UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA

Citometra de flujo: Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

Milena Salgado Lynn

Curso de Mtodos en Biotecnologa

Semestre 2002-2
Coordinador: Dr. Roberto Stock

27 de mayo de 2002
 ndice

Pgina

Introduccin 3

Historia del Instrumento 5

Descripcin y funciones de los componentes del aparato

Sistema de Flujo 7

Sistema ptico 7

Sistema Elctrico 8

Obtencin de los datos e interpretacin 10

Aplicaciones 12

Bibliografa 18

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Introduccin

Actualmente, la mayora de las preguntas en el campo de la biologa celular se enfocan en

saber qu es lo que sucede con las clulas integrantes de un sistema, cmo son las
interacciones dentro del mismo y, sobre todo, cules son las propiedades individuales de
cada una. Estas preguntas han llevado a la necesidad de aislar y/o purificar
subpoblaciones y subcomponentes celulares, generalmente para (1) enriquecer poblaciones o
para (2) eliminarlas. Para alcanzar estos objetivos, el primer paso en el proceso de
aislamiento es la identificacin y clasificacin de las clulas. La clasificacin de las
clulas puede basarse en propiedades fisicoqumicas, inmunolgicas y funcionales. Los
mtodos de clasificacin que se basan en propiedades funcionales utilizan caractersticas
tales como afinidad, adherencia o crecimiento. La clasificacin inmunolgica se basa en la
utilizacin de anticuerpos dirigidos contra eptopes celulares. En la prctica, las
caractersticas fisicoqumicas son las ms utilizadas para la separacin o sorteo celular;
se incluyen caractersticas como tamao, volumen, densidad, propiedades de dispersin de
la luz, potencial de membrana, pH, carga elctrica y contenido celular de diferentes
compuestos como cidos nuclicos, enzimas y otras protenas (Orfao, et.al.; 1996).

En los ltimos aos ha habido un incremento en las tcnicas que utilizan ms de una
caracterstica celular para clasificar y separar diferentes subconjuntos celulares y
componentes subcelulares. Estas tcnicas pueden agruparse bsicamente en (a) separacin
gruesa y (b) separacin de clulas individuales. La separacin gruesa se refiere a mtodos
tales como la filtracin celular, la centrifugacin o sedimentacin y el cultivo celular. La
separacin de clulas individuales se refiere principalmente a la citometra de flujo que,
enriquecida con el sorteo celular, es la mejor tcnica para proveer informacin en cuanto al
anlisis y separacin de poblaciones celulares.

La citometra de flujo es un proceso que permite que las clulas (500 4000/ seg) pasen en
fila dentro de un flujo a travs del aparato (Beckton Dickinson Immunocytometry
Systems; 1995). Mientras esto sucede, se puede hacer la medicin simultnea de mltiples
caractersticas fsicas de una sla clula. La ventaja analtica de la citometra de flujo tiene

3
como base la habilidad de hacer mediciones cuantitativas y multiparamtricas en un
nmero estadsticamente adecuado de clulas para definir las propiedades de una poblacin
celular o de las subpoblaciones que la componen. El anlisis multiparamtrico hace posible
evaluar poblaciones celulares particulares dentro de una mezcla compleja, ya que aprovecha
propiedades intrnsecas de la clula como la dispersin de la luz, y caractersticas
controladas como la fluorescencia. Al mismo tiempo, es posible separar las poblaciones
definidas por ste anlisis (Parks D.R., et.al.; 1984). Estas ideas son la base de la tcnica
conocida como FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting).

El FACS proporciona datos tales como el tamao relativo de la clula, granularidad o

complejidad interna y la intensidad relativa de fluorescencia. Para llevar a cabo lo anterior,
el aparato necesita (como cualquier citmetro de flujo) de un sistema combinado de flujo,
ptica y electrnica (Figura 1). El sistema de flujo introduce y restringe a las clulas para
su anlisis individual, el sistema ptico excita la muestra y colecta las seales de luz
provenientes de la misma y el sistema electrnico convierte la seal ptica en una seal
electrnica y la digitaliza para el anlisis en computadora (Beckton Dickinson
Immunocytometry Systems; 1995). El sistema de citometra de flujo est compuesto por
cinco unidades principales: una fuente de luz (lmpara de mercurio o lser), flujo celular,
unidad de filtros pticos para la deteccin de longitudes de onda especficas, fotodiodos o
fotomultiplicadores para la amplificacin de la seal y una unidad de operacin y
procesamiento de datos.

El funcionamiento del FACS es relativamente sencillo y se describe, brevemente, a

continuacin. Una suspensin celular se inyecta al flujo laminar donde las clulas pasan
una despus de la otra a travs de un capilar y llegan hasta un rayo lser. Cuando este
rayo incide en una clula, la luz de excitacin sale hacia delante y hacia los lados de la
clula y esto genera informacin. La luz dispersada hacia delante provee informacin sobre
el tamao de la clula. La luz dispersada hacia los lados provee informacin sobre la
granularidad, tamao y morfologa celular. Si la clula va marcada con un fluorforo, la
luz fluorescente se procesa, a travs del fotomultiplicador, en el sistema procesador de datos
y los resultados son analizados por el software del citmetro. El FACS posee una unidad de

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sorteo que ofrece la posibilidad de separar subpoblaciones seleccionadas. Las clulas se
cargan elctricamente y las gotas resultantes se desvan al pasar a travs de un campo
elctrico. Cmo sucede todo esto y cules son las bases de esta tecnologa?

Cristal Piezoelctrico

Reservorio
Presurizado Seal Analizador de
De Clulas electrnica Pulsos y
Contador
(Procesamiento
Pulsos
de datos)
De carga
Reservorio Presurizado
De flujo externo
Flujo Filtros
celular pticos

Fotomultiplicador

- 1kV + 1kV

Lser
(fuente de luz) Colector de clulas

Figura 1. Esquema generalizado de los componentes de un citmetro-sorteador; la funcin de los componentes,

el procesamiento de la seal y la electrnica detrs del sorteo se describen ms adelante en el texto (Bonner WA,
et.al.; 1972)

Historia del Instrumento

El FACS naci en el laboratorio de L.A. Herzenberg en 1968, se le llam as por primera vez
en 1972, y se bas en las tcnicas de separacin de Sweet y en el sistema de flujo coaxial de
Crossland-Taylor (Bonner W.A., et.al.; 1972). Los instrumentos para medir y contar en
un flujo se tenan desde mediados del siglo pasado, pero la reproducibilidad y la confianza
en los resultados no se alcanz sino hasta que se aplic un flujo laminar que guiaba la
corriente de clulas en un flujo estable y por un canal relativamente largo (Crossland-
Taylor P.J.; 1953). Para ese entonces ya se haban desarrollado sistemas basados en la
microscopa para medir la dispersin y absorcin de la luz, as como la fluorescencia usando
iluminacin de mercurio y el principio de epifluorescencia. En 1965, Sweet desarroll la
inyeccin de tinta y con ella surgi la idea del sorteo electroesttico, estabilizando la

5
formacin y carga elctrica de gotas individuales (Sweet R.G.; 1965). En cuanto a
tecnologa de fluorescencia, en 1961 Moller demostr que las clulas vivas de cultivos en
suspensin podan marcarse especficamente con anticuerpos conjugados a fluorescena
(Coligan, J.F., et.al.; 2001).

Estas tcnicas se conjuntaron y dieron origen al FACS. El lser se introdujo al FACS

despus de los resultados de Van Dilla et.al. en 1969, adems se introdujeron medidas
pticas en el flujo del sorteo en vez de en el flujo celular y en 1972 se aadi un canal para
la dispersin de la luz del lser que hizo posible la deteccin de clulas no fluorescentes y
que ha servido para medir el tamao de la clula y para discriminar entre vivas y muertas.
El primer instrumento comercial de esta naturaleza fue el FACS I de Becton Dickinson y se
bas en el sistema descrito (Parks D.R., et.al.; 1984). A partir de ah, se han introducido
pocos cambios que tienen que ver con las mediciones multiparamtricas y con la generacin
de softwares de anlisis ms sofisticados y potentes.

Originalmente, el FACS meda slo un tipo de fluorescencia pero conforme se desarrollaron

nuevos fluorforos y se mejor la produccin de anticuerpos monoclonales, se abrieron
nuevas perspectivas en cuanto a la capacidad de deteccin del aparato. En el laboratorio de
Herzenberg, la habilidad de acoplar los anticuerpos monoclonales a diferentes fluorforos
gener la inquietud de hacer anlisis multicolores por lo que se adapt el aparato para poder
hacer lecturas de dos diferentes espectros de emisin a partir de un mismo rayo lser. La
aparicin de mejores monoclonales y mejores fluorforos estimul el desarrollo del FACS de
doble lser ya que se volvi interesante aumentar el nmero de marcadores que podan
medirse simultneamente en una sla clula. Actualmente, los FACS de un slo lser se
utilizan para medir tres diferentes anticuerpos marcados con diferentes fluorforos y los
FACS de doble lser se usan para medir hasta 5 colores de fluorescencia al mismo tiempo.
Adems, el mismo grupo, desarroll recientemente un aparato con tres lsers que permite la
medicin simultnea de hasta 11 colores de fluorescencia (Herzenberg L.A., et.al.; 2000).

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Descripcin y funcin de los componentes del aparato

Sistema de flujo
El sistema de flujo del FACS posee un capilar a travs del cual se hace pasar un lquido
isotnico, a manera de una funda, con una velocidad y presin constante; estas
caractersticas son necesarias para la formacin de un flujo laminar (sin turbulencia). Al
mismo tiempo, por el centro del capilar se hace pasar la suspensin celular, con
aproximadamente de 5 x 105 a 2 x 107 clulas/mL y a una presin mayor que la del flujo
acarreador. Este enfoque hidrodinmico (Figura 2) se asegura de que las clulas
permanezcan centradas y viajen una tras otra en el chorro de inyeccin. Este
confinamiento es necesario para hacer mediciones precisas, es decir para el anlisis
individual de las clulas (Bonner W.A., et.al.; 1972. Beckton Dickinson
Immunocytometry Systems; 1995).
Muestra
Flujo acarreador

Fig. 2. Sistema de flujo del FACS. La muestra pasa

por un flujo laminar producido por otro lquido Capilar
isotnico y esto hace que las clulas viajen
ordenadas una tras otra. Enfoque hidrodinmico

Sistema ptico
La fluorescencia y la luz dispersada se producen cuando una clula contenida en el lquido
inyectado pasa por el rayo enfocado de un lser (Figura 3). La luz dispersada hacia el
frente es colectada por un detector que capta la luz difractada entre 1 y 10 arriba o abajo del
punto de incidencia del lser. La luz dispersada lateralmente y la fluorescencia son
colectadas por un lente que est a 90 del eje de incidencia del lser. Esta luz lateral y la
fluorescencia son divididas por un beamsplitter (Divisor del rayo) para separar entre la luz
difractada y la fluorescencia. La fluorescencia es a su vez dividida por un espejo dicrico
que permite distinguir entre diferentes longitudes de onda. Cada detector de fluorescencia
tiene otros filtros pticos para exclur la luz del lser dispersada y para dejar pasar la luz con
la longitud de onda deseada para ese detector (Bonner W.A., et.al.; 1972. Park D.R., et.al.;
1984).

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 Detector de
Fluorescencia 1

Detector de Filtro
Fluorescencia 2
Espejo Dicrico
Filtro

Detector de
Luz dispersa Divisor del Rayo
lateral
Lente colector
Expansor
Del rayo
Rayo Detector de
lser Lente de Luz dispersa
enfoque frontal

Punto de enfoque
(clula)
Fig. 3. Sistema ptico del FACS. El lser incide en la clula y esta dispersa la luz de manera lateral y frontal
al tiempo que emite fluorescencia. La luz y la fluorescencia son detectadas por separado (Beckton Dickinson
Immunocytometry Systems; 1995. http://www.icnet.uk/axp/facs/davies/flow.html).

Sistema elctrico
Para la obtencin fsica de las poblaciones celulares, es necesario que las clulas vayan en
gotas aisladas y con un marcaje que permita distinguir y separar una poblacin de otra.
Cuando una clula atraviesa el rayo lser, se ilumina por varios microsegundos y durante
ese tiempo emite un pulso fluorescente. Si este pulso cae en los lmites de amplitud
predeterminados, se genera elctricamente un pulso cargado. Este pulso toma en cuenta la
demora que hay entre el evento de la clula estando incidida por el lser y la clula estando
en el lugar donde debe formarse la gota. Este pulso llega a un cristal piezoelctrico que est
conectado a la estructura por la que pasa el capilar. Este artefacto se expande y contrae
ligeramente cuando se aplica un voltaje y este movimiento gua a un oscilador que hace
vibrar la estructura por donde pasa el capilar. La vibracin lleva una frecuencia cercana a la
frecuencia con la que naturalmente el flujo se rompe en una gota. Esto estabiliza la
formacin de la gota en esa frecuencia, resultando en una gota de tamao uniforme y una
demora de tiempo bien definida entre la deteccin de una clula por el rayo del lser y la

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incorporacin de la clula a una gota libre. Si la clula se va a sortear, un potencial en el
orden de los 100 V se aplica, mediante un electrodo, al fluido (isotnico) que va dentro del
capilar. La conductividad elctrica del fluido asegura que cualquier gota que se separa de la
inyeccin, mientras se aplica el voltaje, llevar una carga elctrica. La duracin del voltaje
aplicado se escoge para cargar una o ms gotas que puedan contener a la clula deseada. Se
pueden sortear dos poblaciones de clulas al mismo tiempo al aplicar una carga positiva a
gotas que contengan una poblacin y una carga negativa a gotas que contengan otra
poblacin. La hilera de gotas pasa entre dos placas cargadas a ms o menos varios miles de
volts, separando las gotas cargadas de las no cargadas. Las gotas que no se desplazan se
remueven por una aspiradora y las que se desplazan se colectan en los recipientes adecuados
(Figura 4a) (Bonner WA, et.al.; 1972. Park DR, et.al.; 1984).

El sistema electrnico tambin est involucrado con la amplificacin de las seales que
salen de los detectores, tanto de fluorescencia como de luz dispersa, y con el procesamiento de
los datos para su evaluacin (Fig. 4b)

a) F1
F2
Cristal Dispersin (D)
Piezoelctrico
Seal para la
Formacin de la gota
Fotomultiplicador
Fluorescencia 2 (F2) Muestra
Lquido acarreador

Seal para carga

Capilar De la gota

Detector de
Fotomultiplicador Luz dispersa
Fluorescencia 1 (F1)

Rayo
de Placas
lser separadoras

Aspiradora

Muestras
separadas

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 b) F1
Amplificadores Sistema
F2 Lineales y/o Almacenamiento De
Logartmicos de En computadora y presentacin
D La seal Anlisis

F1 F2 D

Evaluacin Digitalizacin Decisin

De seal Anloga o
anloga Sorteo digital

Seal para formacin de gota

Oscilador

Coincidencia y
Seal para Amplificador de Cronometraje de la
La carga de Carga de la gota
Carga de gota La gota

Fig. 4. Sistema elctrico del FACS. a) Las seales luminosas son colectadas y transformadas en pulsos
elctricos que regresan a la estructura central y forman y dan carga elctrica a la gota; al estar cargadas las
clulas pueden separarse. b) Procesamiento de las seales luminosas en las seales elctricas necesarias para la
separacin de las muestras y su anlisis (Parks DR, et.al.; 1984).

Obtencin de los datos e interpretacin

El aparato de FACS va acompaado por una computadora que adquiere los datos
proporcionados por el sistema elctrico y hace una presentacin grfica. La computadora
produce un histograma o un despliegue de dos parmetros (dot plot o contour plot) a partir de
la luz dispersada por las clulas o a partir de la fluorescencia (Fig. 5). El anlisis de los
datos generalmente se complica porque el volumen de la muestra puede ser variable y por la
complejidad de sta, por lo que es escencial que la forma de interpretacin se disee
especficamente para contestar a las preguntas que se formularon en la investigacin. Sin
embargo, existe una interpretacin generalizada para este tipo de grficas y aqu se muestra
un ejemplo.

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 Rojo

a) b) c)

Fig. 5. Interpretaciones grficas por el Software del FACS. a) Histograma. b) Dot Plot. c) Contour Plot.
(http.//www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/FACS.html. Coligan, J.F., et.al.; 2001)

En la figura 5a tenemos representada en el eje de la abscisa la intensidad de la fluorescencia

roja o verde y en la ordenada tenemos el nmero de clulas con cada nivel de fluorescencia.
En esta figura podemos ver que hay el doble de clulas clasificadas como rojas que de clulas
clasificadas como verdes o como clulas sin fluorescencia, sin embargo, la intensidad de luz
fue mayor en las clulas verdes que en las clulas rojas. Este despliegue de datos es el
mejor si las clulas son rojas, verdes o no marcadas y ninguna tiene una doble tincin.
En el eje de las X de la figura 5b tenemos la intensidad de la fluorescencia verde y en el eje
de las Y tenemos la intensidad de la fluorescencia roja. Los puntos individuales representas
clulas individuales y la idea es ver la densidad relativa de los puntos en cada cuadrante.
De esta grfica se puede concluir que no hay clulas marcadas doblemente (cuadrante
arriba-derecha) y que haba muchas clulas no marcadas (abajo-izquierda). El nmero de
clulas marcadas con un fluorforo de emisin en verde (abajo-derecha) es ms o menos el
mismo que el de clulas no marcadas, tambin vemos que el nmero de clulas marcadas
con un fluorforo de emisin en rojo es casi el doble que el de las otras dos categoras (arriba-
izquierda). Aqu tambin se puede ver que la intensidad de las verdes fue mayor que la
de las rojas. Este mtodo es muy til cuando ha habido una doble tincin, el cual es el
caso en la figura 5c. En esa figura, el cuadrante de arriba a la derecha presenta una
poblacin muy pequea (2.1%) de clulas marcadas doblemente. Los porcentajes
presentados en la figura 5c son determinaciones de frecuencia que muestran el nmero de

11
clulas que presentan una caracterstica definida (Coligan, J.F., et.al.; 2001.
http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/FACS.html).

En la interpretacin de estos resultados, el establecimiento de controles negativos y positivos

es crtico, ya que definirn la localizacin de la poblacin de inters. Por ejemplo, si se
quiere distinguir una poblacin de clulas positiva para cierta fluorescencia, el lmite
mnimo del rea de inters deber definirse de manera que incluya nicamente a ese tpo de
clulas. Para lograr esto, es necesario tener un control positivo que sirva como base para la
definicin del rea positiva. Si el lmite mnimo se establece cerca de la zona donde se
encuentran las clulas negativas, la frecuencia de las positivas podra sobreestimarse o
subestimarse dependiendo de la seal de fondo que den los marcadores. Despus de tener
todos los controles positivos se pueden seleccionar ventanas donde se analicen experimentos
individuales (Coligan, J.F., et.al.; 2001).

Aplicaciones

En general, el FACS se utiliza para analizar y separar clulas segn caractersticas

definidas. En un principio el FACS se utiliz para analizar clulas linfoides murinas,
especialmente para separar entre clulas B y clulas T y para ver su viablilidad. Tambin se
utiliz para aislar poblaciones que estaban involucradas en la respuesta inmune y que
estuvieran funcionalmente activas (Julius, M.H., et.al.; 1975). Actualmente, el desarrollo
y uso de anticuerpos monoclonales especficos para molculas de superficie hacen posible la
definicin y estudio de subpoblaciones de linfocitos que no son posibles utilizando otras
tcnicas.

Adems del anlisis de linfocitos especficos, el FACS se ha vuelto una herramienta en la

farmacologa, la toxicologa, la bacteriologa, virologa, ciencias ambientales y en el
monitoreo de bioprocesos. A travs de la dispersin de la luz, la fluorescencia y la
absorbancia de las clulas teidas o no teidas, se pueden medir un gran nmero de
parmetros celulares (Tabla 1).

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Con respecto a la medicin utilizando la luz dispersada, en el citmetro, la luz que se
dispersa hacia el frente se utiliza para determinar el tamao de la clula. Para lograrlo se
necesita calibrar el aparato con cuentas de poliestrireno que tengan tamaos definidos.
An as, el error puede ser grande ya que las mediciones estn influenciadas por el ndice
de refraccin de las partculas. Adems de medir el tamao, se pueden combinar otras
caractersticas para determinar a un grupo de clulas. Por ejemplo, se han monitoreado
juntos el tamao y el contenido de DNA en cultivos de E. coli, as como tambin se han
monitoreado al mismo tiempo el tamao y la produccin de CO2 en cultivos sincronizados
de Saccharomyces cerevisiae. En estudios como el ltimo que se menciona, los tamaos
muestran la distribucin de subpoblaciones de clulas madre en un ciclo del cultivo
sincronizado (Rieseberg, M., et.al.; 2001).

Caractersticas celulares Componentes celulares

Tamao DNA
Granularidad del citoplasma RNA
Forma de la clula Protena (total)
Potencial de membrana Lpidos
pH intracelular Antgenos
Viabilidad Actividad enzimtica
Autofluorescencia Carbohidratos de superficie
Estado Redox intracelular Receptores de superficie
Contenido de PHB
Calcio intracelular
Contenido de ergosterol
Tabla 1. Caractersticas y componentes celulares que pueden determinarse va FACS (Rieseberg, M., et.al.;
2001)

La mayora de las aplicaciones de la citometra de flujo se basan en el monitoreo de la

fluorescencia. Los parmetros celulares que pueden medirse se caracterizan en extrnsecos o
intrnsecos, dependiendo del reactivo que se necesite. Para los ensayos de fluorescencia
intrnseca no se necesita un pretratamiento como fijacin, tincin o lavados. Los estudios
sobre componentes celulares especficos utilizando fluorforos (fluorescencia extrnseca)
requieren una tincin previa al anlisis de las clulas. En la tabla 2 se muestran los
fluorforos ms comunes para tinciones especficas en el FACS.

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 Fluorocromo Longitud de Longitud de Aplicacin principal
excitacin (nm) emisin (nm)

BCECF-AM 503 528 (pH 9.0) pH intracelular

DAPI 345 455 cidos nuclicos

DiOC6(3) 484 501 Potencial de membrana

EGFP 489 508 Productos intracelulares

FITC 495 519 Deteccin de protenas

Hoechst 33342 343 483 cidos nuclicos

Nile Red 540 610 Lpidos

PerCP 490 675 Conjugado de anticuerpos

Ioduro de Propidio 536 617 cidos nuclicos

R-Ficoeritrina 480, 565 578 Conjugado de anticuerpos

SNARF-1 AM 548 635 Potencial de membrana

Sytox Green 490 525 cidos nuclicos

Tabla 2. Fluorocromos ms utilizados en FACS, aplicacin ms comn, y longitudes de emisin y excitacin.

(Rieseberg, M., et.al.; 2001. http://www.icnet.uk/axp/facs/davies/multi.html)

Algunas de las aplicaciones ms comunes utilizando fluorforos son la viabilidad y el

estado fisiolgico, la apoptsis, el anlisis del ciclo celular y el contenido de cidos nuclicos,
el crecimiento celular y los ndices de mortalidad y la concentracin de calcio intracelular.
La concentracin de clulas viables en un cultivo es uno de los parmetros ms importantes
en la evaluacin de bioprocesos. Una de las formas de evaluar la viabilidad es determinar la
integridad de la membrana y para ello existen colorantes de exclusin o colorantes de
retencin. Los colorantes de exclusin tien los cidos nuclicos de las clulas con
membranas defectuosas y los de inclusin generalmente utilizan sustratos fluorescentes
que son degradados por las enzimas intracelulares y que generan productos fluorescentes.
Como indicador del estado fisiolgico puede usarse el pH intracelular ya que es un factor
importante para la regulacin de diferentes procesos celulares y para la actividad metablica
de clulas en cultivo. Existen derivados de diacetato de fluorescena y ciertos sustratos
fluorescentes que se utilizan para medir el pH intracelular como el BCECF-AM y la
Calcena-AM. Otro indicador de dao celular es el potencial de membrana. Los cambios de

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intensidad de la fluorescencia relacionada al potencial de membrana se han utilizado para
detectar e indicar dao fisiolgico en bacterias (Rieseberg, M., et.al.; 2001).

En los estudios sobre apoptosis, se han utilizado conjugados fluorescentes de Anexina-V ya

que este anticoagulante es una protena que se une a fosfolpidos, especialmente a fosfatidil
serina. Uno de los indicadores de apoptosis es la externalizacin de fosfatidil serina porque
este fosfolpido se encuentra en la cara interna de la membrana de clulas normales,
mientras que en clulas apoptticas se transloca hacia la cara externa. De esta manera, la
diferencia en intensidad de fluorescencia de los complejos de anexina-V fosfatidil serina
entre clulas apoptticas y normales puede detectarse por medio del FACS. Para el estudio
del ciclo celular, se utilizan colorantes para cidos nuclicos como el ioduro de propidio, el
Sytox Green, Hoechst, etc. En aplicaciones biotecnolgicas, el anlisis del ciclo celular y de
RNA se han utlizado para monitorear el estado fisiolgico y el comportamiento de
crecimiento de varios microorganismos en cultivo. Los ndices de crecimiento celular
pueden medirse usando bromodeoxiuridina (BrdU anlogo de Timidina) y una tincin
con ioduro de propidio. Las clulas que estn sintetizando DNA incorporan BrdU y con
anticuerpos fluorescentes especficos contra esta base se hace la deteccin. Despus de eso, se
hace una tincin con ioduro de propidio para medir el contenido total de DNA. Los ndices
de mortalidad de una poblacin pueden determinarse usando un mtodo basado en la
exclusin de ioduro de propidio segn la integridad de la membrana. Con respecto a la
concentracin de calcio intracelular, se han desarrollado colorantes para medir calcio y su
aplicacin ha sido principalmente clnica (Rieseberg, M., et.al.; 2001). En general, hay un
gran nmero de aplicaciones del FACS para el rea de biotecnologa y se resumen en la
tabla 3.

Aplicaciones nfasis Microorganismo/

Clula
Contenido de DNA Control de productividad CHO
( ciclo celular) Control de productividad BHK
Investigacin de Mecanismos S. cerevisiae
Relacin Ciclo celular/IgG de superficie Hibridoma
Proliferacin S. cerevisiae

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 pH intracelular Estudios de apoptsis Hibridoma
Validacin de metodologas Hibridoma
Tamao celular Monitoreo del cultivo S. cerevisiae
Monitoreo del cultivo E. coli
Estudios de apoptosis Clulas de mamfero
Contenido de RNA Produccin de goma Xantana Xantomonas campestris
Protena total Monitoreo del cultivo s. cerevisiae
Produccin de goma Xantana X. campestris
Investigacin de PHB Limitacin y exceso de sustrato Ralstonia eutropha
Acetinobacter calcoacetius
Methylobacterium rhodesianum
Productos intracelulares Optimizacin de la produccion de Ab Hibridoma
Comparacin de GFP mutantes CHO
Apoptosis Anexina-V CHO
Calcio Intracelular Toxicidad H2Os Lineas celulares de mamfero
Potencial de membrana Pruebas de dao en bacterias Acinetobacter calcoaceticus
Comparacin de diferentes cromforos para el U937
potencial de membrana mitocondrial
Viablilidad Esterasa Linfocitos
Pruebas de suceptibilidad a antibiticos Bacterias
Efecto de metales pesados A. johnsonii
Limitacin de glucosa E. coli
Tabla 3. Resumen de aplicaciones del FACS en el rea de biotecnologa (Rieseberg, M., et.al.; 2001)

De 1972 a la fecha, se han ampliado las aplicaciones del FACS y han dado base a nuevas
ideas como es la tecnologa de las microesferas o el MACS (Magnetic-Activated Cell
Sorting). Adems de clulas se pueden analizar microesferas, o micropartculas, que lleven
un marcaje fluorescente. Estas microesferas se utilizaron en un principio para estudiar la
fagocitsis de macrfagos y ahora se utilizan para detectar protenas virales, como
estndares de calibracin para anlisis cuantitativos y para estudios de cintica enzimtica
en tiempo real. Como la mayora de las microesfras son paramagnticas, se pueden
inmobilizar en un campo magntico fuerte (MACS) y durante el tiempo que estn
inmobilizadas dan tiempo a procesos de lavado o liberacin de sustancias, lo que es
interesante para el estudio de cidos nuclicos y otros componentes(Wedemeyer, N., et.al.;
2001. Scheffold, A., et.al.; 2000).

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De 1968 a la fecha, el FACS ha crecido como instrumento y como mtodo gracias al impulso
que han dado los usuarios de esta tecnologa. Este aparato, que meda slo tres parmetros y
era usado slo en la inmunologa, ahora ha llegado a niveles de complejidad que parecen
difciles de superar, ya que pueden medirse hasta 13 parmetros diferentes y ha encontrado
aplicaciones en casi todas las reas de la biotecnologa. De hecho, las nuevas aplicaciones
estn limitadas por la imaginacin de los investigadores y por el desarrollo de nuevos
anticuerpos, fluorforos y sustratos fluorescentes que permitan detectar nuevos
componentes celulares. En definitiva, las ventajas que ofrece el FACS en cuanto a la
separacin de componentes subcelulares o subpoblaciones celulares son difciles de superar
ya que, adems de hacer la separacin fsica de las clulas de inters, se puede hacer una
medicin cuantitativa y multiparamtrica de ciertas caractersticas celulares en una
mezcla compleja y estadsticamente adecuada de clulas. En general, el FACS es una
herramienta muy til que puede dar muchos ms datos sobre las poblaciones celulares y que
no ha llegado al lmite de su aplicabilidad.

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Bibliografa
Beckton Dickinson Immunocytometry Systems. 1995. FACS Training Manual.
Modulos: 1, 5-6.
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