INSTITUTO POLITCNICO

NACIONAL
Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas
Departamento Microbiologa
Laboratorio de Fisiologa y Bioqumica Microbiana
Autores:
Herrera Rodrguez juan Manuel
Garca Garca Citlalli Itzel
Lpez Bailn Luis Uriel
6QV1 Equipo-3 1 - Octubre - 2013

Prctica No. 3 Determinacin de actividad de

succinato deshidrogenasa de Escherichia coli..
HIPTESIS

De acuerdo a la literatura [1] sabemos que la enzima succinato deshidrogenasa es una enzima
regulada por glucosa, en presencia de este sustrato es reprimida su expresin gentica y con
ello los niveles de la enzima bajan, por lo que esperamos que al hacer el ensayo, en presencia de
un cultivo expuesto a glucosa la actividad se vea disminuida, por otro lado en caso contrario, el
succinato estimula la produccin de la enzima por lo que la actividad esperada es alta. La
determinacin de la actividad, se har por medio de una cadena transportadora de electrones
[3]
, puesto que esta enzima adems de participar en el ciclo de los cidos tricarboxilicos participa
en la cadena transportadora de electrones a nivel de la CoQ.

DESARROLLO ESPERIMENTAL.

Diagrama de flujo.

1
 Figura 1. Desarrollo experimental.

Descripcin.
Lo que se muestra en la Figura No.1 es el diagrama que se sigui durante el proceso
experimental, sin embargo hay ciertos pasos que son de vital importancia para poder obtener
buenos. Los pasos crticos tienen un contorno rojo, en primera estancia sabemos que si se
2
adicionan todos las sustancias (regulador de fosfatos, 2,6 diclorofenol-indofenol, KCN y
Metosulfato de Fenazina) no hay gran problema puesto que no se encuentra la enzima que va a
dar pie a las reacciones de una cadena transportadora de electrones artificial sin embargo en el
paso donde dice Suspensin celular, debemos mencionar que se realizaron 4 diferentes
combinaciones de fuentes de carbono entre Succionato y Glucosa, al adicionar la suspensin
celular con las variaciones ya mencionadas la reaccin comenzara de forma inmediata por lo
que se tenia que pasar de forma rpida al espectrofotmetro para comenzar con las lecturas
correspondientes, estos pasos son bsicos por que como sabemos la combinacin de 2,6
diclorofenol-indofenol + Metosulfato de Fenazina con la enzima ya se dara la reaccin y es esto
lo que se quiere determinar.

OBJETIVO GENERAL.

Analizar los resultados obtenidos de la actividad de Succinato deshidrogenasa, en los cultivos

crecidos en diferentes condiciones, concluyendo el papel fisiolgico de esta enzima.

OBJETIVOS PARTICULARES.

Realizar la determinacin de la actividad enzimtica, por medio del mtodo de Ells.

Observar en un grfico la cintica de la actividad de la enzima.
Determinar si es una enzima regulada por glucosa.
Determinar si el succinato la estimula.
Realizar una cadena transportadora de electrones artificial.

CLCULOS Y RESULTADOS.

Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E coli.

Tabla 1. A continuacion de muestran los valores de Absorbancia como medida del crecimiento
de la bacteria Escherichia coli.

Matraces con Crecimiento (Absorbencia a 600 nm)

Cultivos previos. ms fuente de carbono
medio base
Inicial Final absorbencia
1 succinato 0.754 1.157 0.403
Succinato
2 glucosa 0.75 1.197 0.447
3 succinato 0.958 1.296 0.338
Glucosa
4 glucosa 0.95 1.432 0.482

3
Efecto de la fuente de carbono en la actividad de succinato deshidrogenasa.
Tabla 2. Aqu se muestran los valores de % de Transmitancia obtenidos, en base a las diferentes
fuentes de carbono.
% de transmitancia a 600nm de las suspensiones celulares
Tiempo crecidas en las fuentes de carbono
(seg) 1. 2. 3. 4.
Succinato/Succin Succinato/gluco glucosa/succin glucosa/gluco
ato sa ato sa
0 8.1 7 9.1 6.8
30 9.8 7.6 9.3 7
60 10.9 8.1 9.9 7.4
90 12.1 8.5 10.4 7.7
120 13.2 8.8 10.8 8
150 13.4 9.1 11.2 8.2
180 15.6 9.3 11.6 8.5
210 17 9.6 12 8.7
240 18.4 9.8 12.4 8.9
270 19.9 10 12.7 9.1
300 21.6 10.2 13 9.3

Diferencias de % Transmitancia Inicial - % Transmitancia Final.

Tabla 3. Aqu se muestra en resultado de la resta de las transmitancias obtenidas a diferentes
tiempos.
Transmitancia Inicial - Transmitancia final
Tiempo S/S S/G G/S G/G
30 1.7 0.6 0.2 0.2
60 2.8 1.1 0.8 0.6
90 4 1.5 1.3 0.9
120 5.1 1.8 1.7 1.2
150 5.3 2.1 2.1 1.4
180 7.5 2.3 2.5 1.7
210 8.9 2.6 2.9 1.9
240 10.3 2.8 3.3 2.1
270 11.8 3 3.6 2.3
300 13.5 3.2 3.9 2.5

MANEJO DE DATOS

Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E. coli

Se obtiene la diferencia de las absorbancias a 600nm de cada uno de los 4 tratamientos.

Ejemplo:

Matraz 1 Absorbancia=absrobanca finalabsorbanciainicial=1.1570.454=0.403

4
 Efecto de la fuente de carbono en la actividad de succinato deshidrogenasa

A cada dato obtenido de % de transmitancia a los diferentes tiempos se les resta el tiempo 0
respectivo. Ejemplo: Succinato/succinato

Tiempo ( seg ) 30tiempo ( seg ) 0=9.88.1=1.7 Tiempo ( seg ) 60tiempo ( seg ) 0=10.98.1=2.8

Tiempo ( seg ) 300tiempo ( seg ) 0=21.68.1=13.5

GRFICAS.

Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E. coli

0.5

0.4

0.3
absorbancia a 600nm
0.2

0.1

0
S/S S/G G/S G/G

Condiciones de crecimiento y fuente de carbono adicionada

5
Figura 2. En esta grafica se compara el crecimiento de E. coli cuando es crecida en una fuente
de carbono (succinato o glucosa) y posteriormente agregando otra fuente de carbono (succinato
o glucosa) comparando la absorbancia a 600nm inicial y final.

Efecto de la fuente de carbono en la actividad de succinado deshidrogenasa de E. coli

14

12

10

8
S/S a 600nm
%transmitancia S/G G/S G/G
6

0
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

Tiempo (segundos)

6
Figura 3. Comparacin de la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa de E.coli cuando se
cambian las fuentes de carbono

DISCUSIN.

El principal objetivo de este trabajo era medir la actividad enzimtica de la succinato

deshidrogenasa en Escherichia coli. Utilizando como variable la fuente de carbono a la cual
fueron sometidos los cultivos de la bacteria. Donde se observaron fisiolgicamente dos
caractersticas, el crecimiento y la actividad enzimtica de la SDHasa.

Comenzaremos por el anlisis de las 4 variables de fuente de carbono en los cultivos, donde se
tena a los cultivos primero uno en glucosa y el segundo en succinato, de ah se tomaron de cada
uno, dos alcuotas y una de cada uno de los primeros se puso en glucosa y la segunda alcuota
de cada uno en succinato, quedando los cultivos as: Glucosa-Glucosa (G-G), Glucosa-Succinato
(G-S), Succinato-Succinato (S-S) y Succinato-Glucosa (S-G). En donde en cuanto al crecimiento se
sabe que la glucosa es una fuente de carbono que brinda ms energa que el succinato, pues en
glucolisis se obtienen 36 ATPs y en succinato solo 2, es por ello que en el cultivo crecido en G-G
se obtuvo el mayor crecimiento que en los otros 3, en el cultivo G-S, al haber crecido primero en
glucosa y lego pasado a succinato se esperara que en reaccin a los 4, este fuera el segundo
con ms crecimiento, lo cual no fue as, siendo el segundo con ms crecimiento el S-G, lo cual en
comparacin con el S-S suena razonable, puesto que al cambiar a glucosa, este cultivo, obtuvo
ms energa y con ello se desarroll ms que el S-S, el cual obtuvo los valores mas bajos. En el
caso de G-S, pudo haber salido bajo, debido a que al cambiar la fuente da carbono, las bacterias
deban cambiar la maquinaria enzimtica para poder utilizar el succinato y despus de ello al
brindar poca energa el succinato, creci poco.

Despus en cuanto a la actividad de la SDHasa, esta al ser estimulada por el succinato, es por
ello que en los cultivos, donde se pasaron a succinato como fuente de carbono, como en S-S y G-
S, se obtuvieron las actividades mayores de la enzima, siendo considerablemente mucho ms
elevada en el cultivo S-S puesto que siempre fue estimulada la produccin de la enzima en este
cultivo, en cuanto al cultivo de S-G, se sabe que [1} la glucosa inhibe la produccin de la enzima,
lo cual se comprob, pues la actividad de esta en comparacin de S-S fue demasiado baja, y por
ltimo en el cultivo de G-G, al nunca haber estado la bacteria en contacto con el succinato, no se
estimul la produccin de la enzima y por ello no hubo un incremento de la actividad, a esta
lectura de actividad de la SDHasa, podramos considerarla como la cantidad de la enzima en
estado basal.

Por ultimo tenemos un factor que pudo alterar los resultados, la exposicin a la luz de los
reactivos, pues como se menciona en el desarrollo experimental, para medir la actividad de la
enzima se sustenta en el que esta participa en la cadena transportadora de electrones, y
haciendo una cadena artificial con reactivo que son coloridos, la actividad de la enzima se puede
medir, pero esta, se ve alterada, al hacerse de modo artificial, por la luz, pues el MSF y el 2,6
DFIF son foto sensibles y se reducen por la luz, mas no por la accin de la enzima, es por ello que

7
podra verse un poco incrementados los valores de las lecturas de la actividad, pero al ser un
factor que latera todo el proceso, el incremento no altera de modo directo la interpretacin de
los resultados.

CONCLUSIONES.

La enzima succinato deshidorgenasa es regulada por represin catablica por glucosa

La produccin de la enzima solo se estimula en presencia de succinato y ausencia de
glucosa
El succinato como fuente de carbono provee de menos energa a la clula que la
glucosa

BIBLIOGRAFA.

[1] Ruiz-Herrera, J. y L. Garcia. 1972. Regulation of succinate deshidrogenase in Escherichia coli.

J. Gen. Microbiol. 72: 29-35.

[2] Bohinsk. Bioquimica. 5ta edicin Person-Educacin. 580, 581.

[3] Voet Donald. 2009. Fundamentos de bioqumica: la vida a nivel molecular. 2 Ed. Mdica
Panamericana. Buenos aires Argentina. Pg. 530.

[4] Owen Peter JH Freerr. Factores que afectan la actividad de la succinato deshidrogenasa.
Graficas anexas.

ANEXO.

Fotorreduccin 2,6 DFIF + MSF

0.9
0.8
0.7
0.6

E 600/min 0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (min)

8
Figura 2. Efecto de la luz sobre el Diclorofenol indofenol y el Metasulfato de frenazina.

Act. Membranas
0.7
0.6
0.5
0.4
E 600/min 0.3

0.2
0.1
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Membranas (1:11)

Figura 3. Actividad enzimtica de la succinato deshidrogenasa en las membranas.