El enfoque de Aquality por diseo en la provisin de nanotransportador de

polmero de gefitinib: formulacin, caracterizacin in vitro e in vivo

Resumen: El gefitinib es un agente anticanceroso que acta inhibiendo los

receptores de la tirosina quinasa receptora del factor de crecimiento
epidrmico. El objetivo del presente estudio fue preparar la nanosuspensin
de gefitinib. Gefitinib se encapsul en Eudragit RL100 y luego se dispers
en solucin estabilizante, alcohol polivinlico y polivinilpirrolidona K30. La
nanosuspensin se prepar utilizando tcnicas de homogeneizacin y
ultrasonicacin. El enfoque de calidad del diseo tambin se utiliz en el
estudio para comprender el efecto de los atributos de los materiales crticos
(CMA) y los parmetros crticos de procesamiento (CPP) sobre los atributos
crticos de calidad y mejorar la calidad y seguridad de la formulacin. Para
estudiar el efecto de las CMAs y CPPs, se aplic el diseo factorial completo.
El tamao de partcula, el ndice de polidispersidad y el potencial zeta de la
solucin optimizada fueron 248,20 nm, 0,391 y -5,62 mV, respectivamente.
Se encontr que el contenido de frmaco de la nanoformulacin optimizada
era del 87,74% 1,19%. Los estudios de microscopa de fuerza atmica de
la formulacin optimizada confirmaron que las nanopartculas preparadas
son de naturaleza lisa y esfrica. Los estudios de citotoxicidad in vitro de la
nanosuspensin en la lnea celular Vero revelaron que la formulacin no es
txica. La nanosuspensin de gefitinib liber 60,03% 4,09% de frmaco
durante un periodo de 84 horas, mientras que la dispersin estndar de
frmaco liber slo 10,39% 3,37% de frmaco en la misma duracin. A
partir de los estudios farmacocinticos, se encontr que la vida media,
Cmax y Tmax del frmaco de una nanosuspensin optimizada era de 8,65
1,99 h, 46.211,04 5,805.97 ng / ml, y 6,67 1,77 h, respectivamente. Se
encontr un aumento de 1,812 veces en la biodisponibilidad relativa de
nanosuspensin, lo que confirma que la presente formulacin es adecuada
para aumentar la biodisponibilidad oral de gefitinib.

Palabras clave: gefitinib, cncer, factor receptor de crecimiento epidrmico,

inhibidor de la tirosina quinasa, biodisponibilidad, Eudragit RL100, PVP
K30, PVA, Clase II Sistema de Clasificacin Biofarmacutica, QbD, diseo
experimental, diseo factorial completo

Introduccin

El gefitinib es un frmaco utilizado para tratar ciertos tipos de cncer como

el cncer de colon, pulmn, ovario y de mama.1-3 Acta inhibiendo el
receptor de tirosina quinasa4 del factor de crecimiento epidrmico y
pertenece al Sistema de Clasificacin Biofarmacutica de Clase II. Es
escasamente soluble a pH 1 que disminuye ms con respecto al aumento de
pH; Su solubilidad disminuye abruptamente en el rango gstrico superior,
especialmente entre pH 4 y 6. Su baja solubilidad en el fluido gstrico
superior afecta el inicio de la accin, la biodisponibilidad y la actividad
teraputica. El valor log P del gefitinib es 4.15, lo que demuestra que el
gefitinib es altamente hidrofbico.5 La dosis oral diaria y la biodisponibilidad
del gefitinib son 250 mg y 44%, respectivamente. Los trastornos
gastrointestinales (diarrea, nuseas, vmitos y estomatitis), el metabolismo
y el trastorno nutricional (anorexia), los trastornos cutneos y subcutneos
(reacciones cutneas), los trastornos hepatobiliares (elevacin de la alanina
aminotransferasa), las reacciones adversas ms frecuentes notificadas con
dosis de 250 mg de gefitinib , Erupcin pustular y prurito en la piel seca),
etc. 6 Todos los problemas mencionados anteriormente indican claramente
que es necesario reducir la dosis oral diaria y mejorar la biodisponibilidad
oral de gefitinib.

El sistema de suministro de frmacos nanoparticulado tiene un potencial

abundante para superar estos problemas. Por lo tanto, en el presente
estudio, Eudragit RL100 nanosuspension de gefitinib se prepar para
mejorar su biodisponibilidad oral. Las razones para la seleccin de
Eudragit RL100 para preparar la nanosuspensin fueron su alta estabilidad
fisicoqumica, 7,8 perfil de alta permeabilidad, mucoadhesividad, frmaco
dirigido al tracto gastrointestinal, alto tiempo de retencin gastrointestinal,
9-12 y naturaleza no txica.8,13

Los principales desafos en la preparacin de nanopartculas son la

variabilidad de la fabricacin, debido a la falta de comprensin del efecto de
los atributos crticos del material (CMA) y los parmetros crticos de
procesamiento (CPPs) para alcanzar el pequeo tamao, el ndice de
polidispersidad estrecho (PDI), etc. Esta falta de comprensin y las
variabilidades de fabricacin aumentan el costo del sistema de
administracin de frmacos en nanopartculas.14 El sistema de
administracin de frmacos nanoparticulares es tambin conocido por sus
toxicidades debido al inicio rpido de la accin, aumento de la solubilidad,
permeabilidad y biodisponibilidad. Por lo tanto, el objetivo del presente
estudio fue preparar la nanosuspensin de gefitinib con la ayuda del
enfoque de calidad por diseo (QbD) para entender el efecto de CMAs y
CPPs en atributos crticos de calidad (CQAs) para reducir la variabilidad de
fabricacin, , Y mejorar la seguridad y la calidad de la formulacin.

materiales y mtodos

Materiales

Gefitinib y Eudragit RL100 se obtuvieron como muestras de regalo de

Neon Laboratories Ltd. (Mumbai, India) y Dr Reddy's Laboratories Ltd.
(Hyderabad, India), respectivamente. Se obtuvo alcohol polivinlico (PVA)
con un peso molecular de 13.000 de National Chemicals (Gujarat, India). Se
obtuvo polivinilpirrolidona (PVP) K30 con un peso molecular de 40.000 de
HiMedia Laboratories Pvt. Ltd. (Mumbai, India). La calidad de
cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC) de metanol y el sulfxido
de dimetilo (DMSO) se adquirieron de Finar Ltd. (Ahmedabad, India). Se
produjo en el laboratorio agua altamente pura (18,2 M cm de resistividad,
Milli Q). Los medios de Eagle modificados por Dulbecco (DMEM) y el cido
etilendiaminotetraactico de tripsina (EDTA) se adquirieron de Sigma-Aldrich
Co. (St Louis, MO, EE.UU.). El suero bovino fetal (FBS), solucin salina
tamponada con fosfato estril (PBS), bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2il)
-2,5-difeniltetrazolio (MTT) y solucin antibitica (una mezcla de penicilina,
estreptomicina , Y claritromicina) se obtuvieron de HiMedia Laboratories
Pvt. Ltd. Todos los dems productos qumicos se adquirieron de Merck Ltd.
(Mumbai, India).

Mtodos

Preparacin de nanosuspensin de gefitinib

Se disolvi Gefitinib (100 mg) en DMSO (1 ml) y Eudragit RL100 (200 mg) se
disolvi en metanol (1 ml) por separado. A continuacin, se mezclaron
ambos en un tubo de microcentrfuga de 2 ml. Se tom PVA como una
solucin estabilizadora (20 ml) en un vaso de precipitados de vidrio de 50
ml y se mantuvo en un bao de hielo. La solucin orgnica anterior de
frmaco y polmero se aadi gota a gota en la solucin estabilizadora
usando una jeringa gota a gota con homogeneizacin continua (Polytron PT-
MR 3100; Kinematica AG, Luzern, Suiza) a 15.000 rpm durante 10 min. A
continuacin, se aadi gota a gota en PVP como una solucin co-
estabilizadora (20 ml) mantenida en un bao de hielo para mantener la
temperatura baja con homogeneizacin continua a 15.000 rpm durante 10
min. Despus de la homogeneizacin, la preparacin se sonic
inmediatamente (Ultrasonic Processor, VC 130, Sonics & Materials Inc.,
Newtown, CT, EE.UU.) a 36 1 W durante un tiempo especificado utilizando
pulsos de 10 s. A continuacin, la nanoformulacin preparada se someti a
agitacin magntica (3 h) a temperatura ambiente para la evaporacin del
disolvente orgnico.

Perfil de calidad del producto objetivo (QTPP)

Con el fin de determinar el QTPP, se consideraron aspectos regulatorios,

prcticos, aspectos cientficos, riesgos y otros factores. Se defini como
objetivo (QTPP) del estudio el perfil de producto objetivo y el perfil de
calidad de producto objetivo (TPQP). El espacio de control (QTPP) tambin
ayud a establecer la regin de operabilidad. CMAs y CPPs fueron
seleccionados en este estudio para lograr el objetivo predefinido (QTPP). El
QTPP, CMAs y CPP identificados se dan en la Tabla 1.14-22

Evaluacin del riesgo de las AQC

Se construy un diagrama de Ishikawa para identificar los riesgos

potenciales y las causas correspondientes que tienen la mayor posibilidad
de producir fallas en el producto.14,20,22-24 Este enfoque ayuda a mejorar
la seguridad, la eficacia y la calidad del producto farmacutico.17 Sobre la
base De los conocimientos previos, los ensayos experimentales, la revisin
de la literatura y la aplicacin del mtodo de anlisis del efecto modo de
fallo, se seleccionaron los principales atributos de calidad (o parmetros de
respuesta ms dependientes) de las nanopartculas como el tamao de
partcula, PDI y potencial zeta Anlisis de CQA.14,24,25 Los parmetros de
respuesta se consideraron como las CQA y se analizaron dentro del espacio
de conocimiento pre-decidido. La figura 1 muestra el diagrama de Ishikawa
que ilustra el efecto de las CMA y CPP en TPQP.

Diseo de experimentos para la optimizacin de CMAs y CPPs

La seleccin del diseo de optimizacin se basa en el nmero de variables

autnomas y sus niveles. El diseo de la formulacin (o procesamiento) es
una parte de la regin de operabilidad, y en este estudio, se personaliz
sobre la base de las CMA decididas y CPP con sus diferentes niveles. Las
CQAs estn influenciadas principalmente por CMAs y CPPs. Por lo tanto,
stos deben ser escudriados y organizados como parte del espacio de
conocimiento para producir la calidad obligatoria del producto.25,26 En el
presente estudio, las CMA y CPPs fueron consideradas como variables
autnomas, a saber, concentracin de PVP K30 (X1), concentracin De PVA
(X2), y tiempo de sonicacin (X3) con dos niveles diferentes de cada uno
(como se indica en la Tabla 1). Del mismo modo, tres CQAs (o respuestas),
tales como el tamao de partcula (Y1), PDI (Y2), y el potencial zeta (Y3) se
consideraron con fines de optimizacin. Las ecuaciones polinomiales fueron
construidas por el software de diseo Expert y tambin revisado para la
significacin estadstica para desarrollar los modelos. La formulacin se
optimiz para establecer la regin de inters mediante la consideracin de
los valores deseables de CQA. La formulacin optimizada se prepar de
nuevo y se reevalu con respecto al tamao de partcula, PDI y potencial
zeta. A continuacin, los valores residuales se calcularon a partir de los
resultados reales obtenidos y los resultados previstos por software de las
AQC para establecer el espacio de diseo. Los valores residuales ayudan en
la verificacin de viabilidad y validacin de modelos estadsticos. Sobre la
base del espacio de diseo y / o valores residuales, se adopt la estrategia
de control para el desarrollo farmacutico y el sistema de calidad17,20,26
para alcanzar el objetivo. Tambin se construyeron parcelas de superficie de
respuesta tridimensional (3D) utilizando el software Design Expert para
comprender mejor el efecto de los CMA y los CPP en los CQA.14 Ocho
corridas experimentales se llevaron a cabo en el espacio de conocimiento
sobre la base de un diseo factorial completo.

ecnologa analtica de procesos (PAT) - anlisis de tamao de partculas

Se utiliz Zetasizer (ZEN 3600, Malvern Instruments, Malvern, UK) como PAT
para el anlisis del tamao de partcula, PDI y potencial zeta.

La nanosuspensin preparada se diluy 10 veces con agua Milli-Q para

producir la concentracin de trabajo. La nanosuspensin diluida (1 mL) se
tom en una clula zeta, y la clula se fij en el Zetasizer para registrar el
potencial zeta. De forma similar, la nanosuspensin diluida (2 ml) se coloc
en la celda de vidrio transparente para registrar el tamao de partcula y
PDI. El anlisis de las muestras se realiz con un ngulo de dispersin de
90. Este experimento se realiz a 25 C.27

Contenido de la droga

La nanosuspensin se diluy con metanol en una proporcin de 1: 5% v / v y

sonicada (Equitron, Medica Instrument Manufacturing Co., Mumbai, India)
durante 5 min. Se obtuvo un volumen de 10 ml utilizando una fase mvil
(acetonitrilo y tampn formiato de amonio 40 mM con un pH de 2,5 en una
proporcin de 30: 70% v / v) (mtodo no publicado) y se reson durante 10
min. La solucin obtenida se filtr utilizando un filtro de jeringa con un
tamao de poro de 0,22 m. Se determin la presencia de frmaco usando
HPLC (LC-2010CHT, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japn) y se calcul el
porcentaje de contenido de frmaco.

Microscopa de Fuerza Atmica (AFM)

El anlisis de morfologa superficial de las nanopartculas se realiz

utilizando un mtodo de microscopa de exploracin de sonda, a saber AFM
(Bruker Innova, Bruker Corporation, Billerica, MA, EE.UU.). El experimento de
AFM se realiz depositando una gota de nanosuspensin diluida (dilucin
100 veces con agua Milli-Q) en un cubreobjetos de vidrio seguido por
secado al vaco durante un periodo de ~ 10 h a 25 C y presin de 15 bar.
AFM se llev a cabo en condiciones ambientales utilizando el modo de
golpeo con frecuencias de resonancia de 260-340 kHz.28

Estudio de liberacin de frmaco in vitro

La liberacin de frmaco in vitro de una nanosuspensin optimizada se llev

a cabo tomando la nanosuspensin (4 ml) en una membrana de dilisis
(corte molecular 12-14 kDa, HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.) mientras se
cerraban los extremos con clips de dilisis y se suspenda en la Disolucin.
El estudio se llev a cabo utilizando un aparato de disolucin tipo II de la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP). Se sigui el mismo procedimiento
para el estndar mientras se tomaba el frmaco (9 mg) en 4 ml de agua
Milli-Q. El estudio se realiz en tampn fosfato pH 6,8. El volumen de
disolucin utilizado en el estudio fue de 500 ml. La velocidad de la paleta y
la temperatura del medio se mantuvieron a 50 rpm y 37C 0,5C,
respectivamente. Se recogieron las muestras (2 ml) a intervalos de tiempo
predeterminados y se mantuvieron las condiciones de sumidero a lo largo
del experimento reemplazando el mismo volumen de la muestra con
tampn de fosfato en blanco. Las muestras recogidas se filtraron, se
diluyeron (con fase mvil) y se analizaron usando el mtodo de HPLC.

Estudio de citotoxicidad in vitro

La lnea celular Vero (clulas de rin de mono verde africano) se obtuvo
del National Center for Cell Science, Pune, India. Las clulas Vero se
cultivaron en DMEM que contena FBS al 10% y penicilina-estreptomicina al
1%. Se aadieron muestras de ensayo preparadas (100 l) por triplicado a
los pocillos que contenan suspensin de clulas en tres placas de cultivo de
tejidos de 96 pocillos, estriles y diferentes. A continuacin, se incub la
placa de cultivo de tejidos a 37C durante 24 y 48 h con suministro de
dixido de carbono al 5%. El control negativo (DMEM sin FBS), el control
positivo (con el frmaco puro estndar) y el DMSO en la misma
concentracin (100 L con 900 l de DMEM sin FBS) tambin se
mantuvieron por triplicado en la placa de cultivo de tejidos. A continuacin,
se analizaron las muestras bajo un microscopio para determinar el efecto
del frmaco sobre las clulas o la presencia de infecciones. Despus de 24 y
48 h, el sobrenadante se decant de los pocillos de la placa de cultivo de
tejido y cada pocillo se lav con 100 l de PBS. En la oscuridad, se aadi
reactivo MTT (50 l) a cada pocillo y de nuevo se incub la placa de cultivo
de tejidos a 37C con dixido de carbono al 5% durante 4 h. La solucin se
decant suavemente de cada pocillo. A continuacin, se aadieron 100 l
de DMSO estril (despus de la filtracin) a cada pocillo y se agitaron
vigorosamente para asegurar la solubilizacin de los cristales de formazano
formados. La absorbancia se registr utilizando un lector de microplacas de
ensayo de inmunoabsorcin enzimtica (lector de absorbancia ELx-800MS,
BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, EE.UU.) a una longitud de onda de
540 nm. Las placas se leyeron dentro de los 30 minutos despus de la
adicin de DMSO.29-33 Se calcularon el porcentaje de viabilidad celular y
los valores de CC50.34 El porcentaje de viabilidad celular y el porcentaje de
inhibicin celular se calcularon usando las siguientes frmulas:

Porcentaje de inhibicin de las clulasAbsorbencia del controlAbsorbancia de

= - testAbsorbancia del control 100

Porcentaje de viabilidad celular = 100 por ciento de inhibicin celular

Estudio farmacocintico

Animales

Se realiz un estudio farmacocintico de la nanosuspensin y dispersin

estndar de frmaco (gefitinib en agua Milli-Q) en ratas hembras Wistar
(200-250 g) obtenidas por Central Animal Research Facility, Manipal
University, Manipal. El protocolo del experimento animal fue revisado y
aprobado por el KMC Manipal, Comit Institucional de tica Animal (IAEC),
Manipal University, Manipal (IAEC / KMC / 95/2015), fechado el 20 de
noviembre de 2015. Propsito del Control y Supervisin de Experimentos en
Animales (CPCSEA) y las directrices de cuidado de animales de KMC
Manipal, IAEC.

Diseo del estudio y recoleccin de muestras de sangre

Antes del experimento, los animales tenan acceso libre a grub estndar y
agua ad libitum. A lo largo del experimento, todos los animales se
mantuvieron a las 12 h de oscuridad ya los ciclos de luz de 12 h. Las 12
ratas hembra Wistar fueron divididas al azar en dos grupos como seis
animales en cada grupo. Los grupos fueron marcados como "estndar" y
"prueba". El grupo estndar recibi oralmente una dispersin de frmaco
puro preparada en 0,25% de carboximetilcelulosa sdica (NaCMC) a una
dosis de 5 mg por 250 g de peso corporal. De forma similar, el grupo de
ensayo recibi oralmente una nanosuspensin a la dosis de 5 mg por 250 g
de peso corporal.

Se recogi una muestra de sangre (500 l) a intervalos de tiempo de 0,

0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 10, 12, 24, 36, 48, 60 y 72 horas de cada rata por
puncin de plexo orbital retro en Un tubo de microcentrfuga que contena
10 l de solucin EDTA dipotsica (10% p / v). A continuacin, se separ el
plasma de las muestras de sangre recogidas utilizando una centrfuga de
enfriamiento (3K30, Sigma Laborzentrifugen, Osterode am Harz,
Alemania) a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4C. Las muestras de plasma
separadas se almacenaron a -20C hasta un anlisis posterior.

Anlisis de frmacos en muestras de plasma

La presencia de frmaco en plasma de rata se determin usando HPLC

(datos no publicados). Condiciones cromatogrficas tales como columna
HyperClone C18 (250 x 4,6 mm id, 5 m, BDS 130 ) como fase
estacionaria, una mezcla de acetonitrilo: tampn de formiato de amonio 40
mM con pH 2,5 (28: 72% v / v) Fase mvil, caudal: 0,8 ml / min, detector UV
con longitud de onda de 248 nm, temperatura de columna mantenida a 25
C y volumen de inyeccin: 80 l. El mtodo desarrollado fue validado segn
las pautas de USFDA.

Se tom una muestra de plasma (200 l) en el tubo de microcentrfuga. Se

aadi solucin de hidrxido sdico (NaOH, 0,1 M, 40 l) y se someti a
vrtice (SpinixTM MC-01, Vortex Shaker, Tarsons Products Pvt. Ltd.,
Kolkata, India) durante 1 min. A continuacin, se aadi acetonitrilo (560 l)
y de nuevo se someti a vrtice durante 5 min. Despus de agitar en vrtex,
la solucin sobrenadante se recogi por medio de enfriamiento por
centrifugacin a 15.000 rpm durante 15 min a 4C. El sobrenadante se
recogi en tubos de ensayo y se someti a evaporacin de nitrgeno a 50
C hasta la evaporacin completa del disolvente. El residuo se reconstituy
en fase mvil (acetonitrilo: tampn de formiato de amonio 40 mM con pH
2,5 [28: 72% v / v]), y se estim la concentracin del frmaco en plasma
utilizando el mtodo bioanaltico HPLC desarrollado.

Las concentraciones plasmticas de frmaco obtenidas de cada grupo se

alimentaron en WinNonlin Standard Edition v.5.2 (Pharsight, Mountain View,
CA, EE.UU.) con respecto al tiempo para calcular los parmetros
farmacocinticos. El mtodo no compartimental se utiliz para la
determinacin de los parmetros farmacocinticos. Se calcul la
concentracin plasmtica mxima (Cmax) y el tiempo para conseguir la
concentracin plasmtica mxima (Tmax) trazando la concentracin de
frmaco en plasma frente al tiempo. El rea bajo la curva desde el momento
de la administracin hasta el tiempo "t" (AUC0-t) se obtuvo usando la regla
trapezoidal. La semivida de eliminacin (t1 / 2) se calcul a partir de la
constante de velocidad de eliminacin (Ke). El aclaramiento (Cl) de gefitinib
se dedujo del producto de Ke y volumen de distribucin (Vd). La
biodisponibilidad relativa se calcul a partir de la AUC0-t obtenida de
nanosuspensin a AUC0-t de la dispersin de frmaco estndar.36,38,39

Biodisponibilidad relativaAUC de la formulacinDose de stan0t =

-ddardAUC de la normaDose de la formulacin0t- 100

La permeabilidad in vivo de gefitinib de la nanosuspensin tambin se

determin usando la frmula dada: 40

Porcentaje de frmaco absorbidoAUCKVFDose0ted = -100

Donde AUC0-t = ltimo rea bajo la curva, Ke = constante de velocidad de

eliminacin, Vd = volumen de distribucin y F = porcentaje de
biodisponibilidad de gefitinib de la formulacin.

Estudios de estabilidad

Se realizaron estudios de estabilidad acelerada de la nanosuspensin

optimizada a 5 C 3 C. La nanosuspensin se llen en viales de vidrio
de color mbar y se sell con tapn de caucho y tapas de aluminio. Los
viales se almacenaron a las temperaturas especificadas durante 90 das. Las
muestras se recogieron a los 0, 7, 15, 30 y 90 das a partir de estos viales.
Las muestras recogidas se analizaron con respecto al tamao de partcula,
PDI y potencial zeta21,41

anlisis estadstico

El anlisis de varianza de dos vas (ANOVA) seguido de la prueba post hoc

de Bonferroni se aplic para el anlisis de liberacin in vitro de frmacos y
estudios farmacocinticos. Los resultados se consideraron significativos a
nivel de probabilidad 5% (P0.05). El anlisis estadstico se realiz
utilizando GraphPad Prism v.5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA,
EE.UU.)

esultados y discusin

Preparacin de nanosuspensin de gefitinib

La nanosuspensin de gefitinib se prepar usando la tcnica de evaporacin
con disolvente. Eudragit RL100, PVA y PVP K30 se utilizaron para la
preparacin de la nanosuspensin.

Eudragit RL100 fue elegido por su muy fina distribucin de partculas,

buena estabilidad fisicoqumica, 7,8 perfil de alta permeabilidad,
mucoadhesividad, frmacos dirigidos al tracto gastrointestinal, alto tiempo
de retencin, 9-12 y sin propiedades de toxicidad / irritacin.8,13 La alta
permeabilidad, la alta retencin, la estabilidad fisicoqumica y la focalizacin
en el tracto gastrointestinal se deben principalmente a la presencia de
grupos amonio en su estructura qumica. Debido a que el Eudragit RL100
es de naturaleza hidrfoba, tambin se espera que el atrapamiento de
frmaco en las nanopartculas preparadas usando este polmero sea
alto.7,43-45

El PVA se utiliz para la estabilizacin de nanopartculas de gefitinib.27 Es

no inico, no txico, no carcingeno y tiene un alto grado de hinchamiento
en soluciones acuosas y una buena biocompatibilidad. Sin embargo, a veces
produce un patrn de distribucin asimtrico de nanopartculas y tambin
aumenta la viscosidad de la suspensin.46 Por lo tanto, la PVP K30 se us
adicionalmente como un co-estabilizador para asegurar un tamao de
partcula esfrico y pequeo. Otras razones detrs de la seleccin de PVP
K30 fueron su naturaleza hidroflica, alto punto de fusin, naturaleza no
txica, no inica, alta tolerancia fisiolgica y un poderoso efecto inhibidor de
la precipitacin. Estas propiedades mantienen el estado de sobresaturacin
del frmaco en el fluido gastrointestinal.48-50 La PVP K30 produce
partculas esfricas amorfas y / o de superficie lisa.50 La PVP es aprobada
por la Food and Drug Administration y generalmente se considera un
polmero seguro. Tambin se ha informado de que las nanopartculas
producidas con PVA y PVP mejoran la correlacin entre la estabilidad de las
nanopartculas y la longitud monomrica de la cadena polimrica.44
Estudios anteriores tambin han propuesto que los tensioactivos no inicos
tienen una tendencia a adsorberse en superficies hidrfobas.44, 45 Las
ayudas de adsorcin para restringir los segmentos polimricos a la
superficie de la partcula y las cadenas adsorbidas se extienden dentro de la
solucin, lo que restringe las cadenas y disminuye la entropa de la cadena.
Finalmente, aumenta la estabilidad mediante la energa de interaccin
repulsiva. Tambin se ha demostrado que PVA y PVP proporcionan
proteccin contra la oxidacin y tambin reducen las posibilidades de
agregacin de nanopartculas preparadas proporcionando una barrera
estrica.44,45,52-54

En el presente estudio, se us DMSO para disolver el frmaco. Se us

metanol como disolvente orgnico para disolver Eudragit RL100, porque
es compatible con DMSO. Segn el USP 37 / NF 32, el lmite de aceptacin
del metanol como disolvente residual es alto comparado con otros
disolventes de la misma categora, pero se coloca en la categora ms
segura de ICH, clase 2, con carcingenos animales no especficos, Agentes
de otra toxicidad irreversible. Por lo tanto, se aplic una agitacin magntica
adicional a temperatura ambiente (3 h) para la evaporacin de metanol.55
No se aplic ningn procedimiento adicional para la eliminacin de DMSO de
la formulacin, porque se considera DMSO como un disolvente seguro
cuando se compara con metanol y es Colocados en la categora ms segura
de ICH, disolventes de clase 3, con bajo potencial de toxicidad. DMSO 50
mg por da como disolvente residual se considerara aceptable
(correspondiente al 0,5% bajo la opcin 1) .55-57 Se utiliz DMSO (~
0,025%) en la preparacin de nanopartculas de gefitinib que se
consideraron seguras y dentro de la Lmites aceptables de DMSO. Adems,
el DMSO se considera seguro ya que se metaboliza en humanos por
oxidacin a dimetilsulfona (DMSO2) o por reduccin a sulfuro de dimetilo
(DMS). DMSO y DMSO2 se excretan en la orina y las heces. El DMS se
elimina a travs de la respiracin y la piel con un caracterstico olor a ajo o
olor

PAT - anlisis de tamao de partcula

La nanosuspensin de gefitinib se prepar con xito utilizando Eudragit

RL100 con las aplicaciones de QbD. Se encontr que el tamao de partcula,
el PDI y el potencial zeta estaban en el intervalo de 249,8-597 nm, 0,294-
0,456 y -4,26 a -10,79 mV, respectivamente.

Anlisis, optimizacin y verificacin de riesgos

Se implement un diseo factorial completo para la optimizacin de la

formulacin final. Se analizaron los efectos principales e interactivos de tres
variables autnomas (como CMAs y CPPs) en tres respuestas (CQA). El
efecto de las variables autnomas en CQAs se evalu mediante el uso de la
ecuacin polinomial y 3D superficie de respuesta construido por el software,
como se muestra en la Figura 2.

as ecuaciones polinomiales para el tamao de partcula, PDI y potencial zeta

son las siguientes:

Tamao de partcula = 389,280 - 26,880X1 - 48,750X2 -

66,050X3 + 86,500X1X2 - 27,700X1X3 (1)

PDI = 0,150 + 0,170X1 + 0,049X2 + 0,013X3 -

0,062X1X2 - 0,005X1X3 (2)

Potencial Zeta = -7,55 + 0,50X1 + 2,69X2 (3)

Donde X1, X2 y X3 son concentraciones de PVP y PVA y tiempo de

sonicacin, respectivamente.
Se evalu un efecto significativo para la determinacin de las variabilidades
porcentuales en las AQC y se consider un valor de probabilidad de P $ 0,05
como nivel significativo.

Seleccin de modelo para el tamao de partcula

Para el tamao de partcula, se encontr que el modelo R2FI con un valor F

de 26,58 era significativo (P = 0,0366). El coeficiente de regresin con un
valor P 0.05 indica que los trminos del modelo son significativos, mientras
que los valores 0.1000 indican trminos insignificantes del modelo. Del
mismo modo, tambin se evalu el efecto significativo de las variables
principales e interactivas sobre el tamao de partcula de respuesta. Se
encontr que el valor P de la concentracin de PVA era 0,0463 mientras que
el valor P para el tiempo de sonicacin se encontr que era 0,0260. La
concentracin de PVP y PVA como variables interactivas tambin mostr un
efecto significativo en el tamao de partcula con un valor de P 0,0154. Se
encontr que el valor de precisin adecuado para el modelo R2FI era
13.475. Esta es una medida de la relacin seal / ruido. Para un modelo
preciso, el valor mnimo de precisin adecuado debe ser 4.

El valor de R2 es una medida de la variabilidad total que ha sido explicada

por el modelo y se encontr que era 0.9852, lo que significa que las
variaciones de 98.52% han sido explicadas por el modelo actual.58-60 El
valor de R2 real fue ms que el R2 predicho (0,7628), lo que tambin refleja
la idoneidad del modelo R2FI actual.

Los valores estimados de los coeficientes de concentracin de PVP,

concentracin de PVA y tiempo de sonicacin como variables individuales (o
principales) resultaron ser negativos. Del mismo modo, tambin se encontr
que el valor de la estimacin del coeficiente de concentracin de PVP y
tiempo de sonicacin como variables interactivas (complejas) era negativo.
Sin embargo, el coeficiente estimado de la concentracin de PVP y la
concentracin de PVA como variables interactivas fue positivo. Un valor
positivo de estimacin de coeficientes indica que el tamao de partcula
aumenta con respecto a un aumento en el valor de variable autnoma,
mientras que un valor negativo de estimacin de coeficiente indica que el
tamao de partcula disminuye con respecto al incremento en el valor de
variable autnoma. Es muy interesante observar que el PVA como variable
individual se comporta como un estabilizador de gotas mientras que como
variable interactiva aumenta el tamao de las nanopartculas. La propiedad
estabilizadora de las gotitas evita la coalescencia de gotitas al localizarse en
la superficie de la interfase entre la fase dispersa y la fase continua. Esta
observacin coincide con hallazgos anteriores en esta rea con respecto al
efecto de la concentracin de PVA en el tamao de partcula.61,62

Adems, el efecto interactivo de las variables tambin se determin con la

ayuda de un grfico de superficie de respuesta 3D. Como se representa en
la Figura 2A, el tamao de partcula disminuy a medida que aumentaba el
tiempo de sonicacin y la concentracin de PVP. Muestra la perfecta
combinacin de estas dos variables. Entre ellos, uno (tiempo de sonicacin)
ayuda a reducir el tamao de partcula y el otro (concentracin de PVP)
ayuda a reducir la carga estrica generada en la superficie de las partculas
durante la reduccin de tamao. Como se muestra en la Figura 2B, el
tamao de partcula aument a medida que aumentaban las
concentraciones de PVP y PVA. Esto pudo haber ocurrido porque la cadena
del polmero empieza a enredarse juntas causando la viscosidad aumentada
de PVA en el medio debido al aumento en la concentracin; Por lo tanto ms
molculas de polmero pueden haber sido recubiertas sobre la superficie de
las nanopartculas.44

Seleccin de modelos para PDI

Para PDI, el modelo R2FI con valor F de 476,32 se encontr que era
significativo (P = 0,0021). P0,05 fue considerado como un nivel
significativo. Adems, tambin se evalu el efecto significativo de las
variables principales e interactivas en la PDI. El P-valor de todas las
variables autnomas como principal e interactivo se encontr entre 0,0014
y 0,0290, lo que indica que las variables tienen un efecto significativo
(individual / complejo) en PDI. Se encontr que el valor de precisin
adecuado para el modelo R2FI era 57.388, que es una medida fuerte de la
relacin seal / ruido.

El valor de R2 para este modelo result ser 0,9992, lo que significa que el
modelo actual ha explicado las variaciones de 99,92%. 59-61 Este valor de
R2 real (0,9992) fue mejor que el valor de R2 predicho (0,9866). Apoya
firmemente la conveniencia del modelo R2FI actual.

Se encontr que los valores estimados de los coeficientes de las variables

individuales tales como la concentracin de PVP, la concentracin de PVA y
el tiempo de sonicacin eran positivos, mientras que los valores estimados
del coeficiente de tiempo de sonicacin, concentracin de PVP y
concentracin de PVA como variables complejadas negativo.

dems, el efecto interactivo de las variables tambin se determin con la

ayuda de la parcela de superficie de respuesta 3D. Como se muestra en la
Figura 2C, la PDI disminuy a medida que aumentaba el tiempo de
sonicacin y la concentracin de PVP. Tambin confirma la idoneidad de
estas dos variables autnomas como complejas. Como se muestra en la
Figura 2D, la PDI disminuy a medida que aument la concentracin de PVP
y la concentracin de PVA, lo que significa que las nanopartculas tienen una
naturaleza monodispersa.42 Esto tambin refleja que el PVA produce un
recubrimiento uniforme en la superficie de las nanopartculas, Estabilidad de
la formulacin coloidal.44

Seleccin de modelos para el potencial zeta

Para el potencial zeta, se encontr que el modelo lineal con un valor de F de
719.54 era muy significativo (P0.0001). Adems, se evalu el efecto
significativo de la concentracin de PVP y la concentracin de PVA. Los
valores de P de la concentracin de PVP y la concentracin de PVA fueron de
0,0010 y 0,0001, respectivamente. Esto indica que las variables tienen un
efecto significativo sobre el potencial zeta. Se encontr que el valor de
precisin adecuado para este modelo era de 51.021. Puede medir
fuertemente la relacin seal / ruido.

Se encontr que el valor de R2 para este modelo era 0,9965, lo que significa
que el modelo actual ha explicado las variaciones del 99,65%. 58-60 Se
encontr que el valor de R2 real (0,9965) era casi similar al valor de R2
predicho (0,9911). Por lo tanto, esto es tambin una evidencia de apoyo
para el modelo seleccionado. Los valores estimados de los coeficientes de
concentracin de PVP y concentracin de PVA resultaron ser positivos, lo
que claramente define que los valores de potencial zeta aumentaron con
respecto al aumento en la concentracin de cada variable.

Adems, el efecto se ha demostrado con un grfico de superficie de

respuesta 3D. Como se muestra en la Figura 2E, los valores de potencial
zeta aumentaron con el aumento de la concentracin de PVP y la
concentracin de PVA, lo que tambin confirma que PVP y PVA ayudan a
mejorar la estabilidad fsica de la formulacin coloidal.44

Optimizacin de CMAs y CPPs con verificacin de CQAs

Los criterios dirigidos fueron introducidos en el software para lograr la

composicin prevista (sugerencias de software). Sobre la base del valor
deseable, se seleccion una solucin sugerida por software como regin de
inters y se utiliz prcticamente para su verificacin. Se encontr que el
valor de deseabilidad de la sugerencia de software seleccionada era de
0,986, lo que proporciona una garanta de un 98,60% de posibilidades para
alcanzar el objetivo con CMAs optimizadas y CPPs. Mayor el valor de
deseabilidad, ms la posibilidad de alcanzar el objetivo.63 Se prepar una
formulacin con CMAs optimizados y CPPs, y se analizaron sus CQAs. Los
resultados reales obtenidos y los resultados previstos de las AQC se
utilizaron adems para calcular los valores residuales para asegurar el logro
del espacio de diseo. El clculo de los valores residuales es tambin una
verificacin / validacin del modelo y de los CQA. Los valores residuales se
calcularon como porcentaje residual usando la siguiente frmula: 63

Educacin fsica

Rcent residualSoftware resultados sugeridosActual obtaine = -dd

resultsSoftware resultados sugeridos 100

Los CMA optimizados y CPP con valores residuales de CQA se resumen en la

Tabla 2. Los valores residuales se encontraron entre el rango de -3,49 y
1,01, y se encontraron muy bajos, lo que demuestra que los resultados
reales obtenidos tienen muy Fuerte correlacin con los resultados previstos
por el software. Un menor valor residual es tambin un indicador de menor
variacin y ms reproducibilidad de los CQA con los CMAs optimizados y los
CPPs.

La formulacin optimizada mostr que el tama~no de partcula era de 250

nm, lo que indica que la captacin celular de la formulacin preparada
puede ser buena, ya que la captacin celular depende del tama~no de
partcula.64,65 El valor PDI 0,4 confirma PDI uniforme y estrecha que
tambin enfatiza Que las partculas obtenidas son del mismo tamao. Se
encontr que los valores de potencial zeta eran muy bajos, lo que indica que
la formulacin puede ser menos estable. Como los valores de potencial zeta
se encontraron negativos, lo que puede no apoyar mucho la captacin
celular, se espera que sea seguro ya que las nanopartculas cargadas
negativamente disminuyen las posibilidades de citotoxicidad. Debido a la
carga negativa en la superficie de las nanopartculas, pueden sufrir
adsorcin inespecfica a la membrana celular.

Caracterizacin de la nanosuspensin optimizada

Contenido de la droga

La nanosuspensin optimizada se prepar tres veces y se analiz mediante

HPLC. Se encontr que el porcentaje de contenido en frmaco de la
nanosuspensin optimizada era del 87,74% 1,19%. Se encontr una ligera
disminucin en el contenido de frmacos porque el gefitinib es sensible a la
luz y al calor.66 En el presente estudio, la temperatura estaba bajo control
durante la preparacin de nanopartculas. Por lo tanto, la luz puede ser la
principal va de degradacin que fue responsable de la degradacin del
gefitinib en la nanosuspensin.

AFM

AFM es una poderosa herramienta para la determinacin de la morfologa de

la superficie.28 Una fina pelcula de nanopartculas fue sometida a AFM, que
se estableci en modo de toma. La razn para la seleccin del modo de
derivacin fue evitar el dao y la eliminacin de capas dbiles y defectuosas
de PVP y PVA (como adsorbato) en la superficie de las nanopartculas de
Eudragit (como adsorbente). En el modo de contacto, las superficies duras
pueden destruir la morfologa adsorbida.28,67 Los resultados para el
tamao de partcula obtenido con AFM fueron ms cercanos a los obtenidos
con el Zetasizer. Las imgenes en AFD 2D y 3D de nanopartculas de
gefitinib (registradas con un aumento de 20 20 m) se muestran en las
Figuras 3A y B. Las nanopartculas de gefitinib (GNPs) eran de forma esfrica
con superficie lisa. Estos resultados son similares a las nanopartculas
preparadas con Eudragit L100 y PLGA usando PVA como estabilizador.68
Tambin demuestra que el PVA ayuda a impartir la superficie esfrica y lisa
sobre las nanopartculas.

Estudio de liberacin de frmaco in vitro

Los estudios de liberacin de frmaco in vitro se llevaron a cabo usando
aparato USP de tipo II. La razn principal para la seleccin del mtodo de
disolucin fue mantener la temperatura requerida y estimular las
condiciones biolgicas a lo largo del experimento, lo cual es un poco difcil
en los estudios de difusin de nanosuspensiones. Hasta 8 h, la liberacin de
nanosuspensin de gefitinib fue muy lenta, es decir, 5,30% 1,87%, lo cual
puede deberse a que el polmero de envoltura exterior tard ms en
producir la capa estancada (o hidratada) 69,70 o puede deberse a Difusin
lenta del frmaco a partir de la capa estancada formada por el polmero de
envoltura exterior. Se evidenci que el frmaco est atrapado en las
nanopartculas ncleo. Estos resultados son similares a los resultados
reportados por Lee et al.70 Despus de producir la capa estancada (o
hidratacin del polmero), sigui el patrn de liberacin del frmaco de
primer orden como resultado en 84 h; La liberacin de frmaco de la
formulacin fue de 60,03% 4,09%. Este tipo de comportamiento de
liberacin de frmaco observado puede deberse a la combinacin de
polmeros. Se encontr que la liberacin de la dispersin estndar de
frmaco era muy menor, es decir, 10,39% 3,37% en 84 h, en comparacin
con la nanosuspensin de gefitinib. Como se muestra en la Figura 4, en 84 h
con la nanosuspensin de gefitinib ~ 6 veces aumento de la solubilidad se
encontr en comparacin con la dispersin de frmaco estndar. Este
estudio confirm que la disminucin del tamao de partcula (como
nanopartculas) ayuda a mejorar la solubilidad del frmaco.

Los datos de liberacin de frmaco in vitro se analizaron adicionalmente

para el anlisis estadstico mediante la aplicacin de ANOVA de dos vas
seguido por la prueba post hoc de Bonferroni. Se observ significancia (a
P0.001) entre el perfil de liberacin de frmaco de gefitinib (dispersin
estndar de frmaco) y nanosuspensin de gefitinib.

Estudio de citotoxicidad in vitro

Los estudios de citotoxicidad in vitro, realizados en clulas Vero, indican que

la capacidad de inhibicin celular del gefitinib (estndar) es mayor que la
nanosuspensin de gefitinib, haciendo la formulacin ms segura de usar.
Como se muestra en la Tabla 3, el valor de CC50 de las clulas viables es
casi 10 veces en pozos de nanosuspensin de gefitinib en comparacin con
los pocillos de gefitinib. Este fenmeno indica que la nanosuspensin de
gefitinib tiene baja citotoxicidad en comparacin con gefitinib.

Estudio farmacocintico

El perfil farmacocintico plasmtico de gefitinib y nanosuspensin de

gefitinib se ilustra en la Figura 5. Los parmetros farmacocinticos se
calcularon usando WinNonlin Software v.5.2. (Pharsight Corporation) y se
presentan en la Tabla 4.

Se compararon los parmetros farmacocinticos de gefitinib (dispersin

estndar de frmaco) con nanosuspensin de gefitinib. En comparacin con
el estndar, los valores de Cmax, Tmax y AUC aumentaron con la
nanosuspensin de gefitinib, lo que indica el inicio rpido de la accin y la
fase de absorcin prolongada del gefitinib a partir de la nanosuspensin,
pero los valores de t1 / 2, Vd, Ke y Cl disminuyeron Con nanosuspensin
gefitinib. La disminucin en Vd indica que la solubilidad del frmaco se
incrementa despus de la preparacin de la nanosuspensin. Esto tambin
se apoya en los estudios de liberacin de frmaco in vitro, ya que la
liberacin del frmaco es mayor que el estndar. El efecto correspondiente
de Vd tambin puede verse en los valores inferiores obtenidos de t1 / 2, Ke,
Cl y MRT. Esto tambin refleja que la nanosuspensin gefitinib afecta la
terminacin de la accin. El aumento de los valores de Cmax y AUC en el
caso de nanosuspensin de gefitinib indica que la presente formulacin
puede ser til para reducir la dosis de gefitinib. Los resultados relativos de
biodisponibilidad de la nanosuspensin de gefitinib tambin confirmaron el
aumento de 1.812 veces en la biodisponibilidad oral. Los resultados de
biodisponibilidad evidenciaron que la presente formulacin puede ser til
para mejorar la actividad teraputica y reducir la dosis de gefitinib.

Se encontr que el porcentaje de absorcin in vivo de gefitinib a partir de la

dispersin estndar de frmaco y nanosuspensin era de 38,38% y 68,82%,
respectivamente. Esta es una medida de la permeabilidad in vivo del
frmaco y se refleja claramente en el aumento de la permeabilidad in vivo
del gefitinib despus de preparar la nanosuspensin.

Los datos farmacocinticos tambin se analizaron para el anlisis

estadstico mediante la aplicacin de ANOVA seguido de prueba post hoc de
Bonferroni. Se observ significancia (a P0.001) entre las concentraciones
plasmticas de gefitinib (dispersin estndar de frmaco) y nanosuspensin
de gefitinib. Este efecto significativo se observ principalmente entre 2 y 10
h.

Estudios de estabilidad

La primera razn para la seleccin de esta temperatura para el estudio de

estabilidad fue que el gefitinib es estable a esta temperatura en recipientes
de color mbar bien cerrados. En segundo lugar, ya est demostrado con
estudios anteriores que las formas de dosificacin lquidas son menos
estables a temperatura ms alta. Por lo tanto, para evitar la repeticin, se
seleccion una temperatura ms baja para estudios de estabilidad, que es
tambin una temperatura estndar segn las pautas de ICH. Las
nanopartculas polimricas cargadas con gefitinib mostraron un incremento
en el tamao de partcula y PDI aproximadamente tres veces y dos veces,
respectivamente, durante un periodo de 90 das despus del
almacenamiento a 5C 3C. Tambin se observ una ligera reduccin del
potencial zeta despus de 90 das de almacenamiento a 5 C 3 C. Los
resultados de estabilidad fsica reflejan que la nanosuspensin de gefitinib
es menos estable; Por lo tanto, existe la necesidad de convertir esta forma
de dosificacin lquida en una forma de dosificacin slida para mejorar su
estabilidad.

Conclusin

En el presente estudio, la nanosuspensin de gefitinib se prepar con xito

utilizando tcnicas continuas de homogeneizacin y ultrasonicacin. El
enfoque QbD tambin se aplic en el estudio para entender el efecto de
CMAs y CPPs en CQAs y para mejorar la calidad y la seguridad de la
formulacin. Para estudiar el efecto de los CMAs y CPPs, se us el diseo
factorial completo. El tamao de partcula, el PDI y el potencial zeta de la
formulacin optimizada fueron 248,20 nm, 0,391 y -5,62 mV,
respectivamente. Se encontr que el contenido de frmaco de la
nanoformulacin optimizada era del 87,74% 1,19%. El estudio AFM de la
formulacin optimizada confirm que las nanopartculas preparadas son de
naturaleza lisa y esfrica. Los estudios de citotoxicidad in vitro de la
nanosuspensin en la lnea celular Vero revelaron que la formulacin no es
txica. La nanosuspensin de gefitinib liber 60,03% 4,09% de frmaco
durante un periodo de 84 h, mientras que la dispersin de frmaco estndar
liber slo 10,39% 3,37% de frmaco en la misma duracin. A partir de
los estudios farmacocinticos, la vida media, Cmax y Tmax del frmaco en
una nanosuspensin optimizada fue de 8,65 1,99 h, 46,211.04 5,805.97
ng / mL y 6,67 1,77 h, respectivamente. Se encontr un aumento de
1,812 veces en la biodisponibilidad relativa de nanosuspensin, lo que
confirm que la presente formulacin es adecuada para aumentar la
biodisponibilidad oral de gefitinib.

Adems, en relacin con las aplicaciones de QbD en este estudio, pocas

series experimentales utilizadas para la optimizacin son la evidencia para
la reduccin del costo de fabricacin. Los menores valores de error residual
obtenidos son la evidencia para la reduccin de la variabilidad de
fabricacin. El tamao de partcula pequeo, los valores de PDI ms bajos y
las partculas lisas y esfricas confirman la calidad deseada de
nanosuspensin de gefitinib. De manera similar, los estudios de la lnea
celular Vero de la nanosuspensin de gefitinib confirmaron el logro de la
seguridad mediante la nanoformulacin. Sobre la base de los resultados
obtenidos como evidencia, se puede concluir que QbD es una herramienta
til en sistemas de administracin de frmacos nanoparticulares para
reducir el costo de fabricacin, reducir la variabilidad de fabricacin y
mejorar la calidad y la seguridad, lo cual es un requisito primordial de
USDFA .