 g
Cristal Violeta 0,001 g Agar 13,5 g
pH final = 7.1
Preparacin
1. Se suspende 50 g en 1 L de agua destilada.
2. Se hierve hasta disolver por completo.
3. Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 minutos y 15 lb de presin.
4. Se deja enfriar hasta 50 a 55 C y se distribuye en placas.
5. Si se quiere utilizar para identificacin, distribuir 2 mL en tubos 13 x 100 o 12 x 75, luego
esterilizar, dejar enfriar en posicin inclinada y cambiar el tapon de algodn por uno de jebe.
6. Guardar las placas o tubos en refrigeracin, no conservar a temperatura ambiente pues se
deteriora el medio rapidamente.
7. La superficie de las placas debe estar seca antes de sembrar.
8. El medio preparado es claro y de color rojo parduzco.
9. Marcar los tubos o placas con MCS
Fundamento
Las colonias que fermentan el sorbitol producen una acidificacin del medio, lo cual hace que el
indicador Rojo Neutro acte impartiendo un color rojo a la colonia. Las que no fermentan el sorbitol no
varan de color y por lo tanto las colonias se apreciarn incoloras. Se utiliza para diferencia
Enterobacter cloacae de Enterobacter zakazakii.
Control de calidad
Escherichia coli ATCC 25922 Rojo Buena
Escherichia coli O157 Incoloras Buena
Proteus mirabilis ATCC 12453 Rojo Buena
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AGAR MANITOL SALADO
Aplicacin
Es un medio selectivo recomendado por Chapman para el aislamiento de estafilococos
presuntamente patgenos a partir de alimentos y muestras clnicas. En muchos laboratorios es
llamado tambien como Medio Hipertnico o Agar manitol sal rojo de fenol.
Extracto de carne 1g Peptona 10 g
d-Manitol 10 g Cloruro de sodio 75 g
Agar 15 g Rojo de fenol 0,025 g
pH final: 7.4 0.2
Preparacin
1. Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada.
2. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos.
3. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.
4. Distribuir en placas o en tubos anchos (18 x 150 o mayores)
5. Marcar como MS.
Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los estafilococos
coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una
zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una
zona roja o prpura. Las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de cloruro de
sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.
Control de calidad
Staphylococcus aureus A marilla Excelente
Staphylococcus epidermidis Roja Escaso - Bueno
Escherichia coli - No crece
Vibrio parahaemolyticus Amarilla Excelente
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AGAR NUTRITIVO
Aplicacin
El agar nutritivo es un agar de composicin muy simple, se utiliza para el crecimiento de bacterias
que no son exigentes en sus requerimientos nutritivos; se le puede utilizar como base para el agar
sangre. Se ha utilizado tambin para el estudio de aguas y productos lacteos, y para el aislamiento
primario y como base para otros medios.
Extracto de carne 1g Extracto de levadura 2g
Peptona 5g Cloruro de sodio 5g
Agar 15 g
Preparacin
1 Se suspenden 28 gramos en 1 litro de agua destilada.
2 Se hierve hasta disolver el medio por completo.
3 Se distribuye en tubos de 13 x 100 Se esteriliza en el autoclave a 121C durante 15 minutos.
4 Se marca como AN
Fundamento
El medio es simple, no tiene mayores aditivos; es utilizado para el cultivo de microorganismos poco
exigentes nutricionalmente; pueden crecer una gran gama de microorganismos, se puede omitir el
extracto de levadura de la frmula.
Control de calidad
Cepas de ensayo Crecimiento con 5% de sangre de carnero
Neisseria meningitidis Bueno
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Bueno
Escherichia coli ATCC 25922 Bueno
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AGAR SABOURAUD GLUCOSA 4%
Aplicacin
Medio utilizado para el cultivo y diferenciacin de hongos, proporciona un medio favorable en pH y
contenido de glucosa, los hongos crecen fidedignamente manteniendo sus estados culturales
descritos por Sabouraud.
Neopeptona 10 g Dextrosa 40 g
Agar 15 g
pH final= 5.6 aprox .
Preparacin
1. Se suspende 65 gramos en 1 litro de agua destilada
2. Se hierve hasta disolver el medio por completo.
3. Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 minutos y 15 libras de presin.
4. Se distribuye en placas o tubos
5. El medio preparado es ambar ligeramente opalescente.
6. Marcar los tubos o placas con SAB
Fundamento
Para el aislamiento primario utilizado en micologia, el contenido de glucosa y el pH que ofrece el
medio son favorables para el crecimiento de los diferentes hongos, levaduras y mohos.
Control de calidad
Cepas de ensayo Recuperacin
Aspergillus niger Bueno a excelente
Candida albicans Bueno a excelente
Escherichia coli ATCC 25922 Bueno a excelente
Lactobacillus casei Bueno a excelente
Saccharomyces cerevisiae Bueno a excelente
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AGAR SANGRE
Aplicacin
Es un medio no selectivo, para fines generales, especialmente el aislamiento de organismos
exigentes; la adicin de sangre permite determinar si el organismo es hemoltico o no.
Frmula
Agar tripticasa soya, agar Columbia, 1L Sangre desfibrinada de carnero 50 a 100
agar Brucella o base de agar mL
sangre
pH final: 6.8 aprox.
Preparacin
1. Disolver agar en cantidad suficiente para un litro de agua destilada
2. Calentar hasta disolver completamente
3. Esterilizar en autoclave por 15 min. a 121 C y 15 lbs. de presin.
4. Enfriar hasta 45 o 50 C
5. Aadir 5 a 10 % de sangre de carnero desfibrinada estril, mezclar bien.
6. Verter en placas.
7. El medio con sangre es del color de la misma y no hemolizado.
8. Marcar las placas con AS
Fundamento Es un medio sin inhibidores por lo que puede crecer cualquier microorganismo, la
adicin de sangre lo hace un medio enriquecido para el crecimiento de microorganismos exigentes y
para la determinacin de hemlisis. El pH ligeramente cido favorece la conservacin de los
eritrocitos, las reacciones hemolticas y el crecimiento de ciertos microorganismos como
estreptococos y neumococos. El medio no debe tener glucosa porque esta inhibe el desarrollo de
hemlisis.
Control de calidad
Cepas de ensayo Recuperacin Hemlisis
Staphylococcus aureus Buena Variable
Streptococcus pyogenes Buena Beta
Streptococcus pneumoniae Buena Alfa
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AGAR SANGRE AZIDA
Aplicacin
El medio es utilizado para el aislamiento de estreptococos y estafilococos. El medio se puede utilizar
con o sin sangre.
Triptosa 10 g Extracto de carne 3g
Cloruro de sodio 5g Azida de sodio 0,2 g
Agar 15 g
pH final: 7.2
Preparacin
1. Se suspende 33 gramos en un litro de agua destilada.
2. Se hierve hasta disolver completamente.
3. Se esteriliza en autoclave a 121C por 15 minutos y a 15 libras de presin.
4. Si se desea aadir sangre, se enfra el medio a 50C y se aade sangre desfibrinada de carnero
a una concentracin final del 5%.
5. El medio preparado es de color rojo cereza.
6. Marcar las placas con AZ o en el caso de usar sangre con AS Az
7. Si se cuenta con azida de sodio, se puede pesar 0,2 g y colocarlo en tubos para aadirlos a un
litro de agar tripticasa soya, obtenindose un medio similar. La azida de sodio es txica, por lo
que debe manejarse con cuidado siguiendo las indicaciones de la hoja MSDS.
Fundamento
Este medio permite el crecimiento de microorganismos exigentes. La azida inhibe a la flora gram-
negativa, en tanto que la flora Gram-positiva se desarrolla ms o menos indemne. La adicin de
sangre al medio favorece la interpretacin de hemlisis.
Control de calidad
Cepa de ensayo Crecimiento Hemolisis
Streptococcus pyogenes Excelente Beta
Streptococcus pneumoniae Excelente Alfa
Enterococcus faecalis Excelente Alfa/gamma
Staphylococcus epidermidis Excelente Gamma
Escherichia coli ATCC 25922 Nulo
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AGAR SS (SALMONELLA SHIGELLA)
Aplicacin
Es un medio diferencial y selectivo para aislamiento de Salmonella y Shigella a partir de heces,
alimentos y otros.
Extracto de carne 5g Proteosa peptona 5g
Lactosa 10 g Sales biliares 8,5 g
Citrato sdico 8,5 g Tiosulfato sdico 8,5 g
Citrato frrico 1g Verde brillante 0,33 g
Rojo neutro 0,025 g Agar 13,5 g
pH final: 7.0
Preparacin
1 Suspender 60 g en 1 L de agua destilada
2 Calentar hasta disolver.
3 NO SE DEBE AUTOCLAVAR.
4 Verter a placas.
5 Las placas con medio son color rojo cereza.
6 Marcar las placas con SS
Fundamento
La bilis de buey, el verde brillante y la elevada concentracin de tiosulfato y citrato inhiben la flora
acompaante (Gram + y algunos coliformes) permitiendo el crecimiento de Salmonella y Shigella. Con
el tiosulfato e iones de hierro se evidencia la formacin de H2S con el consecuente ennegrecimiento
de la colonia. Los coliformes que fermentan la lactosa viran el pH a cido y por el indicador rojo
neutro se aprecian colonias rojas. Shigella, Salmonella y otros no fermentadores de lactosa producen
colonias transparentes. Las colonias lactosa negativas son incoloras y las lactosa positivas son
rosadas hasta rojas.
Control de calidad
Cepas de ensayo Color de colonias Centro negro Recuperacin
Escherichia coli Rojo No Mala
Shiguella flexneri Incoloras No Buena
Salmonella enteritidis Incoloras Si Buena
Salmonella typhi Incoloras Si Buena
Salmonella paratyphi A Incoloras No Buena
Staphylococcus aureus Ausente
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AGAR TCBS (TIOSULFATO, CITRATO, BILIS, SACAROSA)
Aplicacin
Para el aislamiento y cultivo selectivo de Vibrio cholerae y otros vibriones enteropatgenos (V.
parahemolyticus, etc.).
Extracto de levadura 5g Peptona proteosa 10 g
Sacarosa 20 g Citrato sdico 10 g
Tiosulfato sdico 10 g Bilis de buey 8g
Citrato frrico 1g Cloruro de sodio 10 g
Azul de bromotimol 0,04 g Azul de timol 0,04 g
Agar 15 g
pH final = 8,6 aprox.
Preparacin
1. Disolver 89 g en 1 L de agua destilada estril
2. Calentar hasta disolver el medio.
3. NO SE DEBE AUTOCLAVAR.
4. Repartir en placas.
5. El medio es de un color azul verdoso.
6. Marcar las placas con TCBS
Fundamento
Es un medio selectivo para vibrios, ya que las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato, as
como el medio fuertemente alcalino, inhiben notablemente a las enterobacterias. La bilis de buey
inhibe a los microorganismos Gram positivos. La alta concentracin de cloruro de sodio lo hace
selectivo para vibrios e inhibe otras bacterias. El indicador mixto Azul de timol- Azul de bromotimol
presenta un claro viraje a amarillo por la formacin de cido, incluso en medio fuertemente alcalino.
Solamente algunas cepas de Proteus y enterococos pueden formar colonias en este medio, pero que
se distinguen de las de vibrios pues son ms pequeas. Los vibrios y otros microorganismos, que
puedan crecer en este medio, que fermenten la sacarosa virarn el pH a cido por lo que las colonias
se apreciarn amarillas. Las colonias de vibrios y otros microorganismos que no fermenten la
sacarosa sern de color verdes a verdeazuladas o transparentes.
Control de calidad
Vibrio alginolyticus Amarillo Bueno
Vibrio cholerae Amarillo Bueno
Vibrio parahaemolyticus Azul Bueno
Escherichia coli Nulo
Pseudomonas aeruginosa Azul Nulo/Ligero
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AGAR TRIPTICASA SOYA (TSA)
Aplicacin
Es un medio de uso frecuente y general, utilizado como base frecuente del agar sangre. La bondad
del medio es que pueden crecer tanto aerobios como anaerobios, el medio carece de inhibidores, por
eso se utiliza para el cultivo de una gran variedad de microorganismos.
Triptona 15 g Peptona de Soya 5g
Cloruro de sodio 5g Agar 15 g
pH final = 7.3
Fundamento
El medio carece de inhibidores, el contenido de peptonas favorece el crecimiento de una gran
variedad de microorganismos
Preparacin
1. Se suspenden 40 gramos en 1 litro de agua destilada
2. Se hierve hasta disolver el medio por completo.
3. Se esteriliza en la autoclave a 121 C por 15 minutos.
4. Distribuir en placas o tubos
5. Marcar los medios con TSA
6. El medio preparado es de color blanquecino nacarado.
Control de Calidad
Cepas de ensayo Crecimiento sin Crecimiento con 5% Hemlisis
sangre sangre de carnero
Neisseria meningitidis Excelente Excelente Ninguna
Staphylococcus aureus Excelente Excelente Beta
Streptoccoccus pneumoniae Regular Excelente Alfa
Streptococcus pyogenes Regular Excelente Beta
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AGAR TSI (TRIPLE SUGAR IRON)
Aplicacin
Medio empleado para la clasificacin de enterobacterias que permite investigar la capacidad de
fermentar glucosa, lactosa, sacarosa y detectar la presencia de hidrgeno sulfurado.
Extracto de carne 3g Peptona 20 g
Cloruro de sodio 5g Glucosa 1g
Lactosa 10 g Sacarosa 10 g
Sulfato de hierro y amonio 0,2 g Tiosulfato de sodio 0,2 g
Rojo de fenol 0,025 g Agua destilada 1L
pH final: 7,3 0.2
Instrucciones
1. Suspender 62,5 g del polvo en un litro de agua destilada.
2. Calentar a ebullicin hasta completa disolucin.
3. Distribuir en tubos 13 x 100 con tapa rosca o con tapn de algodn
4. Esterilizar en la autoclave por 15 minutos a 121C.
5. Enfriar dejando un fondo de 2 cm con un plano inclinado corto.
6. El medio es de color rojo
7. Marcar los tubos con las iniciales TSI
Fundamento
La fermentacin de los azcares da lugar a una produccin de cido, que se detecta por medio del
indicador rojo de fenol, los cambios de color al amarillo por una acidificacin y a rojo por una
alcalinizacin. La menor concentracin de glucosa (0,1%) hace que el cambio sea leve y solo se
produzca el cambio en el fondo del tubo, mientras que al estar la lactosa y la sacarosa en mayor
concentracin el cambio a acidez se ve en fondo y en el plano inclinado. El tiosulfato de sodio se
reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico
sulfuro de hierro de color negro.
Control de calidad
Cepas de ensayo Fondo Plano Gas H2S
inclinado
Escherichia coli A A 2+ -
Shigella flexneri K A - -
Proteus mirabilis K A -
Pseudomonas aeruginosa K K - -
A: cido K: alcalino
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AGAR UREA SEGN CHRISTENSEN
Aplicacin
Para la diferenciacin de bacterias productores de ureasa (degradadores de rea).
Peptona 1g Dextrosa 1g
Cloruro de Sodio 5g Fosfato monopotsico 2g
Rojo de fenol 0,012 g Urea 20 g
Agar 15 g
pH final: 6,8
Preparacin del medio:
1. Se disuelve 29 g de la base de agar urea (que tiene todos los componentes de la frmula menos
el agar) en 100 ml de agua destilada
2. Se esteriliza por filtracin.
3. Aparte, se disuelve 15 g de agar en 900 ml de agua destilada estril.
4. Se esteriliza el agar en autoclave por 15' a 121C.
5. Se enfra a 50-55C y aspticamente se le agrega los 100 ml de concentrado de la base de agar
urea.
6. Se mezcla bien y se distribuye 1,5 a 2 mL en tubos estriles 12 x 75.
7. Se inclina los tubos en pico de flauta (aprox. 0,5 cm de profundidad y 1cm de pendiente).
8. El medio de cultivo es claro y de color amarillo-naranja.
9. Se marcan los tubos con AU
10. Se taponan los tubos y se guardan en refrigeracin.
Fundamento
La urea es desdoblada por la enzima ureasa producida por ciertos microorganismos, formando
dixido de carbono y amoniaco, este ltimo alcaliniza el medio lo que se comprueba por el viraje de
amarillo a rojo-prpura por el indicador rojo de fenol. El agar urea (segn Christensen) es menos
tamponado a comparacin del caldo rea (fuertemente tamponado) por lo que puede detectar no slo
microorganismos potentes formadores de ureasa (como Proteus) sino tambin los formadores dbiles
como Klebsiella, Enterobacter, ciertos micrococos, etc.
Control de calidad
Cepas de ensayo Hidrlisis de la urea Crecimiento
Escherichia coli No - Amarillo Bueno
Klebsiella pneumoniae Si Rojo lento Bueno
Proteus vulgaris Si Rojo rpido Bueno
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AGAR XLD (XILOSA, LISINA, DESOXICOLATO)
Aplicacin
Para el aislamiento y diferenciacin de enterobacterias patgenas, especialmente Salmonella y
Shigella en muestras de heces o alimentos.
Extracto de levadura 3g Sacarosa 7,5 g
Lactosa 7,5 g D-Xilosa 3,5 g
L-Lisina 5g Desoxicolato de Sodio 2,5 g
Tiosulfato de Sodio 6,8 g Citrato frrico amnico 0,8 g
Cloruro de Sodio 5g Rojo de fenol 0,08 g
Agar 13,5 g
pH final: 7.4
Preparacin
1. Disolver 55 g rpidamente en un litro de agua destilada estril.
2. Calentar hasta que se disuelva totalmente.
3. NO SE DEBE SOBRECALENTAR NI AUTOCLAVAR.
4. Dejar enfriar a 50-60C y verter inmediatamente en placas
5. El color final del medio es rojo.
6. Marcar las placas con XLD
Fundamento
Se fundamenta en la fermentacin de la xilosa, lactosa y sacarosa, descarboxilacin de la lisina y la
produccin de H2S a partir del tiosulfato de sodio y visible por el citrato frrico amnico. Las colonias
de enterobacterias que fermentan lactosa, sacarosa y/o xilosa revierten el pH a cido y por el
indicador (rojo de fenol) se aprecian amarillas. La gran cantidad de cido formado impide que
coliformes que decarboxilan la lisina (LDC+) reviertan el pH a un valor alcalino.
La fermentacin rpida de la xilosa es casi constante en enterobacterias a excepcin de miembros
del grupo Shigella, Edwarsiella y Providencia. Las especies de Shigella son lactosa (-), xilosa (-) y
LDC (-) por lo que las colonias son rojas (igual al color del medio).
Generalmente las especies de Salmonella son lactosa (-) y sacarosa (-), como descarboxilan la lisina
(en mayor concentracin), el pH vara a alcalino, dando colonias rojas a pesar de ser xilosa (+).
Salmonella y Edwarsiella se diferencian de Shigella por la produccin de H2S, la cual se aprecia como
un punto negro en el centro de las colonias.
Varias de estas reacciones pueden presentarse simultneamente o sucesivamente lo que puede dar
lugar a diversos matices de color del indicador de pH. El desoxicolato acta como un inhibidor (dbil)
de coliformes sin disminuir la capacidad de crecimiento de Shigella y Salmonella.
Control de calidad
Cepas de ensayo Color de colonias Centro negro Recuperacin
Escherichia coli Amarillo No Buena
Shigella sp Rojas No Buena
Salmonella enteritidis Rojas Si Buena
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CALDO INFUSIN CEREBRO - CORAZN (BHI)
Aplicacin
Para el cultivo de estreptococos, neumococos, meningococos y otros organismos exigentes, tambin
para el cultivo de estafilococos destinados a la prueba de coagulasa. Recomendado para
hemocultivos.
Infusin de cerebro de ternero 200 g Infusin de corazn de buey 200 g
Proteosa peptona 10 g Dextrosa 2g
Cloruro de sodio 5g Fosfato disdico 2,5 g
pH final: 7.4
Preparacin
1 Disolver 37 g en 1 L de agua destilada.
2 Distribuir a tubos o frascos.
3 Esterilizar en autoclave por 15 min. a 15 lb de presin y a 121C.
4 El caldo tiene un aspecto claro, ligeramente parduzco.
5 Marcar los tubos con BHI
Fundamento
Es un medio enriquecido sin inhibidores, adecuado para el desarrollo de bacterias aerobias y
anaerobias. La adicin de agar (0.1-0.2%) al caldo sirve para reducir las corrientes de conveccin y
crear de esta manera una tensin de oxgeno similares a las producidas por el tejido, esto favorece el
crecimiento de anaerobios y tambin de aerobios. La adicin de 2% de agar favorece el cultivo y
aislamiento de Actinomyces israeli. La adicin de 2% de agar y 10% de sangre de caballo
desfibrinada favorece el crecimiento de Histoplasma capsulatum y otros hongos como Coccidioides
immitis.
Control de calidad
Cepas de ensayo Incubacin Recuperacin
Streptococcus pyogenes 24h/35C aerbica/anaerbica Bueno
Streptococcus pneumoniae 24h/35C aerbica/anaerbica Bueno
Candida albicans 48h/35C aerbica Bueno
Pseudomonas aeruginosa 24h/35C aerbica/anaerbica Bueno
Bacteroides fragilis 2-5 das/35C anaerbica Bueno
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CALDO PEPTONADO ALCALINO
Aplicacin
Para el cultivo y enriquecimiento de especies de Vibrio a partir de material infectado.
Peptona 10 g Cloruro de sodio 10 g
Agua destilada 1L Extracto de carne (opcional) 3g
Hidrxido de sodio 1 M c.s.p.
pH final de 8.4 aprox.
Preparacin
1. Se pesan la peptona y el cloruro de sodio y se disuelven en 1 L de agua destilada.
2. Se aade hidrxido de sodio 1M gota a gota hasta que el pH sea de 8.4 aproximadamente.
3. Distribuir 10 mL en tubos de 15 x 125 tapa rosca.
4. Esterilizar en la autoclave por 15 minutos a 15 lbs. de presin.
5. El caldo es claro incoloro o ligeramente amarillo.
6. Marcar los tubos con APA.
Fundamento
El medio alcalino y el contenido de sal inhiben el crecimiento de las enterobacterias y otras bacterias
no deseables mas no as las de vibrios.
Interpretacin:
Se inocula el caldo con la muestra y se incuba a 37C por 24 h. Crece como una pelcula superficial,
del cual se toma una asada y se siembra en Agar TCBS.
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CALDO PEPTONADO CON CLORURO DE SODIO
Aplicacin
Esta es una serie de medios diferenciales utilizados para la identificacin y diferenciacin de bacterias
del gnero Vibrio y otras bacterias haloflicas. Este medio tiene como base el caldo peptonado y se le
aade diferentes concentraciones de cloruro de sodio. La cantidad de medio es suficiente para unas
40 determinaciones.
Extracto de Carne 5g Peptona 5g
Agua destilada 500 mL
pH final = 7.3 aprox. a 25 C
Preparacin
1. Pesar los componentes y disolverlo completamente en el agua destilada.
2. Distribuir 100 mL en 5 frascos, marcar los frascos con 0, 3, 5, 7 y 10.
3. Aadir 0, 3, 5, 7 y 10 g de cloruro de sodio a cada frasco segn este marcado.
4. Distribuir 2,5 mL de cada concentracin en tubos de 12 x 75.
5. Colocar los tubos en canastillas marcadas y esterilizar a 121 C por 15 minutos en autoclave.
6. Sacar los tubos de la autoclave, dejar que enfren y cambiar los tapones de algodn por tapones
de jebe.
7. Controlar en la estufa por 24 horas para ver la esterilidad.
8. Marcar los tubos con ClNa y la concentracin de sal.
9. Conservar a temperatura ambiente en gradillas en series.
Fundamento
Los medios mide la capacidad de crecimiento de la bacteria en presencia de diferentes
concentraciones de cloruro de sodio, lo cual permite diferenciar vibrios marinos de Vibrio cholerae,
confirmar la sospecha de Vibrio cholerae no O1 y otras bacterias que pueden sobrevivir en presencia
o ausencia completa de sal.
Interpretacin
Se realiza a las 18 a 24 h. de incubacin a 37 C.
Control de calidad
0% 3% 5% 7% 10 %
Escherichia coli ATCC 25923 - - - - -
Vibrio cholerae + + + - -
Vibrio parahaemolyticus - + + + -
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CALDO TRIPTICASA SOYA (TSB)
Aplicacin
El medio es utilizado como caldo de enriquecimiento por la gama de nutrientes que posee; es muy
utilizado para recuperar aquellos microorganismos que se tengan poco inculo.
Triptona (digerido pancretico de 17 g Soytona (digerido papaico de soya) 3g
caseina)
Cloruro de sodio 5g Fosfato de potasio dibsico 2,5 g
Dextrosa 2,5 g
pH final: 7.3
Preparacin
1. Se aade 30 gramos a 1 litro de agua destilada.
2. Se mezcla bien y se distribuye en los recipientes definitivos.
3. Se puede colocar 2,5 mL en tubos 12 x 75 con tapn de algodn
4. Se esteriliza en la autoclave a 121C durante 15 minutos.
5. Se marcan los tubos con TSB
Fundamento
El medio contiene una muy buena gama de nutrientes lo que lo hace un buen enrriquecidor y
recuperador de bacterias que se encuentran en pocas cantidades como es en el caso de los
hemocultivos. El caldo presenta una buena base para la adicin de diferentes agregados para la
recuperacin de bacterias aerobias como anaerobias de diferentes tipos de muestras.
Control de calidad
Cepas de ensayo Recuperacin
Neisseria meningitidis Bueno
Streptococcus pneumoniae Bueno
Streptococcus pyogenes Bueno
Staphylococcus epidermidis Excelente
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CALDO UREA SEGN STUART
Aplicacin
Para la diferenciacin de microorganismos productores de ureasa (degradadores de rea).
Extracto de Levadura 0,1 g Fosfato monopotsico 9,1 g
Fosfato disdico 9,5 g Urea 20 g
Rojo de fenol 0,01 g
pH final: 6.8
1. Disolver 38.7 g en 100 mL de agua destilada estril.
2. Esterilizar por filtracin con filtro de 0,45 m, calentar si es necesario hasta 60C como mximo.
NO SE DEBE AUTOCLAVAR.
3. Repartir 10 mL a tubos estriles 16 x 100 estriles.
4. El caldo es claro y de color rojo amarillento.
5. Marcar con CALDO UREA (MADRE)
6. Mezclar 1 tubo con 90 mL de agua destilada estril.
7. Distribuir 2,5 mL en tubos de 12 x 75 estriles.
8. Cambiar el tapn de algodn por tapn de jebe y guardar en la refrigeradora.
9. Marcar los tubos con CU.
Fundamento
Los microorganismos que producen ureasa degradan la rea a CO2 y amonaco, este ltimo alcaliniza
el caldo produciendo un viraje de su color de amarillo a rojo-prpura a causa del indicador rojo de
fenol, eventualmente el crecimiento produce turbidez en el medio. Por ser un medio fuertemente
tamponado solamente detecta microorganismos fuertemente productores de ureasa (como Proteus).
Control de calidad
Cepas de ensayo Viraje a rojo
Escherichia coli No
Klebsiella pneumoniae -/+ ligero
Proteus vulgaris Si
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MEDIOS DE HEMOCULTIVO BIFASICO

(RUIZ CASTAEDA)
Propsito
Preparar medios de hemocultivo bifsico tipo Ruiz Castaeda para el cultivo de sangre y mdula
sea.
Equipos
Autoclave Estufa
Cmara de flujo laminar Presillador
Materiales
Frascos de hemocultivo de 100 mL Tapones de algodn recubiertos de gasa
Tubos 20 x 150 con tapa rosca Tapones de jebe tipo penicilina de 20 mm
Precintos de aluminio de 20 mm Papel Kraft
Pita Agar tripticasa soya
Caldo tripticasa soya Polianetol sulfonato de sodio (SPS)
Hematina Hidrxido de sodio
Preparacin
La cantidad de medio depende del volumen del frasco disponible y de acuerdo al uso que se le va a
dar:
Tamao de frasco de Medio 50 mL 60 mL 100 mL 120 mL

Agar tripticasa soya en mL 10 10 25 35
Caldo tripticasa soya en mL 10 15 25 35
Hematina al 0,05%
1. Pesar 50 mg de hematina en tubos 12 x 75 con tapn de jebe y conservarlos a temperatura de
refrigeracin como stock.
2. Aadir el contenido de un tubo a 100 mL de NaOH 0,01M. (0,4 g de NaOH para 1 L de agua
destilada).
3. Disolver, distribuir 10 mL en tubos 15 x 100 con tapn de jebe.
4. Conservar en refrigeracin hasta el momento de uso.
5. Descartar despus de 6 meses.
Fase slida
1. Pesar 40 g de agar tripticasa soya, aadir 1 L de agua destilada y disolver al calor.
2. Distribuir en los frascos de hemocultivo segn el tamao del frasco.
3. Taponar con tapones de algodn con gasa y cubrir con papel Kraft.
4. Autoclavar a 121C por 15 minutos.
5. Dejar enfriar en posicin inclinado permitiendo que se forme un plano inclinado que llegue cerca
de la boca del tubo.
Fase lquida
1. Pesar 30 g de caldo tripiticasa soya y aadir 1 L de agua destilada.
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2. Aadir 0,25 g de polianetol sulfonato de sodio.

3. Aadir 10 mL de solucin de hematina 0,05%.
4. Distribuir el caldo en tubos y dejar entreabierta la tapa.
5. Autoclavar a 121C por 15 minutos y dejar enfriar.
Preparacin del medio
1. Trabajar en la cmara de flujo laminar, en forma asptica aadir el caldo al frasco con agar y
luego reemplazar los tapones de algodn con tapas de jebe
2. Para el control de esterilidad se debe incubar todos los frascos en la estufa por tres das, y buscar
cada da la presencia de frascos contaminados, despus inclinar cada frasco y baar el plano
inclinado con el caldo y devolver los frascos a la incubadora.
3. Despus de los tres das mantener los frascos a temperatura ambiente por 3 das adicionales,
siguiendo el mismo procedimiento.
4. Pasado el perodo de control de esterilidad, colocar precintos de metal a todos los frascos y una
etiqueta para el llenado de informacin. Los frascos tienen una fecha de expiracin de un ao.
5. La tasa de contaminacin es igual al nmero de frascos contaminados sobre la cantidad de
frascos producidos. Una tasa de contaminacin mayor a 5%, implicar un estudio para determinar
la fuente de contaminacin.
6. Se anotar en una hoja los datos de la preparacin del medio:
Lote Fecha Numero de Frascos Tasa de Control Produccin

frascos contaminados contaminacin de final
producidos calidad
Interpretacin
Los frascos de hemocultivo bifsico tienen una fase slida, una fase lquida y usan como
anticoagulante al SPS, no son aceptables otros tipos de anticoagulantes (citrato de sodio, EDTA o
heparina). El frasco permite el crecimiento de bacterias no exigentes y exigentes como Brucella. En el
caso de Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae es preferible que los frascos
contengan CO2 para el aislamiento de estos agentes.
Control de calidad
Cepa Crecimiento
Escherichia coli ATCC 25922 Bueno a las 24 horas
Brucella melitensis Bueno a las 48 horas
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MEDIO DE MUELLER HINTON
Aplicacin
Es un medio que no posee inhibidores, por lo cual crece todo tipo de bacterias. El medio es utilizado
en los antibiogramas y para el aislamiento de especies patogenas de Neisseria.
Infusin de carne 300 g Almidn 1,5 g
Casamino cidos 17,5 g Agar 17 g
pH final: 7.4
1. Se suspenden 38 g en 1 L de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio por completo.
2. Se esteriliza por autoclave a 121C durante 15 minutos.
3. Se distribuye en placas en cantidad suficiente para que de una profundidad de aproximadamente
4 mm.
4. El medio preparado es ambar claro ligeramente opalescente.
5. Marcar las placas con MH.
Fundamento
El medio no posee inhibidores, la inclusin de almidn asegura que los factores txicos que se
encuentran durante el crecimiento sean absorbidos, siendo su presencia a menudo esencial para que
se establezca el crecimiento a partir de inculos muy pequeos.
Se debe utilizar el mismo tipo de placas y determinar la cantidad de medio necesario para obtener la
profundidad de medio necesaria.
Control de calidad
Cepas de ensayo Crecimiento
Escherichia coli ATCC Excelente
Staphylococcus aureus Excelente
Pseudomonas aeruginosa Excelente
Neisseria meningitidis Excelente
Por las caractersticas del uso de este medio necesita pruebas adicionales en el control de calidad
pH Utilizar un potenciometro, 7,4 0,1
Medir la profundidad del agar Debe ser de 4 0,5 mm
Evaluar el nivel de timidina Crecimiento de E. faecalis ATCC 29212 con
disco de SXT
Evaluar concentracin de Ca y Mg Crecimiento de P. aeruginosa ATCC 27853 con
disco de gentamicina o tobramicina
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MEDIO DE TRANSPORTE DE AMIES
Aplicacin
Es una modificacin del medio de transporte de Stuart. Se utiliza para el transporte de Neisseria
gonorrhoeae y de muestras de secreciones respiratorias y de otro origen. Se recoge la muestra con
hisopo estril, la cual se coloca dentro del medio de Amies hasta 1/3 o el fondo del tubo, cerrar
fuertemente el tapn. Mantener fro durante el perodo de transporte.
Fosfato de sodio 1,15 g Tioglicolato de sodio 1g
Fosfato monopotsico 0,2 g Cloruro de sodio 3g
Cloruro de calcio 0,1 g Cloruro de magnesio 0,1 g
Carbn vegetal neutro 10 g Agar 4g
pH final: 7.2.
1. Se suspenden 20 g en 1 L de agua destilada, se calienta hasta disolver completamente.
2. Se distribuye 5 mL en tubos de 13 x 100 con tapa rosca.
3. Se esteriliza en autoclave a 121C por 15'.
4. Mezclar el medio mientras se est enfriando para distribuir el carbn de manera uniforme.
5. Almacenar en lugar fresco.
6. Marcar los tubos con AM
Fundamento La presencia de carbn vegetal y la concentracin de ClNa en el medio es ptimo para
la preservacin de N. gonorrhoeae. El fosfato acta como buffer y evitando la proliferacin de
organismos coliformes y otros bacilos Gram negativos. Las sales de calcio y magnesio contribuyen a
la supervivencia de estos microorganismos.
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MEDIO DE TRANSPORTE DE CARY Y BLAIR
Aplicacin
El medio de Cary-Blair es un medio de transporte semislido para muestras clnicas, sobre todo
cuando se tenga que transportar hisopos rectales a un laboratorio de diagnstico. Para recoger la
muestra se usan hisopos de madera con punta de algodn, se toma la muestra y se introduce el
hisopo en el tercio inferior del medio, se rompe la varilla de manera que cuando se apriete el tapn de
rosca el hisopo se encuentre en el fondo del medio; luego se cierra fuertemente el tapn del frasco.
Fosfato disdico 1.1 g Tioglicolato de sodio 1,5 g
Cloruro de sodio 5g Cloruro de calcio 0,09 g
Agar 5,6 g
pH final: 8.4
1. Se suspenden 12.7 g en 1 L de agua destilada y se calienta hasta disolver el medio
completamente.
2. Se distribuye 5 mL en tubos 13 x 100 con tapa rosca.
3. Se esterilizan en autoclave a 121C por 15'.
4. Se deja que enfren y se aprietan los tapones de rosca para impedir la desecacin. Se puede
utilizar tambin viales con tapa de jebe.
5. Se marcan los tubos con CB.
Fundamento
El bajo contenido nutritivo del medio y el uso de fosfato como buffer en el medio impide el
sobrecrecimiento de las enterobacterias. El bajo potencial de oxido-reduccin del medio asegura una
supervivencia bacteriana durante buen tiempo. Existen diversas modificaciones, esta es la que utiliza
la marca DIFCO, que puede ser esterilizada en la autoclave, mientras que otras formulas son ms
difciles de preparar y solo se calientan en Bao Mara, lo que no garantiza una esterilizacin
adecuada.
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MEDIO MIO (MOVILIDAD, INDOL, ORNITINA)
Aplicacin
Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de
ornitina decarboxilasa y produccin de indol.
Dextrosa 1g Extracto de levadura 3g
Peptona 10 g Triptena 10 g
Clorhidrato de L-Ornitina 5g Agar 2g
Prpura de bromocresol 0,02 g Agua destilada 1L
pH final: 6.5 0.2
Instrucciones
1. Suspender 31 g del polvo en un litro de agua destilada.
2. Calentar a ebullicin hasta completa disolucin.
3. Distribuir en tubos y esterilizar 15 minutos a 121C.
4. Se deja enfriar en posicin vertical.
5. Se puede reemplazar los tapones de algodn por tapones de jebe.
6. Los tubos son de color lila.
7. Marcar los tubos con las iniciales MIO
Fundamento
En este medio se puede observar 3 reacciones en un mismo tubo. La movilidad se demuestra por un
enturbiamiento del medio o un crecimiento que se difunde desde la lnea de inoculacin, mientras en
las no mviles crece a lo largo de la lnea de siembra. La reaccin positiva de la ornitina est dada por
un color prpura del medio debido a la fermentacin de la glucosa que reduce el pH produciendo una
condicin cida originando que el indicador de pH prpura de bromocresol se vuelva amarillo y
proporcione condiciones ptimas para la decarboxilacin de la ornitina. Si ocurre esta reaccin el pH
sube como resultado y el indicador se vuelve prpura. Los cultivos negativos a ornitina producen un
tubo amarillo que puede ser prpura en la parte superior. La prueba de indol se realiza una vez que
se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. Los cultivos positivos de indol producen un
color rosa o rojizo con el reactivo de Kovacs. El indol es producido por los microorganismos a partir
del triptofano presente en la peptona de la frmula.
Control de calidad
Cepas de ensayo Crecimiento Movilidad Indol Ornitina
Escherichia coli Bueno + + +
Klebsiella pneumoniae Bueno - - -
Proteus mirabilis Bueno + - +
Enterobacter aerogenes Bueno + - +
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MEDIO MR VP (ROJO DE METILO, VOGES- PROSKAUER)
Aplicacin
Es un caldo glucosado para la realizacin de la prueba de Rojo de Metilo y Voges-Proskauer para la
diferenciacin de coliformes.
Peptona tamponada 7g Fosfato dipotsico 5g
Dextrosa 5g
Preparacin
1. Disolver 17 g en 1 L de agua destilada.
2. Distribuir 3,5 mL a tubos 12 x 75.
3. Esterilizar en autoclave por 15 a 121C y 15 lb de presin.
4. Dejar enfriar y taponar los tubos para su conservacin.
5. Marcar los tubos con MRVP.
6. El caldo preparado es ligeramente mbar y translcido.
Fundamento
Algunas enterobacterias degradan la glucosa a cidos fuertes (lctico, actico o frmico) medible con
la prueba de Rojo de Metilo pero miembros del grupo Klebsiella, Enterobacter, Hafnia y Serratia,
degradan la glucosa hasta Acetilmetilcarbinol (acetona) medible con la prueba de Voges-Proskauer.
Rojo de Metilo (RM): El RM es un indicador de pH con un espectro de 6 (amarillo) a 4.4 (rojo) por lo
que solo vara de color cuando el pH es muy cido (como el proporcionado por los cidos fuertes).
Dado que muchas especies de Enterobactericeas pueden producir una cantidad de cidos fuertes
durante la fase inicial de incubacin, solo las bacterias capaces de mantener este pH bajo despus
de una incubacin prolongada (48 a 72 h), superando el tampn del medio, pueden denominarse RM
Positivo. Una reaccin positiva es indicado por un viraje del medio a rojo. Una reaccin negativa es
indicado por un color amarillo del medio.
Voges-Proskauer: La acetona producida en presencia de hidrxido de potasio (KOH) al 40% y
oxgeno atmosfrico se oxida en Diacetilo, que se puede medir con la adicin de -Naftol. La
aparicin de un color rojo, indica la presencia de diacetilo y por ende de Acetilmetilcarbinol.
Interpretacin: Se inocula un tubo con la cepa, se incuba 48 horas y se reparte en dos tubos:
A. Rojo de Metilo: Agregar 2 gotas del indicador Rojo de Metilo, mezclar bien y ver si existe variacin
de color.
B. Voges-Proskauer: Se agrega 2 gotas de KOH 40% y se agita. Agregar 2 gotas de -Naftol y
mezclar bien y esperar hasta 15 minutos. El viraje hacia rojo del caldo indica que la prueba es
positiva. En la reaccin negativa no hay cambio de color.
Control de calidad
Cepa de Ensayo Crecimiento MR VP
Escherichia coli Bueno + (Rojo) - (S/C)
Enterobacter aerogenes Bueno - (Amarillo) + (Rojo)
Klebsiella pneumoniae Bueno + -
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MEDIO O/F (OXIDACIN / FERMETACIN)

SEGUN HUGH Y LEIFSON
Aplicacin
Para diferenciar y clasificar microorganismos Gram negativos mediante la fermentacin y oxidacin
de los carbohidratos.
Triptona 2g Cloruro de sodio 5g
Fosfato dipotsico 0,3 g Azul de bromotimol 0,08 g
Agar 2g Carbohidrato al 10 % 100 mL
Preparacin
1. Suspender 9,4 g en 900 mL de agua destilada y calentar hasta disolver completamente.
2. Distribuir 90 mL en frascos y esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min. y 15 lb de presin.
3. Dejar enfriar a 50C y agregar 10 ml de solucin de Dextrosa, Sacarosa, Lactosa, maltosa u otros
carbohidratos a 90 ml de medio, mezclar bien.
4. Dispensar en forma estril 2,5 mL en tubos de 12 x 75.
5. El medio de cultivo preparado y listo para su uso es claro y de color verde.
6. Marcar los tubos con OF y seguido de la inicial del carbohidrato: D, S, L o M.
7. Los carbohidratos se esterilizan por filtracin: pesar 10 g en 100 mL de agua destilada estril y
filtrar a travs de un filtro de 0,45 m de poro, distribuir 10 mL en tubos 16x150 y guardar
refrigerados hasta el momento de uso.
Fundamento
En cada caso se ha aadido al medio de cultivo un determinado carbohidrato, cuya degradacin a
cido se pone en manifiesto por el viraje a amarillo del indicador Azul de bromotimol. Esta
degradacin se estudia tanto en condiciones aerobias (con lo que es posible la degradacin
fermentativa y oxidativa) como anaerobias (slo degradacin fermentativa).
Interpretacin:
Se siembra por puntura hasta el fondo sin tocar la base, con un cultivo puro, a dos tubos rotulados:
uno (O): Oxidador, en contacto con el aire, abierto o en condiciones aerobias y otro (F):
Fermentador, sin contacto con el aire, en condiciones anaerobias o cerrado, esto se logra
adicionando al tubo ya sembrado 2 ml de aceite mineral o vaselina lquida estril, lo que sella la
superficie del medio en contacto con el aire. Los tubos se incuban a 35C por 48 h. o ms.
Control de Calidad
Microorganismo Glucosa O Glucosa F Lactosa Sacarosa Maltosa
E. coli A A A A
P. aeruginosa A K K K K
Shigella A A K K
A: Reaccin cida (amarillo) K: Reaccin alcalina.
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MEDIO SIM (SULFURO, INDOL, MOVILIDAD)
Aplicacin
Este medio sirve para ver la produccin de sulfuro de hidrgeno, la movilidad y la produccin de indol
a partir de triptfano.
Peptona 20 g Extracto de carne 3g
Citrato de amonio y hierro (II) 0,2 g Tiosulfato de sodio 0,2 g
Agar 3g
pH final: 7,3
Preparacin
1. Se suspenden 26,4 g en 1 L de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio por completo.
2. Se distribuye en 3 mL en tubos 12 x 75
3. Se esteriliza en el autoclave a 121C durante 15 min. y 15 lbs. de presin.
4. El medio preparado es claro y de color amarillo.
5. Se marcan los tubos con SIM.
Fundamento
El medio combina tres tipos de prueba: movilidad, para ello utiliza un medio semisolido con una poca
concentracin de agar; la produccin de sulfuro de hidrgeno a partir de la degradacin del sulfato, lo
que da lugar a sulfuro ferroso (al combinarse con el hierro) que se forma a lo largo del inoculo, o en
partes del medio donde se ha movilizado la bacteria (color negro); la produccin de indol a partir del
triptofano (de la peptona) del medio, da como resultado un color rojo al adicionar reactivo de Kovacs,
de Ehrlich o de Gilles.
Control de calidad
Cepas de ensayo H2S Movilidad Indol
Escherichia coli - + +
Klebsiella pneumoniae - - -
Proteus mirabilis + + -
Proteus vulgaris + + +
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Preparacin de reactivos y colorantes
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COLORANTES PARA GRAM
Existen diferentes formas de preparar los reactivos utilizados para la coloracin de Gram, esta es la
modificacin de Hucker.
MATERIALES
Probetas graduadas Mortero con piln
Papel filtro Colorantes
Frascos limpios de 1 o litro Sales
Embudos Etiquetas
COLORANTE DE CRISTAL VIOLETA PARA GRAM

Solucin A
Cristal violeta 5g Alcohol etlico 96 50 mL
Solucin B
Oxalato de amonio 2,5 g Agua destilada a 60 C 100 mL
Preparacin
1. Colocar el cristal violeta en un mortero y con el piln ir machacando los cristales de colorante.
2. Aadir el alcohol y disolver el colorante con ayuda del piln.
3. Disolver el oxalato de amonio en agua destilada.
4. Mezclar las soluciones A y B. Completar a un litro con agua destilada
5. Despus de 24 horas filtrar y colocar en frasco para colorante.
6. La solucin de cristal violeta debe ser filtrada frecuentemente debido a que se forman cristales
que pueden confundir la interpretacin de las observaciones.
SOLUCION DE YODO DE GRAM

Cristales de yodo 1g Yoduro de potasio 2g
Agua destilada 300 ml
Preparacin
1. En un mortero colocar los cristales de yodo y el yoduro de potasio.
2. Moler agregando agua poco a poco y muy suavemente hasta disolver.
3. Colocar en una botella color mbar y completar con el resto del agua
SOLUCION DECOLORANTE DE GRAM

Alcohol etlico 96% 100 mL Acetona 100 mL
Preparacin
1. Mezclar y conservar en frasco de vidrio.
2. Como solucin decolorante se puede utilizar alcohol etlico 95% sin aadir acetona, en este caso
el tiempo de decoloracin debe prolongarse.
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COLORANTE DE SAFRANINA
Solucin stock
Safranina O 2,5 g Alcohol etlico 96% 100 mL
Solucin de trabajo
Solucin stock 10 mL Agua destilada 90 mL
Preparacin
1. En un mortero colocar los cristales de safranina y aadir el alcohol, se disolver fcilmente y
colocarlo en una frasco de vidrio
Observaciones
Los frascos cuentagotas y sus tapas deben ser lavados con todo cuidado cada vez que se
renueve su contenido.
El tiempo de uso de los colorantes es de 6 meses a partir de la fecha de preparacin.
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COLORANTES PARA ZIEHL-NEELSEN
Este es una coloracin para demostrar la presencia de bacilos acido alcohol resistentes que es
caracterstico en la infecciones por Mycobacterium.
COLORANTE DE FUCSINA FENICADA

Solucin A
Fucsina bsica 3g Alcohol etlico de 96% 100 mL
Solucin B
Fenol 5g Agua destilada 100 mL
Preparacin
1. Colocar la fucsina bsica en un mortero y con el piln ir machacando los cristales de colorante.
3. Calentar el fenol suavemente y pesar la cantidad necesaria en una placa de vidrio o luna de reloj.
Aadir el agua destilada.
4. Preparar el carbolfucsina, mezclando 10 mL de la solucin A y 90 mL de la solucin B.
5. Despus de 24 horas filtrar y colocar en frasco para colorante.
6. La solucin debe ser filtrada frecuentemente debido a que se forman cristales que pueden
confundir la interpretacin de las observaciones.
ALCOHOL CIDO (v/v)

Acido clorhdrico concentrado 3 mL Alcohol etlico 96% 97 mL
Preparacin
1. Con la pipeta se deja escurrir el cido clorhdrico por las paredes del matraz que contiene el
alcohol y se agita suavemente.
COLORANTE DE AZUL DE METILENO

Azul de metileno 1g Alcohol etlico 95% 10 mL
Agua destilada 90 mL
Preparacin
1. El azul de metileno de disuelve por agitacin y se agrega agua destilada hasta completar 100 mL
2. Se deja reposar 24 horas y se filtra antes de usar.
FENOL AL 5% EN ALCOHOL 96% (p/v)

Fenol lquido 50 g Alcohol 96 c.s.p. 1 Litro
Preparacin
2. Aadir el alcohol y guardar en un frasco de color mbar.
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COLORANTES PARA WAYSON
Este es una coloracin monocromtica que es util para demostrar la presencia de microorganismos
en muestras como lquido cfalo raqudeo.
COLORANTE DE WAYSON
Solucin A
Fucsina bsica 0,2 G Alcohol etlico de 96% 20 mL
Azul de metileno 0,75 g
Solucin B
Fenol 10 g Agua destilada 200 mL
Preparacin
1. Colocar la fucsina bsica en un mortero y con el piln ir machacando los cristales de colorante.
2. Aadir el azul de metileno y proceder de la misma forma
Aadir el agua destilada.
5. Preparar el colorante mezclando lentamente la solucin A y la solucin B.
6. Despus de 24 horas filtrar y colocar en frasco oscuro.
7. La solucin debe ser filtrada frecuentemente debido a que se forman cristales que pueden
confundir la interpretacin de las observaciones.
TECNICA DE COLORACIN
1. Hacer un extendido de la muestra y dejar secar
2. Fijar al calor las lminas
3. Colorear con Wayson por 10 segundos
4. Lavar con agua y secar
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ESTANDAR DE TURBIDEZ - ESCALA DE Mc FARLAND
Este es un patrn de turbidez muy utilizado en la pruebas de susceptibilidad antibitica (tubo 0,5), en
algunas pruebas de identificacin semiautomatizada y en la preparacin de antgenos para
inoculacin de animales.
Reactivos
1. Solucin de cloruro de bario 0,048 M p/v: Pesar 1,175 g de BaCl2.2H2O, Colocar en una fiola de
100 mL y aadir agua destilada c.s.p. 100 mL
2. Solucin de cido sulfrico 0,18 M v/v: Medir 1 ml de cido sulfrico Q.P., Colocar en una fiola de
100 mL y aadir agua destilada c.s.p. 100 mL
Preparacin
1. Aadir las cantidades que se indican en la tabla para conseguir el patrn que se necesita:
Tubo N Cloruro de Bario Acido Sulfrico Equivalente de Densidad ptica
1% 1% millones de a 625 nm
bacterias x mL
0,5 0,05 9,95 150 0,08 - 0,1
1 0,1 9,9 300 0,16 - 0,2
2 0,2 9,8 600 0,32 - 0,4
3 0,3 9,7 900 0,48 - 0,6
4 0,4 9,6 1200 0,64 - 0,8
5 0,5 9,5 1500 0,8 - 1
6 0,6 9,4 1800
7 0,7 9,3 2100
8 0,8 9,2 2400
9 0,9 9,1 2700
10 1,0 9,0 3000
2. Si solo se va a preparar el estndar 0,5:
a. Medir 10 mL de la solucin de cido sulfrico.
b. Retirar con una pipeta 50 L de la solucin.
c. Aadir 50 L de la solucin de cloruro de bario y mezclar bien.
3. Si se cuenta con un espectrofotmetro, verificar la densidad correcta del estndar, cuya
absorbancia a 625 nm debe ser la indicada en la tabla.
4. Colocar la solucin preparada en los tubos que se van a utilizar para comparacin, sellarlos y
etiquetarlos indicando el tipo de solucin, la fecha de preparacin y la fecha de expiracin (6
meses).
5. Guardar los tubos en oscuridad a temperatura ambiente.
6. El tubo de uso rutinario se debe utilizar durante un mes para luego descartarlo y usar otro del
stock.
7. Existen estndares preparados comerciales que estn compuestos por agua ultrapura que
contiene microesferas de styrene di-vinyl benzene en tubos de borosilicato.
Pag 59
PRUEBA DE OXIDASA
Principio:
Determinar la presencia de la enzima oxidasa.
Propsito:
Se usa para separar Pseudomonas, bacilos Gram negativos no fermentadores y otras bacterias que
son oxidasa positivo de las bacterias oxidasa negativa como Enterobacteriaceae.
Fundamento
La prueba de oxidasa esta basada en la produccin bacteriana de una enzima de oxidasa intracelular.
La reaccin es debida a la presencia de un sistema de citocromo oxidasa que activa la oxidacin del
citocromo reducido por oxgeno molecular, que a su vez acta como un aceptador de electrones en la
fase terminal del sistema de transferencia de electrones.
Reactivos
Reactivo de Kovac: 1% N,N,N,N-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride; Solucin incolora o
ligeramente rosada (Sigma, guardar a temperatura ambiente).
Se puede utilizar N,N-dimethyl-p-phenylene-diamina dihydrochloride, el procedimiento es igual, pero
la reaccin es de color rojizo.
Preparacin
1. Usando un palito de dientes, ponga una pizca del reactivo en 2 ml de agua destilada.
2. Mezcle completamente y ponga una etiqueta al tubo.
Procedimiento:
1. Agregue 3 o 4 gotas de reactivo de oxidasa a un pedazo de papel de filtro.
2. Con una asa de platino (o varilla de plstico, mondadientes o varilla de madera), ponga un poco
de la colonia sospechosa hacia el rea hmeda en una lnea.
3. Se considera positivo cuando aparece un color azul que aparece a los 10 segundos.
4. Si no ocurre un cambio de color dentro de diez segundos, la prueba de oxidasa es negativa.
Control de calidad
Pseudomonas aeruginosa da una Reaccin positiva con cambio de color dentro de 10 segundos.
Escherichia coli da una reaccin negativa sin cambio de color dentro de 10 segundos.
Comentarios:
1. No utilice asas con alambre de nicrn pues dan resultados falsos positivos.
2. Las soluciones preparadas son estables por una semana entre 4-8 C en un tubo protegido de la
luz.
3. No realice pruebas de oxidasa a partir de medios que contengan azcar: agar TSI, agar
Hecktoen, XLD, agar TCBS, Agar MacConkey u otro medio similar.
4. Ponga etiquetas al tubo de reactivo preparado.
5. Use controles cada da que utilice el reactivo y escrbalo en una hoja de control de calidad.
6. Use precauciones de seguridad en la preparacin del reactivo y su manipulacin por ser un
reactivo altamente txico
Pag 60
REACTIVOS PARA MR VP
ALFA NAFTOL
Alfa naftol 5g Alcohol 95 100 mL
Preparacin
1. Pesar 100 mg de alfa naftol y colocarlos en tubos con tapa de jebe, guardarlos en la oscuridad.
2. Aadir 2 mL de alcohol al 95 a un tubo cuando se necesita preparar nuevo reactivo.
3. Colocar en un frasco gotero de color mbar.
4. La fecha de expiracin es a los 30 das a temperatura ambiente.
5. No es necesario preparar el volumen total pues el reactivo se deteriora a los 30 das y es
conveniente preparar lo suficiente para lo que necesita un laboratorio pequeo. Si es necesario
se puede preparar cantidades mayores conservando las proporciones.
HIDRXIDO DE POTASIO AL 40%

Hidrxido de potasio 40 g Agua destilada c.s.p. 100 mL
Preparacin
1. Pesar el hidrxido de potasio y colocarlo en una fiola, aadir agua destilada en cantidad suficiente
para llegar a 100 mL.
2. Guardar en una botella de plstico con gotero.
3. Existe una variante en la que se aade creatinina al 0,3% (300 mg)
INDICADOR DE ROJO DE METILO

Rojo de metilo 0,1 g Alcohol 95 300 mL
Agua destilada c.s.p. 500 mL
Preparacin
1. Disolver 0,1 g de Rojo de Metilo en 300 ml de alcohol de 95
2. Diluir a 500 ml con agua destilada.
Pag 61
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Pag 62

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Autores:

Alfredo Guilln, Nora Bravo

Alfredo Guilln Oneeglio

Nora Bravo Cruz

Lima, Marzo del 2008

Caldo infusin cerebro corazn (BHI) 37

El laboratorio de microbiologa clnica necesita para el procesamiento de muestras

COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo pueden ser clasificados en:

1. Los pasos generales

se debe considerar hacerlo solo en casos muy especiales.

que no contienen agar o gelatina son solubles en agua fra.

Foto 2: Conservacin de medios diferenciales en tubos de vidrio con tapn de jebe

5. Rendimiento del medio de cultivo en diferentes envases

CRITERIOS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS

3. Fallas y causas en la preparacin de medios de cultivo:

AGAR AZUL DE BROMOTIMOL LACTOSA CISTINA

AGAR BILIS ESCULINA

Aplicacin Es un medio diferencial para aislamiento e identificacin presuntiva de Streptococcus del

AGAR CARBON DE JONES KENDRICK

AGAR CITRATO DE SIMMONS

AGAR EMB (EOSINA, AZUL DE METILENO)

AGAR LISINA HIERRO (LIA)

AGAR MAC CONKEY

AGAR MAC CONKEY SORBITOL

AGAR MANITOL SALADO

AGAR SABOURAUD GLUCOSA 4%

AGAR SANGRE AZIDA

AGAR SS (SALMONELLA SHIGELLA)

AGAR TCBS (TIOSULFATO, CITRATO, BILIS, SACAROSA)

AGAR TRIPTICASA SOYA (TSA)

AGAR TSI (TRIPLE SUGAR IRON)

AGAR UREA SEGN CHRISTENSEN

AGAR XLD (XILOSA, LISINA, DESOXICOLATO)

CALDO INFUSIN CEREBRO - CORAZN (BHI)

CALDO PEPTONADO ALCALINO

CALDO PEPTONADO CON CLORURO DE SODIO

CALDO TRIPTICASA SOYA (TSB)

CALDO UREA SEGN STUART

MEDIOS DE HEMOCULTIVO BIFASICO

Tamao de frasco de Medio 50 mL 60 mL 100 mL 120 mL

2. Aadir 0,25 g de polianetol sulfonato de sodio.

Lote Fecha Numero de Frascos Tasa de Control Produccin

MEDIO DE MUELLER HINTON

MEDIO DE TRANSPORTE DE AMIES

MEDIO DE TRANSPORTE DE CARY Y BLAIR

MEDIO MIO (MOVILIDAD, INDOL, ORNITINA)

MEDIO MR VP (ROJO DE METILO, VOGES- PROSKAUER)

MEDIO O/F (OXIDACIN / FERMETACIN)

MEDIO SIM (SULFURO, INDOL, MOVILIDAD)

Preparacin de reactivos y colorantes

COLORANTES PARA GRAM

COLORANTE DE CRISTAL VIOLETA PARA GRAM

SOLUCION DE YODO DE GRAM

SOLUCION DECOLORANTE DE GRAM

COLORANTES PARA ZIEHL-NEELSEN

COLORANTE DE FUCSINA FENICADA

ALCOHOL CIDO (v/v)

COLORANTE DE AZUL DE METILENO

FENOL AL 5% EN ALCOHOL 96% (p/v)

COLORANTES PARA WAYSON

ESTANDAR DE TURBIDEZ - ESCALA DE Mc FARLAND

HIDRXIDO DE POTASIO AL 40%