ANLISIS FUNCIONAL ORGNICO

1 cuatrimestre 2013

HPLC
High Performance Liquid Chromatography
Cromatografa lquida de alta resolucin
(CLAR)

Diseo instrumental de HPLC

Muestra
Inyector

Mezclador

Bombas
Cromatograma
Columna
(fase fija)

Detector

Solventes (fase mvil) Descarte

Comparacin HPLC - CG

Propiedad HPLC CG

Volatilidad de la No es requisito Es un requisito

muestra Muestra soluble en
fase mvil
Polaridad de Inicos, polares, no Polares, no polares
analitos polares

Estabilidad trmica Anlisis a Es un requisito

T amb o menor (inyector, columna)
(Tmx 60 C)
Peso molecular No hay lmite Tpicamente hasta
terico superior 500-600
(solubilidad) (volatilidad)

Comparacin HPLC CG (cont.)

Propiedad HPLC CG

Preparacin de la Filtrar Sv inyeccin voltil,

muestra Sv inyeccin = fase eluye antes que los
mvil (idealmente) analitos (idealmente)
Escala Analtica, preparativa Analtica

Separacin Fase mvil, fase Gas carrier

estacionaria Fase estacionaria
(temperatura)
Detectores Ms comn UV-vis Ms comn FID
Muchos no GC-MS
destructivos
HPLC-MS
Conceptos tericos bsicos

tR,B

tR,A Eficiencia (N platos tericos)

N = 16 (tR/wt)2 = 5,54 (tR/w1/2)2

tR,C

Parmetros de columna
t0
Fase mvil (viscosidad)
W1/2
Velocidad de flujo de solvente
Wt
Analitos

Conceptos tericos bsicos Factor de retencin

(factor de capacidad)

k = (tR-t0)/ t0
tR,B
Tiempo en fase estacionaria vs
tR,A tiempo en fase mvil

tR,C

t0
W1/2
Wt
Conceptos tericos bsicos Selectividad o factor de
separacin

= k2/ k1 = (tR,B-t0)/ (tR,A-t0)

tR,B

1
tR,A
Composicin de fase mvil
Composicin de fase estacionaria
Temperatura
tR,C

t0
W1/2
Wt

Conceptos tericos bsicos Resolucin

tR,B

tR,A

tR,C

t0
W1/2
Wt
 Conceptos tericos bsicos

Selectividad tiene el
mayor impacto sobre
resolucin (fase
estacionaria, fase mvil) Rs = 0,6 valle entre picos
Rs = 1 permite cuantificar
Rs = 1,6-1,7 cuantificacin
confiable

Conceptos tericos bsicos

Cambio de Velocidad
presin Viscosidad de flujo
Longitud de
columna

Dimetro de
Radio de la partcula
columna
Conceptos tericos bsicos
Ecuacin de van Deemter

Altura de plato (H)

Hmn

uopt Velocidad lineal (u)

A menor altura de plato, hay mayor nmero de platos y es mayor la resolucin

cromatogrfica

Conceptos tericos bsicos

Retencin con gradiente de solvente

Tiempo de Velocidad
gradiente de flujo

Volumen muerto de
columna

Cambio de fraccin
en volumen del
solvente B
 Desarrollo de un mtodo para HPLC

-Modos de HPLC
-Eleccin de dimensiones de la columna y tamao de partcula
-Eleccin de fase estacionaria
-Aplicacin a fase reversa
-Seleccin de fase estacionaria
-Seleccin de fase mvil
-pH
-Optimizacin de condiciones
-Desarrollo de condiciones para otros modos cromatogrficos

Variables: fase estacionaria y fase mvil

Eleccin del modo cromatogrfico

-Fase reversa (RP, reverse phase)

-Fase normal
-HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography),
[ANC (aqueous normal phase)]
-Intercambio inico (IEC)
-Exclusin por tamao (SEC) sistema acuoso
Permeacin por geles (GPC) sistema no acuoso

Seleccin determinada por -tipo de analito y su solubilidad

-peso molecular del analito
-matriz de la muestra
-disponibilidad de fase estacionaria y columna
 Fase reversa es aplicable a
analitos inicos, polares y no
polares.
Seleccin adecuada de
condiciones.

Varios modos
posibles para un
mismo tipo de
analito
Eleccin de dimensiones de la columna y tamao de partcula

Columna HPLC

Dimensiones de
Fase estacionaria
columna

Tipo de Tamao de Tamao de Dimetro

Largo
superficie poro partcula interno

Propiedades qumicas Propiedades fsicas

Selectividad, Eficiencia,
factor de retencin velocidad de anlisis
 Algunas especificaciones de columnas para cromatografa lquida

Tamao de partcula
-Tradicional 5 m, tendencia actual 3 m

-UHPLC (Ultra high pressure liquid chromatography)

Para mayor velocidad de anlisis y/o mayor resolucin 1,8-2 m, en combinacin con
columnas cortas (50 mm o menos).
Partculas ms pequeas: mejoran resolucin, eficiencia y tiempo de anlisis;
aumenta la presin de trabajo (600-1200 bar)
Clasificacin segn tiempo de anlisis: fast 10 min
ultra fast 1min

-Se desarrolaron recientemente partculas superficialmente porosas (SPP), tienen un core

slido (1,7 m) recubierto con una capa porosa de slica (0,5 m de espesor).
Separacin superficial disminuye difusin
Ventaja: resolucin similar a partculas de 1,8 m a menor presin de trabajo (<400 bar)
se puede aumentar la velocidad de flujo, menor tiempo de anlisis
 Algunas especificaciones de columnas para cromatografa lquida (cont)

Dimensiones de columna
-Tradicional para desarrollo analtico:

4,6 x 150 mm; 5 m

4,6 x 100 mm; 5 m
4,6 x 250 mm; 5 m

Tendencia actual: 4,6 x 100 mm; 3 m (partcula comn)

4,6 x 100 mm; 2,7 m (partcula porosa)

-Columnas de menor dimetro interno para mejorar sensibilidad o

cuando la muestra es limitada

Nano muestra < 1 pg; velocidad de solvente: nl/min

Capilar muestra pg-ng; velocidad de solvente: 4 l/min

Microbore muestra ng-g; velocidad de solvente: 40 l/min

 Dimensiones de columna
Dimetros de columna segn su aplicacin

-Anlisis de alta capacidad de muestras (high throughput) Longitud , partcula < 2 m

- Muestra compleja con varios componentes Longitud , partcula pequea (P )
-LC-MS dimetro ( 2,1 mm), velocidad de flujo
-Cromatografa preparativa dimetro (10-50 mm), partculas grandes (5-10 m),
velocidad de flujo

Fase estacionaria Modo fase reversa

Principio:
Particin de analitos entre fase estacionaria no polar y fase mvil polar.
Interacciones no polares y no especficas de los analitos con la fase estacionaria hidrofbica.

Fases estacionarias ligadas:

grupos hidrofbicos unidos a los grupos silanoles (SiOH) de la slica.
-C18
-C8
-C3
-fenilo

Fase mvil
-agua, con control de pH opcional (buffer, cido o base)
-solvente orgnico miscible con agua

Separacin de molculas no polares, polares, ionizables y inicas

Se mejora la retencin de compuestos ionizables por agregado de un modificador a la fase mvil.

Regla general:
los analitos de mayor tamao (protenas, PM > 2000) se analizan en columnas de fase reversa de
cadena corta (C3, CN) con poro grande (300 ); los analitos ms pequeos (PM < 2000) se separan
en columnas de cadena ms larga (C8, C18) con poro menor (80-120 ).
 Fase estacionaria Modo fase reversa

Diferentes estrategias para distribuir las cadenas hidrofbicas sobre los SiOH

OH

OH

No recubierta Recubierta
Protegida (end capped) Recubierta,
estricamente mayor estabilidad al pH
No recubierta (hasta pH 11)

Fase estacionaria Modo fase reversa

 Fase mvil Modo fase reversa

H2O + modificador orgnico: acetonitrilo, metanol (THF, i-propanol)

Cambio en fase mvil Variacin en selectividad y retencin de muestras.

La solubilidad de la muestra puede condicionar la seleccin de la fase mvil.

Es importante controlar el pH y la fuerza inica de la fase mvil cuando los analitos son
compuestos ionizables o inicos. Se recomienda trabajar a pH 2-4.

pH de trabajo: 1 unidad de pH con respecto a pKa o pKb de los solutos analizados (90% de
predominio de especies no ionizadas). Ajustar el pH sobre el componente acuoso.

Fase mvil Modo fase reversa

Siempre considerar a la fase mvil como una

potencial fuente de problemas para la columna.
Consultar tablas de propiedades de solventes y
miscibilidades.
Usar solventes frescos (cambio de composicin
o contaminacin).

Asegurar la desgasificacin de los solventes:

-Desplazamiento con un gas menos soluble (He)
-Vaco
-Sonicacin
-Calentamiento
 Fase mvil Modo fase reversa

En lo posible preparar la muestra un solvente de la misma composicin que la fase mvil para
evitar distorsiones por solventes con gran poder de elucin.

pH de la fase mvil Modo fase reversa

Supresin inica: regulacin del pH de la fase mvil para evitar la ionizacin de los analitos y
mejorar su retencin en la fase fija.

Un buffer es efectivo para regular el pH a 1 unidad con respecto a su pK.

Ejemplo: buffer actico/acetato tiene pKa 4,8, regula a pH 3,8-5,8.
pH de la fase mvil Modo fase reversa

pH de la fase mvil Modo fase reversa

- Par inico: alternativa a supresin inica.

Fase unida Reactivo de par inico

SO3 Na+

R
SO3 H
+ N R
R

Separacin de bases con

alquilsulfonatos

cido Trifluoroactico (TFA)

cido Heptafluorobutrico (HFTBA)
cido Hexanosulfnico

- Compuestos bsicos: muchas veces no es necesario trabajar a pH alto, que puede daar
la columna.

- Ionizacin potencial de los SiOH a pH ~7 SiO- aumenta la retencin de cationes

(aminas protonadas), interaccin secundaria, ensanchamiento del pico cromatogrfico. Se
evita a pH bajo. Otra opcin: columnas end-capped, recubiertas.
pH de la fase mvil Modo fase reversa

Es posible usar una fase mvil sin buffer, simplemente una fase acuosa cida

Detector UV:
La fase mvil y en particular el buffer deben ser transparentes a la de medicin solvente y
buffer con cutoff < 220 nm sales de cido fosfrico + acetonitrilo.
Desventaja: no se debe exceder 70% de solvente orgnico debido a la baja solubilidad de las
sales de fosfato.

pH de la fase mvil Modo fase reversa

Detector espectrmetro de masa:

Se deben excluir materiales no voltiles de la fase mvil para no daar la fuente
de ionizacin se evitan sales de fosfato y contraiones no voltiles; se evitan
TEA y TFA que presentan supresin inica en la fuente de ionizacin.
Se usan sales de amonio de buffer formiato y acetato, que no sirven para
detector UV.

Idealmente, ambas fases mviles (A = acuosa, B = orgnica) deberan tener el

mismo contenido de buffer, de modo que cuando se use un gradiente de
solvente slo vare la proporcin de fase orgnica.
Optimizacin de condiciones Modo fase reversa

1) Isocrtica

Para un mtodo de control de calidad, se reducen variables.

2) Gradiente

Para una muestra compleja con un rango amplio de tR de los analitos.

Optimizacin de condiciones Modo fase reversa

1) Isocrtica
Se vara %B de modo que 1 k 10.
Se comienza con %B alto para asegurar elucin de todos los analitos, se va reduciendo
10-20% (cuidado con el uso de buffer!)

-Buena resolucin
-Anlisis rpido
Optimizacin de condiciones Modo fase reversa

Luego de optimizar la retencin, si no se logr resolucin adecuada,

se vara la selectividad ():
Temperatura
pH
Tipo de buffer (acetato, formiato, fosfato)
Modificador orgnico (acetonitrilo, metanol, mezclas)
Velocidad de flujo de solvente

Optimizacin de condiciones Modo fase reversa

2) Gradiente
Se comienza con un amplio rango de %B en poco tiempo, luego se ajusta la retencin k*
Anlisis antidoping en orina humana SPE - LC- ESI - TOF
Deteccin de 124 analitos, incluyendo estimulantes, -bloqueantes, Columna C18 2 x 100 mm; 3 m.
narcticos, agonistas -adrenrgicos, Fase mvil:
antiestrognicos, diurticos y cannabinoides. A: 5 mM NH4Ac en HCOOH 0,1%;
B: acetonitrilo.
Gradiente: 10% a 40% B en 10 min; a 75% B en
13,5 min; a 80% en 16 min; 5 min a 80% B.
Equilibrio post-run 6 min.
Flujo de solvente: 0,3 ml/min
metilfenidato
(m/z 234,1489)

Ac. ritalnico Muestra de orina adquirida luego de

(m/z 220,1332) administrar metilfenidato:
a) Cromatograma TIC;
b) Cromatograma reconstituido por
superposicin de iones especficos
correspondientes a metilfenidato (m/z
234,1489), su metabolito cido ritalnico (m/z
220,1332) y dibenzepina (m/z 296,1757) como
estndar interno

metilfenidato Rango m/z: 50-800

(m/z 234,1489) Resolucin promedio: 10000 para m/z 300
Ac. ritalnico ESI, modo +, [M+H]+
(m/z 220,1332) Identificacin en base a tiempo de
retencin, masa exacta y pattern
isotpico.

Anal. Clin. Acta 2007, 585, 94-102.

Eleccin del modo cromatogrfico

-Fase reversa (RP, reverse phase)
-Fase normal
-HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography),
[ANC (aqueous normal phase)]
-Intercambio inico (IEC)
-Exclusin por tamao (SEC) sistema acuoso
Permeacin por geles (GPC) sistema no acuoso

Fase estacionaria: slica, otras fases polares como amino (RNH2), diol (RCHOHCH2OH) o
ciano (RCN), en orden decreciente de polaridad.
Fase mvil no polar inmiscible con agua: hidrocarburos, CH2Cl2, EtOAc.
Los compuestos ms polares son ms retenidos.
Razones para usar fase normal: -mayor retencin de compuestos polares
-elucin de compuestos hidrofbicos muy retenidos en RP
-separacin de ismeros
-solvente de inyeccin inmiscible con agua
-separaciones preparativas
-recuperacin de muestra en solvente no polar
 HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)

Fase estacionaria: polar.

Fase mvil no polar miscible con agua, con un pequeo porcentaje de agua ( 2,5% en volumen).
Los compuestos hidroflicos, polares o cargados son ms retenidos que los compuestos
hidrofbicos. El agregado de agua a la fase mvil reduce la retencin picos agudos para
analitos polares ( fase normal).
til para compuestos muy polares poco retenidos en RP modo complementario a RP
Fcilmente adaptable a equipos acoplados a espectrmetro de masa.
Cuando se usa fase mvil con alta proporcin de solvente orgnico aumenta la sensibilidad de MS
debido a que se reduce la supresin inica de la fuente (con respecto a buffer acuosos).
Optimizacin de los siguientes parmetros:
Fase estacionaria: slica,
amino (RNH2),
modo mixto (alquil-diol, alquil-carboxilo, C18-amida, aromtico-
ciano, alquil-hidroxilo, etc)
zwitterinico (tetraalquilamonio-sulfnico)
Concentracin de solvente orgnico
Tipo de buffer y concentracin (si se usa)
pH
Temperatura

HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)

Paroxetina
m/z 330 192 Gradiente: 5% B a 90% B en 10 min
RP C18

Ranitidina
m/z 315 176
A: HCOOHNH4 8mM en H2O LC-MS/MS
B: HCOOHNH4 8mM en 95% acetonitrilo

Paroxetina
m/z 330 192
Gradiente: 100% B a 50% B en 10 min

Ranitidina
m/z 315 176
HILIC
Seleccin de los iones

Paroxetina
m/z = 330
192,0

[M+1]+
330,2

Ranitidina
175,9
m/z = 315

[M+1]+
315,1

Varias consideraciones importantes

Preparacin de muestras
Muestras libre de interferencias, compatible con el mtodo de separacin y deteccin
seleccionados.
Filtrar la muestra: a medida que disminuye el tamao de partcula, disminuye tambin el
fritado de la columna. Bloqueo de capilares, fritados, ingreso a la columna, detector.

Filtrar la fase mvil. Daos en vlvulas, sellos, pistones, agujas y jeringas, tubera
capilar.
HPLC estndar: filtro 0,45 m
UHPLC: filtro 0,22 m

Lavar la columna, lavar el buffer, dejar con fase mvil: agua/solvente orgnico.

Usar fases mviles miscibles con el solvente de inyeccin de la muestra.

Usar la columna hasta un 10% por debajo del lmite mximo de presin (ver manual!),
regular las velocidades de flujo de solvente.

Seguir la direccin de flujo marcada en la columna.

Evitar ajustar excesivamente las roscas (fittings) de las columnas al colocarlas o

sacarlas del equipo.
Bibliografa

-The LC Handbook. Guide to LC columns and method development. Agilent. 2011.

Publication number 5990-7595EN.
www.chem.agilent.com\Library\primers\public\LC-Handbook-Complete-2.pdf
-Agilent ZORBAX column guide selection.
-The basics of HILIC. www.sepscience.com
-Trends in universal detection in high performance liquid chromatography. Joshi, P. B.;
Bhoir, S. I.; Bhagwat, A. M. www.sepscience.com