Garcia velazquez luis gerardo IAM-06 PRUEBAS BIOQUIMICAS

Prueba de la Fundamento: Detecta la presencia de la enzima

catalasa catalasa.
Procedimiento: En portaobjetos colocar sobre una
colonia unas gotas de H202 3 %.
H202 H 20 + 02
Liberacin de burbujas rpida y sostenida indica la
produccin de oxgeno molecular = prueba (+)
Consideraciones:
No Agar sangre (peroxidasa en los
eritrocitos).

coagulasa Fundamento: Detecta un factor de agregacin

clumping factor en la superficie de la bacteriana.
Procedimiento: se coloca una colonia sospechosa
de pertenecer a una especie de Staphylococcus y se
emulsifica en una gota de plasma de conejo.
Interpretacin: arracimamiento bacteriano en 1
minuto = prueba (+).
Si el resultado es negativo ensayar la produccin de
coagulasa en tubo.
Consideraciones:
Utilizar plasma con EDTA y no citratado, ya
que organismos capaces de metabolizar el
citrato (Enterococcus spp.) pueden dar
resultados falsos (+).
Las pruebas (-) luego de 4 hs de incubacin a
35C, dejar a temperatura ambiente y leer
luego de 18-24 hs a fin de evitar la fibrinlisis
que producen algunas cepas al ser incubadas
en forma prolongada a 35C.

Prueba del PYR Fundamento: detecta la enzima pirrolidonil

arilamidasa se utiliza como sustrato el
reactivo L-pirrolidonil- beta-naftilamida (PYR),
para la identificacin rpida de enterococos.
Procedimiento: Realizar un alto inculo (2
MacFarland) e introducir un disco de PYR.
Tiempo y T de incubacin: 30 minutos a 35
C.
Tiempo de lectura: 5 minutos.
Interpretacin:
Disco rosado o rojo (+)
Disco y/o solucin amarillo a incoloro (-).
Consideraciones: Algunas especies de
Staphylococcus y los estreptococos del grupo
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A dan, tambin, una prueba positiva.

Prueba de la Fundamento: El S. aureus produce una

DNAsa DNAasa termoestable que hidroliza DNA. La
produccin de DNAsa puede determinarse
incorporando cido desoxirribonucleico (DNA)
en agar nutritivo .
Procedimiento: Se inocula el
microorganismo en manchas densas sobre
agar DNA y despus de 18 a 24 hs de
incubacin. Revelar con HCl al 1%, que
precipita el DNA nativo del medio.
Interpretacin: colonias rodeadas por una
zona clara donde el ADN ha sido
despolimerizado e hidrolizado = prueba (+)

Agar Manitol Fruto: el medio contiene manitol (1%),

salado cloruro de sodio (7,5 %), rojo de fenol y
peptonas.
Procedimiento: Sembrar la cepa e incubar
18 a 24 hs a 35C.
Interpretacin:
Crecimiento y viraje
S. aureus
Crecimiento sin viraje.
S. epidermidis
Consideraciones:
La alta concentracin de sal inhibe otros
microorganismos excepto enterococos (por lo tanto
usar la placa para identificacin, no para
aislamiento).

Prueba de la Fundamento: Se basa en la capacidad de

bilis-esculina: ciertas bacterias (estreptococos del grupo D)
para hidrolizar la esculina en presencia de 1-
4% de sales biliares.
Procedimiento: Se inocula el
microorganismo en la superficie de un pico de
flauta. Incubar 24 hs.
Interpretacin: La beta glucosidasa escinde
la esculina en glucosa y esculetina. Esta
ultima es soluble en el medio y forma un
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complejo de color negro con Fe 3+ .La
hidrlisis de esculina se observa como un
oscurecimiento del medio (color negro) en 24
hs de incubacin a 35C, raramente se
requieren 48 hs de incubacin hasta que la
hidrlisis sea aparente.
Consideraciones: Es importante que el
medio contenga 40% de bilis, ya que algunos
productos contienen menos cantidad lo que
lleva a confundir algunos estreptococos
viridans con enterococos

Prueba de CAMP Fundamento: Los estreptococos grupo B

secretan el factor CAMP que interacta con la
-hemolisina secretada por una cepa -
hemoltica de S. aureus (ATCC 25923) lo que
causa un acrecentamiento o sinergismo de la
hemlisis.
Procedimiento: En placa de agar sangre
sembrar una estra de la cepa de S. aureus y
perpendicularmente a sta (lo ms cerca
posible, sin llegar a tocarla) sembrar la cepa
de estreptococo en estudio.
Tiempo y T de incubacin: Incubar 24 hs
a 35C en aerobiosis (en CO2 aumentan los
falsos positivos).
Interpretacin: El sinergismo se observa
como un rea de -
Hemlisis en forma de punta de flecha en la
zona
de desarrollo ms cercana a ambas estras.

Prueba del Fundamento: Ciertas cepas son capaces de

hipurato de hidrolizar el hipurato de sodio. La produccin
sodio de hipuricasa resulta en la hidrlisis del
hipurato de sodio con la formacin de
benzoato de sodio y glicina.
Procedimiento:
Inocular un tubo con medio hipurato de sodio
con el microorganismo. Incubar 24 hs a 35C.
Centrifugar. Pipetear 0.8 ml el sobrenadante.
Agregar 0.2 ml de cloruro frrico 7%.
Inocular un tubo con 0.4 ml de medio
hipurato de sodio con el microorganismo.
Incubar 2 hs a 35C. Agregar 0.2 ml de
Ninhidrina.
Interpretacin:
La formacin de un precipitado denso y
persistente por 10 minutos = prueba (+)
Benzoato de sodio
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La aparicin de un color prpura profundo =
prueba (+) glicina.

Prueba de la Fundamento: Se basa en que ciertas

susceptibilidad bacterias son sensibles a la novobiocina.
a la Procedimiento: Se inocula el
Novobiocina microorganismo en agar Mueller Hinton segn
tcnica de Kirby-Bauer, utilizando discos de
Novobiocina (5 g).
Interpretacin: Sensible: inhibicin del
desarrollo con un dimetro mayor o igual a 16
mm
Staphylococcus R
Micrococcus S
Consideraciones:
Kirby Bauer (Difusin en disco)
Inoculo sin incubacin previa
Tiempo de lectura: 24 hs.
T de incubacin: 33 a 35

CITOCROMOOX Fundamento: El sistema citocromooxidasa, se

IDASA O halla en microorganismo aerobios,
PRUEBA DE LA microaerfilos y anaerobios facultativos.
OXIDASA Procedimiento: Hacer una suspensin del
microorganismo con solucin fisiolgica
(inculo) en un tubo de vidrio, agregar un
disco (disco comercial de papel impregnado
de tetrametil-para-difenilamina) se agita y
antes de los 2 minutos se debe leer.
Interpretacin: Un cambio de color del disco a
rosado o violeta = prueba (+). Si no hay
cambio de color el microorganismo es oxidasa
negativo.
Consideraciones Esta prueba no puede
realizarse con colonias que provengan de
medios de cultivo que contenga hidratos de
carbono ni indicadores, por lo que si se la va
a realizar se debe incubar los
microorganismos en un placa de AS o bien un
TSA (tripteina-soya-agar)

Triple Azcar Fundamento: Sirve para detectar la

Hierro fermentacin de hidratos de carbono. El
medio contiene: glucosa al 0.1%, lactosa 1%,
sacarosa al 1% y peptonas; tambin tiene un
indicador rojo de fenol y sulfato de hierro para
evidenciar la formacin de SH2.
Procedimiento: El medio se fracciona en
picos de flauta con una capa basal profunda
(2 cm. por lo menos). Con el ansa en punta se
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siembra por puncin y estra.
El medio no inoculado es anaranjado-rojizo
o rojo plido. Incubar 24 hs a 35 C.
Interpretacin:
Fermentacin de la glucosa (alcalino/cido)
Primero los microorganismos empiezan a
fermentar la glucosa, produciendo cidos y virando
totalmente el medio a color amarillo. Como
solamente utilizan la glucosa, no pueden usar la
sacarosa ni la lactosa, cuando la glucosa que se
halla en baja concentracin se consume (antes de
las 24hs) los microorganismos comienzan a utilizar
la peptonas con produccin de amonaco que
alcaliniza el medio dando un color rojo, pero
solamente en el pico, quedando el fondo cido.
Fermentacin de glucosa, lactosa y sacarosa
(cido/cido)
Como la lactosa y sacarosa estn en una
proporcin 10 veces mayor que la glucosa, en un
perodo de 24hs., la lactosa y sacarosa, an no se
consumen quedando cido el medio o sea
totalmente amarillo.
3) No fermentacin de lactosa, sacarosa ni glucosa
(alcalino/alcalino). Un microorganismo incapaz de
obtener sus nutrientes de los hidratos de carbono,
lo obtiene de las peptonas. Cuando las peptonas son
degradadas libran amonaco y alcalinizan el medio.
Producindose entonces intensificacin del color.

Prueba de la Fundamento: Se basa en que ciertas

Bacitracina: bacterias son sensibles a la bacitracina.
Procedimiento: Se inocula el
microorganismo en AS segn tcnica de
Kirby-Bauer utilizando discos de Bacitracina
(0.04 U).
Interpretacin: Sensible: Cualquier zona de
inhibicin del desarrollo.
Consideraciones: Kirby Bauer (Difusin en
disco)
Inoculo sin incubacin previa
Tiempo de lectura: 18 a 24 hs.
T de incubacin: 33 a 35 en CO2
Recordar que el uso de discos de Bacitracina
en forma directa en las placas primarias de
cultivo puede dar como resultado un 40% a
50% de falsos negativos.
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PRUEBA DE Fundamento: Determinan el metabolismo
OXIDACIN oxidativo o fermentativo de un hidrato de
FERMENTACI carbono o su falta de utilizacin. Se usa el
N (O-F) medio O-F de Hugh y Leifson que contiene
peptonas e hidratos de carbono en una
relacin 1:5. Al ser menor la concentracin
de peptonas, hay menor produccin de
productos de oxidacin a partir de los AA que
tienden a elevar el pH y pueden neutralizar
los cidos dbiles producidos por los
microorganismos no fermentadores.
Procedimiento: Se utilizan 2 tubos con el
medio O-F, se hace la siembra con ansa de
punta hasta el fondo de los dos tubos. Uno de
los tubos queda expuesto al aire, y el otro se
cubre con vaselina estril.
Interpretacin:
Microorganismos oxidativo: producen
cido solo en el tubo abierto, expuesto al O2
atmosfrico. Por lo que solamente el tubo
expuesto al aire atmosfrico cambia su color
original a amarillo.
Microorganismos fermentadores:
producen cido en los 2 tubos. O sea que los
dos tubos viran del verde al amarillo.
Bacterias sacarolticas: son inertes a este
medio que conserva su pH alcalino despus
de la incubacin, conservando su color
original.

SIM Fundamento: Es un medio semi-slido

(SULFHDRICO transparente que pone en evidencia la
INDOL movilidad, la produccin de triptofanasa y de
MOVILIDAD) SH2. Contiene:
Triptofano: la enzima triptofanasa, lo
desdobla, produce indol, que se pone de
manifiesto con el reactivo de Erlich o Kovac
Citrato de hierro y amonio: los
microorganismos productores de SH2
ennegrecen el medio de cultivo
Si los microorganismos son mviles, al ser
ste un medio semi-slido se produce
enturbiamiento del medio de cultivo, caso
contrario solo crece en la puncin.
Procedimiento: se inocula el
microorganismo por puncin con ansa de
punta. Se deja incubar a 35C durante 24hs. y
luego de este tiempo se agregan unas gotas
del reactivo de Erlich o Kovac dejndolo
resbalar por las paredes del tubo.
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Interpretacin:
Triptfano (+): observar la interfase, la
aparicin de un color rojo fucsia brillante por
la formacin de un complejo entre el indol y
el p-dimetilaminobenzaldehido.
M (+) / SH2 (-) enturbiamiento del medio
M (+) / SH2 (+), se ennegrece todo el medio
M (-) / SH2 (-) se observa crecimiento
solamente en la estra
M (-) / SH2 (+), se observa precipitado negro
alrededor de la estra (pero no ennegreciendo
de todo el medio).

ROJO DE Fundamento: El acido pirvico, un

METILO compuesto fundamental formado en la
VOGES fermentacin de la glucosa, es metabolizado
PROSKAUER: an mas a travs de cierto numero de vas
metablicas. Una de ellas da como resultado
la produccin de acetona (acetil-metil-
carbinol) un producto final de reaccin
neutra. En presencia de oxigeno e KOH al
40%, la acetona es convertida en diacetilo y
el naftol sirve como catalizador para
producir un complejo de color rojo.
Procedimiento: Se usa el mismo caldo de
enriquecimiento para las dos pruebas (2ml),
se hace la inoculacin del microorganismo, y
se lleva a incubar a 35C durante como
mnimo 24-72hs..
Luego se lo divide en dos partes, una para la
prueba de RM y otra para la de VP.
Rojo de metilo: se agregan 3 gotas del
reactivo de metilo, si en la superficie del
medio aparece un color rojo intenso es RM
(+) = microorganismos que utilizan la glucosa
fermentndola hasta llegar a un pH menor a
4,4.
VP: Se agrega 0.6 ml de alfa-naftol seguidos
de 0,2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los
reactivos se agreguen en este orden. El tubo
se sacude suavemente y luego se deja quieto
de 10 a 15 min. La aparicin de color rojo =
prueba (+) (presencia de acetil-metil-
carbinol).
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ONPG (O- Fundamento: Lo microorganismos lactosa
NITROFENIL-- (+) tienen -galactosidasa y permeasa, dos
GALACTOPIRA enzimas necesarias para la formacin de
NSIDO) cidos a partir de la lactosa
La permeasa es necesaria para que la
molcula de lactosa ingrese en la clula
bacteriana.
Hay algunos microorganismo que son falsos
lactosa (-) por carecer de permeasa, pero s
tienen -galactosidasa, en realidad son
lactosas (+).
Esta prueba se hace con los microorganismo
que dan lactosa (-)
Procedimiento: Hacer un inculo con SF
estril, agregar un disco de papel comercial,
se agita y antes de los 2 minutos se debe
leer.
Interpretacin: Un color amarillo intenso
nos indica que el microorganismo es
productor de -galactosidasa= prueba (+).
Consideraciones
Se hace un inculo del microorganismo en
solucin fisiolgica estril, se agrega un disco
de papel. Se lleva a incubar a 37C durante
24hs.

CITRATO Fundamento: Sirve para poner de manifiesto

aquellos microorganismos que utilizan el
citrato como nica fuente de carbono, el
indicador es azul de bromo timol.
Procedimiento: El color original del medio
es verde, y se encuentra fraccionado en pico
de flauta, la siembra se hace por estra, se
incuba 24-72hs a 35C.
Interpretacin: Si el microorganismo utiliza
citrato, se produce alcalinizacin del medio
de cultivo pasando ste a color azul intenso,
lo cual indica prueba positiva para el citrato
Ureasa Fundamento: Sirve para poner de manifiesto
aquellos microorganismo que poseen la
enzima ureasa.
Procedimiento: El medio fraccionado en
pico de flauta contiene urea y rojo de fenol
como indicador, el color original del medio es
amarillo (o sea cido) La siembra se realiza
con ansa de punta tanto en profundidad como
en la superficie. Se deja incubar 24 hs a 35
C.
Interpretacin: Si el microorganismo es
productor de ureasa, desdobla la urea
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produciendo amonaco, consecuentemente
produce alcalinidad que se manifiesta porque
el medio toma un color fucsia.

Fenilalanina Fundamento: Sirve para poner de

manifiesto aquellos microorganismo que
poseen la enzima FENIL-ALANINA-
DESAMINASA. El medio se prepara con un
pico de flauta largo, pues la lectura se hace
sobre la superficie del medio de cultivo.
Procedimiento: Se siembra sobre la
superficie del medio solamente, se incuba 24
hs a 35 C, se revela con cloruro frrico.
Interpretacin: El color original es amarillo,
si el microorganismo es productor de la
enzima, al agregar sobre el medio cloruro
frrico, sta se pone de manifiesto, dando a
la superficie un color verde intenso.

AMINOCIDOS: Fundamento: Las descarboxilasas son

DESCARBOXIL enzimas sustrato-especficas (presentes o no
ASAS en los microorganismos) capaces de
reaccionar con la porcin carboxilo (COOH) de
AA formando aminas de reaccin alcalina.
Esta reaccin, conocida como
descarboxilacin, forma C02 como producto
secundario. Cada descarboxilasa es especfica
para un aminocido.
Lisina, arginina y ornitina son los aminocidos
evaluados de rutina en la identificacin de
enterobacterias.
El medio Moeller es la base (semi-slida) que
se emplea con ms frecuencia. El aminocido
se agrega a la base. El color original es lila.
Procedimiento: Se inoculan por puncin 2
tubos y se sellan con aceite mineral. Uno de
los tubos contiene el AA y el otro no.
Interpretacin: Si el aminocido es
descarboxilado, se forman aminas alcalinas y
el medio pasa a violeta ms intenso. Si no es
descarboxilado pero fermenta la glucosa,
vira al amarillo por la formacin de cidos

Lisina Hierro Agar de ensayo para la demostracin simultnea de

Agar (LIA) lisina decarboxilasa(LD) y de la formacin de
hidrogeno sulfurado (H2S) para la identificacinde
enterobacterias.
La lisina puede ser descarboxilada por
microorganismos LD positivasque la transforman en
la amina cadaverina. Esto produce un viraje al
violeta del indicador de pH prpura de
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bromocresol,puesto que la descarboxilacin slo
tiene lugar en medio cido (pH inferior a6.0). Es
necesario que se produzca previamente la
acidificacin del medio decultivo, por fermentacin
de la glucosa. Este medio de cultivo solo puede
utilizarse para la diferenciacin de bacterias que
fermentan glucosa.
Los microorganismos LD negativos, pero
fermentadores de la glucosa,producen un viraje al
amarillo de la totalidad del medio de cultivo.
Laincubacin prolongada puede ocasionar
alcalinizacin en la zona de lasuperficie del medio
de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje
alvioleta. La formacin de H2S produce una
coloracin negra debido al sulfuro de hierro
producido