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El mejoramiento gentico de los procesos que dan

productos microbianos.
Adrio JL , AL Demain .

Fuente
Departamento de Biotecnologa, Puleva Biotech, SA, Granada, Espaa. jladrio@pulevabiotech.es

Aunque los microorganismos son muy buenos en presentarnos con una increble variedad de
productos de valor, por lo general los producen nicamente en las cantidades que se necesitan
para su propio beneficio, por lo que tienden a no producir en exceso sus metabolitos. En los
programas de mejora de tensin, una cepa que produce un alto ttulo es generalmente el objetivo
deseado. La gentica ha tenido una larga historia de contribuir a la produccin de productos
microbianos. Los enormes aumentos en la productividad de la fermentacin y la disminucin de
costes resultantes han surgido principalmente por mutagnesis y anlisis / seleccin para mayores
cepas microbianas productoras y la aplicacin de tecnologa de ADN recombinante.

introduccin

Los microorganismos pueden generar nuevos caracteres genticos ('genotipos') por twomeans:
mutacin y recombinacin gentica. En mutacin, un gen se modifica ya sea unintentially
('mutacin espontnea') o intentially ("mutacin inducida ').

Aunque el cambio es generalmente perjudicial y eliminados por la seleccin, algunas mutaciones


son beneficiosas para el microorganismo. Incluso si no es beneficioso para el organismo, pero
beneficiosa para los humanos, la mutacin puede ser detectado por cribado y se pueden conservar
indefinidamente. Esto es precisamente lo que hicieron los microbilogos de fermentacin en los
programas de desarrollo de cepas que dieron lugar a la gran expansin de la industria de la
fermentacin en la segunda mitad del siglo XX.

Fue una suerte que el desarrollo intensivo de la gentica microbiana se inici en la dcada de 1940
cuando la produccin fermentativa de la penicilina se convirti en una necesidad internacional. Los
primeros estudios en gentica bsica se concentr en la produccin de mutantes y sus
propiedades. La facilidad con que "permanentes" ofmicroorganisms caractersticas se podra
cambiar por mutacin y la simplicidad de las tcnicas de mutacin tenan un gran atractivo para los
microbilogos. As comenz la cooperativa de tensin seleccin "programa entre los trabajadores
en los EE.UU. Departamento de Agricultura de los laboratorios en Peoria, de la Carnegie Institution,
Universidad de Stanford y la Universidad de Wisconsin, seguido por los amplios programas
individuales que todava existen hoy en da en los laboratorios industriales en todo el mundo . Es
evidente que la mutacin ha sido el principal factor implicado en la cien a mil veces los aumentos
obtenidos en la produccin de metabolitos microbianos y que la capacidad para modificar
genticamente un cultivo microbiano a una mayor productividad ha sido el factor ms importante
para mantener la industria de la fermentacin en su estado viable, sano.

Aplicaciones de la mutacin
La mutacin ha mejorado la productividad de los cultivos industriales (Vinci
y Byng, 1999;. Parekh et al, 2000). Tambin se ha utilizado para cambiar la
proporcin de los metabolitos producidos en un caldo de fermentacin a
una distribucin ms favorable, elucidar las rutas del metabolismo
secundario, proporcionando compuestos nuevos, y para otras funciones. El
ms comn
mtodo utilizado para obtener altos rendimientos mutantes es tratar a una
poblacin con un agente mutagnico hasta una cierta 'deseado'
matar se obtiene placa a los sobrevivientes y probar cada colonia resultante
o un grupo seleccionado al azar de colonias para la formacin de producto
en frascos. Los mutgenos ms tiles incluyen nitrosoguanidina (NTG), 4-
nitroquinolone-1-xido, sulfonato methylmethane (MMS),
etilmetanosulfonato (EMS), hidroxilamina (HA) y la luz ultravioleta
(UV). El nivel ptimo de matar para aumentar la produccin de antibiticos
se cree que es en el rango de 70-95% (Simpson & Caten, 1979), aunque
algunos programas industriales utilizan niveles mucho ms altos, por
ejemplo, hasta 99,99%. Es incorrecto condenar un procedimiento de
mutacin y seleccin, ya que, en promedio, se reduce la capacidad de
produccin y, de hecho, este es el caso para la mutagnesis con xito. Uno
slo debe estar interesado en la frecuencia de mutantes mejorados.
Aunque las clulas individuales o esporas se prefieren para la mutagnesis,
no formadoras de esporas organismos filamentosos han sido
mutado con xito por mutagnesis de micelios, los protoplastos y la
regeneracin de la preparacin en medio slido (Keller,
1983). La sonicacin se utiliza a veces para romper Streptomyces micelio
despus de la mutagnesis y antes de la deteccin de
mutantes mejorados (Takebe et al., 1989). Mal esporulantes organismos
filamentosos pueden ser mutagenizado despus de la fragmentacin o la
formacin de protoplastos (Kim et al, 1983;.. Kurzatkowski et al, 1986).
Informacin ms detallada se puede encontrar en varias revisiones
authorative sobre gentica y especialmente en la mutacin en
actinomicetos (Baltz, 1986, 1995, 1998, 1999; Hopwood, 1999).
Los mutantes que producen quantites aumento de metabolitos gentica ha
tenido una larga historia de contribuir a la produccin de productos
microbianos. Los enormes aumentos en la productividad de fermentacin y
los consiguientes descensos en los costos han surgido principalmente por
mutagnesis y seleccin de mayores tensiones producingmicrobial. Al
menos cinco diferentes clases de genes controlar la produccin de
metabolito (Malik, 1979): (i) los genes estructurales que codifican sintasas
de producto, (ii) genes reguladores que determinan el inicio y la expresin
de genes estructurales, (iii) los genes de resistencia que determinan la
resistencia de la productor a su propio antibitico, (iv) los genes que
regulan la permeabilidad de entrada,
la exclusin y la eliminacin del producto, y (v) los genes reguladores que
controlan las vas que proporcionan los precursores y cofactores. La
sobreproduccin de metabolitos microbianos se efecta por (i) el aumento
de piscinas precursoras, (ii) la adicin, modificacin o eliminacin de genes
reguladores, (iii) modificacin de promotor, terminador y / o secuencias
reguladoras, (iv) el aumento de nmero de copias de genes que codifican
enzimas que catalizan cuello de botella reacciones, y (v) la eliminacin de la
competencia vas innecesarias (Strohl, 2001). Hace ya ms de 60 aos
desde el primer mutante penicillinproducing superior, Penicillium
chrysogenum X-1612, se aisl afer de rayos X mutagnesis. Esto anunci el
comienzo de una larga y exitosa relacin entre la mutacin gentica y la
microbiologa industrial (Hersbach et al., 1984).
La mejora de la produccin de penicilina por una mejora de tensin
convencional result tanto del gen mejorada
expresin y de amplificacin gnica (Barredo et al, 1989;.. Smith et al,
1989). Los niveles aumentados de ARNm correspondiente a los tres
enzimas de la biosntesis de la penicilina G se encontr en alta penicilina
producir cepas de P. chrysogenum en comparacin con cepas de tipo
salvaje (Smith et al., 1990). De alta produccin cepas contenan una regin
amplificada; una regin 106-kb amplificado cinco a seis veces como
repeticiones en tndem se detect en una cepa de alta produccin,
mientras que de tipo salvaje P. chrysogenum y cepa original de Fleming de
P. notatum slo contena un nico copia (Fierro et al., 1995). Mejora cepa ha
sido el principal factor implicado en la consecucin de ttulos
impresionantes de metabolitos industriales. El ttulo de produccin de
tetraciclina ya en 1979 se inform de que ms de 20 g L_1 (Podojil et al.,
1984), principalmente debido a la tensin mejora. Ms tarde, los ttulos de
30-35 g L_1 se lleg a la clortetraciclina y la tetraciclina. El ttulo de
produccin de la penicilina es 70 g L_1 y que de cefalosporina C durante 30
g L_1 (Elander, 2003). El ttulo de la produccin de tilosina se ha informado
de que ms de 15 g L_1 (Chen et al., 2004) y el de salinomicina es 60 g L_1
(Liu, 1982).
Mutantes morfolgicos y pigmento
Aunque casi nada se sabe acerca de los mecanismos que causan una mayor produccin en
superiores mutantes aleatorios o morfolgicas, es probable que muchas de estas
mutaciones implican genes reguladores, especialmente como mutantes reguladores bsicos
obtenidos en los estudios genticos se encuentran a veces a ser alterado en la morfologa
colonial. Por lo tanto, morphologicalmutants han sido muy importantes en la mejora de la
tensin. Estos incluyen mutantes afectados en la formacin de micelios, que producen
colonias con una apariencia modificada o un nuevo color. Los cambios de color han sido
tambin importante para los productores de pigmentos (Tabla 1).

Mutantes auxotrficos
Muy temprano en el desarrollo de los conceptos de regulacin, los genetistas se dio cuenta
de que el producto final de una ruta biosinttica de un control estricto de metabolitos
primarios ejercicios sobre la cantidad de un compuesto intermedio acumulado por un
mutante auxotrfico de esa va. Slo en una concentracin growthlimiting del producto final
sera una gran acumulacin del sustrato de la enzima deficiente se producen.
Este principio de la disminucin de la concentracin de un producto final inhibidor o
represor para eludir la inhibicin por retroalimentacin o represin se llev a cabo mejor por
el uso de mutantes auxotrficos. En efecto, la mutacin auxotrfica ha sido un factor
importante en la produccin industrial de productos primarios, tales como aminocidos y
nucletidos (Tabla 1). La produccin de productos secundarios tales como los antibiticos
tambin es notablemente afectado por la mutacin auxotrfica, incluso cuando auxotrofos
se cultivan en medios nutricionalmente completos y complejos incluso. Aunque el cambio
en la formacin del producto es por lo general en la direccin negativa, mayor productoras
de auxotrofos se obtienen de los productores de antibiticos.
Cuando varios metabolitos primarios son producidos por una sola va ramificada mutacin,
en una rama de la
va a menudo conduce a la sobreproduccin del producto de la otra rama. Los ejemplos
incluyen la sobreproduccin de
fenilalanina por tirosina auxtrofos y viceversa, y la sobreproduccin de lisina por
auxotrofos requieren treonina y metionina. En el caso de vas ramificadas que conducen a
un metabolito primario y un secundario de metabolitos, mutantes auxotrficos que
requieren el metabolito primario veces sobreproducir el metabolito secundario (Tabla 1).
Reversin de un auxtrofo a prototrofa a veces conduce a prototrofos nuevos que poseen
una mayor actividad de la enzima
que presente en el original 'abuelo' prototroph. Tal aumento de la actividad enzimtica fue
probablemente el resultado de una
mutacin del gen estructural de la produccin de una enzima ms activo o una enzima
menos sujeta a la inhibicin por retroalimentacin (Tabla 1).

Reversiones de los no mutantes productores


Una alta proporcin de tales mutantes se ha encontrado para producir mayores cantidades
de antibiticos (Tabla 1).
Antimetabolito de mutantes resistentes a estudios bsicos sobre regulacin han
demostrado que es posible seleccionar mutantes reguladores, que sobreproducen los
productos finales de las vas principales, utilizando anlogos de metabolitos txicos. Tales
antimetabolito de mutantes resistentes a menudo poseen enzimas que son insensibles a la
inhibicin por retroalimentacin, o enzymeforming sistemas resistentes a la represin
retroalimentacin. La seleccin de mutantes resistentes a anlogos txicos de los
metabolitos primarios ha sido ampliamente empleado por los microbilogos industriales
(tabla 1).
Una variacin de las tcnicas de seleccin antimetabolitos es posible cuando un precursor
es txico para el organismo productor. El principio aqu es que el mutante ms capaz de
desintoxicar el precursor mediante su incorporacin en el antibitico ser el mejor
productor de la presencia del precursor (Tabla 1). Cuando el metabolito secundario
producido es en s mismo un inhibidor de crecimiento del cultivo de produccin, como en el
caso de ciertos antibiticos, el metabolito
a veces puede ser utilizado para seleccionar mutantes resistentes que son productores
mejorados.
Ciertas mutaciones de resistencia a estreptomicina causar aumento de la produccin de
antibiticos no relacionados. Adems de
mejora en la formacin de metabolitos secundarios por la mutacin a la resistencia a la
estreptomicina, la resistencia a la gentamicina o
a la paromomicina es an ms eficaz. Adems, triple mutacin de resistencia a la
estreptomicina, gentamicina
y rifampicina, cada uno de ellos individualmente aumento de la formacin de actinorrodina,
se encontr que era la ms eficaz
(Tabla 1).

Mutantes resistentes a la represin nutricional


Represin nutricional tambin puede ser disminuido por mutacin a la resistencia
antimetabolito. Ejemplos de agentes de seleccin son 2-desoxiglucosa (2-DOG) para
enzimas y rutas controladas por regulacin de la fuente de carbono (Tabla 1), metilamonio
para aquellos regulados por la represin de fuente de nitrgeno, y arseniato de regulacin
fosfato.
Los mutantes que utilizan fosfato de forma menos eficiente para el crecimiento de la
produccin de antibiticos a veces muestran mejorado. Por lo tanto,
la deteccin de pequeas colonias en fosfato de limitacin de medios de comunicacin
puede ser una tcnica til para la mejora de la cepa fosfato productos regulados (Tabla 1).

Mejorar la produccin de agar


En muchos casos, el rendimiento de fermentacin sobre una placa de agar se relaciona con
la produccin en cultivo sumergido lquido, y el mtodo tiene aplicacin como un medio
para detectar mutantes superiores. Las denominadas 'zonas' mutantes han demostrado ser
tiles para la mejora de varios procesos diferentes (Tabla 1).
Una modificacin ampliamente utilizado consiste en la produccin de antibiticos por
colonias en enchufes separados de agar seguido de
La colocacin de los tapones en una placa de ensayo de semillas y la medicin de las zonas
claras resultantes. El uso de este
'Mtodo pieza agar' result en una mejora de la produccin de antibiticos (Tabla 1). Agar-
pieza de deteccin de antibiticos
produccin en presencia de niveles inhibidores de fosfato (15 mM) condujo al aislamiento
de seis notablemente mejoradas y estables cepas de Streptomyces hygroscopicus que
producen el macrlido antifngico complejo '165 '(Gesheva, 1994).

Mutantes de permeabilidad
Excrecin del producto en cepas superproductoras a menudo se produce cuando la
captacin y / o catabolismo se ve perjudicada. As, gentica
lesiones eliminando captacin activa puede ser utilizada para mejorar especficamente la
excrecin de metabolitos (Tabla 1). A menudo es de beneficio para aislar mutantes
incapaces de crecer en el producto deseado en forma de carbono nica o fuente de energa.
Tal
mutantes a menudo estn daados en su capacidad de recogida del producto y contienen
bajos niveles intracelulares de la
producto, disminuyendo as la regulacin feedback. En ciertos mutantes mejorados, hay un
aumento en la sensibilidad
a desoxicolato y la lisozima, que indica un cambio en la permeabilidad.

Los mutantes que muestran cambios cualitativos en los productos offermentation themix
Como muchos organismos producen metabolitos secundarios como mezclas de una familia
qumica o de varias familias qumicas, la mutacin se ha utilizado para eliminar los
productos no deseados en tales fermentaciones. Un ejemplo es el de Nakatsukasa y Mabe
(Nakatsukasa y Mabe, 1978), quienes encontraron que en estras, una sola colonia aislado
natural de Streptomyces aureofaciens (que produce la narasina politer y el enteromycin
antibitico de amplio espectro) en galactosa llev a sectorizacin amarillo y negro . El
efecto era especfico para la galactosa. De los cuatro tipos de colonias obtenidas, una
producida solo narasina y dos produjeron slo enteromycin.
Streptomyces griseus ssp. cryophilus hace cuatro R3_ sulfatados y no sulfatados R3_ cuatro
carbapenems. Las formas sulfatados son menos activas que las formas no sulfatados. Para
eliminar completamente las formas sulfatados R3, mutantes de sulfato de transporte se
obtuvieron. Estos eran de dos tipos: (i) auxtrofos para tiosulfato o cistena, y (ii) los
mutantes resistentes a selenato. Cada tipo producido formas completamente no sulfatado y
los ttulos fueron equivalentes a la titulacin total de la matriz (Kitano et al., 1985).
Ocho avermectinas son producidos por Streptomyces avermitilis, de los cuales slo un
pequeo nmero son deseables. Un mutante nonmethylating producido slo cuatro de los
compuestos y un mutante que no lograron el sustituyente 25-isopropilo (de valina) produjo
una mezcla de diferentes componentes. Por fusin de protoplastos, una cepa hbrida que se
obtuvo hecho solamente dos componentes, B2a y B1a (Omura et al., 1991). Stutzman-
Engwall y colegas (. Stutzman-Engwall et al, 2003) introdujeron mutaciones aleatorias por
PCR en el gen aveC y obtenido un mutante que produce una avermectina B1: B2 relacin de
2,5, mejorado mucho sobre la relacin de 0,6 de la matriz S. avermitilis colar.
La mutacin fue utilizado para eliminar el sulochrin polictidos indeseable y cido asterric a
partir de caldos de la lovastatina
productor, Aspergillus terreus (Vinci et al., 1991). Los mutantes tambin se han empleado
para eliminar coproductos no deseados de la fermentacin monensina (Pospisil et al., 1984).

Los mutantes que producen newantibiotics


Metodologa mutante se ha utilizado para producir nuevas molculas. La utilidad mdica
demetiltetraciclina productos y doxorrubicina fueron descubiertas por simple mutacin de
los cultivos productores de tetraciclina y daunorrubicina,
respectivamente. Ms tarde, la tcnica de 'biosntesis mutacional' (mutasynthesis =) fue
ideado (Shier et al., 1969). En este proceso, un mutante bloqueado en el metabolismo
secundario es alimentado anlogos de la fraccin cuya biosntesis est bloqueada. Si tiene
xito, el mutante (denominado 'idiotroph') produce un nuevo derivado antibitico (Nagaoka
y Demain, 1975). Los hybramycins fueron los compuestos primero para hacer de esta
manera (Shier et al., 1969). Desde entonces, la biosntesis mutacional ha sido utilizado para
el descubrimiento de muchos nuevos metabolitos secundarios (Lemke y Demain, 1976;
Daum y Lemke, 1979;. Kitamura et al, 1982). El ms conocido es la doramectina comercial
agente antihelmntico, la produccin de los cuales emplea un mutante de la avermectina
productor S. avermitilis (Cropp et al., 2000).
Nuevas antraciclinas y agliconas se han aislado a partir de mutantes bloqueados de la
daunorrubicina y doxorrubicina
productores (Cassinelli et al, 1980;.. McGuire et al, 1981). Mediante la adicin de
carminomycinone o dihydrocarminomycinone 13 a un idiotroph de Streptomyces galilaeus
(el productor de aclacinomicina), las agliconas se glicosilada para formar un trisacrido
antraciclina nuevo, trisarubicionol (Yoshimoto et al., 1981). Nuevos antibiticos macrlidos
han sido producidos a partir de mutantes bloqueados de la tilosina-productor, Streptomyces
fradiae (Kirst et al., 1983). Cuatro nuevos antibiticos macrlidos hbridos fueron obtenidos
por la alimentacin de B a un eritronolido
comandos mutante del productor oleandomicina, Streptomyces antibioticus (Spagnoli et al.,
1983). Un comandos-mutante del productor mycinamicin, Micromonospora polytrota, se
aliment varios precursores rosaramicin y los convirti en rosaramicins nuevos (Lee et al.,
1983).
El uso de mutantes de dilucidar las rutas biosintticas
Un uso adicional de los mutantes ha sido la de las rutas metablicas. Esto
se ha explotado para la biosntesis de las tetraciclinas (McCormick, 1965),
novobiocina (Kominek, 1972), eritromicina (Martin et al, 1966.;
Martin & Rosenbrook, 1967), neomicina (Pearce et al., 1978), tilosina (Baltz
et al., 1983), otros aminoglucsidos
(Penzikova y Levitov M, 1970; Takeda et al, 1978;. Fujiwara et al, 1980;.
Kase et al, 1982;. Hanssen & Kirby, 1983), rosaramicin (. Vaughn et al,
1982), daunorubicina (McGuire et al, 1981), otras antraciclinas (Motamedi
et al, 1986;... Yue et al, 1986), actinomicina (Troost y Katz, 1979),
carbapenemes (Nozaki et al, 1984;.. Kojima et al, 1988), ansamicinas (Kibby
et al, 1980;.. Ghisalba et al, 1981), la patulina (Gaucher et al, 1981.) y
fenacinas (Byng et al, 1979.).
La recombinacin gentica
En contraste con la ofmutation amplio uso en la industria, la recombinacin
gentica no se utiliza mucho en la primera, a pesar de las reivindicaciones
iniciales de xito (Jarai, 1961; Mindlin, 1969), debido principalmente a la
ausencia o la frecuencia extremadamente baja de recombinacin gentica
en microorganismos industriales (en estreptomicetos, por lo general era
10_6 o incluso menos). Otros problemas fueron evidentes con los hongos
productores de b-lactama. Aunque Aspergillus exhibi la reproduccin
sexual y parasexual, los gneros ms comercialmente interesante,
Cephalosporium y Penicillium, fueron los ms difciles de trabajar, ya que
slo reproducen parasexually, que rara vez dio como resultado la
recombinacin. Recombinacin se pareca a errneamente como una
alternativa a la mutacin en vez de un mtodo que podra complementar
los programas de mutagnesis. La estrategia cepa desarrollo ms
equilibrado y eficiente no enfatizar uno a la exclusin de la otra, sino que
sera contener tanto la mutagnesis de seleccin y componentes de
deteccin de recombinacin. En dicho programa, las cepas en las diferentes
etapas de una lnea mutacional, o de las lneas desarrolladas a partir de
diferentes ancestros, se recombinan. Tales cepas sin duda difieren en
muchos genes y por el cruce de ellos, se podra generar genotipos que
nunca se producira como descendientes estrictamente mutacin de
cualquiera de los padres. Recombinacin fue tambin de importancia en el
mapeo de genes de produccin. Los estudios sobre los mapas genticos de
organismos tales como la produccin excesiva de actinomicetos son
relativamente recientes. El modelo para tales investigaciones fue el mapa
gentico de Streptomyces coelicolor (Kieser et al., 1992), que se encontr
que era muy similar a los de otras especies de Streptomyces, tales como S.
bikiniensis, olivaceous S., S. glaucescens y S . rimosus. La fusin de
protoplastos como se mencion anteriormente, la recombinacin gentica
fue virtualmente ignorado en la industria, principalmente debido a la baja
frecuencia de recombinacin. Sin embargo, el uso de la fusin de
protoplastos cambiado la situacin notablemente. Despus de 1980, hubo
un aumento del inters en la aplicacin de recombinacin gentica para la
produccin de productos microbianos importantes tales como antibiticos.
Hoy en da, las frecuencias de recombinacin se han incrementado a an
mayor que 10_1 en algunos casos (Ryu et al., 1983), y
programas de mejora de cepas habitualmente incluyen la fusin de
protoplastos entre diferentes lneas mutantes. El poder de la recombinacin
fue demostrado por Yoneda (Yoneda, 1980), que recombina mutaciones
individuales, cada uno de los cuales el aumento de la produccin aamylase
por dos a siete veces mayor en Bacillus subtilis. Una cepa construida por
transformacin gentica, que contena los cinco mutaciones, produce 250
veces ms a-amilasa. La recombinacin es especialmente til cuando se
combina con los programas de mutacin convencionales para resolver el
problema de "enfermizos" organismos producidos como resultado de dao
acumulado gentica a lo largo de una serie de generaciones
mutagenizadas.
Por ejemplo, una cruz a travs de la fusin de protoplastos se llev a cabo
con cepas de Cephalosporium acremonium de un programa de mejora de la
cepa comercial. Un ttulo bajo, de rpido crecimiento, que forma esporas
cepa que requiere para producir metionina ptima cefalosporina C se cruz
con un alto ttulo, de crecimiento lento, tensin asporgeno que podra
utilizar el sulfato inorgnico, menos costoso. La progenie incluye un
recombinante que creci rpidamente, esporulado, producido a partir de
cefalosporina C y sulfato de hecho antibitico 40% ms que el padre de alto
ttulo (Hamlyn y Ball, 1979).
La fusin de protoplastos se utiliza para modificar las caractersticas de una mejora de la
penicilina cepa productora de P. chrysogenum que mostr pobre esporulacin y crecimiento
de las semillas pobres. El retrocruzamiento con una baja produccin (12 g L_1) produjo una
cepa de alta produccin (18 g L_1) cepa con esporulacin mejor y un mejor crecimiento en
medio de siembra (Lein, 1986). Interespecfica fusin de protoplastos entre el mellis
osmotolerante cerevisiae y S. cerevisiae altamente fermentativa produjo hbridos estables
de fermentacin altas concentraciones de glucosa (49% ww_1) (Legmann y Margalith,
1983).
Otra aplicacin de la fusin de protoplastos es la recombinacin de los productores a partir
de una sola mutagnesis
tratamiento. Por recombinacin, uno podra combinar las mutaciones yieldincrease y
obtener una an ms superior
productor, antes de llevar a cabo la mutagnesis adicional. Dos mejores cefamicina-C cepas
productoras de Nocardia
Se fusionaron y entre los recombinantes fueron dos cultivos que produjeron antibitico 10-
15% ms que el mejor padre (Wesseling y Lago, 1981). La recombinacin gentica permite
el descubrimiento de nuevos antibiticos por los productores de fusin de distintos o incluso
los mismos antibiticos. A recombinante obtenido a partir de dos diferentes productores de
rifamicina cepas de Nocardia mediterranei produjo dos nuevas rifamicinas (16,17-
dihydrorifamycin S y S 16,17-dihidro-17-hidroxi-rifamicina) (Traxler et al., 1982). Sin
embargo, de acuerdo con Hopwood (Hopwood, 1983), estos ejemplos pueden reflejar la
diferente expresin de genes de matriz A en el citoplasma de padre B, en lugar de la
formacin de antibiticos hbridos. Interespecfica fusin de protoplastos de S. griseus y
otras cinco especies (Streptomyces cyaneus, exfoliatus Streptomyces, griseoruber
Streptomyces, purpureus Streptomyces y Streptomyces
rochei) dio recombinantes de las cuales el 60% no produjeron los antibiticos y 24% de los
antibiticos producidos diferente de las cepas parentales (Okanishi et al., 1996). Nuevos
antibiticos tambin pueden ser creados por el cambio del orden de los genes de un camino
individual en su hospedador nativo (Hershberger, 1996).
Un nuevo antibitico, indolizomycin, fue producido por fusin de protoplastos entre no
antibiticos mutantes productores de
Streptomyces griseus y tenjimariensis Streptomyces (Gomi et al., 1984). Osmotolerancia de
levaduras de alimentos tales como Saccharomyces cerevisiae y S. diastaticus se aument
por fusin de protoplastos con levaduras osmotolerantes. Otros rasgos transferidos entre
levaduras por fusin de protoplastos incluyen floculacin (Panchal et al, 1982.), La
utilizacin de lactosa (Farahnak et al, 1986.), El carcter killer (Bortol et al, 1986;.. Farris et
al, 1992), celobiosa fermentacin (Pina et al., 1986) y la sobreproduccin de metionina
(Brigidi et al., 1988). Plsmidos, transposones, csmidos y fagos ADN plasmdico ha sido
detectada en prcticamente todas las especies de Streptomyces antibioticproducing.
Algunos son plsmidos sexo y constituyen una parte esencial del proceso de recombinacin
sexual y otras contienen cualquiera de los genes estructurales o genes que influyen en la
expresin de alguna manera de la cromosmico
genes estructurales de la biosntesis de antibiticos. La mayora de los plsmidos no tienen
ningn efecto aparente sobre la produccin de metabolitos y los procesos de antibiticos
slo muy pocos biosntesis son codificadas por el plsmido transmitidas por los genes. Sin
embargo, la produccin de methylenomycin A est codificado por genes presentes en el
plsmido SCP1 en Streptomyces coelicolor. Cuando el plsmido se transfiri a
estreptomicetos otros, los receptores produce el antibitico. Durante muchos aos, SCP1
plsmido no se observ nunca o aislarse como una molcula de ADN circular, porque era un
plsmido lineal gigante. Al principio fue difcil de separar dichos plsmidos lineales gigantes
a partir de ADN cromosmico, pero esto fue logrado despus por
electroforesis en campo pulsante o alteracin ortogonal electroforesis en gel de campo
(OFAGE) (Kinashi y Shimaji, 1987). Algunos productos de bacterias unicelulares son
codificada por plsmidos. Estos incluyen aerobactina, un siderforo hidroxamato y factor de
virulencia producida por Escherichia coli (McDougall y Neilands, 1984) y otras bacterias
Gram-negativas (Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Vibrio mimicus, y especies
de Klebsiella, Salmonella y Shigella). Aerobactina es sintetizado por una plsmidos cargo de
cinco genes del clster, que est regulada negativamente por el hierro (Roberts et al,
1986.), Sino que tambin se puede producir a travs de los genes cromosmicos (Moon et
al, 2004.). Tambin parece que la produccin de siderforos por Arizona hinshawii es
codificada por plsmidos. A microcina, un antimetabolito de
metionina, que est producida por E. coli y acta como un inhibidor competitivo de
homoserina-O-transuccinylase, est codificada por un plsmido que se produce en 20
copias por equivalente del genoma (Perez-Diaz & Clowes, 1980). El gen que codifica para el
cuerpo de cristal parasporal (d-endotoxinas) de Bacillus thuringiensis es plsmidos cargo
(Whiteley & Schnepf, 1986;. De Maagd et al, 2003) en la mayora de las especies, pero est
en el cromosoma en algunas otras especies. La inestabilidad en Streptomyces se produce
por macrolesions ambientalmente estimuladas, por ejemplo, supresiones, transposiciones,
reordenamientos y amplificacin de ADN. Se producen espontneamente o son inducidos
por estrs ambiental tales como colorantes intercalantes, la formacin de protoplastos y la
regeneracin, y la fusin de protoplastos interespecfica. Streptomycetes
son los procariotas slo sepa que dan lugar a la amplificacin de ADN espontnea, a veces
de varios
cien copias en tndem, que representan ms del 10% del ADN total, en ausencia de
seleccin. Amplificacin parece estar acoplado a la eliminacin de ADN y puede implicar la
secuencia de insercin (IS)-como elementos (Baltz, 1986). Etidio curas plsmidos de
bromuro en estreptomicetos, pero tambin aumenta la frecuencia de mutaciones de
delecin, especialmente en las zonas de los cromosomas que son ya inestable (Crameri et
al., 1986). Los elementos transponibles, secuencias de ADN que codifican una enzima
transposasa (Berg y Berg, 1983) que se mueven de un replicn a otro sin funciones de
recombinacin de acogida o una extensa homologa con el sitio de integracin, han sido
extremadamente tiles para las siguientes razones: (i) por lo general proporcionar mutantes
estables, nonreverting; (ii) que se puede utilizar para determinar el orden de los genes en
un opern, (iii) que es fcil de seleccionar mutantes transposones porque contienen
marcadores de antibiticos o de resistencia al mercurio; (iv) que proporcionan porttil
regiones de homologa para la movilizacin de cromosmica; (v) que proporcionan
marcadores de genes no seleccionables y permitir la clonacin de genes tales que luego
pueden ser utilizados como sondas de hibridacin para pescar el gen de tipo salvaje a partir
de una biblioteca genmica, y (vi) que a menudo tienen restriccin nico
sitios, y por lo tanto, son buenos marcadores para aislar definidos derivados de delecin o
la localizacin de la posicin precisa de un gen
por mapeo de heterodplex. En la daptomicina productor Streptomyces roseosporus,
algunos mutantes Tn 5099 transposicin producida daptamycin 57-66% ms de la matriz,
mientras que otros producen menos o la misma (McHenney y Baltz, 1996;. Baltz et al,
1997). Transposicin aument la tasa de limitacin de paso de la biosntesis de la tilosina en
Streptomyces fradiae, es decir, la conversin de macrocina a la tilosina. La transposicin de
una segunda copia de tylF en un
sitio neutral en el cromosoma de S. fradiae aument su producto gnico, la produccin de
O-metiltransferasa de macrocina, y tilosina, mientras que disminuye la concentracin del
intermedio final (macrocina). Produccin de tilosina se increment hasta en un 60% y la
concentracin total de macrlido se mantuvo inalterada (Solenberg et al., 1996).
Mutagnesis de transposones eliminado la produccin de la oligomicina txico por la
avermectinproducing Streptomyces avermitilis (Ikeda et al., 1993). La clonacin de un
fragmento de 34 kb a partir de Streptomyces rimosus a travs de un csmido en
Streptomyces lividans y Streptomyces albus como resultado la produccin de oxitetraciclina
por los destinatarios (Binnie
et al., 1989). Contrariamente a los informes anteriores, todos los genes oxitetraciclina
fueron agrupados juntos en el rimosus S.
mapa cromosmico (Butler et al., 1989
Improvementofmicrobial processesby ingeniera gentica
Primarymetabolites
Nuevos procesos para la produccin de aminocidos y vitaminas se han
desarrollado por tecnologa de ADN recombinante. Las cepas de Escherichia
coli se construy con plsmidos portadores de aminocidos operones de
biosntesis de cidos. Transformacin del plsmido se realiza en
Corynebacterium, Brevibacterium y Serratia y, como resultado, tecnologa
de ADN recombinante se ha usado rutinariamente para mejorar tales
comerciales productoras de cido amino-cepas (Sahm et al., 2000). Una
cepa recombinante de E. coli (fabricado por mutacin a auxotrofa
isoleucina, la clonacin en copias adicionales del opern thrABC,
inactivando el gen tdh treonina-degradantes, y la mutacin de resistencia a
altas concentraciones de L-treonina y L homoserina-) produjo 80 g L_1 L-
treonina en 1,5
da, con un rendimiento de 50% (Sahm y Eggeling, 1999). Clonacin de
copias adicionales de genes exportacin de treonina en E. coli condujo a
aumento de la produccin de treonina (Kruse et al., 2002). La introduccin
de la prolina 4-hidroxilasa gen de
Dactylosporangium sp. en una cepa recombinante de E. coli productoras de
L-prolina en 1,2 g L_1 plomo a una nueva cepa produciendo 25 g L_1 de
hidroxiprolina (trans-4-hidroxi-L-prolina) (Shibasaki et al., 2000). Cuando se
aadi prolina, hidroxiprolina alcanz 41 g L_1, con un rendimiento del 87%
a partir de prolina. Una cepa de Corynebacterium glutamicum por
ingeniera gentica de la produccin de 50 g L_1 de L-triptfano se modific
adicionalmente mediante clonacin en copias adicionales de su propio gen
de transcetolasa para aumentar el nivel del precursor eritrosa-4-fosfato de
la biosntesis aromtica (Ikeda y Katsumata, 1999). Un nmero de copias
del plsmido bajo aumento de la produccin a 58 g L_1, mientras que un
alto nmero de copias del plsmido disminucin de la produccin. L-Valina
produccin por VAL1 cepa mutante de C. glutamicum
ascendi a 105 g L_1 (Radmacher et al, 2002;.. Lange et al, 2003). El
mutante se construy por enzimas biosintticas sobreexpresan en un
plsmido, eliminando deshidratasa ilvA que codifica la treonina, y
eliminacin de dos genes que codifican enzimas de la biosntesis de
pantotenato. El cultivo se dej crecer con limitacin de isoleucina y
pantotenato. Mediante la introduccin de treonina deshidratasas resistentes
a la retroalimentacin y copias adicionales de genes que codifican enzimas
ramificados aminocidos y biosntesis, cepas de lisina-o threonineproducing
fueron convertidos en L-isoleucina productores con ttulos de hasta 10 g L_1
(Morbach et al, 1996;. Guillouet et al ., 1999; Hashiguchi et al, 1999).. La
amplificacin de la de tipo salvaje treonina deshidratasa gen ilvA en una
cepa productora de treonina de Corynebacterium lactofermentum llev a 15
g L_1 de sobreproduccin isoleucina (Colon et al., 1995).
La biotina se ha realizado tradicionalmente por sntesis qumica, pero los
microbios recombinantes se han acercado a la competencia
posicin econmica. La clonacin de un opern de biotina (bioABFCD) en un
plsmido multicopia permitidos E. coli para producir 10 000 veces ms
biotina que hizo la cepa de tipo salvaje (Levy-Schil et al., 1993). Mutacin
secuencial de Serratia marcescens a la resistencia a la acidomycin biotina
antimetabolito (= cido actithiazic) condujo a la cepa mutante SB412,
que produjo 20 mg L_1 biotina (Sakurai et al., 1994). Otras mejoras se
hicieron mediante la mutacin seleccionada
cepas a etionina resistencia (cepa ET2, 25 mg L_1), entonces la mutacin
de resistencia a ET2 S-2-aminoetilcistena (cepa ETA23, 33 mg L_1) y,
finalmente, la clonacin en el opern resistente bio (Sakurai et al., 1994)
produciendo un cepa capaz de producir 500 mg L_1 en la cultura
fermentador discontinuo alimentado junto con 600 mg de L_1 CAV biotina.
Ms tarde avances condujo a la produccin recombinante de S. marcescens
de 600 mg L_1 de biotina (Masuda et al., 1995). Un proceso para la
produccin de riboflavina en Corynebacterium ammoniagenes
(anteriormente Brevibacterium ammoniagenes)
fue desarrollado por clonacin y sobreexpresin propios del organismo
genes de biosntesis de riboflavina (Koizumi et al., 2000) y sus secuencias
propio promotor. El cultivo resultante produjo 15,3 g L_1 riboflavina en 3
das. La ingeniera gentica de una cepa de Bacillus subtilis que ya contiene
las mutaciones de purina analogresistance condujeron a la mejora de la
produccin de riboflavina (Perkins y Pero, 1993). Una cepa industrial de B.
subtilis fue producido por la insercin de copias mltiples de la costilla
opern en dos sitios diferentes en el cromosoma, por lo que la resistencia
de purina analgico mutaciones para aumentar la guanosina trifosfato (GTP,
un precursor) la produccin y un anlogo de riboflavina (roseflavin) -
mutacin de resistencia en RIBC que desregulado toda la va (Perkins et al.,
1999). Vitamina C (cido ascrbico) se ha hecho tradicionalmente en un
proceso de cinco pasos predominantlychemical por la glucosa primero la
conversin a cido 2-ceto-L-gulnico (2-KGA) con un rendimiento del 50% y
luego la conversin de la 2-KGA por cido o la base al cido ascrbico. Un
nuevo procedimiento para la sntesis de vitamina C implic el uso de una
cepa genticamente modificada Erwinia herbicola que contiene un gen de
Corynebacterium sp. El organismo de ingeniera convertida en glucosa 1 g
L_1 de 2 - KGA (Anderson et al, 1985; Pramik, 1986.). Un proceso mejor se
ide independientemente, lo que convierte 40 g L_1 glucosa en 20 g L_1 2-
KGA (Grindley et al., 1988). Este proceso implic la clonacin y expresin
del gen que codifica 2,5-diceto-D-gluconato reductasa de Corynebacterium
sp. en Erwinia citreus. Otro procedimiento utiliza una cepa recombinante de
Gluconobacter oxydans que contiene genes que codifican L-sorbosa
deshidrogenasa y L-sorbosona
de G. oxydans T-100. La nueva cepa fue productor mejora de 2-KGA (Saito
et al., 1997). Mutacin adicional para suprimir la va L-idonate y para
mejorar el promotor llev a la produccin de 130 g de 2-L_1 KGA a partir de
150 g L_1 sorbitol. Los carotenoides se producen en exceso mediante la
introduccin de grupos de genes de carotenoides de Erwinia uredovora en
E. coli y que sobreexpresan la sintasa de E. coli fosfato de desoxixilulosa, la
enzima clave de la va biosinttica de isoprenoides no mevalonato
(Matthews y Wurtzel, 2000). El licopeno acumulado a 1,3 mg g_1 peso
celular seco y zeaxantina a 0,6 mg g_1. Clonacin de aldehdo
deshidrogenasa de Acetobacter polyoxogenes en un vector plsmido en
Acetobacter aceti ssp. xylinum aument la tasa de produccin de cido
actico por encima del 100% (1,8 g L_1 H_1 a 4 g L_1 H_1) y el ttulo por
40% (68 g L_1 a 97 g L_1) (Fukaya et al., 1989).
La ingeniera gentica del gen de la deshidrogenasa monofosfato de inosina
(IMP) en una cepa de B. subtilis produce
7 g L_1 de la guanosina deseable y 19 g L_1 de la inosina no deseable
cambiado produccin a 20 g L_1 guanosina
y 5 g L_1 inosina (Miyagawa et al., 1986). Una cepa recombinante de E. coli
se construy la producida
pticamente activo puro D-cido lctico a partir de glucosa en casi el
rendimiento terico mximo, por ejemplo, dos molculas
a partir de una molcula de glucosa (Zhou et al., 2003). El organismo fue
diseado por la eliminacin de los genes de competicin
vas que codifica fumarato reductasa, alcohol / aldehdo deshidrogenasa y
piruvato formiato liasa y por una mutacin en el gen de la quinasa acetato.
Las nuevas tecnologas que han demostrado ser de gran utilidad para
aumentar la produccin de metabolitos primarios incluyen genoma basado
en la reconstruccin de la tensin, ingeniera metablica, y revolver todo el
genoma (vase la seccin sobre nuevas tecnologas genticas).
Secondarymetabolites
La aplicacin de la tecnologa del ADN recombinante para la produccin de metabolitos
secundarios ha sido de gran
inters (Baltz & Hosted, 1996;. Diez et al, 1997). Las herramientas de la gentica
recombinante para aumentar los ttulos de los metabolitos secundarios han incluido: (i)
mutagnesis transposicin, (ii) deleciones y duplicaciones dirigidos por ingeniera gentica
y (iii) recombinacin gentica por fusin de protoplastos (Baltz, 2003). Las recientes
adiciones a estas tcnicas incluyen el anlisis de la genmica, transcriptoma, protemica,
ingeniera metablica, y revolver todo el genoma (vase la seccin sobre las tecnologas
genticas novedosas). Uno de los primeros indicios de que la tecnologa de ADN
recombinante podra
aplicarse a los antibiticos y otros metabolitos secundarios fue que podra llevarse a cabo
en estreptomicetos (Thompson et al., 1982). Los plsmidos se construyeron a partir del
plsmido SLP 1,2 de Streptomyces lividans y SCP2_ plsmido a partir de Streptomyces
coelicolor. En la monta de plsmido-negativo S. lividans, 'pstulas' (zonas circulares de
inhibicin esporulacin asociado con plsmido de transferencia en el csped de crecimiento
estreptomiceto derivados de una poblacin de protoplastos regenerados) se observaron.
Esto era debido a un bucle de una pieza de S. coelicolor ADN, que se convirti en una serie
de pequeos plsmidos de S. lividans (SLP 1,1 a 1,6) que eran buenos vehculos de
clonacin. La ingeniera gentica de los actinomicetos fue limitado por un nmero de aos
por barreras de restriccin que impiden la introduccin del DNA y por la inhibicin del
metabolismo secundario por auto-replicantes plsmido de clonacin vectores (Baltz &
Hosted, 1996), pero estos problemas se superaron principalmente. Las primeras crticas
sobre la clonacin y expresin de genes antibiticos de produccin en Streptomyces eran
por Martin y Gil (Martin & Gil, 1984) y Liras (Liras, 1988). Una posibilidad interesante es la
transferencia de los operones de un estreptomiceto a otro con la esperanza de que los
genes estructurales podran ser ms capaces de expresarse de otra especie. La agrupacin
facilit la transferencia de una va completa en una nica manipulacin. Los estudios
revelaron que muchos genes de biosntesis de antibiticos se organizan en grupos,
incluyendo undecylprodigiosin, actinorhodina, cloranfenicol, rifamicina, cefamicina,
eritromicina, tetraciclina y tilosina entre otros. Por lo tanto, la va de undecylprodigiosin
completo (va "rojo") de S. coelicolor se transfiri en un fragmento de 37-kb en
Streptomyces parvulus y el antibitico se produce (Coco et al., 1991). Del mismo modo,
toda la va de cefamicina C fue clonado y expresado a partir de una cepa productora de
cefamicina de Streptomyces cattleya.When se clon el fragmento de ADN de 29-kb en el
productor no-b-lactama, S. lividans, un transformante (de 30 000 ) hecho cefamicina (Chen
et al., 1988). Cuando el fragmento se introdujo en otro productor cefamicina, Streptomyces
lactamgens, una de dos a tres veces mejora se obtuvo. En los hongos de toma de penicilina
G, los tres genes estructurales (ACVS, ciclasa y penicilina aciltransferasa) se agrupan en un
solo cromosoma de Penicillium chrysogenum (Smith et al., 1990) y de Aspergillus nidulans
(MacCabe et al., 1990). En estos hongos, los genes de la agrupacin se transcribe por
separado. Por el contrario, los genes fngicos que codifican para la biosntesis de la
cefalosporina se distribuyen entre diferentes cromosomas.
El gen deacetilcefalosporina C acetiltransferasa de Cephalosporium acremonium (cefG) est
estrechamente relacionada con la expandasa (cefEF) gen (Gutirrez et al, 1992;.. Matsuda
et al, 1992) y ambos estn en el cromosoma II, mientras que los genes tempranos de la va
(pcbAB, pcbC) estn situados en el cromosoma VI. b-lactmicos antibiticos
La clonacin ha sido muy importante en la comprensin de la biosntesis de antibiticos b-
lactmicos (Demain y Elander,
1999), la gentica y la mejora de los procesos productivos. Va comn temprana Todos los
productores de penicilinas y cefalosporinas, incluyendo cefamicinas, usar las mismas dos
enzimas para iniciar el proceso de biosntesis. Los pasos implican la condensacin de cido
La-aminoadpico, L-cistena y L-valina para formar el tripptido, d-(a-aminoadipil)-L-cisteinil-
D-valina (ACV) por la sintetasa del ACV (VAC), codificada por gen pcbAB (tambin conocido
como ACVA en A. nidulans). Esto es seguido por ciclacin de ACV en isopenicilina N (IPN) por
la sintetasa del IPN (ciclasa; codificada por PCBB). La clonacin de los genes que codifican
ACVS de P. chrysogenum (Diez et al., 1990), C. acremonium (Gutirrez et al., 1991) y
Nocardia lactamdurans (Castro et al., 1988) contribuyeron en gran medida a la
elucidacin de la ruta biosinttica. La sobreexpresin de ACVA en A. nidulans, mediante la
sustitucin del promotor normal con el promotor de deshidrogenasa de etanol (Kennedy y
Turner, 1996), el aumento de la produccin de penicilina hasta 30-veces. Los genes ciclasa
de diferentes microorganismos se clonaron los (Aharonowitz et al, 1992;.. Martin et al,
1997) y proporcionado enzima pura para estudios estructurales. Clonacin de mltiples
copias de ciclasa en acremonium C. produjo una mejora de la cefalosporina C cepa
productora (Skatrud et al., 1987). Los productores de sucursales hidrofbicas de penicilina
utilizar una rama solo paso implica penicilina de accin aciltransferasa en IPN. Su Pende gen
(tambin conocido como IAT, aat y ACYA en A. nidulans) se clon a partir de P. chrysogenum
en acremonium C, lo que condujo a la
produccin de penicilina G (en presencia de cido fenilactico exgeno) junto con
cefalosporina C (Gutirrez
et al., 1991). Sin clonacin, C. acremonium no puede producir penicilina G. La rama hidrfilo
Todos los productores de cefalosporinas y cefamicinas emplean una serie de enzimas que
conducen a partir de IPN. En primer lugar, IPN se epimerizado a la penicilina N por
epimerasa IPN (codificada por CEFD). Los prximos pasos incluyen la expansin del anillo de
la penicilina N por deacetoxicefalosporina C (DAOC) sintasa (expandasa, codificada por
cefE) y la hidroxilacin de DAOC 30-hidroxilasa (codificada por Ceff) para C
deacetilcefalosporina (DAC). Aunque la expandasa y hidroxilasa son enzimas
independientes codificados por genes separados en las bacterias, estas dos actividades se
encuentran en la misma protena en los hongos, que est codificada por un gen cefEF. En la
etapa de DAC, la va ms general se divide en dos ramas. En acremonium C., DAC se acetila
para cefalosporina C por DAC acetiltransferasa codificada por cefG. Este paso es la reaccin
de terminal en los hongos cephalosporinproducing. Por el contrario, actinomicetos
carbamoylate DAC utilizando tres enzimas, codificadas por CmCH, CMCI y genes
articulacin CMC para producir cefamicina C (Brewer et al., 1980). Cuando una cepa de
produccin industrial de C. acremonium 394-4 fue transformada con un plsmido que
contiene el gen pcbC y la cefEF partir de una cepa inicial de la lnea C. acremonium
mutante, un transformante que produce C 50% ms de cefalosporina de la cepa de
produccin, como as como menos penicilina N, se obtuvo. Produccin en planta piloto (150
L) fermentadores se ha mejorado an ms por 15% (Skatrud et al., 1989). Una copia de la
cefEF se haba integrado en el cromosoma III, mientras que el gen nativo es en
II.Transformation cromosoma de P. chrysogenum con el CEFD Streptomyces lipmanii y
Streptomyces clavuligerus cefE genes permite la produccin de la DAOC intermedio
(Cantwell et al., 1992 ) a ttulos de 2,5 g L_1. DAOC es un intermedio valioso en la
produccin comercial de cefalosporinas semisintticas. Adems, la clonacin de cefE de S.
clavuligerus o cefEF y cefG (ver siguiente prrafo) de acremonium C en P. chrysogenum
cultivadas con cido adpico como
la cadena lateral precursora (Crawford et al., 1995) result en la formacin de adipilo-6-
aminopenicilnico (adipil-6-
APA) y adipil-7 aminodeoxycephalosporanic-cido (adipil-7-ADCA) en el caso de cefE y adipil
6APA-, adipilo-7ADCA, adipilo-7-DAC y adipil-7-aminocefalospornico (7-ACA) en el caso de
cefEF y cefG.
La alteracin de un solo paso y la sustitucin del gen cefEF de una cepa industrial de
produccin de cefalosporina C de A.
chrysogenum producido cepas de acumulacin de hasta 20 g L_1 de penicilina N. Clonacin
y expresin del gen cefE de S. clavuligerus en aquellas cepas de alta produccin producido
cepas recombinantes que producen altos ttulos de DAOC (Velasco et al., 2000). Los niveles
de produccin fueron casi equivalentes (80%) al total de los b-lactmicos biosintetizados
por la cepa parental. Dbil actividad acetiltransferasa promotor parece ser la causa de la
acumulacin de DAC en caldos de C. acremonium. Clonacin de cefG aumentado su nmero
de copias y cefG ARNm, se triplic la actividad acetiltransferasa, y aumento de los ttulos de
cefalosporina C en una manera dependiente de la dosis (Matsuda et al, 1992;.. Mathison et
al, 1993). La clonacin del gen con su propio promotor no tuvo efecto sobre el bajo nivel de
DAC acetiltransferasa normalmente observada en C. acremonium (Gutirrez et al., 1997).
Sin embargo, el uso de promotores extranjeros (el promotor gpd de A. nidulans, el promotor
bla de A. niger o el promotor PBCC de P. chrysogenum) tena una
efecto importante sobre el nivel de las transcripciones cefG DAC, el nivel de protena y la
actividad acetiltransferasa, y la produccin de antibitico de cefalosporina; produccin C
aument de dos a tres veces. De las cefalosporinas producidas, el DAC indeseable
disminuy de 80% del total de 30-39%, mientras que la cefalosporina C aument en una
cantidad similar.
Transformacin de la cepa de P. chrysogenum temprano Wis54-1255 con genes individuales,
pares de genes, y los tres
genes de la va penicilina mostraron que los mayores aumentos se produjo cuando los tres
genes se sobreexpresa
(Theilgaard et al., 2001). La mejor transformante contena tres copias adicionales de pcbAB,
una copia extra de pcbC y dos copias adicionales de Pende y produjo 299% de la produccin
frasco de control por movimientos bruscos y 276% de control de la productividad en cultivo
continuo.
Enzimas microbianas
Los genes que codifican muchas enzimas microbianos se han clonado y expresado las
enzimas a cientos de veces los niveles
ms altos que los producidos naturalmente. Tecnologa de ADN recombinante se ha usado
(Falch, 1991): (i) para producir en
enzimas organismos industriales obtenidos a partir de microbios que son difciles de cultivar
o manipular genticamente; (ii) para aumentar la productividad mediante el uso de enzimas
de mltiples copias de genes, promotores fuertes, y las secuencias de seales eficientes;
(iii) para producir en unos enzimas del husped seguras tiles obtenidos a partir de un
patgeno o microorganismo productor de toxina, y (iv) mejorar la estabilidad, actividad o
especificidad de una enzima por ingeniera de protenas. El negocio enzima industrial
adoptado mtodos de ADNr para aumentar los niveles de produccin y para producir
enzimas de microorganismos industrialmente desconocidos en los organismos industriales,
tales como especies de Aspergillus y Trichoderma, as como Kluyveromyces lactis, S.
cerevisiae, y Yarrowia lipolytica Bacillus licheniformis. Prcticamente todos los detergentes
para ropa contienen enzimas genticamente modificados y mucho queso se hace con
ingeniera gentica enzimas.
De hecho, ms del 60% de los enzimas utilizados en el detergente, la industria alimentaria
y almidn de procesamiento son recombinante
productos (Cowan, 1996). Los cientficos de Novo Nordisk aislado una lipasa muy deseable
para su uso en detergentes de una especie de Humicola. Para fines de produccin, el gen se
clon en Aspergillus oryzae, donde produjo 1000-veces ms enzima (Carlsen, 1990) y es
ahora un producto comercial. Tales lipasas se utilizan para limpieza de lavandera,
interesterificacin de los lpidos, y la esterificacin de los glucsidos producen glicolpidos
que tienen aplicaciones como biodegradables no inicos tensioactivos para detergentes,
productos de cuidado de la piel, productos de limpieza de lentes de contacto y como
emulsionantes de alimentos. El gen de la a-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens se clon
usando pUB110 plsmido multicopia en B. subtilis (Palva, 1982). La produccin fue 2500-
veces mayor que la de tipo salvaje B. subtilis y cinco veces la del donante B.
amyloliquefaciens. Un exoglucanasa de la fimi celuloltica Cellulomonas se producen en
exceso despus de la clonacin en E. coli a un nivel de ms del 20% de la protena celular
(O'Neill et al., 1986). Las endo-bglucanase componentes de los complejos de celulasa de
Clostridium thermocellum Thermomonospora y se clonaron en E. coli como era el gen de
celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei (Shoemaker et al, 1983;.. Teeri et al, 1983). Pichia
pastoris, una mezcla de metanol-utilizar levadura, se ha diseado para producir la invertasa
de S. cerevisiae y para excretar en el medio a 100 mg L_1 (Van Brunt, 1986). Curiosamente,
en S. cerevisiae, la invertasa es periplsmico. Selfcloning del gen de xilanasa en S. lividans
como resultado del exceso de produccin de seis veces de la enzima (Mondou et al., 1986).
Muchas enzimas son hechas por organismos filamentosos, que son de crecimiento lento y
difcil de manejar en fermentadores.
La transferencia de estos genes a gran crecimiento bacterias unicelulares significa que el
crecimiento rpido y la produccin ms reproducible que puede lograrse. Otras ventajas son
la absorcin de nutrientes ms rpido debido a una mayor relacin superficie / volumen,
una mejor transferencia de oxgeno, mezcla mejor y por lo tanto un control ms confiable
de pO2, pCO2 y pH, y un organismo mejor para la mutagnesis. Aspartasa produccin se
increment en 30-veces por clonacin en E. coli (Komatsubara et al., 1986). Captopril
esterasa de Pseudomonas putida, utilizado en la preparacin de la cadena lateral quiral
captopril, se clon en E. coli con un aumento de 38-veces en la actividad (Elander, 1995).
Un aumento de 1000-veces en la produccin de fitasa se logr en A. niger utilizando la
tecnologa recombinante (Van Hartinsveldt et al., 1993). Clonacin del gen de la
bencilpenicilina acilasa de E. coli en multicopia (50) plsmidos result en un incremento 45-
veces en comparacin con no inducido de tipo salvaje produccin. Curiosamente, la enzima
clonada es constitutiva (Mayer et al., 1980). Clonacin de genes adicionales de penicilina V
amidasa en oxysporium Fusarium de tipo salvaje enzima aument ttulo en 130 veces
(Komatsubara
et al., 1986). Las propiedades de muchas enzimas han sido alterados por medios genticos.
"Fuerza bruta" mutagnesis y seleccin aleatoria de los microorganismos en los ltimos
aos llevaron a cambios en el pH ptimo, termoestabilidad, la inhibicin de
retroalimentacin, la inhibicin fuente de carbono, especificidad de sustrato, Vmax, Km y Ki.
Esta informacin se ha explotado ms tarde por las tcnicas ms racionales de ingeniera
de protenas. Cambios individuales en secuencias de aminocidos han producido tipos
similares de cambios en una gran variedad de enzimas. Hoy en da, ya no es necesario
conformarse con las propiedades naturales de una enzima, que se pueden modificar para
adaptarse a las necesidades del investigador o el proceso. Por ejemplo, una proteasa de
Bacillus stearothermophilus se aument en la tolerancia al calor de 86 a 100 1C 1C, hecho
resistente a la ebullicin. La enzima fue desarrollado por mutagnesis dirigida al sitio (Van
den Burg et al., 1998). Slo ocho aminocidos tuvo que ser modificado. Estabilidad de la
temperatura a 100 1C se aument 340-veces y la actividad a baja temperatura no se
redujo. Todas las ocho mutaciones estaban lejos de sitio activo de la enzima. Polvos de
lavado se han mejorado en el funcionamiento a temperatura baja actividad y por la
aplicacin de la tecnologa del ADN recombinante y mutagnesis sitedirected a las
proteasas y lipasas (Falch, 1991; Wackett, 1997).
Los polmeros, combustibles, alimentos y bebidas
Goma de xantano producido microbiano no es slo una aceptable alimentos espesante pero
es uno de los agentes ms prometedores
para la recuperacin mejorada de petrleo en la industria del petrleo. Manipulacin de
ADN recombinante de Xanthomonas campestris ttulos elevados de xantano por el
contenido de piruvato de dos veces y aument en ms del 45% (Bigelas, 1989; Tseng et al,
1992.). El rendimiento fue de 0,6 g de sacarosa utilizado g_1 (Letisse et al., 2001). Diez a
veinte mil toneladas de xantano se producen anualmente para su uso en el petrleo,
productos farmacuticos, cosmticos, papel, pintura y textil (Becker et al., 1998).
Escherichia coli fue convertida en un productor de etanol bueno (4,3%, v v_1) usando
tecnologa de ADN recombinante (Ingram et al., 1987). Alcohol deshidrogenasa II y piruvato
descarboxilasa genes de Zymomonas mobilis se insertaron en E. coli y se convirti en el
sistema dominante para NAD
regeneracin. El etanol representaba ms del 95% de los productos de fermentacin de la
cepa genticamente modificada. Por
clonacin y expresin de los mismos dos genes en Klebsiella oxytoca, el recombinante fue
capaz de convertir la celulosa cristalina a etanol en un alto rendimiento cuando celulasa
fngica se aadi (Doran & Ingram, 1993). El rendimiento terico mximo era de 81-86% y
los ttulos tan altos como 47 g L_1 de etanol se produce a partir de 100 g de celulosa L_1.
La clonacin de su as (acetona) opern de genes adc (descarboxilasa codificacin
acetoacetato), CTFA y CTFB (dos genes que codifican coenzima A transferasa) en un
plsmido que contiene el promotor ADC en Clostridium acetobutylicum result en un
aumento del 95% en la produccin de acetona, un 37 % de aumento en butanol, un
aumento del 90% en etanol, un aumento del 50% con un rendimiento del disolvente a partir
de glucosa y una produccin de 22-veces ms baja de indeseable
cidos (Mermelstein et al., 1993). La introduccin del opern de acetona a partir de C.
acetobutylicum en E. coli condujo a la produccin de acetona alta por este ltimo (Bermejo
et al., 1998). Mosto de cerveza contiene cebada b-glucanos que reducir la filtrabilidad de la
cerveza y conducir a precipitados y la neblina en el producto final. El gen que codifica la
endoglucanasa fue
transferida de T. reesei para la levadura de cerveza y la cepa de levadura de ingeniera
eficientemente el hidrolizado b-glucanos
(Penttil una et al., 1987). Tecnologa similar creado starchutilizing cepas de S. cerevisiae y
cepas de levaduras productoras de vino de baja acidez y un sabor mejorado. Levaduras
Brewing fueron modificados mediante tcnicas de ADN recombinante para que pudieran
producir amiloglucosidasa de A. niger y dextrinas no fermentables romper para la
produccin de cerveza ligera (Van Brunt, 1986; Hammond, 1988). El gen de la glucoamilasa
de Aspergillus awamori se clon y se expres establemente en levadura poliploide del
destilador. Un alto nivel de glucoamilasa fue secretada. Casi todos (95%) de los hidratos de
carbono en el sustrato de almidn 25% fueron utilizados y los altos niveles de etanol fueron
producidos. La cepa de ingeniera super S. diastaticus (Cole et al., 1988). Levaduras
elaboracin de la cerveza fueron diseados para producir acetolactato decarboxilasa de
Enterobacter aerogenes o aceti A.. Esta enzima elimina el diacetil y el requisito de los tres a
cinco semanas perodo de maduracin sabor que normalmente sigue una etapa de
fermentacin de una semana (Sone et al., 1988). La cerveza resultante no sufri ninguna
prdida de calidad o sabor (Holzman, 1994). Bioconversiones tcnicas de ADN
recombinante han sido tiles en el desarrollo de nuevos bioconversiones y mejorar las
antiguas. El uso de un plsmido que contienen triptfano sintasa adems de la induccin
con 3-indol acrilato de E. coli recombinante fue capaz de producir 180 g L_1 de L-triptfano
a partir de indol y L-serina en 8 h (Yukawa et al., 1988). Considerando S. cerevisiae
normalmente produce 2 g L_1 de cido mlico a partir de cido fumrico, una cepa
recombinante que contiene un gen clonado fumarasa fue capaz de producir 125 g L_1 con
un rendimiento de casi el 90% (Neufeld et al., 1991). Un bioconversin oxidativo de
sustratos lineales saturados e insaturados de carbono alifticos 12-22 a sus cidos
dicarboxlicos terminales fue desarrollado por disrupcin gnica y la amplificacin de genes
(Picataggio et al., 1992). Concentraciones de productos alcanzaron 200 g L_1 y
problemticas reacciones secundarias tales como insaturacin, hidroxilacin y
chainshortening no ocurri. 3-0-acetil-40-0-0 isovaleryltylosin (AIV) es til en medicina
veterinaria contra Staphylococcus aureus resistente a la tilosina. Se hace por primera
tilosina producir con Streptomyces fradiae y luego utilizando Streptomyces thermotolerans
(productor de carbomicina) a bioconvert tilosina en AIV. Un nuevo organismo fermentacin
directa se construy mediante la transformacin de S. fradiae con S. thermotolerans
plsmidos que contienen genes de acil transferasa (Arisawa y col., 1996). Recombinante
pasteurianum Candida puede llevar a cabo la conversin de glicerol a 1,3-propanodiol
(Luers et al., 1997). Un proceso ms econmico que implica la conversin de glucosa deEl
menos costoso de 1,3-propanodiol se ha logrado con una cepa recombinante de E. coli
(Nakamura y Whited, 2003). El proyecto es un esfuerzo de colaboracin entre Genencor
International y DuPont (Potera, 1997). La cepa recombinante contiene dos vas metablicas,
una para la conversin de glucosa en glicerol y la otra para la conversin de glicerol a 1,3-
propanodiol (Tong et al, 1991;.. Laffend et al, 1996). El 1,3-propanodiol (tambin conocido
como trimetilenglicol o 3G) se utiliza como bloque de construccin para producir un
polister biodegradable nuevo (3G1).
Novedosas tecnologas genticas
Una tcnica genmico nueva llamada 'basado en el genoma reconstruccin
cepa' permite construir una cepa superior a
la cepa de produccin ya que slo contiene mutaciones cruciales para
hiperproduccin, pero las mutaciones desconocidas no otros que se
acumulan por mutagnesis de fuerza bruta y el cribado (Ohnishi et al.,
2002). Este enfoque se utiliz para mejorar la tasa de produccin de lisina
de Corynebacterium glutamicum mediante la comparacin de la cepa de
alta produccin de B-6 desarrollado por Hirao y colaboradores (Hirao et al.,
1989) (tasa de produccin ligeramente inferior a 2 g L_1 H_1) y un tipo
salvaje colar. Comparacin de los 16 genes de la cepa B-6, que codifica
enzimas de la ruta de la glucosa a la lisina, revel mutaciones en cinco de
los genes. Introduccin de tres de estas mutaciones en el tipo salvaje
creado una nueva cepa que produjo 80 g L_1 en 27 h, a una velocidad de 3
g L_1 H_1, la tasa ms alta jams reportada para una fermentacin de
lisina. 'La ingeniera metablica' es la mejora de la formacin de producto
dirigido o propiedades celulares a travs de la modificacin de las
reacciones bioqumicas especficas o la introduccin de nuevos utilizando
tecnologa de ADN recombinante (Stephanopoulos, 1999; Nielsen, 2001). Su
esencia es la combinacin de los mtodos de anlisis para cuantificar los
flujos y el control de los flujos con tcnicas de biologa molecular para la
aplicacin sugeridas modificaciones genticas. Flux es el punto focal de la
ingeniera metablica. Diferentes medios de anlisis de flujo son: (i)
cinticos basados en modelos, (ii) las teoras de control, (iii) experimentos
con trazadores, (iv) transferencia de magnetizacin; (v) el equilibrio
metabolito; (vi) Anlisis de la enzima y (vii) el anlisis gentico ( Eggeling et
al., 1996). Anlisis de control metablico revel que el flujo total a travs de
una va metablica depende de varios pasos, no slo un nico limitante de
la velocidad de reaccin (Kacser y Acerenza, 1993).
La ingeniera metablica se ha aplicado a la produccin de antibiticos
(Khetan & Hu, 1999, 1999; Thykaer & Nielsen,
2003). Los aumentos en el flujo metablico se llevaron a cabo por la
actividad enzimtica mejora, la manipulacin de regulador
genes, la resistencia a los antibiticos y mejorar la expresin heterloga de
genes novedosos. La Tabla 2 resume varias
ejemplos de los avances en la produccin de los metabolitos secundarios.
La produccin de aminocidos muestra muchos ejemplos de este enfoque.
Una revisin til de la ingeniera metablica en C. glutamicum,
especialmente en relacin con la produccin de L-lisina, fue publicado por
Sahm y colegas (Sahm et al., 2000). Los estudios metablicos de flujo de
tipo salvaje C. glutamicum y cuatro mejores mutantes productores de lisina
disponibles en la ATCC mostr que el rendimiento aument de 1,2% a
24,9% en relacin con el flujo de glucosa. Otros ejemplos recientes se
encuentran en la sobreproduccin de aminocidos aromticos y derivados
(Bongaerts et al., 2001), L-lisina (Wittmann y Heinzle, 2002) y glutamato
(Kimura, 2003).
Hay muchas otras aplicaciones exitosas de ingeniera metablica para
productos tales como 1,3-propanodiol (Nakamura y Whited, 2003),
carotenoides (Rohlin et al, 2001;. Visser et al, 2003;. Wang y Keasling,
2003), orgnico (cidos. Kramer et al, 2003), etanol (. Nissen et al, 2000),
vitaminas (Zamboni et al, 2003;. Sybesma et al, 2004.) y polictidos
complejos en las bacterias (Pfeifer et al, 2001;. Khosla y Keasling, 2003).
Durante los ltimos aos, una vista ampliada de la clula ha sido posible
gracias a los avances impresionantes en todas las tcnicas de las "micas"
(genmica, la protemica, la metabolmica, etc) y las tecnologas de alto
rendimiento para la medicin de las diferentes clases de molculas
intracelulares clave. "La biologa de sistemas" ha surgido recientemente
como un trmino para describir un enfoque que
considera las mediciones a escala del genoma de clulas y de amplio en los
procesos de elucidar y mecanismos (Stephanopoulos et al., 2004). El
progreso en el desarrollo de la cepa depender, no slo de todas las
tecnologas mencionadas anteriormente, sino tambin en el desarrollo de
mtodos matemticos que facilitan la elucidacin de los mecanismos y la
identificacin de dianas genticas para la modificacin. La integracin de
los perfiles de transcripcin y metabolito de 21 cepas de A. terreus que
producen diferentes niveles de lovastatina y otras 19 cepas con alteracin
(1)-geodin niveles condujeron a una mejora en la produccin de lovastatina
de ms de 50% (Askenazi et al., 2003). La solucin, denominada "anlisis
de asociacin", se utiliza para reducir la complejidad de los conjuntos de
datos de perfiles para identificar los genes en los que la expresin estaba
ms estrechamente vinculados a la produccin de metabolitos. Tal
aplicacin es adecuado para todos los organismos industrialmente tiles
para los que
datos del genoma son limitados. Un anlisis de transcripcin genoma de
toda expresin llamada "masiva paralelo firma secuenciacin '(Brenner et
al., 2000) se utiliz con xito para descubrir nuevos objetivos para la
mejora adicional de la produccin de riboflavina por el hongo A. gossypii
(Karos et al., 2004). Los autores identificaron 53 Integracin de perfiles de
transcripcin y el metabolito de 21 cepas de A. terreus producen diferentes
niveles de lovastatina
y otras 19 cepas con alteracin (1)-geodin niveles conducido a una mejora
en la produccin de lovastatina de ms de 50%
(Askenazi et al., 2003). La solucin, denominada "anlisis de asociacin", se
utiliza para reducir la complejidad de los conjuntos de datos de perfiles para
identificar los genes en los que la expresin estaba ms estrechamente
vinculados a la produccin de metabolitos. Tal aplicacin es adecuado para
todos los organismos industrialmente tiles para los que los datos del
genoma son limitados.
Un genoma en todo el anlisis de la expresin transcripcin llamado
"secuenciacin masiva paralela firma" (Brenner et al.,
2000) se utiliz con xito para descubrir nuevas dianas para la mejora
adicional de la produccin de riboflavina por el hongo
A. gossypii (Karos et al., 2004). Los autores identificaron 53 genes de
funcin conocida, algunos de los cuales claramente podra estar relacionado
con la produccin de riboflavina. Este enfoque tambin permiti la
determinacin de los sitios dentro del genoma con alta actividad
transcripcional durante la biosntesis de riboflavina que son adecuados loci
de integracin de los genes diana encontrados.
Anlisis de expresin gnica de cepas de produccin de tipo salvaje y la
mejora de Saccharopolyspora erythraea y S.
fradiae utilizando microarrays de S. coelicolor revel que la regulacin de
las enzimas biosintticos de antibiticos, as como
enzimas implicadas en el metabolismo de precursor se modificaron en
aquellas cepas mutadas (Lum et al., 2004). El S. erythraea overproducer
expres el grupo eritromicina gen entero por varios das ms que la de tipo
salvaje. Pareca que el gen eryA y las diferencias de expresin de protenas
observadas para la overproducer podra ser responsable de ms del 50%
del aumento de eritromicina ttulo total. El S. fradiae mutante expresado los
genes biosintticos de la tilosina en una forma similar a la cepa de tipo
salvaje, sin embargo, dos genes, ACO (que codifica acil-CoA
deshidrogenasa) y ICMA (codificacin isobutiril-CoA mutasa), se expresaron
ms alto que en la naturaleza la cepa de tipo. La induccin de estos dos
genes podra aumentar el flujo de metabolitos de cidos grasos a los
precursores de la tilosina en la overproducer.
Estas tecnologas recientes y enfoques matemticos, que contribuirn a la
generacin y caracterizacin de
microorganismos capaces de sintetizar grandes cantidades de metabolitos
de importancia comercial. La secuenciacin en curso
proyectos de cientos de genomas, la disponibilidad de secuencias
correspondientes a organismos modelo, los microarrays de ADN nuevo y
herramientas de protemica, as como las nuevas tcnicas de mutagnesis
y recombinacin descrito anteriormente acelerar programas de mejora de
la cepa. El desarrollo de aplicaciones y combinado de estas tecnologas
ayudarn a desarrollar lo que ya se ha descrito sucintamente hace varios
aos como "ingeniera inversa netabolic" (Bailey et al., 1996), lo que
significa para identificar, construir o calcular un fenotipo deseado,
identificar los mecanismos moleculares base de que la propiedad deseable,
y que incorpore ese fenotipo en otra cepa o de otras especies por
manipulaciones genticas y ambientales.
"Evolucin dirigida" (= Evolucin Molecular Aplicada = evolucin molecular dirigida) es un
rpido y barato
manera de encontrar variantes de las enzimas existentes que funcionan mejor que las
enzimas presentes en la naturaleza bajo condiciones especficas
condiciones (Kuchner y Arnold, 1997; Skandalis et al, 1997;. Arnold, 1998). El proceso
implica mtodos evolutivos de diseo utilizando mutagnesis al azar, la recombinacin de
genes y seleccin de alto rendimiento (Arnold, 2001). Diversidad se crea inicialmente
mediante mutagnesis in vitro de la matriz de genes usando ciclos repetidos de reaccin
mutagnico cadena de la polimerasa (PCR propensa a error) (Leung et al., 1989), que se
repite mutagnesis dirigida a oligonucletidos (Reidhaar-Olson et al., 1991) , cepas
mutadoras (Bornscheuer et al., 1998) o agentes qumicos (Taguchi et al., 1998). Una
limitacin clave de estas estrategias es que introducen mutaciones 'ruido' azar en el gen en
cada ciclo y por lo tanto, las mejoras se limitan a pequeos pasos. Esta estrategia se ha
utilizado con xito en diferentes aplicaciones (Zhao et al., 2002). "Tcnicas de cra de
Molecular (combinacin aleatoria de ADN, Molecular BreedingTM) se acercan ms a la
imitacin de recombinacin natural al permitir recombinacin homloga in vitro (Ness et al.,
2000). Estas tcnicas no slo fragmentos de ADN se recombinan, sino tambin introducir
mutaciones puntuales a una velocidad controlada muy bajo (Stemmer, 1994; Zhao y Arnold,
1997). A diferencia de mutagnesis dirigida al sitio, este mtodo de mezcla y recombinacin
de partes de genes similares de diferentes especies o cepas ha producido mejoras notables
en las enzimas en una cantidad de tiempo muy corto (Patten et al., 1997). Un paso adelante
en esta tcnica se cra una poblacin con alta variabilidad gentica como punto de partida
para generar diversidad (ADN Familia arrastrando los pies). Este enfoque condujo a un 240 -
a 540-veces mejora en la actividad cefalosporinasa cuando cuatro genes cefalosporinasa se
barajan como punto de partida (Crameri et al, 1998.). Cuando cada uno de estos genes se
mezclan de forma independiente, slo ocho veces se obtuvieron mejoras. Innovaciones que
amplan los formatos para la generacin de la diversidad por recombinacin incluyen
formatos similares a combinacin aleatoria de ADN y otros con pocos requisitos o no para
homologa gen parental (Kurtzman et al, 2001;.. Lutz et al, 2001). Tcnicas de azar rediseo
se utilizan actualmente para generar enzimas con propiedades mejoradas tales como:
actividad y la estabilidad a diferentes valores de pH y temperaturas (Ness et al, 1999.),
Aumentado o modificado enantioselectividad (Jaeger y Reetz 2000,), especificidad alterada
de sustrato ( Suenaga y col.,
. 2001), la estabilidad en disolventes orgnicos (Song y Rhee, 2001), especificidad de
sustrato novedosa y actividad (Raillard et al, 2001), aumento de la actividad biolgica de
los productos farmacuticos de protenas y molculas biolgicas (Patten et al, 1997;.
Kurtzman et al. , 2001), as como nuevas vacunas (Marshall, 2002;. Locher et al, 2004). Las
protenas de evolucin dirigida trabajo ya estaban en el mercado en 2000 (Tobin et al.,
2000). Estos fueron protena verde fluorescente de Clontech (Crameri et al., 1996) y lipasa
de Novo Nordisk LipoPrimes. "Todo el barajado genoma (WGS) 'es una novedosa tcnica
para la mejora de la cepa que combina la ventaja de cruce multiparentales permitido por la
combinacin aleatoria de ADN con la recombinacin de genomas enteros. Este mtodo se
aplic con xito a la produccin de tilosina mejorada en S. fradiae (Zhang et al., 2002).
Histricamente, los 20 ciclos de mejora cepa clsica de Eli Lilly and Co. llev a cabo ms de
20 aos el empleo de alrededor de un milln ensayos de mejora de la produccin por seis.
En contraste, dos rondas de WGS con siete cepas temprano cada bastaron para lograr
resultados similares en un ao y slo participaron 24 000 ensayos. Tal recombinacin
genmica recursiva se ha utilizado tambin para mejorar la tolerancia al cido de un
comercial lctico Lactobacillus sp productor de cido. (Patnaik et al., 2002). 'Biosntesis
combinatoria' se utiliza para el descubrimiento de frmacos nuevos y modificados
(Hutchinson, 1998; Reeves, 2003). En esta tcnica, las tcnicas de ADN recombinante son
utilizados para introducir genes que codifican sintasas de antibiticos en productores de
otros antibiticos en cepas no productoras o para obtener antibiticos modificados o
hbrido. La primera demostracin de esta tecnologa de transferencia de gen que participa
de una cepa estreptomiceto producir la actinorrodina isochromanequinone antibiticos en
cepas productoras de granaticin, dihydrogranaticin y mederomycin (que tambin son
isochromanequinones). Esto llev al descubrimiento de dos nuevos derivados de
antibiticos, mederrhodin A y dihydrogranatirhodin. Dado que este documento avance por
Hopwood y sus colaboradores (Hopwood et al., 1985), muchos antibiticos hbridos se han
producido por tecnologa de ADN recombinante.
Cientos de polictidos nuevos han sido realizadas por biosntesis combinatoria (Rodrguez y
McDaniel, 2001; Donadio y Sosio, 2003;. Kantola et al, 2003). Manipulaciones incluyen: (i)
supresin de uno de los dominios de un mdulo en particular, (ii) la adicin de una copia del
dominio tioesterasa hasta el final de un mdulo anterior resulta en un polictido acortado;
(iii) reemplazo de un dominio AT de una polictido sintasa (PKS) con un dominio de AT de
PKS otro, lo que resulta en la adicin de un grupo metilo en un sitio particular o eliminacin
de un grupo metilo, (iv) adicin de un dominio reductora (s) a un mdulo particular,
cambiando as un grupo ceto a un doble enlace o un grupo metileno; (v) uso de diketides
sintticos suministrados en forma de N-acetilcisteamina tiosteres para cargar en el sitio
activo de la cetosintasa (KS) en el mdulo 2 y que deben tomarse todo el camino a una
producto final novela; (vi) sustitucin del mdulo de carga de una PKS con el mdulo de
carga de PKS otro, cambiando de este modo la unidad de motor de arranque de propionato
de acetato, por ejemplo, y (vii) la sustitucin de las enzimas hidroxilasa o glicosilasa de una
va a otro, modificando as la estructura de anillo con respecto a los grupos OH y / o
azcares (Staunton, 1998).
Como se mencion anteriormente, existen muchos ejemplos de nuevos polictidos han
realizado mediante la combinacin de biosntesis de polictidos
genes de diferentes productores (McAlpine et al, 1987;. Epp et al, 1989;. Donadio et al,
1991, 1993;.. Weber et al,
1991; Hara y Hutchinson, 1992; Decker & Hutchinson, 1993; Hopwood, 1993; Katz y
Donadio, 1993; Khosla et al, 1993;.. McDaniel et al, 1993a, b, 1999; Hutchinson y Fujii,
1995; Kao et al, 1995;. Tsoi y Khosla, 1995; Pacey et al, 1998;. Wohlert et al, 1998;. Xue et
al, 1999;. Pfeifer & Khosla, 2001).
Algunos de estos nuevos polictidos contienen azcares en las posiciones normalmente no
glicosilada (Trefzer et al, 2002.) O como restos de azcar nuevos (Zhao et al, 1999;. Mendez
y Salas, 2001). Nueva antraciclinas (Bartel et al, 1990;. Strohl et al, 1991;. Hwang et al,
1995;. Niemi y Mantsala, 1995; Kim et al, 1996;.. Ylihonko et al, 1996) y antibiticos
peptdicos (Stachelhaus et al., 1995) tambin se han hecho por biosntesis combinatoria.
Observaciones finales
Microorganismos producen muchos compuestos de inters industrial. stos pueden ser
materiales muy grandes, tales como protenas, cidos nucleicos, polmeros de hidratos de
carbono, o incluso clulas, o pueden ser molculas ms pequeas que pueden ser
esenciales para el crecimiento vegetativo o metabolitos no esenciales, es decir, primaria y
secundaria, respectivamente. La potencia del cultivo microbiano en el mundo competitivo
de sntesis comercial se puede apreciar por el hecho de que las molculas ms simples son
hechas por fermentacin en vez de por sntesis qumica. Mayora de los productos naturales
son tan complejos que probablemente nunca se harn comercialmente por sntesis qumica.
Las cepas aisladas de la naturaleza producen slo pequeas cantidades de producto. Esto
se debe a que necesitan estos metabolitos secundarios para su propio beneficio
competitivo, y no sobre producir estos metabolitos. Los mecanismos de regulacin han
evolucionado en los microorganismos que permiten una cepa para evitar la produccin
excesiva de sus metabolitos, por lo tanto, los programas de mejora de la cepa se requieren
para su aplicacin comercial. El objetivo es aislar los cultivos exhiben fenotipos deseados.
Ms comnmente, la capacidad de una cepa para mejorar ttulo es lo que se desea, aunque
las otras caractersticas tambin puede ser mejorado. Los enormes aumentos en la
productividad de fermentacin y los consiguientes descensos en los costos han surgido
principalmente mediante el uso de mutagnesis. En aos recientes, la tecnologa de ADN
recombinante tambin se ha aplicado. La promesa de un futuro
es a travs de un amplio uso de nuevas tcnicas genticas, tales como: (i) llevar a cabo
ingeniera metablica y cuantificacin
el control de los flujos metablicos e incluyendo ingeniera inversa metablico y anlisis de
transcripcin de expresin tales como
anlisis de asociacin y secuenciacin masiva de firma paralela, (ii) la evolucin dirigida,
(iii) el mejoramiento molecular incluyendo combinacin aleatoria de ADN y la combinacin
aleatoria de genoma completo, y (iv) la biosntesis combinatoria. Estos esfuerzos no slo de
facilitar el aislamiento de cepas mejoradas sino tambin la dilucidacin y la identificacin
de nuevas dianas genticas para ser utilizados en programas de mejora de la cepa.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los siguientes colegas por el suministro de la informacin: Richard
H. Baltz, Graham S. Byng, Richard P. Elander, David A. Hopwood, Hranueli Daslav, Madduri
Krishna, Spizek Jaraslav, William R. Strohl y Mark J.Weber.