EXPERIMENTO 6

PURIFICACIN DE LA ENZIMA LISOZIMA PRESENTE

EN LA CLARA DE HUEVO

REQUISITOS
Repasar los principios
de cromatografa de
intercambio inico, OBJETIVOS
electroforesis, Purificar la enzima lisozima a partir de la
influencia del pH y clara de huevo por cromatografa de
espectrofotometra intercambio inico, basndonos en su
punto isoelctrico, purificacin mediante
electroforsis en geles de poliacrilamida
y determinacin de la actividad
enzimtica por espectrofotometra.

1. FUNDAMENTO

Entre las protenas de la clara de huevo la lisozima es la nica que presenta un punto
isoelctrico pH 9,5 por esta razn es fcilmente separable del resto de las protenas de la
clara de huevo, a un pH entre 9,5 y 10 es la nica que posee una carga neta positiva, por lo
tanto, los intercambiadores aninicos dejaran libre esta enzima o los intercambiadores
catinicos se ligaran a ella. Nosotros seguiremos la purificacin basados en este principio,
para luego efectuar una electroforesis vertical en geles de poliacrilamida. Cuando
comprobemos el recorrido de las bandas originadas por las protenas presentes en cada
fraccin (de F0 a F4) contra las bandas de las protenas comerciales con peso molecular
(PM) conocido, podemos verificar el grado de purificacin de la fraccin que contiene la
enzima ya que presentara una banda ntida y con el mismo PM de la lisozima comercial.

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Tambin, podemos establecer el PM aproximado de las otras protenas presentes en las
fracciones restantes, y as comprobar si la purificacin mediante columnas de
intercambiadores inicos fue eficiente.

La enzima lisozima es una hidrolasa que cumple funciones de proteccin antibacteriana en

nuestro organismo, ya que hidroliza el enlace glucosdico de los polisacridos que forman
las paredes celulares de las bacterias, por esta razn, al provocar la lisis del microorganismo
Micrococus lisodeikticus, la suspensin bacteriana se aclara (pierde turbidez) permitiendo
medir la actividad enzimtica siguiendo el declive de la absorbancia a 450 nm.

2. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO:
2.1. Materiales equipos y reactivos

La clara de un huevo da aproximadamente 20 mg de enzima.

Lisozima comercial
2 g de CM-Celulosa
2 g de DEAE-Celulosa
Glicina 0,1 M en tampn de NaOH pH 10,0
Glicina 0,1 M en tampn de NaOH pH 10,0 con 0,5 M de NaCl
Centrifuga
Columna de 1 cm de dimetro x 25 cm de largo
Reactivos para calcular la concentracin de protenas por el mtodo de Lowry
Espectrofotmetro
Tampn fosfato 0,1 M pH 6,24
20 mg de M. lisodeikticus comercial
Equipo de electroforsis
Soluciones para electroforsis (ver mtodo)
Agitador rotatorio

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 2.2. PROCEDIMIENTO

2.2.1. Protocolo para la Purificacin de la Enzima (columna de CM-Celulosa)

Filtrar 5 mL de clara en gasa, medir y diluir 5 veces con

tampn de glicina 0,1 M en NaOH pH 10

F0 = Medir 1 mL de esta muestra

donde estn todas las protenas

Pesar 2 g de CM-Celulosa en un vaso de precipitado y

mezclar 15 min. para adsorber la lisozima

Centrifugar la suspensin por 5 min. a 1.500 g

F1 = Medir 3 mL de En el sedimento de celulosa

sobrenadante donde estn est la lisozima
todas las protenas menos
la lisozima
Lavar con 10 mL de tampn de glicina y
centrifugar como anteriormente
y centrifugar como anteriormente

F2 = Medir 3 mL
de sobrenadante Resuspender el sedimento en 10 mL del
(pocas protenas) mismo tampn y llenar la columna de 1cm

Eluir con el tampn glicina hasta no

encontrar ms protenas (Biuret, ver mtodo)

F3 = Medir 3 mL del eluato

de la columna negativo para Eluir la lisozima de la columna con el tampn
Biuret (muy pocas protenas) glicina que contiene 0,5 M de NaCl

F4 = Medir 3 mL del eluato de la columna

positivo para Biuret (lisozima pura)
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2.2.2. Determinacin de la concentracin de protenas por el mtodo de Lowry
2.2.2.1. Soluciones:

Solucin A: Na2CO3 2% en NaOH 0,1N

Solucin B1: CuS04 1% en H2O
Solucin B2: Tartrato de sodio-potasio 2% en H2O
Solucin Folin diluida 1:1 con H2O
Solucin C: B1 + B2 + A (1:1:100)
Solucin de albmina (Patrn) 1 mg/mL.

2.2.2.2. Procedimiento de la curva patrn:

Solucin
H2 O Solucin A Solucin DO
Muestra Albmina * **
(mL) (mL) Folin (mL) 750nm
(mL)
Blanco 0 0,6 3 * 0,3 **
Patrn 1 0,025 0,575 3 * 0,3 **
Patrn 2 0,05 0,55 3 * 0,3 **
Patrn 3 0,1 0,5 3 * 0,3 **
Patrn 4 0,15 0,45 3 * 0,3 **
Patrn 5 0,2 0,4 3 * 0,3 **

* Luego de aadir la solucin A esperar 10 minutos

** Despus de aadir la solucin Folin esperar 30 minutos

2.2.2.3. Determinacin de la concentracin de protenas en la muestra problema:

Muestra Sustancia H2 O Solucin A * Solucin ** DO

problema (mL) (mL) Folin (mL) 750nm
(mL)
Fracciones 0,1 0,5 3 * 0,3 **

* Luego de aadir la solucin A esperar 10 minutos

** Despus de aadir la solucin Folin esperar 30 minutos

2.2.3. Determinacin cualitativa de protenas mediante la reaccin de Biuret

Prepare CuSO4 al 0,5 % y NaOH al 10 %. Coloque 0,5 mL en un tubo y 0,5 mL de NaOH

al 10 % agite y aada 4 gotas del CuSO4 al 0,5 %, agitando despus de cada adicin. La
aparicin de un color violeta indica la presencia de protenas al formarse un complejo de
coordinacin entre el Cu y las uniones peptdicas.

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2.2.4. Determinacin de la Actividad de la Lisozima
2.2.4.2. Disuelva 20 mg de M. lisodeikticus en 100 mL de tampn fosfato pH 6,24.
2.2.4.3. Prepare los tubos suficientes, incluyendo el blanco. La actividad enzimtica en
cada una de las fracciones se detectar mediante el declive de la absorbancia a 450 nm en el
espectrofotmetro.
2.2.4.4. Bajo estas condiciones estndar 1 unidad es definida como la actividad causada a
450 de 0,001 g en 1 min.
2.2.4.5. Efecte los clculos y escriba sus resultados en una tabla.
PROCEDIMIENTO:

MUESTRA TAMPN FOSFATO TAMPN FOSFATO + H2O FRACCIONES

(mL) MICROORGANISMO (mL) (mL) (mL)
Blanco 3 - - -
Control - 2 1 -
F0 - 2 - 1
F1 - 2 - 1
F2 - 2 - 1
F3 - 2 - 1
F4 - 2 - 1
Medir la absorbancia cada 15 min. hasta obtener la misma lectura, a una D.O. de 450 nm.

Actividad Enzimtica = Lectura Inicial-Lectura final = X

Tiempo

Actividad Especfica de la Enzima = X

mg de protenas

3. AUTO-EVALUACION

3.1 Consulte sobre las propiedades lticas de la enzima, su sustrato, clasificacin.

3.2 Disee un protocolo para intercambio con DEAE-Celulosa.
3.3 Cmo cree Ud. que se pudo determinar el punto isoelctrico de la lisozima?, disee un
protocolo para llegar a determinarlo