Para Uso Diagnostico In Vitro

Slo para uso profesional

Toxoplasma gondii Real-TM

Manual
Kit de PCR en tiempo real para deteccin
cualitativa de Toxoplasma gondii

Sacace Tox oplasma gondii Real-TM VER 24.04.2012

REF P1-50FRT

50
NOMBRE
Toxoplasma gondii Real TM

USO PREVISTO
El kit Toxoplasma gondii Real-TM es un test in vitro de amplificacin de cidos
nucleicos para la deteccin cualitativa del ADN de Toxoplasma gondii en la muestra
(sangre perifrica, sangre de cordn umbilical, leucocitos de sangre perifrica o de
cordn umbilical, piezas de biopsia o autopsia, lquido cefalorraqudeo y lquido
amnitico) mediante la deteccin de hibridacin-fluorescencia en tiempo real.
Los resultados del PCR se tomarn en cuenta dentro del complejo diagnstico de
la enfermedad.

PRINCIPIOS DEL ENSAYO

La deteccin de Toxoplasma gondii por reaccin en cadena de polimerasa (PCR) se basa
en la amplificacin de una regin especifica del genoma del patgeno por medio de
cebadores (primers) especficos. Durante la PCR en tiempo real, el producto amplificado
es detectado utilizando colorantes fluorescentes. Estos colorantes se encuentran ligados
a sondas de oligonucletidos que se enlazan especficamente con el producto
amplificado. El monitoreo en tiempo real de la intensidad de la fluorescencia durante la
PCR permite la deteccin del producto acumulado sin la necesidad de volver a abrir los
tubos de reaccin posterior a la PCR.
El kit Toxoplasma gondii Real-TM utiliza Hot-start, lo que reduce en gran medida la
frecuencia de reacciones cebadas no especficas. Hot-start garantiza la separacin de
los nucletidos y la Taq-polimerasa por medio de una polimerasa modificada
qumicamente (TaqF), la cual es activada por calentamiento a 95C durante 15 min.
La deteccin del ADN de Toxoplasma gondii en las muestras clnicas incluye:
(a) La extraccin total del ADN de los leucocitos de sangre perifrica y de sangre del
cordn umbilical, piezas de biopsia y autopsia, lquido cefalorraqudeo y lquido
amnitico simultneamente con el control interno exgeno.
(b) Mltiples PCR en tiempo real de un fragmento de ADN de un gen repetido no
estructural (529 pares de bases de largo) que codifica una protena del Toxoplasm a
gondii y de un fragmento de ADN artificial clonado en fago , que se utiliza como
control interno exgeno no competitivo.
La amplificacin del ADN de Toxoplasma gondii es detectada en el canal
JOE/Yellow/HEX/Cy3, la amplificacin del Control Interno exgeno no competitivo es
detectada en el canal FAM/Green.
El Control Interno exgeno permite monitorear los procesos principales del anlisis PCR
(extraccin y amplificacin de ADN). La principal ventaja de un Control Interno exgeno
no competitivo es la extensin del rango de deteccin lineal y, por lo tanto, un incremento
en la sensibilidad analtica del ensayo.

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MATERIALES SUMINISTRADOS
Reactivo Descripcin Volumen, ml Cantidad

PCR-mix-1-FRT T.gondii Lquido incoloro claro 0.6 1 tubo

PCR-mix-2-FRT Lquido incoloro claro 0.3 1 tubo

Polymerase (TaqF) Lquido incoloro claro 0.03 2 tubos

Pos Control DNA T. gondii /STI (+) Lquido incoloro claro 0.1 1 tubo

DNA-buffer Lquido incoloro claro 0.5 1 tubo

Negative Control (C-)* Lquido incoloro claro 1.2 1 tubo

Internal Control STI-87 (IC)** Lquido incoloro claro 1.0 1 tubo

*Debe utilizarse en el proceso de aislamiento como control negativo de la extraccin.
**Agregar 10 l de Internal Control STI-87 (IC) a cada muestra durante el proceso de
purificacin de ADN directamente a la mezcla de muestra / lisis.

MATERIALES REQUERIDOS, PERO NO SUMINISTRADOS

Kit de extraccin de ADN.
Guantes desechables sin polvo y bata de laboratorio.
Pipetas (ajustables).
Puntas de pipeta estriles con barreras de aerosol (hasta 200 l).
Rejillas de tubo.
Mezclador Vortex.
Centrifuga de mesa con rotor para tubos a reaccin de 2 ml.
Caja de PCR.
Termociclador de PCR en tiempo real.
Microtubos desechables de polipropileno para PCR o placa PCR
Refrigerador a 2-8 C
Congelador a -16 C.
Contenedor de residuos para las puntas usadas.

LIMITACIONES DEL USO DEL PRODUCTO

Todos los reactivos deben utilizarse exclusivamente para el diagnostico in vitro. El uso
de este producto debe limitarse al personal capacitado en tcnicas de amplificacin de
ADN (EN375). Se requiere un cumplimiento estricto al manual de usuario para obtener
resultados ptimos de PCR. Debe prestarse atencin a las fechas de caducidad impresas
en la caja y en las etiquetas de todos los componentes. No utilice un kit despus de su
fecha de caducidad.

CONTROL DE CALIDAD
De acuerdo al Sistema de Gestin de Calidad ISO 13485 de Sacace, cada lote es
probado con especificaciones predeterminadas para asegurar la calidad del producto.
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ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES

Dispositivo Medico De Diagnstico In Vitro

Slo para uso diagnstico In Vitro
1. Utilice guantes desechables, bata de laboratorio y proteccin para ojos cuando
manipule muestras y reactivos. Lvese bien las manos posteriormente.
2. No pipetear con la boca.
3. No coma, beba, fume, aplique cosmticos o manipule lentes de contacto en reas de
trabajo de laboratorio.
4. No utilice un kit despus de su fecha de caducidad.
5. Elimine todas las muestras y reactivos no utilizados de acuerdo a las regulaciones
locales.
6. Debe utilizarse el nivel 2 de bioseguridad para materiales que contengan o sean
sospechosos de contener agentes infecciosos.
7. Limpie y desinfecte todos los derrames de los especmenes o reactivos utilizando un
desinfectante como hipoclorito de sodio al 0.5%, u otro desinfectante adecuado.
8. Evite el contado de los especmenes y reactivos con la piel, ojos y membranas
mucosas. Si entra en contacto con estas soluciones, enjuague inmediatamente con
agua y busque valoracin mdica inmediata.
9. Las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) estn disponibles bajo
peticin.
10. El uso de este producto debe limitarse a personal capacitado en tcnicas de
amplificacin de ADN.
11. Las reacciones de PCR son sensibles a la contaminacin. Las medidas para reducir
el riesgo de contaminacin en el laboratorio incluyen separacin fsica de las
actividades involucradas en la realizacin de la PCR de acuerdo a las buenas
prcticas de laboratorio
12. El flujo de trabajo en el laboratorio debe proceder de manera unidireccional,
comenzando en el rea de extraccin y pasando al rea de PCR y deteccin. No
devuelva muestras, equipos o reactivos a las reas donde se realiz el paso anterior.

Algunos componentes del kit contienen azida de sodio como conservador. No utilice tubos
metlicos para la transferencia de reactivos.
El muestreo de materiales biolgicos para anlisis de PCR, transporte y almacenamiento
se describe en detalle en el manual del fabricante. Se recomienda que lea este manual
antes de comenzar el trabajo.

INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
Todos los componentes del kit Toxoplasma gondii Real-TM (excepto la polimerasa
TaqF, PCR-mix-2-FRT, y PCR-mix-1-FRT Toxoplasma gondii) se almacenarn de 2
8 C. Todos los componentes del kit Toxoplasma gondii Real-TM son tiles hasta la
fecha de caducidad en la etiqueta. La vida til de los reactivos antes y despus del primer
uso es la misma, a menos que se indique lo contrario.

Los reactivos polimerasa (TaqF), PCR-mix-2-FRT, y PCR-mix-1-FRT Toxoplasma gondii

deben almacenarse a 16 C.
El reactivo PCR-mix-1-FRT Toxoplasma gondii se debe mantener alejado de la luz.

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ESTABILIDAD
La prueba Toxoplasma gondii Real-TM es vlida hasta la fecha de caducidad indicada
en la etiqueta del kit. La exposicin a la luz, calor o humedad puede afectar la vida til
de algunos de los componentes del kit y debe evitarse. Debe evitarse la descongelacin
y congelacin repetida de los reactivos, ya que esto puede reducir su sensibilidad. Los
componentes almacenados en condiciones distintas de las establecidas en las etiquetas
pueden no funcionar correctamente y pueden afectar adversamente los resultados del
ensayo.

RECOLECCIN, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

El kit Toxoplasma gondii Real-TM est destinado a analizar ADN extrado con kits de
extraccin de ADN de:
Sangre total perifrica y de cordn umbilical.
Leucocitos de sangre perifrica o de cordn umbilical.
Piezas de biopsia y autopsia.
Lquido cefalorraqudeo.
Lquido amnitico.
Sangre total perifrica y umbilical. La sangre debe ser recolectada en un tubo
con solucin EDTA al 6% en una proporcin de 20:1 (20 porciones de sangre por 1
porcin de EDTA) despus de ayunar durante toda la noche. La sangre de cordn
umbilical debe ser obtenida por cordocentesis. Revolver el tubo varias veces para
asegurar una mezcla adecuada.
No congele las muestras de sangre total!

Leucocitos. Recolecte muestras de sangre de 2.5 10 ml de acuerdo a los

procedimientos estndar en tubos con anticoagulante (el anticoagulante
recomendado es EDTA). Centrifugue las muestras a ~1500-2000 X g por 10-15
min. Esto separar la sangre en una capa superior de plasma, una capa inferior de
eritrocitos (RBC), y una capa intermedia que contiene los leucocitos, tambin
llamada capa leucocitaria. Remueva el plasma con una pipeta de transferencia,
teniendo cuidado de no alterar los leucocitos. Las muestras con un recuento
excepcionalmente alto de leucocitos tendrn una capa leucocitaria ms gruesa.
Use otra pipeta de transferencia para aspirar cuidadosamente la capa leucocitaria
en un volumen aproximado de 0.5 ml o menos. Aspire lentamente, usando un
movimiento circular, todo el material visible en la capa leucocitaria a la pipeta de
transferencia. Es esperado algo de contaminacin por la capa inferior de
eritrocitos.
Agregue 300 l de solucin para lisis al tubo donde obtuvo la muestra de
leucocitos (para el protocolo DNA/RNA-Prep).
Piezas de biopsia y autopsia son obtenidas de la ubicacin esperada del
patgeno, del tejido daado o del rea adyacente a ste. Recolecte las muestras
en tubos de 2 ml con 0.3 ml de medio de transporte. Transfiera la muestra a un
mortero de porcelana; aada una cantidad equivalente de solucin salina o PBS.
Homogenice completamente la muestra con un mazo de porcelana. Tomar una
alcuota de 100 l y transferir a un tubo estril para la extraccin de ADN.

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 Lquido cefalorraqudeo debe ser obtenido por el procedimiento estndar y
recolectado en un tubo estril Eppendorf.
Lquido amnitico Debe ser obtenido durante la amniocentesis por el procedimiento
estndar y recolectado en un tubo estril de Eppendorf. Resuspender por completo
la muestra obtenida y transferir 1 ml de ella a un nuevo tubo estril. Centrifugue el
tubo a 8,000 9,000 g por 10 min. Remueva el sobrenadante dejando 200 l del
lquido sobre el precipitado (pellet). Utilice puntas con barrera de aerosol.
Resuspenda el precipitado.

AISLAMIENTO DE ADN
Se podr utilizar cualquier kit comercial de aislamiento de ARN/ADN, siempre y cuando
haya sido validado por IVD-CE para los tipos de muestra indicados en el prrafo
RECOLECCIN, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS de este
manual.

Sacace Biotechnologies recomienda utilizar los siguientes kits:

DNA-Sorb-C (Sacace, REF K-1-6/50): piezas de biopsia y autopsia
DNA/RNA-Prep (Sacace, REF K-2-9): sangre total, lquido cefalorraqudeo,
lquido amnitico y leucocitos;
SaMag Bacterial DNA Extraction Kit (Sacace, REF SM006): liquid
cefalorraqudeo.
Por favor realice la extraccin de ADN de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Aada 10 l de control interno durante el proceso de aislamiento de ADN directamente
a la mezcla de muestra/lisis.

PROTOCOLO (Volumen de reaccin 25 l):

1. Prepare la cantidad necesaria de tubos de reaccin para las muestras (N) y los
controles (N+2)
2. Prepare en un nuevo tubo estril para cada muestra 10*N l de PCR-mix-1, 5,0*N de
PCR-mix-2-FRT y 0,5*N de TaqF Polymerase. Centrifugue en el vortex durante 2-3
segundos.
3. Agregue 15 l de la mezcla de reaccin y 10 l de muestra de ADN extrado al tubo
apropiado. Mezclar con pipeta.
(*Recentrifugar todos los tubos con el ADN extrado durante 2 min a la velocidad mxima
(12000-16000 g) y tomar cuidadosamente el sobrenadante. No altere el precipitado,
puede inhibir la reaccin!
4. Prepare para cada panel 2 controles:
Agregue 10 l de DNA-buffer al tubo etiquetado Control Negativo de
Amplificacin (NCA);
Agregue 10 l de Toxoplasma gondii C+ al tubo etiquetado. C+;

Toxoplasma gondii en el canal JOE (Yellow)/HEX/Cy3, el control interno se detecta en el canal

FAM (Green).

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Amplificacin
Programe el instrumento en tiempo real de acuerdo al manual suministrado por el
fabricante.
Programa de amplificacin para instrumentos tipo rotor 1
Temperatura, Deteccin de
Paso Tiempo Repeticiones
Fluorescencia
Mantener 95 15 min 1
95 5s
Ciclaje 60 20 s 5
72 15 s
95 5s
FAM/Green,
Ciclaje2 60 20 s 40
JOE/Yellow
72 15 s

Programa de amplificacin para instrumentos tipo placa2

Temperatura, Deteccin de
Paso Tiempo Repeticiones
Fluorescencia
1 95 15 min 1
95 5s
2 60 20 s 5
72 15 s
95 5s
60 30 s FAM,
3 40
HEX/Cy3/JOE
72 15 s

AJUSTE DE INSTRUMENTOS
Instrumentos tipo rotor (RotorGene 3000/6000, RotorGene Q)
Ms ajustes/
Eliminacin de Pendiente
Canal Umbral
valores atpicos correcta
(Outlier)
FAM/Green 0.03 10 % On
JOE/Yellow 0.03 10 % On

1
Por ejemplo Rotor-Gene 3000/6000/Q (Corbett Research, Qiagen)
2 Por ejemplo, SaCycler-96 (Sacace), CFX/iQ5 (BioRad); Mx3005P (Agilent), ABI 7300/7500/StepOne Real Time
PCR (Applied Biosystems), SmartCycler (Cepheid), LineGeneK (Bioer)

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 Instrumentos tipo placa (iQ5, Mx300P, ABI 7500/7300)
Canal Umbral
La lnea umbral debe cruzar solo las curvas sigmoides de la
acumulacin de seales de muestras positivas y no debe cruzar la
FAM lnea de base; en caso contrario, el umbral debe elevarse. Establezca
el umbral en un nivel donde las curvas de fluorescencia son lineales
y no cruzan las curvas de las muestras negativas.

ANLISIS DE DATOS
El producto de amplificacin de ADN de Toxoplasma gondii se detecta en el canal
JOE/Yellow/HEX, el producto de amplificacin del control interno se detecta en el canal
FAM/Green. Los resultados son interpretados por el software del instrumento de PCR
por el cruce (o el no cruce) de la curva de fluorescencia en la lnea del umbral.
Los resultados del anlisis se consideran vlidos slo si los resultados de las muestras
de control cumplen con lo siguiente:

Resultados de control
Canal de control

Control Etapa de control Interpretacin

FAM/Green JOE/Yellow/HEX

NCE Extraccin de ADN 35 Neg OK

NCA Amplificacin Neg Neg OK
C+ Amplificacin 35 33 OK

1. La muestra se considera positiva si los valores de control detectados en los canales

FAM/Green y JOE/Yellow/HEX son menores que los valores de control lmites ( 38)
para estos canales. La curva de fluorescencia debe tener una forma sigmoidea tpica
y cruzar la lnea umbral en la regin de aumento significativo de fluorescencia slo una
vez.
2. La muestra se considera negativa si la curva de fluorescencia no cruza la lnea de
umbral (el valor de control est ausente) y no tiene la forma tpica.
Los resultados del anlisis se consideran fiables slo si son correctos los resultados
obtenido por los controles positivo y negativo de amplificacin, as como tambin el
control negativo de extraccin.

PROCEDIMIENTO DE CONTROL DE CALIDAD

Desde el inicio de la preparacin de la muestra se debe introducir, a cada muestra y
control, una cantidad definida de Control Interno (IC) con el fin de controlar el proceso de
extraccin, de cada muestra individual, y as identificar una posible inhibicin de la
reaccin.
Se requiere un control negativo de la extraccin (NCE), control negativo de amplificacin
(NCA), control positivo de amplificacin (C+) para cada prueba con el fin de verificar que
las etapas de preparacin, amplificacin y deteccin de la muestra se realizaron de
manera correcta.
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Si los controles estn fuera del rango esperado (Ver tabla Resultados de Controles), los
especmenes y controles de esa ejecucin deben ser procesados desde el inicio de la
preparacin de la muestra.

CARACTERSTICAS DE PRESENTACIN
Sensibilidad
La sensibilidad analtica del kit Toxoplasma gondii Real-TM es de 400 copias de ADN
de Toxoplasma gondii / ml.
Las caractersticas analticas del k it Toxoplasma gondii Real-TM estn garantizadas slo
cuando se utiliza un k it de reactivos adicional (DNA/RNA-prep o DNA-sorb-C).

Especificidad
La especificidad analtica del kit Toxoplasma gondii Real-TM se asegura mediante la
seleccin de cebadores y sondas especficas probadas bajo estrictas condiciones de
reaccin.
Los cebadores y sondas se verificaron para detectar posibles homologas a todas las
secuencias publicadas en bancos de genes mediante anlisis de comparacin de
secuencias. La especificidad clnica del kit Toxoplasma gondii Real-TM se confirm en
pruebas clnicas de laboratorio.

Regin objetivo: repeticin en tndem de 529pb.

SOLUCIN DE PROBLEMAS
1. Seal dbil o ausente del control interno (Fam/Green): requiere el re-anlisis de la
muestra.
Se inhibi la PCR.
Asegrese de utilizar un mtodo de extraccin de ADN recomendado
y siga las instrucciones del fabricante.
Recentrifugar todos los tubos, durante 2 min a velocidad mxima
(12000 16000 g), antes de pipetear el ADN extrado y tomar el
sobrenadante cuidadosamente. No altere el centrifugado (pellet),
puede inhibir la reaccin.
Las condiciones de almacenamiento de los reactivos no cumplen con las
instrucciones.
Compruebe las condiciones de almacenamiento.
Las condiciones de la PCR no cumplan con las instrucciones.
Compruebe las condiciones de la PCR y para la deteccin del control
interno seleccione el canal de fluorescencia reportado en el protocolo.
Extraccin inapropiada del ADN.
Repita el anlisis a partir de la etapa de extraccin de ADN
El control interno no se aadi a la muestra durante el pipeteado de
los reactivos.
Preste atencin durante el procedimiento de extraccin de
ADN

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 2. Seal dbil (Control > 38) en el canal Joe (Yellow)/Cy3/HEX: EL
resultado se considera equvoco. Es necesario repetir el anlisis dos veces.
Si se detecta dos veces un valor de control positivo, la muestra se
considera positiva.
3. Seal Joe (Yellow)/Cy3/HEX con control negativo de extraccin.
Contaminacin durante el procedimiento de extraccin de ADN. Todos los
resultados de las muestras son invlidos.
Descontamine todas las superficies e instrumentos con hipoclorito de
sodio y etanol.
Utilice nicamente puntas de filtro durante el procedimiento de
extraccin. Cambie las puntas entre tubos.
Repetir la extraccin de ADN con un Nuevo conjunto de reactivos.

4. Cualquier seal de control negativo de PCR.

Contaminacin durante el procedimiento de PCR. Todos los resultados de las
muestras son invlidos.
Descontaminar todas las superficies e instrumentos con hipoclorito de
sodio y etanol o reactivos especiales para descontaminacin de ADN.
Pipetear los controles positivos al final.
Repita la preparacin de PCR con un nuevo conjunto de reactivos.

REFERENCIAS
Detection of Toxoplasma gondii by PCR and tissue culture in cerebrospinal fluid and blood of human
immunodeficiency virus-seropositive patients. Dupon, M. et al. J Clin Microbiol 1995: 33:2421-2426.

Diagnosis of Toxoplasma parasitemia in patients with AIDS by gene detection after amplification
with polymerase chain reaction. Filice, GA. et al. J Clin Microbiol 1993; 31:2327-2331.

PCR detection of Toxoplasma gondii DNA in CSF for the differential diagnosis of AIDS -related focal
brain lesions. Antonella Cingolani, Andrea De Luca, Adriana Ammassari, Rita Murri, Angela
Linzalone, Rita Grillo* and Andrea Antinori. J Med Microbiol December 1996 vol. 45 no. 6 472-
476

Real-Time PCR for Quantitative Detection of Toxoplasma gondii. Mei-Hui Lin,1 Tse-Ching Chen,2
Tseng-tong Kuo,2 Ching-Chung Tseng,3 and Ching-Ping Tseng1, Journal of Clinical
Microbiology, November 2000, p. 4121-4125, Vol.38, No.11

Detection of Toxoplasma gondii in cerebrospinal fluid from AIDS patients by polymerase chain
reaction.
S F Parmley, F D Goebel and J S Remington J Clin Microbiol. 1992 November; 30(11): 30003002

The detection of Toxoplasma gondii by comparing cytology, histopathology, bioassay in mice, and
the polymerase chain reaction (PCR) Aristeu Vieira da Silva, Helio Langoni. Veterinary Parasitology,
Volume 97, Issue 3, 12 June 2001, Pages193-200

Detection by PCR of Toxoplasma gondii in blood in the diagnosis of cerebral toxoplasmosis in

patients with AIDS.J Lamoril, J M Molina, A de Gouvello, Y J Garin, J C Deybach, J Moda, F
Derouin J Clin Pathol 1996;49:89-92 doi:10.1136/jcp.49.1.8

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CLAVE DE SMBOLOS UTILIZADOS

Precaucin!
Nmero de Lista

Contiene suficiente para

Nmero de lote
<n> ensayos

Para uso diagnstico

in Vitro
Versin

Almacenar en NCA Control Negativo de la

Amplificacin

Control negativo de la
Fabricante C
extraccin

Consultar las Control Positivo de la

C+ Amplificacin
instrucciones
de uso

IC Control interno
Fecha de
caducidad

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NOTAS

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* SaCycler es una marca registrada de Sacace Biotechnologies
* CFX and iQ5 son marcas registradas de Bio-Rad Laboratories
* Rotor-Gene es una marca registrada de Qiagen
* MX3005P es una marca registrada de Agilent Technologies
* ABI es una marca registrada de Applied Biosystems
* LineGeneK es una marca registrada de Bioer
* SmartCycler es una marca registrada de Cepheid

Sacace Biotechnologies Srl

via Scalabrini, 44 22100 Como Italia Tel +390314892927 Fax +390314892926
email: info@sacace.com web: www.sacace.com

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