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BIOQUMICA DE LOS
MICROORGANISMOS

RAMON PARS I FARRS


Catedrtico de Microbiologa de la Universitat de Barcelona
ANTONIO JUREZ GIMNEZ
Catedrtico de Microbiologa de la Universitat de Barcelona

EDITORIAL REVERT, S. A.
Barcelona - Bogot - Buenos Aires - Caracas - Mxico
INTRODUCCIN

UNA TEORA DE LOS MICROBIOS EN CULTIVO PURO

Este libro de Bioqumica de los microorganismos se enmarca delibe-


radamente dentro de una abstraccin, la cual comprende la conside-
racin exclusiva del cultivo puro, un crecimiento balanceado de la
biomasa microbiana como un tipo de catalizador particular y unos
cambios denidos de composicin del medio de cultivo, incluyendo
tanto el medio propiamente dicho como la atmsfera circundante. En
el contexto de esta abstraccin puede desarrollarse un discurso razo-
nablemente coherente de una gran parte de lo que sabemos de los
microorganismos en cuanto a su diversidad y actividad qumica. El
desarrollo de esta abstraccin es el resultado de una estrategia que
persigue una comprensin del sistema microbio-medio que pueda
servir de base para abordar cualquier otro aspecto del desarrollo
microbiano, partiendo de unos conocimientos directamente compro-
bables que estructuran una teora de los microbios en cultivo puro.
Como puede verse al examinar el ndice de este libro, esta teora
comprendera la cintica del crecimiento de la biomasa microbiana
(parte B, captulo 3), la generacin de productos en el medio (C y H) y
la intervencin de oxidantes y reductores presentes en el mismo (D, E
y F), incluyendo la utilizacin de los compuestos C1 (E, captulo 19) y
la utilizacin y produccin de energa radiante (G). La parte A y lo
relativo a la composicin qumica de la parte B (captulo 2) pueden
considerarse introductorias.
Una vez redactado el texto se ha considerado til aadir los Apn-
dices A y B, que constituyen un complemento para facilitar la com-
prensin de la obra. Por una parte, el Apndice A es un corolario de la
teora del cultivo puro de microorganismos. Quizs con l pueda
entenderse mejor que los grandes y complejos mapas metablicos no
son esenciales para el microbilogo realmente interesado por la acti-
vidad qumica que tiene lugar en los diferentes cultivos que obtiene y
VI maneja. Por otra parte, las lminas a color del Apndice B pretenden
INTRODUCCIN ser una ayuda tanto para relacionar diferentes vas metablicas o gru-
pos siolgicos de microorganismos, como para mostrar estas relacio-
nes a un auditorio en un momento dado. Con esta ltima nalidad
tambin se han editado las mismas lminas en forma de transparen-
cias que pueden ser adquiridas adicionalmente al libro.
Dado el planteamiento sealado, se excluyen muchos otros aspec-
tos, como los relativos a la ecologa microbiana, la biosntesis y la
gentica de poblaciones. El mismo metabolismo de las reservas y la
formacin de metabolitos secundarios se tratan slo marginalmente,
as como los sistemas de regulacin metablica. Este estudio se basa
fundamentalmente en aquellas propiedades fenotpicas de los micro-
bios que determinan los cambios qumicos del medio cuando crecen
en cultivo puro, dejando otros muchos aspectos en segundo plano.
Por lo tanto, recoge como un todo lo que solamente constituye un
aspecto parcial de la biologa microbiana. Un tratamiento anlogo en
un marco ms amplio tomara una envergadura excesiva, tanto para
el objetivo establecido por los autores como para su propia capacidad.
El prerrequisito para la comprensin de esta Bioqumica de los
microorganismos es efectivamente el conocimiento de una microbio-
loga general y el de una bioqumica bsica. Consecuentemente, est
situado a nivel de los segundos y terceros ciclos de la actual enseanza
universitaria en varias de sus ramas, como pueden ser los estudios de
Biologa, Qumica, Medicina, Farmacia y Veterinaria. Especcamente,
est pensado para que sea de inters para los alumnos que cursan la
Licenciatura de Bioqumica u otras carreras ms o menos anes.
Este libro no ha nacido in vacuo. En realidad slo se ha escrito como
consecuencia de una historia determinada que posiblemente es su ver-
dadera justicacin. Todo comenz en la dcada de los cincuenta,
cuando la enseanza de la microbiologa estaba vinculada al mundo de
las enfermedades infecciosas o bien a la siologa vegetal, quizs con la
importante excepcin de la escuela de Delf. De hecho, es en esa poca
cuando, junto a grandes avances experimentales, se llega a un conven-
cimiento general de la importancia del microbio para los problemas
fundamentales de la biologa, as como para toda la economa del hom-
bre. Es el periodo en el que, gracias a los trabajos de J. Buder, se
empieza a comprender la siologa de las bacterias rojas del azufre,
dentro de la duda de si eran verdaderas fotosintticas como haba
sugerido Engelmann, o si se trataba de un tipo particular pigmentado
de bacterias quimiosintticas oxidadoras del azufre, como las descu-
biertas por Winogradsky. En realidad en los aos cincuenta todava
sabamos relativamente poco, tanto de la fotosntesis bacteriana como
de la misma jacin autotrca de CO2, pero ya se haba llegado al
convencimiento de que el rasgo general de las reacciones metablicas
era la transhidrogenacin, lo cual haca suponer que el sulfuro de
hidrgeno actuara en las bacterias rojas del azufre como un reductor,
de forma anloga a la funcin del agua en la fotosntesis vegetal.
En los aos cincuenta se saba bastante de las fermentaciones y de
la oxidacin de los hidratos de carbono. Sin embargo, es justamente
cuando F. Lynen da las pruebas concluyentes de la condensacin del VII
acetato activo para la formacin de los cidos grasos, cerrando una UNA TEORA DE LOS MICROBIOS EN
serie de estudios, entre los que destacaban los trabajo llevados a cabo CULTIVO PURO
por Lipmann y Barker, donde los resultados obtenidos en el msculo
y con los microorganismos llegaron a una feliz conjuncin, constitu-
yendo un brillante captulo de lo que dentro del estilo del pensa-
miento de la poca se llam bioqumica unitaria.
En el contexto referido, fue durante este tiempo cuando el autor
de estas lneas empez a trabajar en varios aspectos de la bioqumica
de la levadura, especialmente en el transporte de glucosa a travs de la
membrana, y en la formacin y utilizacin del glucgeno. Trabajar
con la levadura para iniciarse en la Bioqumica de los microorganis-
mos era obligado, por cuanto todo haba empezado con este micro-
organismo y, a travs de casi un siglo, la mitad de lo que se haba
llegado a saber lo habamos aprendido trabajando con levaduras.
Fue hacia nales de la dcada de los cincuenta cuando casual-
mente se encomend al que suscribe la traduccin al castellano del
captulo Bacterial metabolism de la McGraw-Hill Encyclopedia of
Science and Technology, escrito por C. B. van Niel. Casi al mismo
tiempo, por sugerencia de uno de sus profesores en la Facultad de
Ciencias de la Universidad de Barcelona, ley The Microbes Contri-
bution to Biology, la edicin de un clebre curso dado por A. J. Klu-
yver y C. B. van Niel. Estas dos lecturas son la raz profunda del
presente libro, cuyo efecto es patente todava en sus pginas, a pesar
de los treinta y cinco aos transcurridos. De hecho, como despus se
ha podido comprobar, la obra referida en segundo lugar ha marcado a
muchos microbilogos de toda una generacin en el mundo entero.
Desde 1960 a 1964 la Academic Press public los cinco volme-
nes sobre The Bacteria. A Treatise on Structure and Function, bajo
la direccin de I. C. Gunsalus y Roger Y. Stanier, los cuales constitu-
yen un hito en la historia de la literatura microbiolgica. Esta obra es
indudablemente otra fuente bsica que podra citarse en casi todos los
captulos del presente libro.
La referencias bibliogrcas que se acaban de referir constituyeron el
fundamento sobre el que se desarroll el curso de Metabolismo bacte-
riano (Ampliacin de Microbiologa) de la Licenciatura de Biologa en la
Universidad de Barcelona durante toda la dcada de los sesenta. No obs-
tante, los trabajos de investigacin que se iban llevando a cabo paralela-
mente, principalmente sobre las bacterias del cido actico y las
bacterias del cido frmico, dejaron una huella indiscutible en la ense-
anza, como posteriormente ocurrira como consecuencia de los traba-
jos sobre bacterias del gas detonante, sobre la utilizacin de materia
orgnica por Chlorella y sobre Bidobacterium. Las grandes revisiones, las
lecturas de artculos especializados y la misma discusin personal tuvie-
ron tambin su repercusin sobre las sucesivas reestructuraciones del
curso de Metabolismo bacteriano que sigui en la dcada de los
setenta. Precisamente fue en este tiempo cuando el Bacterial Metabo-
lism de H. W. Doelle (1975) contribuy especialmente a una nueva y
profunda reestructuracin y ampliacin del programa del curso referido.
VIII Tambin la obra de Gottschalk sobre el mismo ttulo, menos
INTRODUCCIN extensa pero ms didctica, fue especialmente tenida en cuenta para
que, nalmente, se llegara a redactar un extenso curso de metabo-
lismo bacteriano, que con el ttulo de Ampliacin de microbiologa
I: Actividad qumica, se public en 1982 por Edicions de la Univer-
sitat de Barcelona.

FUENTES BIBLIOGRFICAS BSICAS


KLUYVER, A. J. y VAN NIEL, C. B. The Microbes contributions to Biology. Cam-
bridge (Mass.), 1956.
VAN NIEL, C. B. Metabolismo bacteriano. Enciclopedia Salvat de la Ciencia y la
Tecnologa. Vol. 8. Salvat, S. A. Barcelona, 1964.
GUNSALUS, I. C. y STANIER, R. Y. The Bacteria. A Treatise on Structure and
Function. (5 vol.) Academic Press. New York, 1960-1964.
DOELLE, H. W. Bacterial Metabolism. Academic Press. London and New York
(2nd edition), 1975.
GOTTSCHALK, G. Bacterial metabolism. Springer-Verlag. New York, 1985.
PARES, R. Ampliacin de microbiologa I: Actividad Qumica. Edicions de la Uni-
versitat de Barcelona, 1982.

GNESIS DEL PRESENTE TEXTO


La reforma de los planes de estudios universitarios de los aos
noventa y la creacin de la Licenciatura de Bioqumica han hecho
repensar la materia impartida durante tantos aos para dar forma a
este texto, centrado en un campo ms restringido, y con una estructu-
racin diferente. Como es obvio, se han incorporado los conocimien-
tos obtenidos en los ltimos diez aos a partir de las fuentes que se
indican especcamente en cada captulo. Para el resto, puede servir
lo que acabo de sealar ms arriba.
El Prof. A. Jurez, primero brillante alumno y colaborador, y despus
excelente profesor de microbiologa ha sido determinante para tomar
la decisin de llevar a cabo el replanteamiento aludido y la elaboracin
conjunta del presente texto. Este hecho podra considerarse natural
dadas las circunstancias de nuestra cooperacin en la enseanza del
metabolismo microbiano y la naturaleza misma de su currculum
investigador, especialmente en su primera etapa de Barcelona, antes de
sus interesantes trabajos sobre regulacin de la expresin gnica. Des-
graciadamente, estos ltimos se hallan en el contexto de una historia
diferente a la que ha servido para disear esta Bioqumica de los
microorganismos. No obstante, se est en el convencimiento de que la
participacin de dos autores de diferente generacin es extraordinaria-
mente positiva para dibujar, aunque sea parcialmente, una etapa de la
evolucin de nuestro conocimiento de los microbios tan activa como
la correspondiente a los ltimos cincuenta aos.
Los autores quieren manifestar su agradecimiento a la Dra. Merce-
des Mourio por su ayuda en la revisin del texto original as como a
la Editorial Revert por su inters en la publicacin de este libro y la
ecaz labor realizada por su competente equipo tcnico.

Ramon Pars
NDICE ANALTICO

INTRODUCCIN V

UNA TEORA DE LOS MICROBIOS EN CULTIVO PURO V


FUENTES BIBLIOGRFICAS BSICAS VIII
GNESIS DEL PRESENTE TEXTO VIII

PARTE A: EL METABOLISMO MICROBIANO 1

CAPTULO 1: INTEGRACIN DE LA TOTALIDAD DE LAS


TRANSFORMACIONES QUMICAS DE LA BIOFASE 3

1.1 LA QUMICA DEL CULTIVO PURO 4


1.2 ACTIVIDAD QUMICA Y GRUPOS TAXONMICOS 5
1.3 LA ACTIVIDAD DE LA BIOFASE 6
1.4 EL SUMINISTRO ENERGTICO 7
1.5 LA REGULACIN METABLICA 9
1.6 EL PRINCIPIO DE LA BIOQUMICA UNITARIA 10

PARTE B: COMPOSICIN QUMICA Y CRECIMIENTO DE


LA BIOMASA MICROBIANA 13

CAPTULO 2: COMPOSICIN QUMICA 15

2.1 LA PRODUCCIN DE BIOMASA 16


2.2 CONTENIDO DE AGUA DE LA BIOFASE 17
2.3 COMPOSICIN ELEMENTAL 18
2.4 FRACCIN CIDO-SOLUBLE 18
2.5 PROTENAS 19
2.6 CIDOS NUCLEICOS 19
X 2.7 LPIDOS 20
2.8 HIDRATOS DE CARBONO 20
NDICE ANALTICO
2.9 MOLCULAS EXCLUSIVAS DE LAS BACTERIAS 21
2.10 OTROS COMPONENTES MOLECULARES DE LA BIOMASA
MICROBIANA 25
2.11 CONCLUSIONES GENERALES SOBRE LA COMPOSICIN QUMICA DE
LA BIOFASE 27
BIBLIOGRAFA 27

CAPTULO 3: CINTICA DEL CRECIMIENTO 29

3.1 CULTIVO DISCONTINUO (BATCH CULTURE) 30


3.2 CULTIVO CONTINUO 34
BIBLIOGRAFA 36

PARTE C: PRODUCTOS FINALES DEL


CATABOLISMO 37

CAPTULO 4: ETANOL 39

4.1 LAS LEVADURAS 40


4.2 ALGUNAS REFERENCIAS HISTRICAS SOBRE LA CONTRIBUCIN DE
LAS LEVADURAS A LA BIOQUMICA 42
4.3 EFECTO PASTEUR 43
4.4 CULTIVO, SISTEMAS CELULARES Y EXTRACTOS 44
4.5 FERMENTACIONES DE LA GLUCOSA 45
4.5.1 Fermentacin alcohlica 45
4.5.2 Fermentacin glicrica con sulfito 47
4.5.3 Fermentacin aceto-glicrica 47
4.5.4 Fermentacin pirvico-glicrica 48
4.6 ACEITE DE FUSEL Y CIDO SUCCNICO 48
4.7 DESARROLLO AEROBIO 50
4.8 ASIMILACIN OXIDATIVA Y FERMENTATIVA DE LA GLUCOSA 50
4.9 FERMENTACIN ENDGENA 52
BIBLIOGRAFA 52

CAPTULO 5: CIDO ACTICO 53

5.1 EL VINAGRE 54
5.2 CARACTERSTICAS GENERALES DE LAS BACTERIAS DEL CIDO
ACTICO 55
5.3 CINTICA DE LA PRODUCCIN DE ACETATO 56
5.4 OXIDACIN DEL ETANOL 60
5.5 OXIDACIN DE ALCOHOLES PRIMARIOS 61
5.6 CETOGNESIS 62
5.7 OXIDACIN DE POLIALCOHOLES 62
5.8 OXIDACIN DE LOS CIDOS LCTICO Y PIRVICO 63
5.9 OXIDACIN DE AZCARES 63
5.9.1 El sistema de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 63
5.9.2 Va de Entner-Doudoroff 64
5.9.3 Ciclo de la hexosa monofosfato o va de Warburg-Dickens 66
5.9.4 Formacin de gluconato 66 XI
5.9.5 Utilizacin del gluconato 69
NDICE ANALTICO
5.9.6 El sistema de las fosfocetolasas 69
5.10 MODELOS DEL METABOLISMO OXIDATIVO DE LAS BACTERIAS DEL
CIDO ACTICO 71
5.11 FORMACIN DE CELULOSA 71
BIBLIOGRAFA 72

CAPTULO 6: CIDO LCTICO 73

6.1 EL CIDO LCTICO COMO PRODUCTO DE FERMENTACIN 74


6.2 CARACTERSTICAS GENERALES DEL GRUPO LCTICO 74
6.3 FERMENTACIONES LCTICAS DE HEXOSAS Y PENTOSAS 77
6.4 BALANCES DE FERMENTACIN 79
6.5 FERMENTACIONES LCTICAS DE LA FRUCTOSA 82
6.6 FERMENTACIN LCTICA DE LA DESOXIRRIBOSA 83
6.7 COFERMENTACIN DE LA LACTOSA Y LA TREONINA 83
6.8 FERMENTACIN DEL MALATO 85
6.9 FERMENTACIN LCTICA DEL TARTRATO 86
BIBLIOGRAFA 87

CAPTULO 7: CIDO PROPINICO 89

7.1 EL CIDO PROPINICO COMO PRODUCTO DE


FERMENTACIN 90
7.2 REACCIN DE SWICK Y WOOD 91
7.3 FERMENTACIN PROPINICA DEL LACTATO 91
7.3.1 Va metablica de Propionibacterium y Veillonella 91
7.3.2 Formacin de propionato en C. propionicum y Megasphaera
elsdenii 91
7.4 FERMENTACIN PROPINICA DE LA GLUCOSA 92
BIBLIOGRAFA 94

CAPTULO 8: CIDO BUTRICO 95

8.1 PRODUCCIN DE CIDO BUTRICO Y DE DISOLVENTES NEUTROS


POR FERMENTACIN: PERSPECTIVA HISTRICA 96
8.2 VAS METABLICAS UTILIZADAS POR LAS BACTERIAS DEL CIDO
BUTRICO 97
8.3 FORMACIN DE ACETATO POR FERMENTACIN DE SUSTRATOS
ORGNICOS 99
8.4 FORMACIN DE ACETATO POR REDUCCIN DIRECTA DE
CO2 101
8.5 BACTERIAS ACETGENAS 103
8.6 LA VA DE WOOD PARA LA FIJACIN AUTOTRFICA DE CO2 103
8.7 LA GENERACIN DE ENERGA EN LAS BACTERIAS
ACETGENAS 106
8.8 OTRAS VAS METABLICAS UTILIZADAS POR LAS BACTERIAS
ACETGENAS 107
8.8.1 Sistemas dependientes del tetrahidrofolato 107
8.8.2 Reduccin indirecta del CO2 107
8.9 FERMENTACIN DEL ETANOL POR Clostridium kluyveri 108
8.10 FORMACIN DE BUTIRATO A PARTIR DE GLUCOSA 109
8.11 FORMACIN DE ACETONA Y BUTANOL 110
XII 8.12 OTROS PRODUCTOS FINALES DE FERMENTACIN PRODUCIDOS POR
LAS BACTERIAS DEL CIDO BUTRICO 110
NDICE ANALTICO
8.13 PRODUCCIN DE SUCCINATO POR MICROORGANISMOS 112
BIBLIOGRAFA 114

CAPTULO 9: CIDO FRMICO 115

9.1 EL GRUPO ENTRICO 116


9.2 EL DESARROLLO DE LA BIOLOGA DE Escherichia coli 119
9.3 LA FERMENTACIN CIDO MIXTA 121
9.3.1 Formacin de etanol 122
9.3.2 Formacin de acetato 124
9.3.3 Formacin de CO2 y H2 a partir del formiato 124
9.3.4 Formacin de succinato 125
9.3.5 Formacin del lactato 125
9.4 LA FERMENTACIN 2,3-BUTILENGLICLICA 127
9.4.1 Formacin de acetona 127
9.4.2 Formacin de 2,3-butanodiol (2,3-butilenglicol) 129
9.5 FORMACIN DE TRIMETILENGLICOL 130
BIBLIOGRAFA 131

CAPTULO 10: AMONACO 133

10.1 CLOSTRIDIOS PUTREFACTIVOS 134


10.2 FERMENTACIONES DE UN SOLO AMINOCIDO 134
10.2.1 Arginina 135
10.2.2 Histidina y cido glutmico 136
10.2.3 Glicina 137
10.2.4 Serina 138
10.2.5 Treonina 138
10.2.6 Triptfano 139
10.2.7 Lisina 139
10.2.8 Ornitina 141
10.2.9 Cistena y metionina 141
10.3 DESCARBOXILACIN DE AMINOCIDOS 142
10.4 FERMENTACIN ACOPLADA DE DOS AMINOCIDOS 142
10.5 FERMENTACIN DE UN AMINOCIDO JUNTO A UN
CETOCIDO 145
10.6 FERMENTACIN DE LA PURINA 147
10.7 FERMENTACIN DE LA PIRIMIDINA 147
10.8 FERMENTACIN DE LA ALANTONA 149
10.9 FERMENTACIN DEL CIDO NICOTNICO 149
BIBLIOGRAFA 149

CAPTULO 11: METANO 151

11.1 BACTERIAS METANGENAS 152


11.2 REDUCCIN DEL DIXIDO DE CARBONO 155
11.3 EL SISTEMA DE LA METILREDUCTASA 157
11.4 LA PRODUCCIN DE ENERGA 159
BIBLIOGRAFA 159
CAPTULO 12: DIXIDO DE CARBONO 161 XIII

NDICE ANALTICO
12.1 EL GAS SILVESTRE 162
12.2 EL CO2 COMO CATABOLITO 163
12.3 EL CICLO DE LOS CIDOS TRICARBOXLICOS (CAT) 163
12.4 SISTEMAS ENZIMTICOS DEL CAT 164
12.5 ESTEQUIOMETRA DEL CICLO 167
12.6 REACCIONES ANAPLERTICAS 168
12.7 CICLO DEL CIDO GLIOXLICO 170
BIBLIOGRAFA 171

PARTE D: OXIDANTES INORGNICOS 173

CAPTULO 13: OXGENO MOLECULAR 175

13.1 RESPIRACIN AEROBIA 176


13.2 ASIMILACIN DE O2 177
13.3 OXIDASAS Y PEROXIDASAS 178
13.4 SUPERXIDO DISMUTASA Y CITOCROMO c PEROXIDASA 179
13.5 LAS FLAVOPROTENAS AUTOOXIDABLES 179
13.6 BALANCE ENERGTICO DE LAS REACCIONES OXIDATIVAS 180
13.7 LA CADENA RESPIRATORIA 181
13.8 FOSFORILACIN OXIDATIVA 188
BIBLIOGRAFA 189

CAPTULO 14: NITRATO 191

14.1 DESNITRIFICACIN Y RESPIRACIN DEL NITRATO 192


14.2 BACTERIAS DESNITRIFICANTES 193
14.3 FISIOLOGA Y BIOQUMICA DE LA DESNITRIFICACIN 194
14.4 LA RESPIRACIN DEL NITRATO EN LAS BACTERIAS
FACULTATIVAS 195
14.4.1 Catabolismo de la glucosa 196
14.4.2 Respiracin del nitrato y fermentacin 197
14.4.3 Ciclo de los cidos tricarboxlicos (CAT) 197
14.4.4 Respiracin anaerobia 198
14.4.5 Mutantes clorato resistentes 198
14.4.6 Metabolismo del nitrito 198
BIBLIOGRAFA 199

CAPTULO 15: SULFATO 201

15.1 REDUCTORES DE SULFATO Y BACTERIAS SULFURGENAS 202


15.2 REDUCCIN DEL SULFATO CON LACTATO 204
15.3 HIDROGENASAS Y TRANSPORTADORES DE ELECTRONES 205
15.4 REDUCCIN DEL SO42 CON H2 205
15.5 METABOLISMO DEL CARBONO EN LOS SULFATO
REDUCTORES 208
15.6 BISULFITO REDUCTASAS 210
BIBLIOGRAFA 211
XIV PARTE E: REDUCTORES ORGNICOS Y
NDICE ANALTICO COMPUESTOS C1 213

CAPTULO 16: COMPUESTOS ALIFTICOS 215

16.1 ATAQUE PRIMARIO DE LAS FUENTES ORGNICAS DE PODER


REDUCTOR 216
16.2 OXIDACIN DE ALCANOS Y ALQUENOS 216
16.3 SISTEMA DE LA -HIDROXILASA 218
16.4 OXIDACIN DE LOS CIDOS GRASOS 218
16.5 LA -OXIDACIN 218
16.6 LA -OXIDACIN 219
16.7 FORMACIN DE PROPIONIL-CoA 220
16.8 OXIDACIN A -HIDROXICIDOS 221
BIBLIOGRAFA 222

CAPTULO 17: COMPUESTOS AROMTICOS 223

17.1 PROCESOS AEROBIOS Y ANAEROBIOS 224


17.2 CARACTERSTICAS GENERALES DE LA DEGRADACIN
AEROBIA 224
17.3 LA ORTO-RUPTURA DEL ANILLO BENCNICO 224
17.4 LA META-RUPTURA DEL ANILLO BENCNICO 226
17.5 OXIDACIN DEL GENTISATO 228
17.6 OXIDACIN DEL D-MANDELATO Y OTROS PRECURSORES DEL
CATECOL 229
17.7 OXIDACIN DEL p-HIDROXIBENZOATO Y OTROS PRECURSORES DEL
CIDO PROTOCATQUICO 231
17.8 RELACIN ENTRE LAS DISTINTAS VAS DE OXIDACIN AEROBIAS DE
LOS COMPUESTOS AROMTICOS 232
17.9 INDUCCIN DE LOS ENZIMAS IMPLICADOS EN LA DEGRADACIN DE
COMPUESTOS AROMTICOS 233
17.10 DEGRADACIN ANAEROBIA DE COMPUESTOS
AROMTICOS 234
17.10.1 Obtencin de metabolitos centrales a partir de intermediarios
activados 236
17.10.2 Fotometabolismo anaerobio 237
17.10.3 Catabolismo por desnitrificantes 238
17.10.4 Fermentacin 239
17.10.5 Degradacin por reductores de sulfatos 239
17.10.6 Metabolismo en condiciones metanognicas 239
BIBLIOGRAFA 240

CAPTULO 18: COMPUESTOS NITROGENADOS 241

18.1 DIGESTIN DE PROTENAS Y PPTIDOS 242


18.2 DEGRADACIN OXIDATIVA DE LOS AMINOCIDOS 242
18.2.1 Aminocido oxidasas 242
18.2.2 Deshidrogenasas 243
18.2.3 Aspartasa 243
18.3 OXIDACIN DE LA HISTIDINA 243
18.4 OXIDACIN DE LA HIDROXIPROLINA 244
18.5 OXIDACIN DEL TRIPTFANO 245 XV
18.6 OXIDACIN DE LA TREONINA 248
NDICE ANALTICO
18.7 OXIDACIN DE PURINAS Y PIRIMIDINAS 249
18.8 OXIDACIN DE LA VITAMINA B6 251

CAPTULO 19: COMPUESTOS C1 COMO SUSTRATOS 253

19.1 CRECIMIENTO SOBRE COMPUESTOS DE UN SOLO TOMO DE


CARBONO 254
19.2 CICLO REDUCTOR DE LAS PENTOSAS 254
19.3 UTILIZACIN DEL FORMIATO POR EL CICLO DE CALVIN 257
19.4 CICLO REDUCTOR DEL CIDO TRICARBOXLICO 258
19.5 FIJACIN DE CO2 EN CHROMATIUM 259
19.6 BACTERIAS METILOTROFAS 260
19.7 OXIDACIN DEL METANO 263
19.8 VAS DE LA RIBULOSA-5-P Y DE LA SERINA 265
19.9 CRECIMIENTO SOBRE METILAMINA 267
BIBLIOGRAFA 268

PARTE F: REDUCTORES INORGNICOS 269

CAPTULO 20: COMPUESTOS REDUCIDOS DE NITRGENO 271

20.1 QUIMIOLITOTROFISMO 272


20.2 LAS BACTERIAS NITRIFICANTES 273
20.3 EL GRUPO NITROSO 274
20.4 EL GRUPO NITRO 276
20.5 OBTENCIN DEL PODER REDUCTOR POR LAS BACTERIAS
QUIMIOLITOTROFAS 278
20.6 EFECTO DE LA MATERIA ORGNICA SOBRE LAS BACTERIAS
NITRIFICANTES 278
BIBLIOGRAFA 280

CAPTULO 21: COMPUESTOS DE HIERRO Y DE AZUFRE 281

21.1 OXIDACIN DEL HIERRO 282


21.2 OXIDACIN DE COMPUESTOS REDUCIDOS DE AZUFRE 285
21.3 CRECIMIENTO AUTOTRFICO, MIXOTRFICO Y
HETEROTRFICO 285
21.4 VAS DE OXIDACIN DE LOS COMPUESTOS REDUCIDOS DE
AZUFRE 286
21.5 CADENAS RESPIRATORIAS EN LOS TIOBACILOS. GENERACIN DE ATP
Y DE PODER REDUCTOR 288

CAPTULO 22: HIDRGENO MOLECULAR 291

22.1 LAS BACTERIAS DEL HIDRGENO Y OTROS AUTOTROFOS


FACULTATIVOS 292
22.2 TAXONOMA DE LAS BACTERIAS DEL HIDRGENO 292
XVI 22.3 CRECIMIENTO AUTOTRFICO 293
22.3.1 Caractersticas generales del crecimiento autotrfico de las
NDICE ANALTICO
bacterias del H2 293
22.3.2 El sistema de la hidrogenasa 294
22.3.3 Asimilacin del CO2 295
22.4 ASIMILACIN DEL NITRGENO 296
22.5 CRECIMIENTO MIXOTRFICO 296
22.6 OXIDACIN DEL MONXIDO DE CARBONO 297
22.7 OXIDACIN DEL H2 EN PARACOCCUS DENITRIFICANS 297
22.8 OXIDACIN DEL HIDRGENO EN DESULFOVIBRIO 298
BIBLIOGRAFA 299

PARTE G: ENERGA RADIANTE 301


CAPTULO 23: FOTOFOSFORILACIN Y
FOTOMETABOLISMO 303

23.1 FOTOSNTESIS VEGETAL Y FOTOSNTESIS BACTERIANA. PERSPECTIVA


HISTRICA 304
23.2 FOTOSNTESIS OXIGNICA Y ANOXIGNICA EN EL MUNDO
MICROBIANO 307
23.3 GRUPOS DE BACTERIAS FOTOTROFAS 307
23.4 BACTERIAS PRPURA 308
23.5 BACTERIAS VERDES 311
23.6 FISIOLOGA DEL CRECIMIENTO FOTOTRFICO EN LAS BACTERIAS
PRPURA Y VERDES 311
23.7 LA FOTOSNTESIS DE LAS CIANOBACTERIAS 313
23.8 EL FOTOMETABOLISMO DE LAS HALOBACTERIAS 317
23.9 BIOLUMINISCENCIA EN LAS BACTERIAS 318
BIBLIOGRAFA 320

PARTE H: METABOLISMO SECUNDARIO 321


CAPTULO 24: METABOLITOS SECUNDARIOS: COMPOSICIN,
PRODUCCIN Y ACTIVIDAD 323

24.1 DEFINICIN Y CARACTERSTICAS DEL METABOLISMO


SECUNDARIO 324
24.2 TIPOS DE METABOLITOS SECUNDARIOS 326
24.2.1 Composicin qumica 326
24.2.2 Actividad 329
24.3 FUNCIONES DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS 331
24.4 REGULACIN DEL METABOLISMO SECUNDARIO 333
24.4.1 Cintica de formacin de los metabolitos secundarios 333
24.4.2 Induccin y represin de la sntesis de metabolitos
secundarios 335
24.4.3 Gentica del metabolismo secundario. Superproduccin de
metabolitos secundarios 337
24.5 MACROMOLCULAS ESPECFICAS COMO METABOLITOS
SECUNDARIOS 338
BIBLIOGRAFA 338
APNDICE 339 XVII

NDICE ANALTICO
APNDICE: GRUPOS FISIOLGICOS Y DIVERSIDAD
BACTERIANA 341

A.1 EL TIPO CULTURAL COMO PIEZA BSICA DEL TRABAJO


BIOQUMICO 342
A.2 LA IDEALIZACIN DE LAS VAS METABLICAS Y LA UNIDAD DE LA
ACTIVIDAD QUMICA DEL CULTIVO PURO 343
A.3 GRUPOS FISIOLGICOS Y TAXONOMA 344

NDICE ALFABTICO DE MATERIAS Y AUTORES 347

NDICE ALFABTICO DE MICROORGANISMOS CITADOS 363

ASPECTOS COMPARATIVOS DE DIFERENTES VAS


METABLICAS Y DE DIFERENTES GRUPOS FISIOLGICOS
MICROBIANOS 367
PARTE A
EL METABOLISMO
MICROBIANO
1 INTEGRACIN DE LA
TOTALIDAD DE LAS
TRANSFORMACIONES
QUMICAS DE LA BIOFASE

1.1 LA QUMICA DEL CULTIVO PURO 4


1.2 ACTIVIDAD QUMICA Y GRUPOS TAXONMICOS 5
1.3 LA ACTIVIDAD DE LA BIOFASE 6
1.4 EL SUMINISTRO ENERGTICO 7
1.5 LA REGULACIN METABLICA 9
1.6 EL PRINCIPIO DE LA BIOQUMICA UNITARIA 10

4 1.1 LA QUMICA DEL CULTIVO PURO


Parte A: EL METABOLISMO En condiciones naturales, los microorganismos se desarrollan en dife-
MICROBIANO
Captulo 1: INTEGRACIN DE LA
rentes hbitats y frecuentemente en poblaciones mezcladas o junto a
TOTALIDAD DE LAS otros seres vivos. Sin embargo, la mayor parte de la informacin que
TRANSFORMACIONES QUMICAS DE poseemos de los microorganismos se deriva del estudio de cultivos
LA BIOFASE puros de los mismos. Sin duda, este hecho constituye una limitacin,
pero es dudoso que sin la prctica del aislamiento y mantenimiento de
lneas clonales la microbiologa hubiera llegado a constituirse como tal.
La bioqumica de los microorganismos se centra fundamental-
mente en el estudio de sistemas constituidos por una biofase reducida
a un conjunto de individuos idnticos, el medio propiamente dicho y
una fase gaseosa. En un medio constante, cualquiera de los innitos
cultivos puros que pueden obtenerse a partir del mismo aislamiento
inicial son idnticos. Este conjunto de cultivos constituyen la cepa:
cepa = C1 + C2 + C3 + ... + Cn
y, en todo caso, Cm Cn (m, sera cualquier cultivo entre C1 y Cn). En
realidad, esto slo se cumple aproximadamente, porque en ciertos casos
pueden aparecer variaciones en la descendencia clonal, y en el cultivo
discontinuo han de considerarse los efectos que las variaciones del
medio pueden tener sobre la poblacin microbiana durante su creci-
miento. Sin embargo, estos fenmenos pueden ser minimizados en la
prctica de tal modo que no se altere la validez del principio establecido.
El cultivo puro es un sistema dinmico que puede caracterizarse en
funcin del aumento de la biomasa, de la formacin de nuevos pro-
ductos que se acumulan en el medio y de la desaparicin o consumo
de componentes originales del mismo. En estos dos ltimos casos se
incluye tambin la atmsfera circundante. Todo esto se puede poner
claramente de maniesto separando las clulas y analizando el medio
y la atmsfera a lo largo del tiempo.
Existen muchas formas de medir la biomasa. Las clulas pueden
separarse por centrifugacin y lavarse para obtener luego su peso seco,
el correspondiente a una muestra del cultivo. Muchos otros mtodos,
como el del recuento celular, de la densidad ptica o del carbono total
de la fraccin celular, pueden ser utilizados de acuerdo al plantea-
miento de un determinado experimento. Tambin existe toda una
amplia metodologa analtica aplicable tanto al medio de cultivo pro-
piamente dicho como a la atmsfera que forma parte del sistema. En
este libro no se hace una descripcin sistemtica de las tcnicas de
anlisis aludidas, pero se habla de ellas con mayor o menor detalle
segn los diferentes casos, y, si es necesario un conocimiento ms pre-
ciso, se remite al lector a libros o manuales especcos. En relacin con
la evolucin de la biomasa en el cultivo puro, en este libro se conside-
ran separadamente los siguientes aspectos que pueden tener lugar
durante el desarrollo microbiano: evolucin de la biomasa micro-
biana; formacin de nuevos productos; desaparicin de sustratos
orgnicos; y transformaciones de compuestos inorgnicos. Se tratan
tambin de un modo relativamente independiente la utilizacin de
compuestos de un solo tomo de carbono y la formacin de produc-
tos especiales denominados metabolitos secundarios, los cuales no 5
tienen relacin aparente con el desarrollo de la biofase. 1.2 ACTIVIDAD QUMICA Y GRUPOS
El metabolismo microbiano tiene un alcance mayor que el com- TAXONMICOS
prendido en los temas sealados, abarcando la integracin de la totali-
dad de las transformaciones qumicas que se realizan en el microbio.
Aparte de la biosntesis y la regulacin metablica, dentro del metabo-
lismo se incluyen los fenmenos de permeabilidad, la diferenciacin
celular y molecular, el trabajo osmtico, la motilidad, los tactismos, la
luminiscencia y el mantenimiento de la forma y estructura en ausen-
cia de crecimiento. Estos aspectos, junto a la reproduccin, el creci-
miento celular y la adaptacin, son parte del metabolismo por cuanto
presuponen de algn modo determinados cambios qumicos. En todo
caso, son materias que exceden al programa desarrollado en este libro,
el cual, en lneas generales, se centra particularmente en las transfor-
maciones qumicas mayoritarias y, especialmente, en las relacionadas
con el suministro energtico.

1.2 ACTIVIDAD QUMICA Y GRUPOS TAXONMICOS

Las condiciones del cultivo y la actividad de los microorganismos die-


ren de un caso a otro. De este modo puede reconocerse una diversidad
importante de microorganismos, cada uno con caractersticas peculia-
res. Estos aspectos son relevantes en relacin con la distribucin taxo-
nmica de los diferentes microorganismos, si bien la caracterizacin
completa requiere del conocimiento de otros aspectos relativos a su
forma y estructura, propiedades antignicas y genticas, caractersticas
de los cidos nucleicos y de otras molculas estructurales.
El grupo taxonmico bsico es la especie. En microbiologa la espe-
cie queda generalmente denida por una cepa tipo. Todas las cepas lo
sucientemente semejantes a una cepa tipo se incluyen en una misma
especie, mientras que las cepas los sucientemente distintas de esta
cepa tipo se comprenden en otras especies. Esto siempre puede impli-
car criterios subjetivos que exigen un cierto compromiso provisional.
Las especies parecidas se incluyen en el mismo gnero, y as se forman
sucesivamente categoras superiores. Por lo que respecta a la relacin
entre actividad qumica y grupos taxonmicos, hay que considerar que
una misma actividad qumica puede hallarse en microorganismos muy
diferentes. No obstante, existe una relacin signicativa entre los gru-
pos de microorganismos que presentan actividades qumicas globales
equivalentes y la proximidad taxonmica de los mismos.
La bioqumica de los microorganismos, como disciplina indepen-
diente, presenta una obvia interseccin entre microbiologa y
bioqumica. Esto se reeja en el gran nmero de publicaciones al res-
pecto que aparecen tanto en revistas de microbiologa como en revis-
tas de bioqumica. En los tratados y manuales de microbiologa y de
bioqumica tambin se desarrollan algunos temas comunes. La carac-
terstica de la bioqumica de los microorganismos que este libro pre-
tende asumir es la de sistematizar una parte del conocimiento de la
qumica biolgica desde la perspectiva de los distintos grupos de
microorganismos particulares.
6 El concepto de microorganismos que se utiliza aqu est de
Parte A: EL METABOLISMO acuerdo con todo lo que se ha referido ms arriba. Evidentemente se
MICROBIANO trata de organismos generalmente de tamao microscpico, pero fun-
Captulo 1: INTEGRACIN DE LA damentalmente interesan aquellos que permiten obtener una infor-
TOTALIDAD DE LAS
macin importante a travs del estudio de cultivos puros. No hay que
TRANSFORMACIONES QUMICAS DE
LA BIOFASE olvidar que un cultivo puro est constituido por una poblacin
enorme de individuos iguales que viven sobre un medio uniforme y
que se multiplican con un tiempo de generacin relativamente muy
corto. En este sentido se incluyen igualmente bacterias, levaduras y
algas unicelulares. Tambin podra comprender a los protozoos, e
incluso a cultivos de clulas de organismos superiores, aunque aqu
no se hace referencia a ellos.

1.3 LA ACTIVIDAD DE LA BIOFASE

El metabolismo microbiano comprende miles de transformaciones


distintas, incluso considerando exclusivamente las que se llevan a
cabo en una sola cepa bacteriana. De hecho, aunque pudieran hacerse
todas a la vez, no constituiran por s mismas el metabolismo, porque
para ello se requiere una integracin. El rasgo ms distintivo de la
integracin del metabolismo es que dichas transformaciones se llevan
a cabo en una estructura altamente organizada y que gracias a su
actividad esta estructura organizada se perpeta e incrementa, mante-
nindose fundamentalmente idntica a s misma. Sin estructura no
hay metabolismo, y sin metabolismo no hay estructura. Este aparente
crculo vicioso en el que parecen estar la estructura y la actividad qu-
mica del protoplasma se considera que es el resultado de un largo pro-
ceso de evolucin a partir de una actividad muy simple relacionada
con una estructura tambin muy simple. Actualmente esta actividad
es muy compleja y tiene lugar en una estructura tambin muy com-
pleja, y ambas estn diversicadas de forma irreversible.
Otra caracterstica fundamental de la integracin de la actividad
qumica es que todas las reacciones aparecen ordenadas en secuencias
muy bien denidas en las que el producto nal de una es el sustrato
de la siguiente. Estas secuencias de reacciones se llaman vas metab-
licas y algunas se inician en algn material del medio exterior, que
debe pasar al protoplasma a travs de las envueltas celulares. Otras
terminan en productos que se liberan al medio exterior.
Cada cambio qumico aislado de una va metablica est catali-
zado por un enzima. Muchos tipos de cambios requieren adems un
coenzima y, ocasionalmente, otros factores menos especcos, como
por ejemplo la presencia de determinados iones. El cambio qumico
realizado en una sola etapa es muy simple y generalmente reversi-
ble. Existe un nmero relativamente reducido de cambios de este tipo,
que pueden limitarse prcticamente a transferencias inter o intramole-
culares de 2H, PO3H2, NH2, SH, CH3CO, CH3, aminoci-
dos y a carboxilaciones o descarboxilaciones. Concomitantemente
pueden romperse o formarse nuevos enlaces CC.
Muchas vas metablicas tienen carcter cclico, esto es: cualquier 7
producto de la misma puede considerarse el nal y el punto de partida. 1.4 EL SUMINISTRO ENERGTICO
Casi todas las vas metablicas estn relacionadas unas con otras y
un mismo intermediario puede obtenerse por distintos caminos. No
se puede actuar sobre una secuencia de reacciones sin afectar al resto.
Clsicamente, las vas metablicas pueden tener una funcin
catablica o anablica. Estrictamente, las primeras seran aquellas
que partiendo de ciertos materiales exteriores terminan en otros pro-
ductos ms simples que se devuelven totalmente al medio exterior. La
nica nalidad de estas vas sera la produccin de energa. Los pro-
ductos nales son de menor peso molecular y globalmente la reac-
cin tiene carcter oxidante.
La secuencia bioqumica de carcter anablico conduce al incre-
mento de protoplasma y por lo tanto supone siempre un balance de
materia positivo para la fraccin celular. Tiene carcter reductor y
forma molculas de mayor peso molecular que las de partida.
Alternativamente, tambin puede hacerse una separacin en tres
clases de vas metablicas. Las de clase I comprenden reacciones
puramente degradativas que conducen a productos nales que se
liberan al exterior o a subunidades que son utilizadas ulteriormente
para la biosntesis; son sistemas fundamentalmente exoergnicos. Las
vas metablicas de la clase II tienen carcter biosinttico y sus pro-
ductos nales son subunidades y coenzimas. Las de clase III condu-
cen a la formacin de macromolculas especcas a partir de
subunidades. Estas macromolculas son protenas, cidos nucleicos y
polmeros de envueltas.
En los microorganismos encontramos una gran diversidad de otras
vas metablicas que conducen a la formacin de materiales que no
forman ninguna estructura esencial para la clula bacteriana. Estos
materiales se encuentran en proporcin variable y generalmente pue-
den ser reutilizados para la formacin de subunidades destinadas a la
biosntesis o para la obtencin de energa, sin participacin de nin-
gn sustrato exterior. Se trata de los metabolitos de reserva.
En determinadas condiciones de crecimiento muchos microorganis-
mos pueden tambin dar lugar a la formacin de grandes cantidades de
algunos productos que no tienen funcin estructural ni de reserva.
Generalmente se liberan al medio exterior, pero no son productos na-
les de reacciones degradativas sino de vas biosintticas especcas.
Entre ellos se encuentran antibiticos y otras sustancias que pueden ser
de utilidad para el hombre. En algunos casos pueden ser artefactos
metablicos, pero en otros pueden tener sentido adaptativo. De forma
general, estos productos se denominan metabolitos secundarios.

1.4 EL SUMINISTRO ENERGTICO

Las reacciones biosintticas requieren suministro energtico. Este


suministro suele llevarse a cabo generando un sustrato activado con
el cual la reaccin puede tener lugar espontneamente. Para la forma-
cin de sustratos activados es esencial la produccin de dadores de
energa libre cuyo tipo ms general es el ATP.
8
NH2
Parte A: EL METABOLISMO
MICROBIANO N
N
Captulo 1: INTEGRACIN DE LA ADENINA
TOTALIDAD DE LAS
TRANSFORMACIONES QUMICAS DE O O O N N
LA BIOFASE O P O P O P O CH2
O O O O

OH OH

RIBOSA

ADENOSINA

MONOFOSFATO DE ADENOSINA (AMP)

DIFOSFATO DE ADENOSINA (ADP)

Trifosfato de adenosina (ATP)

Las reacciones biosnteticas son muy parecidas no slo entre distin-


tos microorganismos sino incluso a las de los organismos pluricelulares.
Mucha mayor diversidad encontramos en los sistemas suministrado-
res de energa, los cuales pueden ser divididos en tres grandes tipos: la
fotosntesis, la oxidacin de compuestos inorgnicos y el catabo-
lismo o metabolismo degradativo de sustratos orgnicos.
En general, la actividad qumica que conduce a la produccin de
energa es cuantitativamente mayoritaria. Adems, si se comparan las
bacterias o las levaduras con las clulas de los organismos superiores,
en las primeras existe de modo caracterstico una proporcin an
mayor respecto de la actividad qumica total.
La biosntesis es totalmente dependiente de la integridad metab-
lica, esto es, de la estructura y del sistema qumico suministrador de
energa. En cambio, la actividad de este ltimo puede tener lugar en
ausencia de biosntesis y se mantiene en gran parte en los sistemas
libres de clulas.
De acuerdo con el segundo principio de la termodinmica, cuando
una reaccin qumica libera energa, slo una parte de la misma, lla-
mada energa libre (G), puede ser utilizada para desarrollar trabajo.
El resto se pierde en forma de calor.
Las reacciones qumicas reversibles ocurren espontneamente en
el sentido en el cual el cambio de energa libre sea negativo. Si todos

los productos estn presentes en concentracin molar, G se llama 9


energa libre especca (G), que est relacionada con la constante de 1.5 LA REGULACIN METABLICA
equilibrio
G = RT ln K

donde R es la constante de los gases, T es la temperatura absoluta y K


la constante de equilibrio. Si K es mayor que 1, G ser negativo y
esto indica que la formacin de los productos en el sentido conside-
rado est favorecida. Si K es menor que 1, G ser positivo y entonces
la reaccin no puede producirse. Esto es, si se aumenta la cantidad de
alguno de los productos, se lleva a cabo en sentido opuesto hasta res-
tablecer el equilibrio. Para una estequiometra determinada, el valor
de G puede ser calculado de la diferencia entre G de los produc-
tos nales y G de los productos reaccionantes.
Cuando el ATP da lugar a la formacin de un compuesto activado,
el nivel de energa libre de este ltimo aumenta, lo cual determina
una situacin termodinmicamente favorable en comparacin con el
sustrato sin activar. El valor de G pasa de un valor positivo a un
valor negativo relativamente grande. Estos compuestos activados son
intermediarios fosforilados.
En la biosntesis intervienen otros intermediarios que tienen un
efecto activador parecido al ATP. En su formacin participa general-
mente el ATP, pero algunas veces se forman directamente como resul-
tado de reacciones catablicas. A este grupo pertenecen el GTP, UTP,
CTP, dTTP (desoxitimidina trifosfato) y acetil-CoA.

1.5 LA REGULACIN METABLICA

Otra caracterstica de la integracin de la actividad qumica del proto-


plasma es su capacidad de modicarse ordenadamente segn sean las
condiciones del medio exterior. Estos cambios tienen sentido adapta-
tivo y se llevan a cabo mediante mecanismos de regulacin diversos.
Los mecanismos ms sencillos de regulacin metablica son:
a) El bypass metablico. En este mecanismo dos enzimas compi-
ten por un mismo sustrato.

e1 B

e2 C

b) La represin de la sntesis de un enzima o la inhibicin de su


actividad. La inhibicin de la actividad suele afectar al enzima
que cataliza la primera etapa de una va metablica, y est con-
trolada por el producto nal de la misma (regulacin feedback).
Cuando crecen en un medio sinttico, los microorganismos
sintetizan en cantidades adecuadas todas las subunidades nece-
sarias para la biosntesis de macromolculas, pero, por la exis-
10 tencia de este tipo de mecanismo, dejan de sintetizar una
Parte A: EL METABOLISMO subunidad si sta se aade al medio de cultivo. Por lo que res-
MICROBIANO pecta a la sntesis de enzimas implicados en procesos catabli-
Captulo 1: INTEGRACIN DE LA cos, stos slo suelen sintetizarse cuando el sustrato catablico
TOTALIDAD DE LAS est presente. Cuando hay dos sustratos, la bacteria utiliza pri-
TRANSFORMACIONES QUMICAS DE
mero uno y despus el otro. El enzima que se sintetiza primero
LA BIOFASE
es siempre el que acta sobre el sustrato que produce un creci-
miento ms rpido.
c) Otro sistema de regulacin metablica es el de reacciones aco-
pladas por un coenzima comn. En este sistema, la forma del
coenzima que requiere una reaccin es la que se produce des-
pus de actuar en la otra.

A B

Coenzima Coenzima
oxidado reducido

C D

d) Todo el metabolismo se desarrolla en un sistema altamente


heterogneo y muchas actividades estn localizadas en determi-
nados orgnulos. Por lo tanto, la sntesis de los mismos regular
la intensidad de aqullas. Tal es el caso de la sntesis proteica y
la sntesis de RNA ribosmico.
Al considerar los aspectos estructurales hay que mencionar que las
envueltas celulares tienen una capacidad importante de regular la
entrada de productos al citoplasma y la salida de productos desde l.
En algunos casos las bacterias son capaces de modicar la estructura
de los compuestos que constituyen el medio exterior, generalmente
degradndolos para obtener un conjunto de compuestos ms hetero-
gneo y de estructura ms sencilla, pero tambin formando cpsulas y
limos. Esto les permite estar en contacto directo con un medio ms
favorable para conseguir un desarrollo mayor y ms ecaz que el que
correspondera a un medio de la misma composicin pero de concen-
tracin homognea.
Considerada en s misma, la actividad qumica de las bacterias
parece tener como objetivo nico el uso de los nutrientes disponibles
para conseguir formar cuanto antes dos clulas idnticas a la de par-
tida. La coordinacin de la actividad qumica y la existencia de los
diversos mecanismos de regulacin dan la impresin de que las bacte-
rias estn programadas para tal n.

1.6 EL PRINCIPIO DE LA BIOQUMICA UNITARIA

La bioqumica empez con el estudio de la fermentacin alcohlica


con extractos de levadura. El estudio de la glucolisis in vitro e in vivo se
bas en dos materiales de trabajo: la levadura y el msculo. Esto segu-
ramente fue el principio de la bioqumica comparada. Principalmente
gracias a la visin de Kluyver y Van Niel, hacia los aos 30 se lleg al 11
convencimiento de que las vas metablicas de los distintos organis- 1.6 EL PRINCIPIO DE LA BIOQUMICA
mos tenan muchos aspectos comunes, independientemente de su UNITARIA
naturaleza vegetal, animal o microbiana. Es por ello que de una forma
general el metabolismo microbiano ha constituido un modelo cuyos
resultados no slo han servido para comprender mejor la actividad
qumica de las bacterias sino la de toda la materia viva. En gran parte
ha sido as porque el uso de las bacterias como material de experi-
mentacin es mucho ms favorable que el de otros organismos y por-
que una parte de la historia de la biologa, que va desde nales del
pasado siglo hasta los aos 40, est profundamente marcada por la
huella de una fructfera interaccin entre bioqumica y microbiologa.
La semejanza entre las distintas vas metablicas aboga en favor de
una unidad de esquema de organizacin de todos los seres vivos y
tambin en favor de su parentesco. Se considera que las secuencias
bioqumicas son el resultado de una historia evolutiva paso a paso, en
la cual ha sido la seleccin natural la que ha potenciado los modelos
de organizacin ms ecaces que pueden surgir de pequeas variacio-
nes dentro de una poblacin homognea. La evolucin bioqumica
tiene el mismo carcter neodarwiniano que la evolucin morfolgica.
Las grandes lneas de la evolucin bioqumica ya se manifestaron
en la organizacin de los procariotas. Dentro de ella encontramos la
mayor simplicidad, la mayor diversidad y, en cierto sentido, la mayor
complejidad. La inventiva bioqumica en la evolucin biolgica de
los eucariotas ha sido importante pero relativamente menor. De aqu
el gran inters del metabolismo bacteriano para la bioqumica compa-
rada. Tambin en ella encontramos una mejor comprensin de la
diversidad de las bacterias, dada su relativa simplicidad morfolgica y
la prctica ausencia de testimonios fsiles.
PARTE B
COMPOSICIN QUMICA Y
CRECIMIENTO DE LA
BIOMASA MICROBIANA
2 COMPOSICIN QUMICA

2.1 LA PRODUCCIN DE BIOMASA 16


2.2 CONTENIDO DE AGUA DE LA BIOFASE 17
2.3 COMPOSICIN ELEMENTAL 18
2.4 FRACCIN CIDO-SOLUBLE 18
2.5 PROTENAS 19
2.6 CIDOS NUCLEICOS 19
2.7 LPIDOS 20
2.8 HIDRATOS DE CARBONO 20
2.9 MOLCULAS EXCLUSIVAS DE LAS BACTERIAS 21
2.10 OTROS COMPONENTES MOLECULARES DE LA
BIOMASA MICROBIANA 25
2.11 CONCLUSIONES GENERALES SOBRE LA COMPOSICIN
QUMICA DE LA BIOFASE 27
BIBLIOGRAFA 27

16 2.1 LA PRODUCCIN DE BIOMASA


Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y
CRECIMIENTO DE LA BIOMASA La cantidad de clulas disponible para el anlisis depende de la con-
MICROBIANA. centracin celular nal obtenida y del volumen de los cultivos. El cre-
Captulo 2: COMPOSICIN QUMICA cimiento microbiano cesa por agotamiento del sustrato, o porque ste
deja de ser utilizable, y tambin a causa de que la acumulacin de
productos metablicos alcanza niveles inhibidores. Para obtener el
crecimiento mximo debe explotarse al mximo la capacidad meta-
blica del microorganismo, principalmente en relacin con la fuente
de energa, y, adems, hay que eliminar o neutralizar los productos
que se acumulan en el medio. La consecucin de estos objetivos
requiere un planteamiento diferente segn sea el microorganismo.
Cuando la fuente de energa es un sustrato orgnico que puede ser
oxidado completamente, lo primero es encontrar la cantidad ade-
cuada del mismo y el suministro de oxgeno necesario. As, por ejem-
plo, con E. coli creciendo en caldo ordinario (5 g de peptona y 3 g de
extracto de carne por litro) se obtienen alrededor de 2 108 clulas/
ml en la fase estacionaria del crecimiento o 5 109 cuando el medio
esta dotado de agitacin o aireacin,. Esto signica que se obtiene
poco ms de 1 g de peso seco por litro o una produccin del 15%,
referida a la cantidad de nutrientes convertida en biomasa. En un
medio constituido por un 2% de hidrolizado de casena y un 1% de
glucosa, con Brucella suis, que es bastante ms pequea que E. coli, se
obtienen 8 1010 clulas/ml, lo que signica de 5 a 10 g/l de peso
seco. En estos casos, son importantes la buena circulacin del oxgeno
con difusores apropiados, la agitacin y la prevencin de la forma-
cin de espuma con antiespumantes no txicos.
A menudo resultan apropiados para grandes producciones los
medios de composicin qumica denida en los que se pueda conse-
guir una utilizacin completa del sustrato energtico y el manteni-
miento del pH con un tampn apropiado. Evidentemente, el medio
sinttico debe contener las fuentes de N, S y P adecuadas, as como los
factores de crecimiento necesarios para conseguir el mximo rendi-
miento. De este modo, con la misma Brucella suis, se puede alcanzar
una concentracin nal de 1011 clulas/ml.
En los medios sintticos puede aumentarse la produccin utili-
zando una mezcla de sustratos. As, con Serratia marcescens, que
oxida tanto la glucosa como el citrato, se llegan a obtener 29 g/l de
peso seco celular (2 1011 clulas/ml) con 57 g/l de glucosa y 20 g/l
de cido ctrico. El 40% del C asimilado se incorpora a la biomasa, en
tanto que el resto es oxidado hasta CO2. Con E. coli se pueden obte-
ner resultados semejantes utilizando, en lugar de citrato, malato u
otro intermediario del ciclo de Krebs. Con levaduras se consiguen en
medio sinttico producciones de hasta 10 g/l de peso seco celular con
la completa utilizacin de 100 g/l de glucosa.
Los sustratos oxidables pueden ser aadidos gradualmente para pre-
venir la inhibicin del crecimiento debido a la alta presin osmtica.
En sistemas de ujo continuo, bien regulados y con un reemplaza-
miento del medio no demasiado rpido, pueden obtenerse produccio-
nes de 13 g de peso seco l 1 h 1 de levadura con completa utilizacin 17
del azcar. De todas formas, cuando se pretenden obtener produccio- 2.1 LA PRODUCCIN DE BIOMASA
nes absolutas muy grandes, la construccin de fermentadores apropia-
dos puede presentar problemas complejos de ingeniera en aspectos
tales como la optimizacin del suministro de oxgeno, la mezcla del
cultivo y la separacin de las clulas.
Las altas producciones de bacterias aerobias y de levaduras condu-
cen a una biofase que representa del 10 al 40% del volumen del cul-
tivo. En estas circunstancias, los problemas de alimentacin,
aireacin y separacin celular pueden ser muy delicados, si bien en s
mismos no constituyen una limitacin del crecimiento. Se ha de
tener en cuenta que en el crecimiento de un cultivo sobre medios
slidos la produccin alcanzada por gramo de nutriente utilizado no
diere de la que puede conseguirse con el mismo cultivo en medio
lquido.
Con los microorganismos que crecen anaerobiamente o que slo
realizan una oxidacin parcial del sustrato energtico se plantean
generalmente problemas ms complicados. Cuando se producen ci-
dos, el control del pH es esencial y la naturaleza y concentracin del
tampn utilizado pueden ser crticos. As, con las bacterias del cido
lctico se obtienen resultados mucho mejores con tampones de
citrato o acetato que con fosfato o aminocidos. El principio del
doble sustrato es igualmente aplicable. Por ejemplo, el crecimiento de
Lactobacillus arabinosus puede aumentar utilizando mezclas de glu-
cosa y malato en lugar de glucosa sola. Streptococcus faecalis y Saccha-
romyces cerevisiae crecen anaerobiamente con glucosa, produciendo
respectivamente 22 y 21 microgramos de peso seco celular por micro-
mol de glucosa. Aadiendo arginina, en S. faecalis tenemos una pro-
duccin adicional de 10 microgramos de peso seco por micromol de
arginina. Estos crecimientos corresponden a producciones de alrede-
dor del 12% en gramos de peso seco por gramo de glucosa y del 6%
para la arginina. Ambos resultados muestran un crecimiento que
depende de la capacidad de generar ATP a partir del sustrato. S. faeca-
lis y S. cerevisiae obtienen 2 moles de ATP a partir de cada mol de glu-
cosa fermentada, y S. faecalis obtiene 1 mol de ATP por mol de
arginina fermentada a ornitina. En el desarrollo fermentativo siempre
hay un crecimiento total jo para cada microorganismo correspon-
diente a la utilizacin de una determinada cantidad de sustrato.
En conjunto es razonable asumir que no existe lmite para la canti-
dad de clulas que se puede obtener por cultivo de microorganismos
si se llegan a controlar sucientemente las condiciones ptimas de
crecimiento. Sin embargo, las caractersticas metablicas de algunos
microorganismos hacen que su cultivo presente dicultades prctica-
mente infranqueables. As, las bacterias del hierro requieren a la vez
oxgeno y hierro en estado reducido, lo cual es muy difcil de conse-
guir en el laboratorio. En realidad, representan una adaptacin margi-
nal en el seno de medios biticos naturales complejos.
18 2.2 CONTENIDO DE AGUA DE LA BIOFASE
Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y
CRECIMIENTO DE LA BIOMASA Tal y como ha sido comentado anteriormente, las clulas pueden ser
MICROBIANA. separadas del medio por centrifugacin o ltracin y posterior
Captulo 2: COMPOSICIN QUMICA lavado. La biomasa hmeda obtenida pierde por secado a 105 C de
un 70 a un 90% de agua, segn el microorganismo y las condiciones
de crecimiento, una cantidad inferior a la que se encuentra en orga-
nismos superiores (90%).
Hay un agua intercelular y otra intracelular. La primera puede
variar segn el mtodo de obtencin de la masa hmeda y de los pro-
ductos hidroflicos (polisacridos) o hidrofbicos (lpidos) que se
encuentren sobre las paredes celulares. El agua intercelular puede ser
determinada por medio de protenas marcadas isotpicamente, las
cuales no penetran en la clula. Puede representar un 10-20% del
volumen total de la masa hmeda.

2.3 COMPOSICIN ELEMENTAL

El anlisis elemental se practica por los mtodos de la qumica org-


nica sobre una alcuota de la materia seca obtenida del crecimiento
total de un cultivo. Para nuestro objetivo, el detalle de la composicin
elemental no tiene demasiado inters. Podemos sealar que propor-
ciona un resultado global tpico de la materia viva y que diere poco
de un microorganismo a otro. Como valores medios se obtiene un
50% de carbono, 20% de oxgeno, 14% de nitrgeno, 8% de hidr-
geno, 3% de fsforo, 2% de potasio, 1% de azufre, 0,05% de calcio,
magnesio y cloro, 0,2% de hierro y un total de elementos traza del
0,3% que comprenden manganeso, cobalto, cobre, zinc y molibdeno.
A partir de estos datos se puede anticipar que la biomasa microbiana
est formada de materia orgnica.

2.4 FRACCIN CIDO-SOLUBLE

Es la que se obtiene por extraccin con cido tricloractico al 5% o


cido perclrico al 10% en fro, para minimizar la hidrlisis. Contiene
molculas orgnicas de bajo peso molecular y iones inorgnicos.

TABLA 2.1 Tipos y nmero aproximado de molculas distintas de la fraccin


cido-soluble.

Tipos de molculas Nmero de tipos

Aminocidos, precursores y derivados 120


Nucletidos, precursores y derivados 100
cidos grasos y sus derivados 50
Azcares y sus precursores 250
Quinonas, poliisoprenoides, porfirinas,
vitaminas, otros coenzimas, grupos
prostticos y sus precursores 300
Las molculas orgnicas representan en E. coli unos 8 fg (femtogra- 19
mos, 10 15 g) por clula. Hay centenares de tipos diferentes de mol- 2.5 PROTENAS
culas que incluyen precursores de macromolculas, intermediarios
metablicos y cofactores de enzimas (tabla 2.1).
La fraccin cido-soluble comprende un 8% del C total y un 20%
del fsforo. Constituye una especie de medio interno en el que muchos
compuestos estn enormemente ms concentrados que en el medio
externo. Esto determina una alta presin osmtica, variable de un caso
a otro (Staphylococcus aureus: 20-25 atmsferas, E. coli: 5-6 atmsferas).
Hay que resaltar que esta fraccin no presenta fragmentos de las gran-
des molculas estructurales (protenas y cidos nucleicos). Su eventual
liberacin puede ir seguida de hidrlisis hasta pequeos fragmentos.
Los aniones ms abundantes dependen de la composicin del
medio, pero siempre incluyen sulfato, fosfato y cloruro. El catin ms
abundante es el K+, que es el factor inorgnico ms importante en la
regulacin de la presin osmtica. El Na+ est ausente o se halla en
pequea proporcin. Tambin se encuentran concentraciones reduci-
das de NH4+, Mg2+, Ca2+ y Fe2+-Fe3+, y, a concentraciones an ms
bajas, Mn2+, Mo2+, Co2+, Cu2+ y Zn2+. El conjunto de molculas
inorgnicas slo alcanza alrededor del 1% del peso seco, pero sus fun-
ciones son esenciales para el crecimiento.

2.5 PROTENAS

Las protenas pueden separarse de la fraccin cido-insoluble en


caliente. Representan alrededor del 50% del peso seco de las clulas.
Contienen el 60% del carbono celular y el 70% del azufre. Se cree que
de un 15 a un 20% de las protenas son, probablemente, lipoprotenas.
Se ha estimado que el nmero total de polipptidos diferentes que
se encuentran en E. coli es del orden de 1800, con un peso molecular
medio de 40 kDa. El total de molculas proteicas puede llegar a 2,5
millones por clula.

2.6 CIDOS NUCLEICOS

Se pueden separar de la fraccin alcohol-ter insoluble con cido tri-


cloroactico al 5% (30 min a 90 C). Los dos componentes, RNA y
DNA, pueden ser estimados colorimtricamente despus de una
hidrlisis sin ulterior separacin. Las fracciones de RNA y DNA pue-
den separarse por su solubilidad selectiva en soluciones salinas, por
hidrlisis alcalina del RNA, o por digestin con RNAsa o DNAsa
seguida de una precipitacin alcohlica de la fraccin no digerida.
Las clulas de muchos microorganismos son muy ricas en RNA. En
las bacterias y levaduras constituye el 20-25% del peso seco. El RNA
preponderante es el ribosmico (rRNA) que se presenta en varias espe-
cies moleculares (23S, 16S y 5S) y constituye el 80% del RNA total. El
RNA de transferencia (tRNA) constituye el 15% del total y tiene un
peso molecular del orden de 25 kDa. Existen diferentes tipos de tRNA;
as, por ejemplo, se estima que en E. coli hay unas 60 molculas dife-
rentes. Pero la abundancia de molculas diferentes de tRNA vara

20 mucho de un microorganismo a otro. El conjunto de las poblaciones


Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y de RNA ribosomal y de transferencia recibe el nombre de RNA estable.
CRECIMIENTO DE LA BIOMASA Ello es as en contraposicin al RNA mensajero (mRNA), que presenta
MICROBIANA. generalmente una vida media corta (entre 0,5 y 10 min). Este ltimo
Captulo 2: COMPOSICIN QUMICA es el menos abundante (4% del RNA total).
La elevada proporcin de RNA total y la baja estabilidad del mRNA
son dos caractersticas asociadas al relativamente rpido crecimiento
de muchos microorganismos.
El material gentico de las bacterias est ordenado en una sola
molcula de DNA llamada cromosoma. Adems, las bacterias tambin
pueden tener otras molculas de DNA independientes, llamadas pls-
midos, relativamente ms pequeas. Estas ltimas constituyen una
fraccin variable y no esencial del genoma de la clula bacteriana. En
los organismos eucariotas el DNA se encuentra en estructuras mucho
ms complejas que comprenden varios cromosomas propiamente
dichos, puesto que el nombre de cromosoma se aplica en las bacterias
solamente en sentido anlogo.
El cromosoma de E. coli se conoce con notable precisin. Repre-
senta 9 femtogramos por clula y est formado por una doble cadena
de DNA cerrada covalentemente que contiene unos 4 720 000 pares de
bases. Totalmente extendida alcanzara 1 mm de longitud. Sin
embargo, dentro de la clula se encuentra convenientemente plegada
de modo que su longitud es unas 500 veces menor.

2.7 LPIDOS

La fraccin cido-insoluble puede ser tratada con alcohol o alcohol-


ter a 40-50 C para extraer algunos lpidos. Sin embargo, otras mol-
culas de este tipo slo se separan con disolventes despus de una
enrgica hidrlisis con HCl concentrado (6 N a 100 C durante varias
horas). Claramente, la mayor parte de estos lpidos deben formar
parte de estructuras mole-culares ms complejas de la pared celular o
de la membrana protoplasmtica.
En E. coli los lpidos totales contienen del 10 al 15% del carbono
total de la clula y una proporcin semejante del peso seco. Se encuen-
tran repartidos entre la pared celular y la membrana protoplasmtica.
Algunas bacterias acumulan poli--hidroxibutirato, que es una ecaz
reserva energtica. En las micobacterias se encuentran lpidos estructu-
rales especiales que pueden llegar a constituir el 10% del peso seco.
Excluyendo el lipopolisacrido, los lpidos de E. coli son fosfolpi-
dos (g. 2.1). Los cidos grasos ms frecuentes que se encuentran en
estas molculas son el palmtico (43%), el palmitoleico (33%) y el cis-
vaccnico (25%).

2.8 HIDRATOS DE CARBONO

Se encuentran formando parte de los cidos nucleicos, en oligosacri-


dos de la fraccin cido-soluble, como polisacridos extracelulares
(cpsulas y limos) y formando parte de molculas complejas en la
pared celular.

21
R1 O CH2
Fosfatidiletanolamina 2.9 MOLCULAS EXCLUSIVAS DE LAS
R2 O CH O (75%) BACTERIAS

H2C O P CH2 CH2 NH2


OH
R1 y R2: cidos grasos

CHOH CH2OH Fosfatidilglicerol


(18%)

H2C O R1
O HC O R2
CH CH2 O P O CH2
OH OH Cardiolipina
(5%)
Figura 2.1 Fosfolpidos de Escherichia coli.

Tambin se encuentran polisacridos como reserva energtica en


forma de grnulos. En Clostridium se acumula almidn o granulosa, y
en las enterobactericeas y las levaduras se acumula una sustancia
anloga al glucgeno. Son reservas energticas que pueden almace-
narse en gran cantidad cuando se dispone de sustrato en el medio
exterior y el crecimiento est impedido por falta de algn nutriente
imprescindible. Un caso particular es el de Acetobacter xylinum, que
forma celulosa que es extruida al medio en forma de bras. Esto cons-
tituye un fenmeno nico en el mundo procariota.

2.9 MOLCULAS EXCLUSIVAS DE LAS BACTERIAS

Todos los componentes de la biomasa microbiana referidos antes se


encuentran tambin , en lneas generales, en cualquier tipo de mate-
ria viva. Las bacterias presentan adems cuatro molculas importan-
tes en exclusividad: la murena, el lipopolisacrido, los cidos
teicoicos y los cidos lipoteicoicos.
La murena es un peptidoglicano que se encuentra en todas las
bacterias, con excepcin de las arqueobacterias y los mollicutes
(micoplasmas). Constituye la mayor parte de la pared celular y es res-
ponsable de la forma de la clula y de su integridad estructural, pro-
porcionando rigidez a la misma.
La murena est compuesta de restos de N-acetilglucosamina (NAG)
y de cido N-acetil murmico (NAM), unidos alternativamente por enla-
ces -1,4-glucosdicos. Hay un tetrapptido unido al NAM que puede
unirse a su vez con el tetrapptido de una cadena adyacente (g. 2.2).
UNIDAD BSICA
NAG NAM NAG NAM
CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH
O O O O
O
OH O O O OH O O

NH NH NH NH
HC CH3 HC CH3
C O C O C O C O
C O C O
CH3 CH3 CH3 CH3
L-Ala nina L-Alanina
D-Glutmico D-Glutmico
Meso-diaminopimlico Meso-diaminopimlico
D-Alanina D-Alanina
(a)

NAM NAG NAM NAG NAM NAG


NAM
NAM NAG NAM NAG NAM NAG
L-Ala NAM
NAM NAG NAM NAG NAM NAG
D-Glu L-Ala
NAM NAG NAM NAG NAM NAG
DAP D-Glu
D-Ala CO NH DAP
D-Ala
(b) (c)

NAM: cido N-acetil murmico


NAG: N-acetilglucosamina
Figura 2.2 Diagrama de la murena de E. coli. (a) Esquema de la unidad bsica repetida del peptidoglicano. (b) Enlace pep-
tdico que posibilita la unin de cadenas lineales. (c) Estructura de la red formada por cadenas de peptidoglicano unidas por
enlaces peptdicos. Algunas cadenas peptdicas quedan libres.

La estructura del lipopolisacrido (LPS) vara de una bacteria a


otra, e incluso entre diferentes cepas, pero se presenta en todas las
bacterias gramnegativas. Una subunidad del lipopolisacrido de Sal-
monella podra representarse como se indica en la gura 2.3.
El lpido A es un disacrido de glucosamina fosforilado y esteri-
cado con distintos cidos grasos (R12: dodecanoico, R14: tetradeca-
noico, R16: hexadecanoico y OH-R14: 3-hidroxitetradecanoico). El
ncleo es un oligosacrido que comnmente incluye L-glicero-d-
manoheptosa y cido ceto-desoxi-octanoico (3-desoxi-D-manooctulo-
smico). El lpido A y el ncleo correspondientes al LPS de las distin-
tas enterobactericeas parecen ser semejantes. La cadena O, que es
22
23
Azcar Azcar
2.9 MOLCULAS EXCLUSIVAS DE LAS
BACTERIAS

Azcar Cadena O

Azcar n

Azcar Azcar

Azcar

Azcar Azcar

Ncleo
Heptosa Heptosa

Etanolamina P P Heptosa

KDO

Etanolamina P KDO KDO

P P Glucosamina Glucosamina P
Lpido A
Etanolamina R14 R16 R12 OH R14 R14
Figura 2.3 Subunidad del lipopolisacrido (LPS) de Salmonella (vase
texto).

especca de cada cepa, tiene mayor longitud que el ncleo y est for-
mada por la repeticin de varias subunidades de tri-, tetra- o pentasa-
cridos, constituidos por azcares poco comunes.
Las bacterias grampositivas no tienen LPS, pero pueden presentar
cidos teicoicos asociados a la murena. Se trata de polmeros del gli-
cerol o del ribitol unidos por enlaces fosfodister y con uno o ms
aminocidos como sustituyentes (g. 2.4).
24
Lactobacillus casei O CH2
Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y
R O CH O
CRECIMIENTO DE LA BIOMASA
MICROBIANA. H2C O P
Captulo 2: COMPOSICIN QUMICA
OH
R = D-alanina

Actinomyces antibioticus R O CH2


O CH O
H2C O P
OH
R = D-alanina

Streptococcus lactis D-ala


AcN glu P O CH2
HO CH O
H2C O P
OH

Bacillus subtilis O CH2


R O CH
HO CH
D-ala
HO CH O
H 2C O P
OH

Actinomyces streptomicini CH2OH


CHOH
2(gal)1-3 (glu)1-3 (ram)1 O CH
HOCH O
H2C O P
OH
Figura 2.4 Ejemplos de cidos teicoicos.

Ms recientemente (1987-1993), se ha descrito otro tipo de molcu-


las complejas que se encuentran en muchas bacterias grampositivas. Se
trata de los llamados cidos lipoteicoicos (LTA) y los lipoglucanos, los
cuales tienen carcter macroanflico y estn anclados en la membrana
25
O
O CH2 CH CH2 O P O 2.10 OTROS COMPONENTES
MOLECULARES DE LA BIOMASA
X OH OH CH2 MICROBIANA
H O CH O O CH2
OH O O CH2
HO OH O O CH2
OH
OH HCOR1
f-gal OH OH
m n H2C
OH
p-glu OH
p-gal
X = L-ala
R1
m = 11-18 resto acil-graso f, forma furansica
R2 p, forma piransica
n = 8-12

Figura 2.5 Estructura caracterstica de un lipoglucano.

protoplasmtica por interaccin hidrofbica con los restos acil-grasos.


La cadena hidroflica, que alcanza hasta 13-30 nm de longitud, puede
penetrar en la cubierta de peptidoglicano y llegar hasta la supercie o
bien puede quedar enrollada sobre la membrana protoplasmtica.
Unos y otros son parcialmente perdidos durante el crecimiento,
pasando al medio. En la gura 2.5 se representa una estructura caracte-
rstica de un lipoglucano. Los LTA son parecidos, pero tienen D-Ala,
azcares aminados y enlaces -glucosdicos en lugar de -glucosdicos.
Las molculas macroanflicas referidas varan de una especie a
otra y, en menor grado, de una cepa a otra. Como ejemplo de la inte-
raccin de la murena con los cidos teicoicos y lipoteicoicos, en la
gura 2.6 se representa un modelo del complejo membrana proto-
plasmtica-pared celular en las bacterias grampositivas.
Adems de la complejidad de estas molculas singulares de las bac-
terias que se acaban de referir brevemente, es interesante destacar el
hecho de que algunas de ellas contienen D-aminocidos, los cuales
no se encuentran en ninguna protena.

2.10 OTROS COMPONENTES MOLECULARES DE LA BIOMASA MICROBIANA

Otro importante grupo de componentes orgnicos del protoplasma


bacteriano est constituido por los pigmentos. Algunos de ellos,
como la prodigiosina, la piocianina y la violacena, slo se forman en
determinadas condiciones de crecimiento. Los pigmentos pueden
permanecer dentro de la clula o excretarse al medio. Algunos pig-
mentos tienen un papel semejante a un metabolito secundario, pero
otros desempean un papel funcional crtico, como las clorolas y los
carotenoides.
26

Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y


CRECIMIENTO DE LA BIOMASA
MICROBIANA.
Captulo 2: COMPOSICIN QUMICA

.
...................
... .
.... .. . ...
....... . ... .
.... . . ..
.. .. . . .. .
.......... . . ..
. .. .. .
.
.... . .. .. .. . . ..
....... .. . .
.. ... .. . .
............. . . .. .

Peptidoglicano Glicolpido

cido teicoico Fosfolpido


.
...................
cido lipoteicoico Protena
Figura 2.6 Modelo del complejo membrana protoplasmtica-pared celular
en las bacterias grampositivas. Los LTA estn anclados hidrofbicamente, en
tanto que los cidos teicoicos (TA) se unen covalentemente al peptidogli-
cano.

Tambin en muchas bacterias podemos encontrar cido fosfrico


altamente polimerizado. Los grnulos de polimetafosfato son una
reserva energtica. Son conocidos como volutina o grnulos metacro-
mticos por su caracterstica de cambiar el color de los colorantes que
incorporan en las preparaciones microscpicas.
Otra molcula que slo se halla en las bacterias es el cido dipicol-
nico (cido piridn-2-6-dicarboxlico), encontrado en las esporas de
Clostridium y Bacillus (10-15% del peso seco de las esporas). Durante
la germinacin se libera al medio.
2.11 CONCLUSIONES GENERALES SOBRE LA COMPOSICIN QUMICA DE 27
LA BIOFASE 2.11 CONCLUSIONES GENERALES
SOBRE LA COMPOSICIN QUMICA
La biomasa microbiana que se obtiene a partir de cultivos puros es DE LA BIOFASE
qumicamente compleja. No obstante, actualmente existen recursos
analticos sucientes para denir cuantitativa y cualitativamente
cualquier tipo de molcula presente en la misma. Ello no impide reco-
nocer que la denicin precisa de una molcula de LPS o de LTA sea
un problema de gran complejidad.
Es sumamente importante tener presente que para una cepa deter-
minada, un medio de cultivo denido y unas condiciones de desarro-
llo constantes, se encuentra siempre la misma composicin. En
cambio, sta puede variar de un microorganismo a otro. Los cambios
relativos al medio y a las condiciones de cultivo son reversibles y pue-
den ser prede-cibles.
Una gran parte de la composicin qumica de los microorganismos
es semejante a la de otros organismos. Sin embargo, aqullos presen-
tan algunas caractersticas peculiares que merecen ser tenidas en
cuenta: el alto contenido de ARN y la presencia de molculas espec-
cas de alto signicado siolgico como la murena, el LPS, los AT y los
LTA. Aparte de esto, pueden encontrarse singularidades menores que
caracterizan a algunos microorganismos particulares.

BIBLIOGRAFA

SOKATCH, J. R. Bacterial Physiology and Metabolism. Academic Press. New


York and London 1969.
REAVELEY, D. A. y BURGE, R. F. Walls and Membranes in Bacteria. Advances
in Microbial Physiol. (Ed. by a. H. Rose and D. W. Tempest). v. 7. Academic
Press. New York and London, 1972.
NEIDHARDT, F. C., INGRAHAM, J., SCHACHTER, M. Physiology of the Bacte-
rial cell. A Molecular Approach. Sinauer Associates, Inc. Massachusetts. 1990.
FISCHER, W. Bacterial phosphoglycolipids and lipoteichoic acids. Handbook
Lipid Resch. 1990; 6:123.
FISCHER, W. Lipoteichoic acids and lipoglycans. En Bacterial Cell Wall (J.-M.
Gluysen y R. Hakenbeck, eds.). Elsevier Science B. V. Amsterdam 1994.
3 CINTICA DEL CRECIMIENTO

3.1 CULTIVO DISCONTINUO (BATCH CULTURE) 30


3.2 CULTIVO CONTINUO 34
BIBLIOGRAFA 36

30 3.1 CULTIVO DISCONTINUO (BATCH CULTURE )


Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y
CRECIMIENTO DE LA BIOMASA Cuando una fraccin de clulas de un cultivo puro es inoculada en un
MICROBIANA determinado volumen de medio fresco, despus de una incubacin,
Captulo 3: CINTICA DEL se produce un incremento de la biomasa hasta un valor mximo
CRECIMIENTO
denominado crecimiento total. Este proceso comporta crecimiento
celular propiamente dicho y aumento del nmero de clulas por
autoduplicacin. La biomasa es un catalizador de una reaccin que
produce ms biomasa idntica a la de partida.
Para poder cuanticar el aumento del nmero de clulas de la
poblacin, es importante limitarnos aqu a microorganismos que se
multiplican por divisin binaria, tal y como sucede con la mayora de
las bacterias. Si consideramos el crecimiento de una nica clula en
condiciones ambientales que no imponen ninguna restriccin a su
multiplicacin, el crecimiento de dicha clula, que se divide de forma
binaria, sigue una progresin geomtrica de base 2, es decir:

20 21 22 23 2n

Si la poblacin inicial, en vez de estar formada por una clula, est


formada por N0 clulas, el nmero nal de clulas que habr en un
momento dado (N1) depender, obviamente, del nmero de genera-
ciones que hayan tenido lugar (n), y ser:

N1 = N0 2n (1)

o, tomando logaritmos:

log N1 = log N0 + n log 2 (2)

Conociendo experimentalmente N0 y N1, el nmero de generaciones


n puede determinarse por la ecuacin:

log N 1 log N 0
n = ------------------------------------------ (3)
log 2

Como el log 2 es igual a 0,301, puede escribirse tambin:

n = 3,32 (log N1 log N0) (4)

Estos clculos permiten determinar con facilidad el nmero de


generaciones que ha tenido lugar en una poblacin que ha incremen-
tado su nmero de clulas de N0 a N1. Es importante resaltar aqu que
estas frmulas son vlidas para cualquier organismo vivo que proli-
fere por divisin binaria.
El factor que puede introducirse ahora hace referencia al tiempo
necesario para que N0 clulas se conviertan en N1. Este factor s que es
caracterstico de cada microorganismo y puede variar enormemente
de uno a otro. La introduccin del factor tiempo (t) implica necesaria-

mente la aparicin del concepto de velocidad de multiplicacin (R), o 31


nmero de generaciones por unidad de tiempo: 3.1 CULTIVO DISCONTINUO
(BATCH CULTURE)
n
R = --- (5)
t

Si el valor de n se obtiene de la ecuacin (4), tenemos:

3,32  log N 1 log N 0


R = ----------------------------------------------------------- (6)
t

Un concepto que suele utilizarse para caracterizar el crecimiento


microbiano es el llamado tiempo de generacin g que el tiempo nece-
sario para que se duplique la poblacin:

g = 1/R = t/n (7)

El planteamiento matemtico realizado hasta ahora es un modelo


terico, que si bien nos posibilita una aproximacin interesante para
la determinacin de una serie de parmetros que caracterizan el creci-
miento microbiano, presenta algunas limitaciones. Por ejemplo, hay
que tener en cuenta que no todas las clulas de un cultivo se dividen,
por lo que, en conjunto, el cultivo presentar un valor de g algo
mayor que el calculado a partir de la ecuacin (7).
Una aproximacin matemtica ms precisa se basa en considerar
el mismo sistema referido anteriormente, es decir, clulas creciendo
en condiciones no restrictivas, como un sistema autocataltico y ana-
lizar los cambios que se producen en la biomasa en intervalos inni-
tesimales de tiempo en lugar de estudiar el promedio de cambios en el
nmero de clulas que tienen lugar a lo largo de un periodo de
tiempo. En estas condiciones, el aumento de biomasa a lo largo del
tiempo es proporcional a la biomasa existente, por lo que sigue la
cintica de una reaccin de primer orden.
En trminos matemticos, esto puede expresarse como:

dN/dt = N (8)

Aqu y en adelante, N puede ser cualquier parmetro que reeje la


biomasa, como el nmero de clulas, pero tambin podra ser la canti-
dad de protena, de cidos nucleicos, etc. Por otro lado, t es el tiempo y
una constante de proporcionalidad que se denomina constante de la
fase de crecimiento o velocidad especca de multiplicacin. Es impor-
tante mencionar aqu que no es la velocidad de crecimiento (dN/dt),
sino un valor que reeja la capacidad del microorganismo de incre-
mentar su biomasa en un medio determinado.
Si integramos la ecuacin (8) entre N0 y N1, tenemos:

ln (N1/N0) = t (9)

32 Tambin con este planteamiento matemtico puede calcularse el


Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y tiempo de generacin, g, a partir de la ecuacin (9). Si g es el tiempo
CRECIMIENTO DE LA BIOMASA necesario para la duplicacin de la poblacin, tendremos que N1 = 2
MICROBIANA N0 y t = g. Sustituyendo:
Captulo 3: CINTICA DEL
CRECIMIENTO ln 2
ln 2 = g, o g = ---------- = 0,693/ (10)

Si comparamos las ecuaciones (7) y (10):


g = 1/R g = 0,693/
entonces:
= 0,693 R
Esto signica que R es mayor que . Este hecho hay que interpretarlo
pensando que reeja la tasa de crecimiento instantnea, y que esta
se toma como si se mantuviese constante desde el momento en que
una clula resultante de una divisin empezase a crecer. En la prc-
tica, al nal del ciclo celular, la tasa de sntesis de biomasa es prctica-
mente el doble que al principio. Por ello R, que representa el
promedio de lo que ocurre durante el periodo de duplicacin, es
mayor que .
Otra pregunta interesante es si vara con la concentracin del sus-
trato de crecimiento ([S]). Si los valores de obtenidos con diferentes
concentraciones de sustrato se representan grcamente, se obtiene:

1
m
2

KS [S]

La curva obtenida es muy parecida a la descrita para la catlisis


enzimtica. Monod demostr que la ecuacin de esta curva es:

;S=
= m r-------------------- (11)
Ks + ; S =

donde m es la velocidad especca mxima de crecimiento para valo-


res de [S] no muy alejados de aquellos para los que deja de ser limi-
tante para el crecimiento. Ks es la constante de saturacin, igual a la
33
1
3.1 CULTIVO DISCONTINUO
(BATCH CULTURE)

1
m

1
1 [S]
KS

Figura 3.1 Determinacin de la Ks para un sustrato determinado.

concentracin de sustrato que reduce la velocidad especca de creci-


miento a 1--2- m.
La ecuacin (11) se parece mucho a la ecuacin de Michaelis-Menten
para la cintica de los sistemas enzimticos. De este modo tambin
puede aplicarse el mtodo de Lineweaver-Burk para la determinacin
ms precisa de Ks y m. La ecuacin (11) puede expresarse tambin como:

1 Ks + ; S = 1 Ks 1
--- = -------------------- = ------- ------- + ------- (12)
m r; S = ; S = m m

Llevando a una grca los valores de 1/ como ordenadas y los de 1/


[S] como abscisas, puede calcularse la Ks (g. 3.1).
A la hora de establecer una relacin entre la concentracin de sus-
trato y la tasa de crecimiento bacteriana, es muy importante tener en
cuenta que las bacterias incorporan la mayora de los nutrientes por
mecanismos de transporte activo o de translocacin de grupo. Ello
implica que incluso cuando un nutriente est notablemente diluido
en el medio, su concentracin citoplasmtica es mxima. Por ello,
bajas concentraciones de sustrato proporcionan ya una m. As, Esche-
richia coli ya crece con una tasa mxima de crecimiento en medios
con una concentracin de glucosa de 0,004 mM (0,72 mg l1).
Monod tambin demostr experimentalmente que existe una rela-
cin constante entre el crecimiento de un cultivo y la cantidad de sus-
trato utilizado:
dN/dt = Y dS/dt (13)
Donde Y es el llamado factor de produccin. Durante la fase exponencial:
Y = peso de biomasa formada/peso de sustrato consumido
Cuando se conocen los valores de m, Ks e Y se tiene una descripcin
cuantitativa completa del desarrollo de un ciclo del cultivo discontinuo.
34 3.2 CULTIVO CONTINUO
Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y En la prctica, las condiciones de crecimiento no restrictivas indica-
CRECIMIENTO DE LA BIOMASA
das en el apartado anterior solamente perduran durante un tiempo
MICROBIANA
Captulo 3: CINTICA DEL limitado. Tanto el agotamiento de los nutrientes como la produccin
CRECIMIENTO de metabolitos inhibidores del crecimiento por parte de la biomasa en
desarrollo producen condiciones en las que el crecimiento micro-
biano cesa. Una alternativa para mantener la poblacin indenida-
mente en crecimiento en condiciones no restrictivas lo constituye el
cultivo continuo. El cultivo continuo se inicia del mismo modo que
el discontinuo. Si cuando se alcanza la fase logartmica se aade
medio fresco a una velocidad adecuada para mantener la densidad de
poblacin en un valor constante e inferior al valor mximo de la fase
estacionaria, el crecimiento puede continuar indenidamente. Sin
embargo, la velocidad de entrada y el volumen de cultivo crecern
exponencialmente con la biomasa, a no ser que se vaya eliminando
un volumen de cultivo igual al del medio fresco que va entrando. El
sistema de volumen constante tiene un intercambio energtico jo y
la biofase produce un mnimo de entropa.
En un quimiostato los microorganismos crecen a una velocidad
especca constante inferior a m. En el recipiente de cultivo, que
tiene un volumen V, entra un ujo constante F de medio de cultivo
fresco. Este medio tiene todos los nutrientes a una concentracin no
limitante, a excepcin de uno que se halla a una concentracin limi-
tante para una velocidad de crecimiento determinada. El volumen V
se mantiene constante porque simultneamente se elimina un ujo F
de medio modicado por la actividad metablica que adems lleva
clulas producto del crecimiento. El caudal de entrada F, determina la
velocidad de dilucin:
D = F/V
La velocidad especca de multiplicacin depende de la dilucin,
esto es, del nmero de volmenes de cultivo que pasan por el reci-
piente de cultivo en la unidad de tiempo. Si la dilucin es constante,
la concentracin de sustrato tambin ser constante y habr una velo-
cidad especca de crecimiento = D que determina un estado esta-
cionario que puede mantenerse indenidamente.
La concentracin efectiva de sustrato puede expresarse por:
[S]x = [S]0 [S]

donde [S]0 es la concentracin de sustrato en el depsito de medio


fresco y [S] la concentracin en el recipiente de cultivo. Si [S]x = 0, el
sustrato no es utilizado y no hay crecimiento. Para que haya creci-
miento, [S]x debe ser mayor que 0. Aumentando [S]0, puede conse-
guirse un valor de [S] que d una prxima a m.
La velocidad especca de crecimiento ser prxima a m si pue-
den satisfacerse las siguientes condiciones: (a) medio de cultivo per-
fectamente agitado, (b) cultivo homogneo, (c) que las propiedades
del cultivo sean prcticamente constantes a altas concentraciones de
sustrato (S >> Ks) y (d) que todos los dems componentes del medio 35
estn en exceso. Recordando la ecuacin (8): 3.2 CULTIVO CONTINUO

dN/dt = N

Si N es ahora compensado por la salida de biomasa del volumen


de cultivo DN, el cambio neto de concentracin de biomasa con el
tiempo ser:
Incremento = Crecimiento Prdida
dN/dt = N DN (14)
dN/dt = N  D

Si > D, dN/dt ser positivo y la concentracin de microorganismos


en el cultivo aumentar con el tiempo. Si < D, dX/dt ser negativo y la
concentracin celular disminuir, esto es, el cultivo se ir lavando fuera
del recipiente de cultivo. nicamente cuando = D ser dN/dt = 0 y la
concentracin de microorganismos en el recipiente de cultivo perma-
necer constante. Esta es la situacin de estado estacionario, en la que:

;S=
r -------------------- = ----------
ln 2
D = = (15)
m K s + ; S = g

El estado estacionario no es difcil de conseguir, porque, al estar


limitada por el suministro del sustrato, la velocidad especca de cre-
cimiento cambiar con la dilucin. Si esta ltima es constante, el sis-
tema tiende a equilibrarse.
Cuando la velocidad de dilucin aumenta, D > y, entonces, dX/dt
se hace negativo y la biomasa decrece. Esto conduce a una menor uti-
liacin sustrato, lo cual, para < m, conduce a un aumento de la
velocidad de crecimiento por incremento de [S]. La velocidad de cre-
cimiento no puede sobrepasar m y, por lo tanto, hay una dilucin
crtica Dc por encima de la cual el cultivo ser denitivamente lavado.
Puesto que depende de [S], es necesario considerar no slo el
efecto de la dilucin sobre la velocidad especca de crecimiento, sino
tambin el efecto de la dilucin sobre la concentracin de sustrato [S]
y la biomasa (N) en el cultivo.
El sustrato entra en el recipiente de cultivo a la concentracin [S]0, es
consumido por el microorganismo y emerge en el euente a la concentra-
cin [S]. De este modo, el cambio neto en la concentracin de sustrato es:

Incremento de sustrato = Entrada Salida Consumo


d ; S =/dt = D ; S = 0 D ; S =  Crecimiento/Produccin
d ; S =/dt = D ; S = 0 D ; S =  N/Y

Reordenando la ecuacin y sustituyendo por la ecuacin (11):

d;S= m rN ;S=
----------- = D  ; S = 0 ; S = ---------------- -------------------- (16)
dt Y K s + ; S =
36 De modo semejante, puede ser sustituida en la ecuacin (14), con
Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y lo cual tendremos:
CRECIMIENTO DE LA BIOMASA ;S=
-------- = N m -------------------- D
dN
MICROBIANA (17)
dt K s + ; S =
Captulo 3: CINTICA DEL
CRECIMIENTO
Las ecuaciones, (16) y (17) denen cuantitativamente el comporta-
miento del cultivo en el quimiostato y la capacidad autorreguladora
del sistema.
En estado estacionario, las ecuaciones (16) y (17) son 0 y por lo tanto,
los valores de N y [S] pueden ser calculados. En la ecuacin (16) tenemos:

m N ;S=
D  ; S = 0 ; S = = -------------- --------------------
Y K s + ; S =
y en (17):
D = m ([S]/(Ks + [S]))
con lo que, operando:
D
; S = = K s ------------------ (18)
m D
y
D
N = Y ; S = 0 K s ------------------ (19)
m D

Los valores de Ks, m e Y pueden determinarse en un cultivo dis-


continuo y aplicarse a las ecuaciones (18) y (19). Entonces pueden
variarse [S]0 y D para obtener un gran nmero de estados estaciona-
rios para distintas concentraciones celulares (N). La nica restriccin
es que [S]0 debe permanecer dentro del margen que permita que el
sustrato sea el factor limitante del crecimiento.
El quimiostato controla la velocidad de crecimiento con ayuda de
dilucin y una sustancia limitante del crecimiento. Para diluciones
grandes la estabilidad de la poblacin es difcil. Cuando la velocidad
de crecimiento no resulta estrechamente ligada a la densidad de
poblacin, el estado estacionario tampoco resulta fcil. Entonces
puede utilizarse otro recurso que permite una regulacin directa de la
densidad de poblacin mediante una clula fotoelctrica que emite
seales al desviarse de una determinada turbidez, las cuales permiten
aumentar o disminuir la entrada de medio fresco para volver al valor
deseado. Esto constituye el fundamento del cultivo continuo en el
turbidostato, que puede utilizarse en conjuncin con el quimiostato
incluso cuando el sustrato no es el factor limitante del crecimiento.

BIBLIOGRAFA
MONOD, J. Recherches sur la croissance des cultures bactriennes. Deuxime
dition. Hermann. Paris 1958.
TEMPEST, P. W. The continuous cultivation of microorganisms. I. Theory of
the chemostat. En Methods in Microbiology (J. R. Norris y D. W. Ribbons,
eds.), vol. 2, p. 259. Academic Press, New York. 1970.
PARTE C
PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO
4 ETANOL

4.1 LAS LEVADURAS 40


4.2 ALGUNAS REFERENCIAS HISTRICAS SOBRE LA
CONTRIBUCIN DE LAS LEVADURAS A LA
BIOQUMICA 42
4.3 EFECTO PASTEUR 43
4.4 CULTIVO, SISTEMAS CELULARES Y EXTRACTOS 44
4.5 FERMENTACIONES DE LA GLUCOSA 45
4.5.1 Fermentacin alcohlica 45
4.5.2 Fermentacin glicrica con sulfito 47
4.5.3 Fermentacin aceto-glicrica 47
4.5.4 Fermentacin pirvico-glicrica 48
4.6 ACEITE DE FUSEL Y CIDO SUCCNICO 48
4.7 DESARROLLO AEROBIO 50
4.8 ASIMILACIN OXIDATIVA Y FERMENTATIVA DE LA
GLUCOSA 50
4.9 FERMENTACIN ENDGENA 52
BIBLIOGRAFA 52
40 4.1 LAS LEVADURAS
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO Desde hace tiempo existe un acuerdo general en denominar levaduras
Captulo 4: ETANOL a los hongos que presentan predominantemente carcter unicelular. La
reproduccin vegetativa tiene lugar habitualmente por gemacin. En
comparacin con los otros grandes grupos de microorganismos, las
levaduras presentan escasa diversidad (39 gneros, 350 especies). No
constituyen una unidad taxonmica propiamente dicha. Este grupo
est formado por especies relacionadas con distintos grupos de hongos
lamentosos. Muchos hongos pueden presentar dos fases: miceliar y
unicelular. Las levaduras slo se presentan en forma de clulas aisladas
o, como mucho, pseudomicelios. Se reproducen por ascosporas o slo
asexualmente por gemacin o divisin binaria. Las caractersticas gene-
rales de las levaduras por las que se las diferencia entre s son ms bien
siolgicas que morfolgicas. En observacin microscpica se las dis-
tingue a primera vista de las algas por no poseer pigmentacin verde,
de los protozoos por presentar pared rgida y ser inmviles, y de las bac-
terias por presentar un tamao mucho mayor.
Las levaduras son organismos eucariotas. En la gura 4.1 se repre-
senta un diagrama de una clula de levadura de pan (Saccharomyces
cerevisiae) en reposo divisional. La gura 4.2 representa la estructura
molecular del principal componente de la pared celular de las algas,
las levaduras y las bacterias.

Pi
Pi
M
W
F
M Nc ER
ER N
Nn Mt
L Nm
L

M V

Vp
Vp
ER

ER M
Ws

1
Figura 4.1 Diagrama de una clula de levadura de pan en reposo divisio-
nal. ER indica retculo endoplasmtico; F, lamentos; G, aparato de Golgi; L,
grnulo de lpidos (esferosoma); M, mitocondrias; Mt, mitocondrias lifor-
mes; N, ncleo; Nc, placa centriolar; Nm, membrana nuclear; Nm,
nucleolo; Pi, invaginacin; Pl, plasmalema; V, vacuola; Vp, grnulo de poli-
metafosfato (volutina); W, pared celular; y Ws, cicatriz de gemacin.
CELULOSA
OH OH OH
CH2 CH2 CH2

H C O H C O H C O
H H H
O C OH H C O C OH H C O C OH H C O
C C H C C H C C H

H OH H OH H OH

QUITINA
OH OH OH
CH2 CH2 CH2

H C O H C O H C O
H H H
O C OH H C O C OH H C O C OH H C O
C C H C C H C C H

H N C CH3 H N C CH3 H N C CH3


H O H O H O

GLUCOPPTIDO

OH OH OH
CH2 CH2 CH2

H C O H C O H C O
H H H
O C O H C O C OH H C O C O H C O
C C H C C H C C H

H N C O H N C CH3 H N C CH3
H O H O H O
H3C C C CH3 H3C C C O
H R H R
Figura 4.2 Estructura molecular comparativa del principal componente de la pared celular de las algas, las
levaduras y las bacterias. Las echas denen la unidad estructural.

Las levaduras se siguen considerando separadamente de los hon-


gos en funcin de su mayor actividad metablica (moles O2 g 1 h 1),
de su crecimiento ms rpido y de su mayor efectividad como bioca-
talizadores. Su manipulacin en el laboratorio es similar a la de las
bacterias y puede aplicarse a ellas el principio del cultivo puro. Su dis-
tribucin en la naturaleza es parecida a la de las bacterias.
41
42 4.2 ALGUNAS REFERENCIAS HISTRICAS SOBRE LA CONTRIBUCIN DE
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
LAS LEVADURAS A LA BIOQUMICA
CATABOLISMO
Captulo 4: ETANOL Clsicamente, se ha considerado que las levaduras son los microorga-
nismos ms vinculados al progreso y bienestar humano. Esto ha sido
as debido principalmente a su capacidad de convertir ecientemente
azcares, como los que se encuentran en mostos de uva, frutas,
cebada y otros cereales y leche en alcohol y CO2. Se ha dicho que la
levadura es la planta ms antigua que ha sido cultivada. Se sabe que
la fabricacin del pan y la cerveza ya se practicaban en Tebas durante
la XI dinasta, 2000 aos antes de Cristo. Tales procesos se han venido
desarrollando ininterrumpidamente hasta nuestros das.
Saccharomyces cerevisiae y algunas especies prximas han sido micro-
organismos muy utilizados tanto en microbiologa industrial (bebidas
fermentadas, pan y, ocasionalmente, glicerina y grasa) como en todo el
desarrollo de la Bioqumica. A esto ltimo ha contribuido la facilidad
de disponer de levaduras de pan o de cerveza prcticamente puras y en
unas condiciones excepcionalmente favorables de mantenimiento y
cultivo. Probablemente, el primero que vio una clula de levadura fue
A. van Leewenhoek en 1680, segn se desprende de alguna de sus car-
tas enviadas a la Royal Society. En el siglo XVIII, Linneo, el creador de
la sistemtica moderna, se interes por la fermentacin alcohlica,
pero hubo que esperar hasta mediados del siglo XIX para obtener los
primeros avances importantes en el conocimiento de la siologa y
bioqumica de las levaduras. En 1897, los hermanos Bchner obtuvie-
ron el primer extracto de levadura, con el que pudieron fermentar la
glucosa sin la presencia de clulas. Por este motivo esta fecha se consi-
dera como la del nacimiento de la Bioqumica.
Cagniard-Latour demostr en 1837 que la levadura se multiplica
durante la fermentacin alcohlica y fue quien primero le atribuy
una naturaleza vegetal. Schwann la llam zuckerpilz (hongo del
azcar), de lo que se deriva el nombre de Saccharomyces dado ms
tarde por Kutzing.
El proceso qumico de la fermentacin alcohlica fue establecido
por Gay-Lussac a principios del siglo XIX:

C6 H12 O6 = 2 CH3 CH2OH + 2 CO2

Constituye la tercera estequiometra de la qumica biolgica, despus


del proceso respiratorio de Lavoisier

C6 H12 O6 + 6 O2 6 H2O + 6 CO2

y la fotosntesis:

luz
6 H2O + 6 CO2 C6 H12 O6 + 6 O2
clorofila

a la ltima de las cuales se llega tambin a nes del siglo XVIII gracias
a los trabajos de Priestley, Ingenhouz, Senebier y Saussure. Por lo que
se reere a la fermentacin alcohlica, a mediados del siglo pasado se
estableci una apasionada discusin entre los grandes qumicos org- 43
nicos, como Liebig, Whler y Berzelius, que consideraban que el cre- 4.3 EFECTO PASTEUR
cimiento de la levadura era un fenmeno secundario, y los partidarios
de la llamada teora vitalista, la cual estableca que la fermentacin
era una actividad qumica ligada a la vida. En 1857 Pasteur asoci fer-
mentacin y microbio de forma totalmente convincente y estableci
la fermentacin como una forma de vida anaerobia en la que el sumi-
nistro energtico se deriva de la degradacin parcial de la materia
orgnica. Los trabajos memorables a este respecto son Etudes sur le
Vin (1866) y Etudes sur la Bier (1876). Despus de las obras Pasteur
destacan las de Hansen y Jrgenson (1886) y Guillermond (1912).
Para el conocimiento actual de las levaduras son bsicas las obras de
Rose (1969) y Lodder (1970).
Es ilustrativo recordar que el nombre de fermentacin es muy anti-
guo y signica ebullicin a temperatura ambiente. Tambin es intere-
sante sealar que el nombre de fermento es sinnimo de levadura y,
en menor grado, de microbio.

4.3 EFECTO PASTEUR

Pasteur fue el primero en comprobar que, si se suministra suciente


oxgeno, la levadura crece sobre glucosa sin producir alcohol. En este
caso, sigue el proceso respiratorio:

C6 H12 O6 + 6 O2 6 H2O + 6 CO2

El cese en la produccin de alcohol viene acompaado de una dismi-


nucin en el consumo de glucosa.
Como otros microorganismos, muchas levaduras son facultativas y
la fermentacin slo tiene lugar cuando falta el oxgeno. Sin embargo,
en los medios azucarados en presencia de aire se pasa espontneamente
al proceso anaerobio porque el consumo de oxgeno es muy alto, por lo
que se agota rpidamente. Adems, la abundante produccin de CO2
suele desplazar el aire de la atmsfera, dicultando la disolucin del
oxgeno. En muchas bacterias anaerobias facultativas, como E. coli,
ocurre lo mismo en las condiciones habituales de cultivo.
Cuando la concentracin de glucosa es el factor limitante del cre-
cimiento se obtiene mucha ms biomasa en aerobiosis. En este caso la
produccin celular y de CO2 por gramo de glucosa consumida es
mayor que en la fermentacin. Si hay sustrato en exceso, el creci-
miento es igual tanto aerobia como anaerobiamente, pero entonces la
produccin absoluta de CO2 es mucho mayor en la fermentacin.
El cambio de energa libre para la completa oxidacin de un com-
puesto orgnico es mucho mayor que para su fermentacin. La com-
pleta oxidacin de 1 mol de glucosa libera 688 kcal, en tanto que las
distintas fermentaciones que puede experimentar esta cantidad de
glucosa slo producen como mximo unas 10 kcal. Las fosforilaciones
caractersticas de la fermentacin de los compuestos orgnicos tam-
bin tienen lugar durante la respiracin aerobia de los mismos, pero
44 en este ltimo caso la cantidad de ATP que se produce en total pro-
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL cede fundamentalmente de la fosforilacin oxidativa.
CATABOLISMO La paradoja del efecto Pasteur consiste en que se produce ms bio-
Captulo 4: ETANOL masa con menor consumo de sustrato. Ello es simplemente conse-
cuencia de lo que acabamos de sealar. La produccin total de ATP
por mol de sustrato respirado es mucho mayor que la que pueda obte-
nerse por fermentacin de igual cantidad del mismo compuesto. Ade-
ms, en el efecto Pasteur interviene un mecanismo de regulacin
metablica que determina que la cantidad mxima de glucosa que
puede ser absorbida disminuya en condiciones aerobias.

4.4 CULTIVO, SISTEMAS CELULARES Y EXTRACTOS

Las levaduras crecen bien en un medio constituido por un azcar,


NH4Cl, Na2SO4, K2HPO3 y extracto de levadura. El pH ms favorable
se halla entre 3,5 y 4,5. Se conocen varios medios sintticos, como los
de Devereux y Taner, Fulmer y Nelson, y el de Mayer. Estos medios
son tambin adecuados para muchos otros hongos. Las bacterias
habituales se desarrollan mal o no crecen en estos medios, principal-
mente debido al bajo pH.
Para estudiar la actividad qumica de las levaduras pueden utilizarse
sistemas de clulas enteras. Se manejan fcilmente porque se lavan y
sedimentan sin dicultad por centrifugacin. Resisten bien en agua
destilada y soluciones salinas como el Ringer 1/4. Si a una suspensin
celular de este tipo se le aade glucosa u otro azcar, tiene lugar inme-
diatamente una activa fermentacin hasta el agotamiento del sustrato.
No obstante, no hay crecimiento, puesto que la biosntesis est prcti-
camente bloqueada por falta de las fuentes de N, P y S. El sistema de
clulas enteras no proliferante o en reposo divisional permite separar
prcticamente el sistema suministrador de energa del biosinttico.
Si la concentracin de azcar es el factor limitante del crecimiento
en un cultivo proliferante, entonces podemos tener un desarrollo equili-
brado en el cual el nmero de clulas, el peso seco, el nitrgeno celular,
el RNA y el DNA se incrementan a la misma velocidad. Esto no ocurre
cuando el sustrato est en exceso, ya que entonces se producen veloci-
dades diferentes de incremento de uno o varios de estos parmetros.
El crecimiento y la actividad qumica de la levadura en un cultivo
dependen del medio en que ha sido preparado el inculo. Por esto,
para trabajar en un sistema de clulas enteras hay que hacer previa-
mente varias resiembras en el mismo medio con el sustrato como fac-
tor limitante. De esta manera, utilizando glucosa como sustrato, puede
estudiarse su degradacin fermentativa con formacin de etanol y CO2.
Los extractos o sistemas libres de clulas son imprescindibles para
estudiar las reacciones intermedias de la fermentacin y obtener enzi-
mas aislados. El primer extracto de levadura obtenido por los herma-
nos Bchner se preparaba tratando las clulas con arena y extrayendo
con agua y ltracin a alta presin. Levedev obtuvo extractos activos
lavando la levadura con agua, secando a 20-30C y hacindola pasar
por un tamiz no antes de secarla de nuevo a la misma temperatura.
Este preparado le permita obtener el extracto activo mezclndolo con
agua en la proporcin 1:3 e incubando a 37C durante 3 horas. Final- 45
mente, se ltra y se mantiene fro a alrededor de 0C hasta su uso. Los 4.5 FERMENTACIONES DE LA
extractos comerciales de levadura no suelen ser activos y se preparan GLUCOSA
por autolisis a 37C durante 24 h, aadiendo un poco de cloroformo
y con agitacin suave. Luego se ltran o clarican por centrifugacin
y se concentran por destilacin al vaco.
Los extractos de levadura fermentan la glucosa durante un corto
tiempo. Si se aade fosfato, la fermentacin prosigue. Esto constituy un
fenmeno clave que condujo a Harden y Young al descubrimiento de
fosfatos orgnicos en la primera etapa de la fermentacin de la glucosa.
Aparte del efecto de la adicin de fosfatos a los extractos que fermentan
glucosa, otros tres recursos experimentales resultaron bsicos para desen-
traar el mecanismo de fermentacin alcohlica por la levadura:
1. El mtodo de jacin de Neuberg. En este mtodo se emplea sul-
to clcico para jar el acetaldehdo segn se va formando. En
consecuencia no aparece etanol. Como el acetaldehdo acta
como aceptor de hidrgeno en la fermentacin alcohlica (ver
gura 4.3), otras molculas adoptan su papel. En concreto, la
dihidroxiacetona fosfato acepta hidrgeno, formndose enton-
ces glicerina.
2. Inhibidores selectivos. Cuando se aade cido monoiodoac-
tico a un extracto que contiene una hexosa difosfato, se forma,
como sucede en ausencia del mismo, una mezcla de triosas fos-
fato, pero no tiene lugar la oxidacin de los mismos a cido fos-
foglicrico. Sin embargo, el cido monoiodoactico no retarda
la descomposicin del cido fosfoglicrico. Por otra parte, el
uoruro sdico impide que el cido fosfoglicrico se desdoble
en piruvato y fosfato, pero no impide la oxidacin de la triosa
fosfato. La adicin de alguno de estos inhibidores al extracto
posibilita la acumulacin de alguno de los intermediarios en el
proceso de fermentacin de la glucosa.
3. Dilisis. Teniendo en cuenta que el cido adenlico y el Mg2+,
as como el NAD+, son dializables, esta operacin inactiva el
extracto crudo de forma reversible. El mismo no puede volverse
a activar si se ha calentado a 60C.

4.5 FERMENTACIONES DE LA GLUCOSA

Podemos considerar cuatro tipos de fermentacin de la glucosa por la


levadura, tres de ellos en un sistema de clulas enteras en condiciones
limitantes de sustrato y el cuarto a partir de extracto seco.

4.5.1 Fermentacin alcohlica


Es la transformacin cuantitativa de la glucosa en etanol y CO2. Aparte
la levadura, solamente se ha encontrado en Zymomonas mobilis, aunque
este microorganismo sigue una ruta metablica completamente distinta
(ver Lmina 1). En la gura 4.3 se presentan las distintas etapas com-
prendidas en la fermentacin alcohlica de la glucosa por la levadura.
(C6H10O5)n C6H12O6 C6H12O6
glucgeno glucosa fructosa
ATP ATP
fosforilasa + H3PO4 hexoquinasa hexoquinasa
ADP ADP

CH2OH CH2O P CH2O P


O
O O CH2OH

OH OH OH
Fioldiexosa

HO OP HO OH isomerasa
OH
OH OH OH
Glucosa-1- P Glucosa-6- P Fructosa-6- P
(Ester de Cori) (Ester de Robinson) (Ester de Neuberg)

Fosfofructoquinasa
ATP
CH2O P
C O
ADP
CH2OH
Dihidroxiacetona- P
CH2O P
Triosa fosfato O
isomerasa CH2O P
OH
HC O Aldolasa
CHOH OH
CH2O P OH
Gliceraldehdo-3- P Fructosa-1,6- PP
(Ester de Fischer) (Ester de Harden-Young)
NAD+ + H3PO4
Gliceraldehdo
fosfato deshidrogenasa
NADH + H+

COO P
CHOH
CH2O P
1,3-difosfoglicerato
(Ester de Negelein)
ADP
Fosfoglicerato
quinasa
ATP

COOH COOH H2O COOH


CHOH H C OP C OP
Fosfoglicerato Enolasa
CH2O P mutasa CH2OH CH2
3-fosfoglicerato 2-fosfoglicerato Fosfoenolpiruvato
(Ester de Nielson) ADP
Piruvato
quinasa
ATP

COOH CO2 NADH + H+ NAD+

C O HC O CH2OH
Piruvato Alcohol
descarboxilasa deshidrogenasa
CH3 CH3 CH3
Piruvato Acetaldehdo Etanol

Figura 4.3 Reacciones comprendidas en la fermentacin alcohlica de la levadura.

46
Desde la glucosa hasta la sntesis de piruvato, se trata de una va meta- 47
blica idntica a la gluclisis muscular, denominada va de las triosas o 4.5 FERMENTACIONES DE LA
de Embden-Meyerhof. Las etapas fundamentales de la misma son: GLUCOSA

1. Formacin de hexosas fosfato.


2. Formacin de triosas fosfato.
3. Oxidacin del gliceraldehdo-3 P .
4. Formacin del piruvato.
5. Descarboxilacin del piruvato.
6. Reduccin del acetaldehdo.
Por otra parte, hay que considerar tres tipos de reacciones funda-
mentales:
1. Transferencia de grupos fosfato.
2. Transferencias de H+.
3. Roturas del enlace C C .
El enzima caracterstico de la va de Embden-Meyerhof es la fosfo-
fructoquinasa.

4.5.2 Fermentacin glicrica con sulto


En sus estudios sobre el vino y la cerveza, Pasteur encontr que en la
fermentacin alcohlica siempre se produce una pequea cantidad de
glicerina. Este proceso puede aumentarse, tal como realiz Neuberg,
aadiendo sulto al sistema a n de jar el acetaldehdo, lo que pro-
voca que se produzca un mol de glicerina por cada mol de glucosa fer-
mentada:

C6 H12 O6 + Na2 SO3 + H2O Na HCO3 + CH3 CHOH Na SO3 +


CH2OH CHOH CH2OH

En estas condiciones, al no poder utilizar el acetaldehdo como acep-


tor de hidrgeno, la reoxidacin del NADH se hace a partir de la dihi-
droxiacetona fosfato, generndose entonces glicerina:

CH2O P NADH + H+ NAD+ CH2O P CH2OH


Fosfatasa
C O CHOH CHOH + Pi
Glicerofosfato
CH2OH deshidrogenasa CH2OH CH2OH

4.5.3 Fermentacin aceto-glicrica


En medio alcalino varan los productos nales de la fermentacin de
la glucosa por la levadura, producindose por cada dos moles de glu-
cosa fermentados, dos moles de glicerina, uno de cido actico y uno
de etanol:

+ H2O
2 C6 H12 O6 2 CH2OH CHOH CH2OH + CH3 COOH +
CH3 CH2OH + 2 CO2
48 En estas condiciones, la fermentacin de dos moles de glucosa genera
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL tres moles de NADH, dos de ellos formados en la oxidacin del glice-
CATABOLISMO raldehdo-3 P y uno en la transformacin de un mol de acetaldehdo
Captulo 4: ETANOL a acetato:
+ H2O
CH3 COH CH3 COOH
NAD+ NADH + H+
Acetaldehdo
deshidrogenasa

La reoxidacin de los tres moles de NADH tiene lugar con la forma-


cin de glicerina (2 moles) y etanol (1 mol).

2 glucosa

2 gliceraldehdo-3 P 2 dihidroxiacetona- P
2 NAD+

2 NADH + H+

2 piruvato 2 glicerina

acetaldehdo acetaldehdo
NAD+

NADH + H+

acetato etanol

4.5.4 Fermentacin pirvico-glicrica


Si la fermentacin se realiza con extracto seco redisuelto en solucin
de glucosa, los productos nales obtenidos son piruvato y glicerina:

C6 H12 O6 CH3 CO COOH + CH2OH CHOH CH2OH

En estas condiciones, el piruvato no se decarboxila y, de este modo,


no genera acetaldehdo, por lo que la reoxidacin del NADH se lleva a
cabo en la reaccin anteriormente ya comentada de la dihidroxiace-
tona fosfato, que es transformada en glicerina.

4.6 ACEITE DE FUSEL Y CIDO SUCCNICO

Durante la fermentacin alcohlica de la levadura se pueden producir


tambin ciertas cantidades de otros productos, siempre minoritarios,
que no se derivan de la transformacin de la glucosa, pero que tam-
poco se producen si no hay fermentacin. El aceite de fusel, que cons-
tituye del 0,1 al 0,7% del destilado de algunos mostos fermentados,
est constituido principalmente por una mezcla de los alcoholes 49
D-amlico e isoamlico, con trazas de alcoholes isobutlico y proplico 4.6 ACEITE DE FUSEL Y CIDO
normal y algunos steres y aldehdos. Ehrlich demostr que los alco- SUCCNICO
holes amlico e isoamlico se derivan de aminocidos del medio o de
protenas de la propia levadura:

CH3 CH3
+ H2 O
CH CH COOH CH CH2OH + CO2 + NH3
CH3 CH2 NH2 CH3 CH2

Isoleucina Alcohol D-amlico

CH3 CH3
H2O
CH CH2 CH COOH CH CH2 CH2OH + CO2 + NH3
CH3 CH3
NH2
Leucina Alcohol isoamlico

La formacin de los alcoholes a partir de los aminocidos puede


demostrarse aadiendo stos al medio de fermentacin y determi-
nando la aparicin de los alcoholes. No se producen en ausencia de
levadura ni sin fermentacin del azcar. La produccin de sustancias
pticamente activas durante la fermentacin ya fue sealada por Pas-
teur, quien la consider como una prueba ms de la naturaleza biol-
gica del proceso, dado que slo en este tipo de fermentaciones tiene
lugar la sntesis asimtrica, a diferencia de la sntesis orgnica que
siempre produce el racmico.
En la fermentacin alcohlica tambin puede producirse cido
succnico, el cual se deriva del cido glutmico. En este caso, el cido
succnico se forma por la glutamato deshidrogenasa y enzimas del
ciclo del cido tricarboxlico:

Glutamato deshidrogenasa
NAD(P)+ NAD(P) H + H+

HOOC CH2 CH2 CH COOH HOOC CH2 CH2 CO COOH + NH3


NH2 H2O
Glutamato
-Cetoglutarato
-
NAD+ HS CoA

+ H2O
NADH + H+ CO2
HS CoA

HOOC CH2 CH2 COOH HOOC CH2 CH2 CO ~ HS CoA


Succinato ATP ADP + Pi Succinil-CoA

Sistema de la
-cetoglutarato
- deshidrogenasa
50 4.7 DESARROLLO AEROBIO
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO Algunas especies de levadura son estrictamente aerobias, pero gene-
Captulo 4: ETANOL ralmente tienen carcter facultativo. El desarrollo aerobio depende de
un suministro de oxgeno suciente y de la concentracin de azcar,
ya que en condiciones anaerobias la velocidad de consumo del sus-
trato puede ser mucho ms alta. Las pentosas slo se utilizan aerobia-
mente siguiendo la va de Warburg-Dickens (ver captulo 5).

4.8 ASIMILACIN OXIDATIVA Y FERMENTATIVA DE LA GLUCOSA

Las levaduras, tanto cuando metabolizan oxidativamente como fer-


mentativamente la glucosa, pueden asimilar una parte de la misma,
acumulndola en la biomasa celular en forma de glucgeno, grasa,
etc. La asimilacin de la glucosa puede tener lugar tambin en siste-
mas no proliferantes, donde se excluye la utilizacin de una parte del
sustrato para la biosntesis.
En un sistema no proliferante de clulas de levadura, puede obte-
nerse una fermentacin activa de la glucosa con concentraciones del
5 al 10% a 30 C y pH 3-4. En soluciones ms diluidas de azcar es
tambin fcil obtener un rpido consumo aerobio. La fermentacin
alcohlica y el proceso respiratorio permiten esperar, respectiva-
mente, una produccin de 44,8 ml de CO2 o un consumo de 134,4 ml
de O2 por milimol de glucosa utilizada. Sin embargo, la determina-
cin experimental de estos parmetros muestra que se obtiene menos
CO2 y se consume menos O2 de los esperado. Barker fue el primero
que, estudiando el alga Prototheca zophii, observ que slo se consu-
ma un 30% del oxgeno correspondiente al terico necesario para
mineralizar el acetato incorporado del medio. Como no haba acetato
intracelular ni intermediarios de su oxidacin, concluy que haba
una asimilacin oxidativa del acetato que deba conducir a la forma-
cin de reservas del tipo (CH2O). Pickett y Clifton demostraron que
cuando Saccharomyces cerevisiae utiliza glucosa aerobiamente tambin
consume solamente el 50% del O2 necesario para la respiracin del
azcar tomado del medio. Poco ms tarde, van Niel y Anderson pusie-
ron de maniesto que durante la fermentacin con exceso de sustrato
slo se produca el 35% del CO2 terico. En los sistemas no prolife-
rantes, siempre y cuando el sustrato se encuentre en exceso, las leva-
duras dan lugar a una asimilacin oxidativa o fermentativa de una
fraccin de la glucosa que se incorpora del medio. Se ha demostrado
citolgica y qumicamente que esta glucosa se transforma en una sus-
tancia muy parecida al glucgeno del msculo.
La asimilacin de glucosa puede valorarse fcilmente midiendo los
azcares totales despus de recuperar las clulas del cultivo, lavarlas e
hidrolizarlas. Si se utiliza glucosa al 10%, un resultado caracterstico
se reeja en la tabla 4.1.
51
TABLA 4.1 Proporcin de azcares totales en clu-
las de levadura recuperadas a diferentes intervalos de 4.8 ASIMILACIN OXIDATIVA Y
tiempo del medio de cultivo. FERMENTATIVA DE LA GLUCOSA

Azcares totales Tiempo de incubacin


(%/peso seco) (min)
6,2 0
8 15
10,4 30
10,9 50
12 60

La formacin de glucgeno tiene lugar a partir de la glucosa-1- P :

C6 H12 O6 + ATP G-6- P + ADP


Hexoquinasa

G-6- P G-1- P
Fosfohexosaisomerasa

G-1- P + UTP UDP-glucosa + PPi


UTP-glucosa fosforilasa

Tiempo de
incubacin

90 min
Produccin de CO2 (ml h1 100 g1 peso seco)

600

70 min
500

400
50 min

300

200
30 min

100

0 min
10 20 30 40 50 60
Tiempo de fermentacin (Min)
Figura 4.4 Intensidad de la fermentacin endgena en funcin del tiempo
de incubacin.
52 La UDP-glucosa se polimeriza formndose un -1,4-glucano con la
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL UDP-glucano sintasa. Posteriormente se ramica rompindose enla-
CATABOLISMO ces 1,4 y unindose de nuevo por enlaces 1,6, por efecto de una
Captulo 4: ETANOL amilo-1,6-glucosidasa.
Algunas levaduras acumulan tambin grasa como consecuencia de
la asimilacin de la glucosa. La grasa de las levaduras est constituida
por una mezcla de lpidos.

4.9 FERMENTACIN ENDGENA

Las reservas formadas por asimilacin de la glucosa pueden utilizarse


en ausencia de sustrato exterior. La produccin de CO2 por una sus-
pensin de clulas lavadas a pH 3-4 despus de diferentes tiempos de
incubacin en glucosa al 10% es del tipo representado en la gura
4.4. La intensidad de la fermentacin aumenta con el tiempo de incu-
bacin y, en consecuencia, en funcin de la cantidad de reserva acu-
mulada. En condiciones basales se consumen por fermentacin
endgena 60 mg de glucgeno/h por cada 100 g de peso seco. Des-
pus de 1 h de incubacin en glucosa al 10%, se pasa a 2000 mg/h por
cada 100 g. Esta diferente velocidad de fermentacin del glucgeno
basal (previamente acumulado) y del de nueva sntesis ha hecho pen-
sar que quizs se trate de dos tipos de glucgeno diferentes. De hecho,
hay evidencias que indican que las levaduras pueden sintetizar dos
tipos diferentes de molculas de glucgeno.
El carcter endgeno de la fermentacin puede ponerse de mani-
esto mediante el uso de inhibidores. El nitrato de uranilo a concentra-
cin de 4 105 M no penetra en la clula, pero inhibe en un 80% la
utilizacin de la glucosa exterior. No obstante, no afecta en absoluto a
la fermentacin endgena. En cambio, el uoruro sdico, que a una
concentracin 102 M penetra en la clula impidiendo la formacin de
piruvato, inhibe un 80% tanto la utilizacin de la glucosa exterior
como la fermentacin endgena. El DNP (dinitrofenol) a una concen-
tracin 3 104 M, como la azida sdica o la aureomicina, inhiben
tanto la asimilacin oxidativa de la glucosa como la fermentativa.
Las reseas que se reeren en este captulo acerca del metabolismo
de las levaduras ponen de maniesto que el sistema no proliferante, ya
est en una fase metablica oxidativa o fermentativa, no se halla ni
mucho menos restringido a la oxidacin de la glucosa hasta CO2 o a su
fermentacin hasta etanol y CO2, sino que pueen existir de forma alter-
nativa o concomitante a estos procesos otras actividades metablicas
que provocan la aparicin en el medio externo de diferentes tipos de
metabolitos o incluso la acumulacin intracelular de reservas.

BIBLIOGRAFA

LOODER, J. The Yeasts (J. Looder, ed.). North-Holland Publishing Co. Amster-
dam 1970.
ROSE, A. H. y HARRISON, J. S. The Yeasts. 3 vols. Academic Press. London
and New York. 1969.
5 CIDO ACTICO

5.1 EL VINAGRE 54
5.2 CARACTERSTICAS GENERALES DE LAS BACTERIAS DEL
CIDO ACTICO 55
5.3 CINTICA DE LA PRODUCCIN DE ACETATO 56
5.4 OXIDACIN DEL ETANOL 60
5.5 OXIDACIN DE ALCOHOLES PRIMARIOS 61
5.6 CETOGNESIS 62
5.7 OXIDACIN DE POLIALCOHOLES 62
5.8 OXIDACIN DE LOS CIDOS LCTICO Y
PIRVICO 63
5.9 OXIDACIN DE AZCARES 63
5.9.1 El sistema de la glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa 63
5.9.2 Va de Entner-Doudoroff 64
5.9.3 Ciclo de la hexosa monofosfato o va de Warburg-
Dickens 66
5.9.4 Formacin de gluconato 66
5.9.5 Utilizacin del gluconato 69
5.9.6 El sistema de las fosfocetolasas 69
5.10 MODELOS DEL METABOLISMO OXIDATIVO DE LAS
BACTERIAS DEL CIDO ACTICO 71
5.11 FORMACIN DE CELULOSA 71
BIBLIOGRAFA 72
54 5.1 EL VINAGRE
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO El vinagre se conoce hace milenios. Puede denirse como un condi-
Captulo 5: CIDO ACTICO mento hecho a partir de sustancias que contienen azcares o fculas y
que experimentan una fermentacin alcohlica seguida de fermenta-
cin actica. Contiene unos 4 g de cido actico/100 ml. Adems
tiene pequeas cantidades de etanol, glicerina, steres, azcares, pen-
tosas, sales minerales y otras sustancias. Su composicin depende de
la materia prima, del proceso de obtencin y de la maduracin. La
FDA americana distingue: vinagre de sidra o manzana, de vino o uva,
de malta, de melazas, de glucosa y vinagre destilado.
Existen distintos sistemas de fabricacin. El mtodo llamado de
Orleans, que utiliza barriles de unos 200 litros llenos de vino hasta una
tercera parte, es el ms antiguo. Produce de 10 a 15 litros de vinagre
cada cuatro o cinco semanas. Es lento y caro, pero puede producir los
vinagres de mesa de mejor calidad. La madre del vinagre es la pelcula
que se forma sobre la supercie del medio. Esta pelcula va transfor-
mando el vino en vinagre desde la supercie hacia el fondo. Se van
aadiendo de 10 a 15 litros de vino cada cuatro o cinco semanas, a
medida que se separa un mismo volumen de vinagre. Hay que vigilar la
aireacin y que no se hunda la pelcula supercial. Existen procesos
rpidos, como el de Boerhave o alemn, en los que se hace pasar el vino
a travs de bagazo de manzanas u otros soportes porosos. El generador
de Fings utiliza virutas de haya y puede producir 300 litros de vinagre
destilado por da. El acetator es un tipo de fermentador que permite un
cultivo en profundidad que da tambin altos rendimientos.
Persson (1822) design a la pelcula supercial que se forma sobre
el vino con el nombre de Micoderma, considerando que se trataba de
un hongo relacionado con las levaduras. Pasteur (1868) atribuy la
formacin de vinagre a una fermentacin actica del etanol por una
bacteria o fermento de crecimiento en supercie que denomin Mico-
derma aceti. En realidad el micoderma contiene una ora compleja
dentro de un limo broso que incluye burbujas de CO2 que facilitan
su otacin. Eventualmente puede contener incluso gusanos nemato-
dos (Anguilula aceti). Existe tambin el Micoderma vini que no forma
vinagre, constituido por una ora compleja en la que dominan leva-
duras aerobias.
Hansen (1878) fue el primero en demostrar que la transformacin
del etanol en cido actico la realizan unas bacterias particulares de
las cuales hay varios tipos y que en conjunto se denominan actual-
mente bacterias del cido actico. Hansen obtuvo el cultivo puro de
varias de ellas. Realiz la fermentacin actica del etanol con cultivos
puros y mixtos y puso claramente de maniesto la necesidad de ox-
geno, lo que pona en entredicho el concepto de fermentacin ac-
tica, puesto que en rigor el trmino fermentacin es slo aplicable
a procesos anaerobios.
El conocimiento actual de las bacterias del cido actico se basa
fundamentalmente en los trabajos de Frateur (1960), Asai (1964), De
Ley (1970) e Izuka Komasata (1980).
TABLA 5.1 Caractersticas diferenciales de los gneros Gluconobacter, Acetobacter y Pseudomonas.

Caractersticas Gluconobacter Acetobacter Pseudomonas

Flagelacin Polar o ninguna Peritrica o ninguna Polar


Crecimiento a pH 4,5 + +
Oxidacin de:
Etanol a cido actico a pH 4,5 +(M) +(F)
cido actico a CO2 + d
Lactato a CO2 + +
Glucosa a gluconato + d d
Aminocidos por clulas en reposo + +
Ciclo de Krebs + +
Produccin de 5-cetogluconato + d
Cetognesis + d
Quinonas Q10 +
Quinonas Q9 +
Hidrlisis de:
Lactosa y almidn d
Gelatina /D d
Pigmentos verdosos y/o uorescentes d

* M, moderado; F, fuerte; D, dbil; d, variable segn la cepa.

5.2 CARACTERSTICAS GENERALES DE LAS BACTERIAS DEL CIDO ACTICO


Se trata de bacterias gramnegativas (grampositivas en cultivos viejos),
bacilares o pleomrcas y estrictamente aerobias. Se distribuyen en
los gneros Acetobacter y Gluconobacter, segn tengan o no capacidad
de oxidar el acetato (presencia del ciclo de Krebs funcional). Pueden
considerarse logenticamente prximas al grupo Pseudomonas. En la
tabla 5.1 se resean las caractersticas diferenciales.
Adems de la fermentacin actica, pueden formarse cido glucu-
rnico de la glucosa, sorbosa del sorbitol, dihidroxiacetona de la gli-
cerina y 5-cetogluconato de la glucosa. Las bacterias del cido actico
oxidan muchos alcoholes y cidos orgnicos como el pirvico y el
lctico; algunas de ellas producen celulosa (caso nico en las bacte-
rias). Gluconobacter es siempre catalasa positivo, pero dentro del
gnero Acetobacter la prueba de la catalasa puede dar una reaccin
dbil o incluso nula (A. peroxydans). La caracterstica metablica que
dene al grupo es la capacidad de utilizar una gran diversidad de sus-
tratos y la incapacidad de oxidarlos completamente. A pesar de tra-
tarse de microorganismos aerobios, acumulan en el medio en que
crecen una gran cantidad de catabolitos diferentes.
Las bacterias del cido actico pueden aislarse fcilmente del vina-
gre y tambin del vino, la cerveza o los zumos de frutas agriados. Para
su aislamiento, basta con centrifugar un volumen de uno de estos
medios, resuspender el sedimiento en Ringer 1/4 y sembrar diluciones
sucesivas de la suspensin en placas de agar que contengan 0,05% de
triptona, 2% de glucosa 1% de CaCO3 y 20% de extracto de carne.
55
56 Despus de una incubacin a 30 C durante 2 3 das, las colonias
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL que forman las bacterias del cido actico pueden reconocerse porque
CATABOLISMO clarican el medio a su alrededor (disolucin de la dispersin de
Captulo 5: CIDO ACTICO CaCO3) formando un halo. Pueden repicarse sobre el mismo medio
para obtener subcultivos. La gran cantidad de extracto de carne que se
aade al medio se justica en funcin de la necesidad de asegurar el
suministro de una serie de factores de crecimiento que en el extracto
de carne se hallan ms o menos diluidos.
Existe un mtodo sencillo y elegante que permite diferenciar rpi-
damente los tres grupos de bacterias reseados anteriormente (Pseudo-
monas, Acetobacter y Gluconobacter). Para ello, se preparan tubos con
6,5 ml de un medio formado por extracto de levadura (3%), agar (2%)
y verde de bromocresol (1 ml/l de una solucin al 2,2%). Despus de
esterilizar el medio y antes de que solidique, se aade a cada tubo 1
ml de etanol al 15%. Se permite la solidicacin de los tubos en posi-
cin inclinada y se inocula en estra, incubndose a 28 C. A medida
que el crecimiento alrededor de la estra se hace ostensible, pueden
producirse cambios en el color del medio, inicialmente verde. Gluco-
nobacter provoca el cambio a amarillo. Acetobacter vira inicialmente el
medio a amarillo, para volver ms tarde al color verde inicial. En cam-
bio, el crecimiento de Pseudomonas en este medio no provoca en nin-
gn momento un cambio de color del mismo.

5.3 CINTICA DE LA PRODUCCIN DE ACETATO

Para un estudio elemental de la cintica de produccin de acetato por


las bacterias del cido actico hay que determinar como mnimo cua-
tro parmetros: las concentraciones de acetato, de etanol y de glu-
cosa, y tambin el crecimiento.
La concentracin de cido actico en soluciones del mismo puede
determinarse por simple volumetra con NaOH 0,5 N, utilizando
fenolftalena como indicador. Otra alternativa es realizar previamente
una destilacin a volumen constante a pH 4,5. No obstante, para el
tipo de estudio que aqu se comenta, resulta mejor la cromatografa
de gases, despus de extraccin metanlica y oxidacin con cido sul-
frico. El destilado a bao mara se lleva a un volumen determinado
con metanol, se aaden unas gotas de cido sulfrico y se inyecta una
pequea alcuota. El cromatograma que se obtiene presenta tres
picos, que corresponden a metxido de metilo, acetato de metilo y
metanol. Se obtiene el calibrado con patrones de acetato.
El etanol suele determinarse por el mtodo de Buchner y Redetzki,
basado en la reaccin de la alcohol deshidrogenasa:

CH3 CH2OH + NAD+ CH3 CHO + NADH + H+

La concentracin de etanol se determina en funcin de la variacin


de absorbancia a 340 nm debida a la reduccin del NAD+.
La glucosa se determina por la reaccin de la glucosa oxidasa:

Glucosa + O2 D-Gluconolactona + H2O2


El perxido de hidrgeno producido se determina colorimtricamente. 57
El crecimiento puede seguirse por la absorbancia a 400 nm. 5.3 CINTICA DE LA PRODUCCIN DE
Los inculos para el estudio se obtienen mediante cultivos de 48 h ACETATO
incubados a 30 C en el siguiente medio: triptona 0,5%; glucosa 2%;
CaCO3 1% y extracto de hgado 10%. El medio de ensayo (100 ml)
puede estar constituido por extracto de levadura (0,1%) juntamente
con cantidades de etanol, acetato sdico o glucosa y 10 ml de inculo
en frascos de Roux. Las cepas de Pseudomonas y Gluconobacter se incu-
ban a 30 C y las de Acetobacter a 26 C.
Con etanol al 4,5% pueden obtenerse las curvas de produccin de
acetato indicadas en la gura 5.1. Los cultivos de Pseudomonas no pro-
ducen acetato, pero en ellos puede seguirse el consumo de etanol, el
cual es posible simultanear con el de acetato.
3
gr. c. actico/100 ml.
2
1

(a) 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220


Horas
3
gr. c. actico/100 ml.
1 2

(b) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110


Horas
gr. cido actico/100 ml. y ml. etanol/100 ml.
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1

Acetato
Etanol

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120


(c) Horas

Figura 5.1 Produccin de acetato por Gluconobacter (a) y Acetobacter


(b). En (c) se representa el consumo de acetato y etanol por Pseudomonas.
58 En Acetobacter, la concentracin de etanol puede aumentarse como
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL mximo hasta el 7%, concentracin que ya inhibe el crecimiento. La
CATABOLISMO concentracin de acetato producido slo puede llegar al 5%, ya que por
Captulo 5: CIDO ACTICO encima de esta concentracin inhibe su propia oxidacin, pero no
impide que siga oxidndose el etanol (gura 5.2). Si se aade etanol
cuando se est utilizando el acetato, la oxidacin de ste se para inme-
diatamente. Por lo tanto, el etanol ejerce una inhibicin de la oxida-
cin del acetato. Si se observan las curvas de crecimiento, puede
detectarse un tpico fenmeno de diauxia, con una fase de reposo al
pasar de la utilizacin de uno a otro sustrato, lo cual sugiere un efecto
represor de la sntesis de los enzimas necesarios en uno y otro caso. De
todas formas, a partir de una concentracin de etanol del 5% se obtiene
una produccin de acetato idntica en Gluconobacter y Acetobacter.
Por adiciones sucesivas de etanol pueden obtenerse concentracio-
nes de hasta el 13% de acetato, tal como se indica en la gura 5.3a.
Acetobacter aceti, creciendo sobre glucosa, produce acetato que luego
es utilizado simultneamente con el azcar, si bien se mantiene una
cierta cantidad de cido mientras hay glucosa disponible (gura 5.3b).
6
gr. c. actico/100 ml.

5,25
5

EtOH
5,00%
4
3
2
1

3,50% EtOH 4,5% EtOH


4,00%
24 48 72 96 120 144 168
(a) Horas

10 20 30 40 50 60 70 80 90
3
gr. c. actico/100 ml.
2
1

Adicin 2% etanol

24 48 72 96 120 144 168


(b) Horas
Figura 5.2 (a) Efecto de la concentracin de etanol en el medio sobre la
produccin y consumo de cido actico por Acetobacter aceti. (b) Produc-
cin y consumo de cido actico ( ) por Acetobacter aceti a lo largo del cre-
cimiento ( ). Efecto de la adicin de etanol.
59
c. actico

10
5.3 CINTICA DE LA PRODUCCIN DE
gr. c. actico/100 ml. y ml. etanol/100 ml.
9
ACETATO
8
7
6
5

Etanol
4
3
2
1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
(a)

1,5
9
8
ml. NaOH 0,1 N/5 ml. medio

Glucosa
7

gr. glucosa/100 ml.


6

1
5
4

0,5
3
2
1

Adicin 1% c. actico

24 48 72 96 120
(b) Horas
grs. c. actico/100 ml. y ml. EtOH/1

0,5 6

5
log n

0,0 4

3
Log n

0,5 2

Actico EtOH
1

1,0
24 48 72 96 120
(c) Horas

Figura 5.3 (a) Produccin de cido actico ( ) por Acetobacter aceti con
adiciones sucesivas de etanol ( ) al medio de cultivo. (b) Consumo de glu-
cosa ( ) y cido actico () por Acetobacter aceti. (c) Efecto de la adicin de
etanol al medio. Efecto sobre el crecimiento () y la produccin de acetato
( ) de adiciones sucesivas de vino ( ) a un cultivo en fermentador de Aceto-
bacter aceti.
60 5.4 OXIDACIN DEL ETANOL
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
La oxidacin del etanol por las bacterias del cido actico tiene lugar
CATABOLISMO
Captulo 5: CIDO ACTICO en dos etapas, llevando la primera de ellas a la produccin de acetal-
dehdo y la segunda a acetato:

Alcohol
deshidrogenasa
1) CH3 CH2OH CH3 CHO
2H

Aldehdo H Aldehdo
deshidrogenasa deshidrogenasa
2) CH3 CHO CH3 C OH CH3 COOH
+ H2O 2H
OH
Hidrato de aldehdo

La reaccin global de la fermentacin actica

CH3 CH2OH + O2 CH3 COOH + H2O

es una oxidacin sin produccin de CO2, por lo que aparentemente


correspondera a una asimilacin de oxgeno por una reaccin mono-
oxigensica (ver captulo 13).

AH + 2 H+ + O2 AOH + H2O

En realidad se trata de dos reacciones deshidrogensicas en las cuales


los 4 H van a formar 2 H2O con O2 por una cadena respiratoria que
comprende la citocromo oxidasa. Una de las dos molculas de agua es
requerida para la oxidacin del acetaldehdo.
Tal como se ha comentado anteriormente, las especies del gnero
Gluconobacter no tienen ciclo del cido ctrico funcional y acumulan
acetato. Las del gnero Acetobacter slo acumulan acetato mientras
hay alcohol en el medio, pero luego pueden oxidar el acetato hasta
CO2. En el gnero Pseudomonas la oxidacin del acetato tiene lugar
simultneamente con la del etanol. La capacidad de oxidar el acetato
no es uniforme en todos los miembros del gnero Acetobacter. As, A.
peroxydans oxida el acetato muy lentamente. Si se trabaja con extrac-
tos crudos de esta bacteria, al aadir etanol como sustrato se obtiene
acetato junto a intermediarios del ciclo de Krebs, lo que sugiere que
existe la capacidad de oxidar el acetato transriendo los electrones
hasta la cadena respiratoria, que no es funcional en el extracto crudo.
En tales extractos se ha podido poner en evidencia la existencia de
una alcohol deshidrogenasa NAD+ dependiente muy parecida a la de
los organismos superiores. En cambio, la oxidacin del acetaldehdo
se lleva a cabo por una citocromo c553 reductasa sin la intervencin
del NAD+.
En los miembros del gnero Gluconobacter, tanto la oxidacin del
etanol como la del acetaldehdo estn ligadas directamente a la cito-
cromo c553 reductasa y tienen un pH ptimo entre 5,7 y 6,2. En la sub-
Etanol 61

5.5 OXIDACIN DE ALCOHOLES


2H NAD+ Cit c553 Cit Ox O2 PRIMARIOS

Acetaldehdo

2H

Acetato

CAT
CAT: ciclo de los cidos tricarboxlicos o de Krebs
1
O
2 2
CR: cadenas respiratorias
CR CO2
Cit Ox: citocromo oxidasa
H 2O
Acetobacter

Etanol

2H Cit c553 Cit Ox O2

Acetaldehdo

2H

Acetato
Gluconobacter
Figura 5.4 Oxidacin del etanol en Acetobacter y Gluconobacter. Ntese
que Gluconobacter no requiere la participacin del NAD+.

especie suboxydans de G. oxydans el pH ptimo se halla entre 3,7 y 4,7,


como en la mayora de los miembros del gnero Acetobacter. Esto
sugiere que en las bacterias del cido actico el transporte de hidrgeno
desde el etanol y el acetaldehdo puede depender de enzimas diferen-
tes. En trminos generales la oxidacin del etanol en Gluconobacter y
Acetobacter puede representarse como se indica en la gura 5.4.
En Acetobacter, la alcohol deshidrogenasa moviliza todo el NAD+
mientras hay alcohol disponible. El ciclo de Krebs se paraliza al no
disponer de NAD+.

5.5 OXIDACIN DE ALCOHOLES PRIMARIOS

Las bacterias del cido actico pueden oxidar otros alcoholes prima-
rios adems del etanol. As, por ejemplo, la oxidacin del etilenglicol
62 y del 1,3-butanodiol llevan a la produccin de cido gliclico y 3-
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL hidroxibutirato respectivamente:
CATABOLISMO
Captulo 5: CIDO ACTICO CH2 CH2OH CH2 CHO H 2O CH2 COOH
OH 2H OH 2H OH
Etilenglicol Aldehdo cido gliclico
gliclico

H2O
CH3 CH CH2 CH2OH CH3 CH CH2 CHO CH3 CH CH2 COOH
2H 2H
OH OH OH
1,3-Butanodiol Aldehdo 3(OH) butrico 3(OH) butirato

Los alcoholes de ms de cinco tomos de carbono son txicos y


slo se oxidan a muy bajas concentraciones.

5.6 CETOGNESIS

Las bacterias del cido actico convierten muchos alcoholes secunda-


rios en cetonas. Los siguientes ejemplos son caractersticos:

CH2OH CH2OH
CHOH C O
2H
CH2OH CH2OH
Glicerina Dihidroxiacetona

CH3 CH3
CHOH C O
2H
CHOH CHOH
CH3 CH3
2,3-Butanodiol Acetoina

CH3 CH3
CHOH C O
2H
CH2OH CH2OH
1,2-Propanodiol Acetol

5.7 OXIDACIN DE POLIALCOHOLES

Muchas bacterias del cido actico oxidan alcoholes a azcares. De


este modo tenemos:
Manitol Fructosa
Sorbitol Sorbosa
Eritritol Eritrulosa
La sorbosa, mediante una serie de oxidaciones, es transformada qu- 63
micamente en cido 2-ceto-L-gulnico, que mediante un tratamiento 5.8 OXIDACIN DE LOS CIDOS
cido se convierte en cido ascrbico (vitamina C). Actualmente, la LCTICO Y PIRVICO
produccin comercial de vitamina C se realiza a partir de la D-glu-
cosa, en un proceso que comprende diferentes transformaciones qu-
micas y una etapa fermentativa, la oxidacin del sorbitol a sorbosa,
que es catalizada por Gluconobacter oxydans.

5.8 OXIDACIN DE LOS CIDOS LCTICO Y PIRVICO

Hay miembros de los gneros Acetobacter y Gluconobacter que oxidan


el cido lctico (-hidroxicido). Se conocen dos modalidades:
1. Oxidacin a piruvato. Se han identicado varias lctico deshi-
drogenasas estereoespeccas. Algunas utilizan NAD+, pero
otras dependen del FAD o del citocromo c:

CH3 CHOH COOH CH3 CO COOH


2H

2. Oxidacin directa a acetato. Tiene lugar a travs de una mono-


oxigenasa u oxidasa de funcin mixta:

(*)
(*)
CH3 CHOH COOH + O2 CH3 COOH + CO2 + H2O

(*) oxgeno procedente de O2

El cido pirvico tambin es transformado en acetato por muchas


bacterias del cido actico. Al igual que en las levaduras, y a diferencia
del resto de las bacterias, no se sigue una descarboxilacin oxidativa,
sino una reaccin catalizada por una piruvato descarboxilasa que ori-
gina directamente CO2 y acetaldehdo. Este ltimo es luego oxidado a
acetato segn se ha descrito.

5.9 OXIDACIN DE AZCARES

Las bacterias del cido actico oxidan pentosas y hexosas, pero a dife-
rencia de los miembros del gnero Pseudomonas, no utilizan triosas.

5.9.1 El sistema de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa


Es el ms utilizado para la oxidacin de las hexosas. Comprende tres
reacciones que transforman un mol de glucosa-6-fosfato en un mol de
ribulosa-5-fosfato con formacin de dos moles de NADPH (g. 5.5).
La descarboxilacin oxidativa del 6-fosfogluconato se realiza proba-
blemente en dos etapas (g. 5.6).
En todos los casos la produccin de energa tiene lugar en la reoxi-
dacin del NADPH. Esto condiciona una baja disponibilidad de
NAD+, que queda todo en forma reducida parando el ciclo de Krebs
cuando ste es funcional, tal como sucede en los miembros del
CH2O P CH2O P
NADP+ NADPH + H+
O O

OH OH O
Glucosa-6- P deshidrogenasa
HO OH HO
OH OH
Glucosa-6- P D-Glucono--lactona-6- P
D-Glucono--lactona-6-

H2O
Gluconolactonasa

COOH
CH2OH NADPH + H+ NADP+ HC OH
CO2
C O OH CH
HC OH 6- P -gluconato HC OH
deshidrogenasa
HC OH HC OH
CH2O P CH2O P

Ribulosa-5- P 6- P -gluconato
Figura 5.5 Las dos etapas de la descarboxilacin oxidativa del sistema de la glucosa-6-
fosfato deshidrogenasa.

gnero Acetobacter. En general, la reoxidacin de coenzimas se realiza


a travs de una cadena respiratoria que contiene quinonas, citocromo
c y a, pero no citocromo b. En Gluconobacter slo se presentan la qui-
nona Q10 y el citocromo c. En todos los casos se presenta la citocromo
oxidasa. La fosforilacin oxidativa tiene lugar en la reoxidacin del
citocromo c y de la citocromo oxidasa con un rendimiento de P/O = 2
(4 moles de ATP/mol O2).

5.9.2 Va de Entner-Doudoroff

En Gluconobacter oxydans ssp. melanogenes, el 6-fosfogluconato puede


deshidratarse a 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato. Este compuesto
puede desdoblarse luego en piruvato y gliceraldehdo-3- P mediante
una aldolasa (g. 5.6). Mediante esta ruta se produce menos NADPH
que en la situacin en la que el 6-fosfogluconato es descarboxilado a
ribulosa-5- P . Adicionalmente, el gliceraldehdo-3- P se oxida a piru-
vato por la va de Embden-Meyerhof, decarboxilndose en ambos
casos el piruvato y originando acetato tal como ha sido descrito ante-
riormente. Esta va se conoce como va de Entner-Doudoroff, y es la
misma utilizada por Zymonomas mobilis para llevar a cabo una fer-
mentacin alcohlica con una estequiometra similar a la de las leva-
duras (ver captulo 6 o Lmina 1).
64
* COOH * COOH * CO2
+
HC OH NADP+ NADPH + H+ HC OH CH2OH
Mn2+
(a) HO CH C O C O
HC OH HC OH HC OH
HC OH HC OH HC OH
CH2O P CH2O P CH2O P
6- P -Gluconato 3-Ceto-6- P -gluconato Ribulosa-5- P

COOH COOH COOH


HC OH C O C O Piruvato

(b) HO CH CH2 CH3


Aldolasa
HC OH H2O HC OH HC O
6- P -Gluconato
HC OH HC OH HC OH Gliceraldehdo-3- P
dehidratasa
CH2O P CH2O P CH2O P
6- P -Gluconato 2-Ceto-3-desoxi-
6- P -gluconato

1 CH3 1 CH3
2 C O 2 CH2OH
f 3 COOH 3 CO2
rho
1 HC O eye
-M 4 COOH 4 CO2
2 H C OH en
bd 5 C O 5 CH2OH
(c) 3 HO CH Em
6 CH3 6 CH3
4 HC OH
En
tn

5 HC OH 1 COOH 1 CO2
er
-D
ou

6 CH2O P 2 C O 2 CH2OH
do
ro

3 CH3 3 CH3
ff

Glucosa-6- P

4 COOH 4 CO2
5 C O 5 CH2OH
6 CH3 6 CH3

Figura 5.6 Las dos vas del 6- P -gluconato. (a) sistema de la 6- P -gluconato deshidrogenasa (b) reaccin
clave de la va de Entner-Doudoroff (c) origen de los tomos de C de las molculas de CO2 formadas en la fer-
mentacin alcohlica de la glucosa por las levaduras (va de Embden-Meyerhof) y Zymonomas mobilis (va
de Entner-Doudoroff) (ver Lminas 1 y 3).
65
66 5.9.3 Ciclo de la hexosa monofosfato o va de Warburg-Dickens
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
Si la degradacin de la glucosa utilizando el sistema de la glucosa-6-
CATABOLISMO
Captulo 5: CIDO ACTICO P -deshidrogenasa (ver apartado 5.9.1) conduce a la formacin de
ribulosa-5- P , la misma puede convertirse en xilulosa-5- P y ribosa-
5- P (g. 5.7). A partir de la xilulosa-5- P , algunas bacterias del cido
lctico (ver captulo 6) pueden producir acetilfosfato y gliceraldehdo-
3- P . El gliceraldehdo-3- P es transformado en lactato siguiendo la
va de Embden-Meyerhof. Esta va metablica, anaerobia, que fer-
menta la glucosa produciendo lactato y etanol, es conocida como va
de la pentosa, y se caracteriza por la presencia de la pentosa fosfoceto-
lasa que cataliza la transformacin de la xilulosa-5- P en acetilfosfato
y gliceraldehdo-3- P (ver captulo 6 y Lminas 2 y 3).
La ribosa-5- P es importante como precursor para la biosntesis de
las purinas, las pirimidinas y los aminocidos aromticos, pero en el
contexto del metabolismo de hexosas y pentosas por las bacterias del
cido actico se utiliza en su mayor parte juntamente con xilulosa-5-
P para generar gliceraldehdo-3- P y sedoheptulosa-7- P a travs de
la transcetolasa (g. 5.7). Posteriormente, una serie de transformacio-
nes llevan a producir bien una triosa- P (que puede ser degradada por
la va de Embden-Meyerhof) o una hexosa- P que entra nuevamente
en el ciclo.
El ciclo de la hexosa monofosfato puede mineralizar la glucosa
(C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O), siempre que a travs de las
cadenas respiratorias se reoxide el NADPH + H+ y se regenere el ATP.
En la gura 5.8 se representa la forma en la que se utilizan las reaccio-
nes de las gs. 5.6a y 5.7 para vericar este proceso de acuerdo con el
balance global:

6 Glucosa + 1 ATP + 12 NADP+ + 6 H2O 5 G-6- P +


1 ADP + 12 NADPH + H+ + 6 CO2 + Pi

5.9.4 Formacin de gluconato

Gluconobacter oxydans ssp. suboxydans presenta dos glucosa deshidro-


genasas:

a) Glucosa D-Glucono--lactona + H2O2

que aparentemente es idntica a la glucosa oxidasa que trabaja con


DPI (2,6-dinitrofenol indofenol) como aceptor de hidrgeno en lugar
de O2, y:

b) Glucosa D-Glucono--lactona
NAD+ NADH + H+

En ambos casos, la gluconolactona se hidroliza a gluconato (g. 5.9).


CH2OH 67
C O
5.9 OXIDACIN DE AZCARES
HC OH
HC OH
CH2O P
Ribulosa-5- P
Ribulosa fosfato Ribulosa fosfato
3-epimerasa isomerasa

CH2OH HC O
C O HC OH
HO CH HC OH
HC OH HC OH
CH2O P CH2O P
Xilulosa-5- P Ribosa-5- P

Transcetolasa

HC O CH2OH
Una transcetolasa primero HC OH C O
y una transaldolasa despus
catalizan las reacciones CH2O P HO CH
5C + 5C 3C + 7C y Gliceraldehdo-3- P HC OH
3C + 7C 6C + 4C
respectivamente HC OH
HC OH
CH2O P
Sedoheptulosa-7- P

Transaldolasa
CH2OH
CH2OH HC O C O
La eritrosa-4- P , C O HC OH HO CH
como la ribosa-5- P ,
son importantes HO CH HC OH H C OH
precursores de la HC OH CH2O- P CH2O- P
biosntesis de las
purinas, pirimidinas HC OH Eritrosa-4- P Xilulosa-5- P
y aminocidos aromticos
CH2O P
Fructosa-6- P Transaldolasa

CH2OH HC O
C O H C OH
La eritrosa-4- P , juntamente HO CH CH2O- P
con una nueva molcula de
xilulosa-5- P , condensa en una HC OH Gliceraldehdo-3- P
reaccin catalizada por la aldolasa, HC OH
generando fructosa-6- P y Triosa- P -isomerasa
HC O
gliceraldehdo-3- P CH2O- P
HC OH CH2OH
Fructosa-6- P
Al

CH2O- P
do

C O
la
sa

Gliceraldehdo-3- P
CH2O- P
Dihidroxiacetona- P
HC O CH2O- P CH2OH

El ciclo se cierra con una HC OH C O C O


serie de transformaciones HO CH HO CH
Hexosa
HO CH
difosfatasa
que producen glucosa-6- P ,
fructosa-1,6- PP o triosa- P HC OH HC OH H C OH
Pi
HC OH HC OH H C OH
CH2O- P CH2O- P CH2O- P
Glucosa-6- P Fructosa-1,6- PP Fructosa-6- P

Figura 5.7 Transformaciones de la ribulosa-5- P .


68 ATP ADP

Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL Glucosa 6 G-6- P


CATABOLISMO
Captulo 5: CIDO ACTICO
6 H2O
Reacciones
de la
fig. 5.6a 12 NADP+
12 NADPH + H+
6 CO2

5F-6- P
6 Ru-5- P
2F-6- P

3F-6- P
2 R-5- P 2X-5- P 2X-5- P

F-6- P

PI Reacciones de la transcetolasa
2F-6- P
y transaldolasa (fig. 5.7)
F-1,6- PP

2 GA-3- P 2 E-4- P

Figura 5.8 Mineralizacin de un mol de glucosa por la va de la hexosa monofos-


fato (Warburg-Diekens o va de la pentosa fosfato).

CH2OH CH2OH
O NAD+ NADH + H O

OH OH O
HO OH HO
OH OH
Glucosa-deshidrogenasa
H2O
lactonasa

COOH
HC OH
HO CH
HC OH
HC OH
CH2OH
Gluconato
Figura 5.9 Formacin de gluconato.
5.9.5 Utilizacin del gluconato 69

5.9 OXIDACIN DE AZCARES


En algunos casos el gluconato se oxida con NADP+ a 2-cetogluconato
o a 5-cetogluconato y luego, a 2,5-dicetogluconato. Gluconobacter oxy-
dans ssp. suboxydans puede transformar el 2,5-dicetogluconato en -
cetoglutarato, previa descarboxilacin y pasando por una serie de
intermediarios que no estn caracterizados.

COOH COOH
C O CH2
CO2
HO CH CH2
2H
H C OH C O
C O COOH
CH2OH
2,5-Dicetogluconato -Cetoglutarato

Acetobacter aceti ssp. xylinum tiene una glucoquinasa que permite


pasar el gluconato a fosfogluconato con ATP. De este modo puede
continuar la va de Warburg-Dickens cortocircuitando la reaccin de
la glucosa-6- P -deshidrogenasa. Esta glucoquinasa tambin se ha
encontrado en Bidobacterium.

5.9.6 El sistema de las fosfocetolasas

Acetobacter aceti ssp. xylinum puede formar acetil- P a partir de fosfato


inorgnico y fructosa-6- P :

Fructosa-6- P + Pi Acetil- P + Eritrosa-4- P

Esto es debido a la accin de la fosfohexosa fosfocetolasa. Este


enzima slo se ha encontrado adems en Bidobacterium (ver captulo
6 y Lmina 2). El acetil- P genera ATP mediante la acetil- P quinasa:

Acetil- P + ADP ATP + Acetato

En conjuncin con la fosfopentosa fosfocetolasa, enzima mucho


ms difundido, la fosfohexosa fosfocetolasa permite una conversin
de la fructosa-6- P en tres molculas de acetato con la formacin de
tres de ATP (g. 5.10, Lmina 2).
70

Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL


CATABOLISMO Fructosa-6- P
Captulo 5: CIDO ACTICO
Fosfohexosa fosfocetolasa

Acetil- P Eritrosa-4- P Fructosa -6- P

Sedoheptulosa-7- P Gliceraldehdo-3- P

Xilulosa-5- P Ribosa-5- P

2 x Xilulosa-5- P Ribulosa-5- P

Pentosa fosfocetolasa

2 x Acetil- P Gliceraldehdo-3- P

Dihidroxiacetona- P

Fructosa-1,6- PP

Pi

Fructosa-6- P

Figura 5.10 Sistema de las fosfocetolasas en las bacterias del cido ac-
tico.

Las alternativas consideradas permiten resumir el metabolismo de


los glcidos en las bacterias del cido actico mediante el esquema
que se muestra en la gura 5.11.
Fructosa Glucosa Gluconato
ATP ATP (2)
ADP ADP ATP 2H
(4) 3 ATP 3 ADP
ADP
Fructosa-6- P Glucosa-6- P 2-Ceto- 5-Ceto-
NADP+ gluconato gluconato
NADPH + H+
3 Acetato
2H
Fructosa-1,6- PP 6- P -Gluconato
CO2
NADP+ 2,5-Diceto- (3)
gluconato
(1) NADPH + H+

(1) Va de Warburg-Dickens Triosa- P Ribulosa-5- P NAD+


(2) Va de la gluconoquinasa CO2
NADH + H+
(3) Va del gluconato
(4) Va de las fosfocetolasas -Cetoglutarato
-Cetoglutarato
Figura 5.11 Resumen del metabolismo de los glcidos en las bacterias del cido actico.

5.10 MODELOS DEL METABOLISMO OXIDATIVO DE LAS BACTERIAS DEL


CIDO ACTICO

El gnero Acetobacter fue dividido por Frateur en tres grupos: peroxy-


dans (A. peroxydans y A. paradoxum); oxydans (A. pasteurianus, A. leva-
nicux, A. ascendens y A. rauceus) y mesoxydans (A. aceti, A. xylinum y
A. mesoxydans). Actualmente se aceptan slo tres especies: A. aceti, A.
pasteurianus y A. peroxydans. Las dems seran subespecies.
Con el gnero Gluconobacter y con las tres especies de Acetobacter
pueden hacerse cuatro modelos metablicos distintos (g. 5.12). Los
detalles de las transformaciones comprendidas en los mismos pueden
entenderse fcilmente con lo que se ha descrito ms arriba. La ace-
tona (CH3 CHOH CO CH3) se forma a partir del piruvato y ace-
taldehdo por la acetona sintasa de forma semejante a lo que realizan
algunas bacterias del cido lctico (ver captulo 6).

5.11 FORMACIN DE CELULOSA

Desde hace tiempo se sabe que una singularidad de las bacterias del
cido actico es la de producir celulosa, la cual no se da en ninguna
otra bacteria. Este producto, un (1 4) glucano, slo ha podido ser
detectado en Acetobacter aceti ssp. xylinum y tiene menos peso molec-
ular que la celulosa vegetal. Glaser (1958) consigui obtenerlo con el
extracto celular que contiene la fraccin microparticulada. La celu-
losa se forma con la celulosa sintasa a partir de UDP-glucosa. Esta
ltima se forma con la UDP-glucosa pirofosforilasa:

UTP + Glucosa-1- P UDP-Glucosa + PPi

La sntesis de la celulosa es endocelular, pero luego se secreta al medio


externo donde forma una malla brosa que retiene burbujas de CO2.
71
Acetobacter peroxydans Acetobacter oxydans

GLUCOSA
GLUCOSA HMP MANITOL

HMP GLUCONATO

2-CETOGLUCONATO
LACTATO PIRUVATO
LACTATO PIRUVATO

LACTATO ACETONA
ETANOL ACETALDEHDO ACETATO
ETANOL ACETALDEHDO ACETATO

CAT CAT

Gluconobacter Acetobacter aceti


GLUCONATO GLUCOSA GLUCONATO GLUCOSA
MANITOL
MANITOL

FRUCTOSA
2-CETO- 5-CETO- HMP FRUCTOSA 2-CETO- 5-CETO- HMP
GLUCONATO GLUCONATO GLUCONATO GLUCONATO
SORBITOL
SORBITOL

2,5-DICETOGLUCONATO SORBOSA
2,5-DICETOGLUCONATO
SORBOSA ERITRULOSA ERITRITIOL
ERITRULOSA ERITRITIOL DIHIDROXIACETONA GLICEROL
DIHIDROXIACETONA GLICEROL
LACTATO PIRUVATO GLICEROL-3- P
GLICEROL-3- P
LACTATO PIRUVATO

ETANOL ACETALDEHDO ACETATO ACETONA

ETANOL ACETALDEHDO ACETATO

CAT

Figura 5.12 Modelos metablicos de los cuatro tipos principales de bacterias del cido actico. Las echas
con lnea discontinua indican procesos no demostrados completamente. Con recuadro sencillo se indican los
compuestos utilizados como sustratos. Con recuadro doble, los productos nales de la actividad metablica.
Con recuadro doble discontinuo, productos nales que son posteriormente reutilizados. HMP, va de la hexosa
monofosfato. CAT, ciclo de los cidos tricarboxlicos.

BIBLIOGRAFA

FRATEUR, J. La cellule, fascs, 3, 334, 353, 358, 367 y 382. (1950).


ASAI, T. Acetic acid bacteria. Classication and biochemical activities. Uni-
versity of Tokyo Press, Tokyo, and University Park Press, Baltimore (1968).
SWINGS, J. y DE LEY: The Genera Gluconobacter and Acetobacter. En The
Prokaryotes (Stars, Stolp, Trper, Balows y Schlegel, eds.). Springer Verlag.
Berlin (pp. 771778) (1981).
BERGEYS MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY. Vo. 1, pp. 267275.
Williams and Wilkins. Baltimore/London. (1984).
72
6 CIDO LCTICO

6.1 EL CIDO LCTICO COMO PRODUCTO DE


FERMENTACIN 74
6.2 CARACTERSTICAS GENERALES DEL GRUPO
LCTICO 74
6.3 FERMENTACIONES LCTICAS DE HEXOSAS Y
PENTOSAS 77
6.4 BALANCES DE FERMENTACIN 79
6.5 FERMENTACIONES LCTICAS DE LA FRUCTOSA 82
6.6 FERMENTACIN LCTICA DE LA
DESOXIRRIBOSA 83
6.7 COFERMENTACIN DE LA LACTOSA Y LA
TREONINA 83
6.8 FERMENTACIN DEL MALATO 85
6.9 FERMENTACIN LCTICA DEL TARTRATO 86
BIBLIOGRAFA 87

74 6.1 EL CIDO LCTICO COMO PRODUCTO DE FERMENTACIN


Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO El cido lctico o cido -OH-propinico CH3CHOHCOOH, es el res-
Captulo 6: CIDO LCTICO ponsable de la leche agriada que el hombre conoce desde hace miles
de aos, igual que los efectos de las levaduras y los de las bacterias del
cido actico (captulos 4 y 5). Tambin aqu, el cido lctico es con-
secuencia del desarrollo de un tipo peculiar de microorganismos eng-
lobados en un grupo denominado bacterias del cido lctico.
El cido lctico fue aislado e identicado por Scheele en 1780,
reconocindose como un producto de fermentacin por Blondeaur en
1847. Pasteur en 1855 public su clebre memoria titulada Mmoire
sur la fermentation appele lactique, la cual se considera la base de la
teora microbiana de la fermentacin. Lister en 1877 obtiene el cul-
tivo puro de Streptococcus lactis, el primero de una bacteria lctica.
Pocos aos despus, en 1881, Littleton iniciara la produccin indus-
trial de este cido por fermentacin.
Las bacterias del cido lctico intervienen en la preparacin de
muchos alimentos, como la col cida (sauerkraut), los embutidos
curados, pepinillos y anlogos y las aceitunas aliadas. Tambin son
esenciales para la obtencin de la leche cida, el kr, el yogur y los
forrajes ensilados. Forman parte del proceso de fabricacin de
muchos quesos, solas o en conjuncin con hongos y propionibacte-
rias. Hay tambin bacterias del cido lctico que son patgenas.
El cido lctico tiene un carbono asimtrico, lo cual da lugar a acti-
vidad ptica. Hay dos estereoismeros el D() y el L(+), adems del
racmico, pticamente inactivo. Esta es una caracterstica taxonmica
importante, puesto que cada especie produce un tipo de cido lctico.
A menudo, en el proceso industrial se obtiene el racmico por efecto
de racemasas exgenas procedentes de otras bacterias contaminantes
(p. ej.: Clostridium acetobutylicum).
La estequiometra clsica de la fermentacin lctica es

C6 H12 O6 2 CH3 CHOH COOH

Este proceso tiene lugar tambin en el msculo (gluclisis anaerobia).


No hay que olvidar que el msculo de paloma y la levadura fueron los
materiales bsicos utilizados para el esclarecimiento de la denominada
va de Embden-Meyerhof, uno de los pilares de toda la bioqumica.

6.2 CARACTERSTICAS GENERALES DEL GRUPO LCTICO

Las bacterias del cido lctico constituyen un grupo muy heterogneo


desde el punto de vista taxonmico. Tienen como caracterstica
comn la de producir cido lctico como catabolito nico o mayori-
tario (ms de la mitad) en la fermentacin de los azcares. Los miem-
bros ms caractersticos son cocos o bacilos grampositivos, inmviles
y catalasa negativos.
Los cocos grampositivos se distribuyen en tres grupos: aerobios,
facultativos y anaerobios. Los primeros se distinguen por una prueba
de oxidacin/fermentacin, como la de Hugh y Leifson, que da +/, a
diferencia de los facultativos que dan +/+. Los anaerobios slo se desa- 75
rrollan en anaerobiosis estricta. Sin embargo, dentro de los facultati- 6.2 CARACTERSTICAS GENERALES
vos debemos distinguir aquellos que tienen la capacidad de alternar DEL GRUPO LCTICO
un metabolismo oxidativo aerobio con otro fermentativo, de aquellos
otros que nunca pueden utilizar el O2 como aceptor nal de electro-
nes, pero que fermentan indistintamente en presencia y en ausencia
de aire. Este ltimo caso es el de las bacterias lcticas incluidas dentro
del grupo de cocos grampositivos facultativos. En cambio, los estalo-
cocos son verdaderos facultativos, capaces de presentar dos siologas
alternativas, como ocure con la mayor parte de las levaduras.
Algunos cocos del grupo lctico crecen mal en condiciones estric-
tamente anaerobias, aunque nunca utilizan el O2. Otros crecen bien
slo a bajas presiones parciales de oxgeno y por ello se les denomina
microaerlos. Finalmente, muchas bacterias lcticas crecen mejor en
una atmsfera que contenga del 5 al 10% de CO2 y algunas no crecen
sin este requisito.
Otra caracterstica de las bacterias del cido lctico, que abarca
tanto a cocos como a bacilos, es la de presentar unos requerimientos
nutritivos complejos. Esto lleva a la necesidad de utilizar medios espe-
ciales como el de agar sangre, el de Etwards, el de jugo de tomate o el
de Rogosa. Las caractersticas comunes de todos estos medios son la
presencia de azcar, la adicin de productos naturales complejos
apropiados a cada caso y, para el aislamiento, la presencia de substan-
cias inhibidoras del crecimiento de otros microorganismos. Es esen-
cial tener en cuenta que en las bacterias lcticas el azcar se utiliza
slo como fuente de energa, en tanto que el carbono para el creci-
miento se toma de aminocidos.
En la tabla 6.1 se consignan las caractersticas diferenciales de los
distintos gneros de cocos grampositivos facultativos. De todos ellos,
pertenecen al grupo lctico los gneros Streptococcus, Leuconostoc,
Pediococcus y Aerococcus. Es interesante sealar que tanto en el pri-
mero como en el cuarto puede presentarse pseudocatalasa, enzima
que desdobla el perxido de hidrgeno como la catalasa, pero que no
es un enzima hemnico. Esto se pone de maniesto por la reaccin
negativa de la bencidina. En cambio, algunos estreptococos pueden
sintetizar citocromo y dar bencidina positiva y catalasa negativa. Para
ello se requiere que el medio de cultivo tenga el grupo hemo, cosa
normal en el medio de agar sangre que se utiliza frecuentemente.
Por lo que respecta a las bacterias lcticas de morfologa bacilar, se
agrupan actualmente en una sola familia de bacilos grampositivos no
esporgenos. Se trata de unas bacterias catalasa negativas y, por lo
tanto, estrictamente fermentativas, tanto en presencia como en
ausencia de oxgeno. Son bacterias que se presentan en formas que
van desde cocobacilos distribuidos irregularmente a bacilos largos en
cadenas, con tendencia pleomrca considerable.
En la tabla 6.2 se consignan las propiedades diferenciales de los
miembros de los gneros de bacilos grampositivos no esporgenos,
dentro de los cuales se encuentra el gnero Lactobacillus, nico que
podemos incluir en el grupo lctico.

TABLA 6.1 Caractersticas diferenciales de los distintos gneros de cocos grampositivos facultativos.
Gneros facultativamente anaerobios
Caractersticas Staphylococcus Stomatococcus Streptococcus Leuconostoc Pediococcus Aerococcus Gemella
Distribucin predomi- Ttradas, Parejas,
nante (aparte de Grupos, Racimos, algu- Cadenas, Parejas, algunas Ttradas, cadenas
clulas individuales) parejas nas parejas parejas cadenas parejas parejas cortas
Aerobios estrictos 1
Anaerobios facultati-
vos o microaerlos + + + + + +2 +3
Anaerobios estrictos 4
Catalasa +5 (dbil) 6 6
Citocromo presente + + 7 7
Principales productos
de la fermentacin
de hidratos de car-
bono en condicio- ND Lactato, ND
nes anaerobias Lactato (cido) Lactato etanol Lactato (cido) ND
1 Raramente estrictamente aerobios
2 Crecen mejor a una concentracin reducida de oxgeno, algunas veces no crecen anaerobiamente.
3
Dbil crecimiento anaerobio.
4
Raramente estrictamente anaerobio.
5
Raramente negativos.
6 Algunas veces presentan una dbil reaccin de catalasa o pseudocatalasa.
7 En condiciones aerobias, algunas cepas sintetizan citocromo en medios suplementados con hemina.

ND: No determinado.

TABLA 6.2 Caractersticas diferenciales de los bacilos grampositivos no esporgenos.


Anaerobios facultativos Anaerobios facultativos
Catalasa-negativos Catalasa-positivos Aerobios
Caractersticas Lactobacillus Erysipelothrix Brochothrix Listeria Kurthia Caryophanon Renibacterium
Morfologa celular Bacilos, usual- Bacilos del- Bacilos Bacilos cor- Bacilos Bacilos cortos Bacilos cor-
mente rectos, gados, a delgados, a tos, a en cade- en cadenas tos, a menudo
algunas veces menudo la- menudo menudo nas, en parejas
cocobacilos mentos lamentos cadenas cocos en
cortas y cultivos
lamentos viejos
Bacilos multicelulares
(tricomas) +
Dimetro de los bacilos
(micras) 0,5-1,1a 0,2-0,5 0,6-0,8 0,4-0,5 0,7-0,9 1,4-3,2 0,3-1,0
Motilidad (por agelacin
peritrica, si son mviles) b +c +d +d
Aerobios + + +
Anaerobios facultativos o
microaeroflicos + + + +
Catalasa e + + + + +
Principales productos de Principal- Lactato Principal- Lactato NC NC NC
fermentacin a partir mente lactato, mente lac-
de hidratos de carbono pero pueden tato
producir algo
de acetato, eta-
nol, CO2
a
A veces hasta 1,6 m.
b
Raramente mviles.
c
A 20-25 C; poco mviles a 37 C.
d Raramente mviles
e Algunas cepas dbilmente positivas.
NC: No considerados para su distincin.

76
77
TABLA 6.3 Propiedades distintivas de los cinco gneros de bacterias del
cido lctico. 6.3 FERMENTACIONES LCTICAS DE
HEXOSAS Y PENTOSAS
Forma Fermentacin Catalasa Gnero

Cocos en cadenas o Homolctica Streptococcus


parejas
Cocos en cadenas o Heterolctica Leuconostoc
parejas
Cocos en ttradas Homolctica
(D,L-lctico) Pediococcus
Cocos en ttradas Homolctica (pseudocata- Aerococcus*
(D-lctico) lasa si la reac-
cin es positiva)
Bacilos usualmente Homo o
en cadenas heterolcticos Lactobacillus

* Microaerlos. Algunas cepas no crecen en anaerobiosis estricta.

El cido lctico puede ser tambin producido en mayor o menor


proporcin por bacterias que no suelen incluirse en el grupo lctico.
Adems de los bacilos grampositivos no esporgenos sealados en la
tabla 6.2, podemos aadir Bidobacterium, y algunas especies de Baci-
llus, Clostridium perfringens, Butyribacterium rettgeri, especies de Micro-
bacterium y muchas bacterias entricas.
Desde el punto de vista bioqumico, la clasicacin fundamental
de las verdaderas bacterias del cido lctico, de acuerdo con lo que
establecieron Kluyver y Donker, es la de las homofermentativas que
slo producen cido lctico de la glucosa y las heterofermentativas,
en las que se producen otros catabolitos entre los que siempre se
encuentra el CO2. El carcter gasognico de la fermentacin de la glu-
cosa es muy fcil de poner de maniesto y, juntamente con la morfo-
loga y otras pocas caractersticas, permite determinar cada uno de los
cinco gneros en los que podemos distribuir las bacterias del cido
lctico (tabla 6.3).

6.3 FERMENTACIONES LCTICAS DE HEXOSAS Y PENTOSAS

De acuerdo con lo sealado en el apartado anterior existen bacterias


lcticas homofermentativas y heterofermentativas. Las primeras utili-
zan las hexosas siguiendo la va de Embden-Meyerhof. Sin embargo,
hay homofermentativas obligadas y facultativas. Estas ltimas tienen
glucosa-6-P-deshidrogenasa y siguen la va de la pentosa. El que utili-
cen una u otra va, alternativa o simultneamente, depende de las
condiciones de cultivo.
Las bacterias lcticas heterofermentativas propiamente dichas pro-
ducen siempre, adems de cido lctico, otros productos nales de la
fermentacin heterolctica.
78 Entre todas las bacterias pueden distinguirse los siguientes tipos de
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL fermentaciones heterolcticas:
CATABOLISMO 1. Tipo Leuconostoc. La fermentacin tpica de 1 mol de glucosa da
Captulo 6: CIDO LCTICO lugar a un mol de cido lctico, un mol de CO2, y otro de eta-
nol. En algunos casos se produce glicerina y acetato en pequea
proporcin, disminuyendo el lactato y el etanol.
2. Tipo Bidobacterium. La fermentacin de glucosa produce ace-
tato y lactato, as como trazas de frmico.
3. Tipo entrico. La fermentacin produce lactato, junto a fr-
mico, acetato y, eventualmente, succinato.
4. Tipo C. perfringens. Produccin de cido lctico junto a cido
butrico.
5. Tipo Propionibacterium. Produccin mayoritaria de cido pro-
pinico junto a trazas de lctico y succnico.
6. Tipo Actinomyces. Produccin mayoritaria de cido succnico y
lctico con pequeas cantidades de actico o frmico.
De todos estos grupos heterofermentativos, solamente Leuconostoc
pertenece al grupo de las bacterias lcticas.
La formacin de cido lctico siempre tiene lugar por reduccin
del cido pirvico, mediante la deshidrogenasa lctica. Se conocen
varios tipos de enzima segn el estereoismero producido y segn
sean dependientes del NADH + H+ o del FADH2. La mayor parte se
halla en la fraccin soluble pero tambin se han encontrado algunos
en la fraccin microparticulada.
La fermentacin homolctica de la glucosa es una conversin de
un mol de azcar en dos de cido lctico. En la fermentacin hetero-
lctica tenemos una formacin de xilulosa-5-fosfato (X-5-P) por el sis-
tema de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa:
ATP ADP
NADPH + H+
Glucosa Glucosa-6- P 6- P -Gluconato
NADP+
NADPH + H+ NADP+
CO2

Xilulosa-5- P
La X-5-P es el intermediario clave de la llamada va de la pentosa,
paralelamente a las denominaciones frecuentemente utilizadas de las
vas de la hexosa monofosfato (Warburg-Dickens o va de la pentosa fos-
fato) y de la hexosa difosfato (Embden-Meyerhof o de las triosas) (ver
Lmina 3). El enzima caracterstico es la fosfopentosa fosfocetolasa:

X-5- P + Pi PGA + acetil- P


El gliceraldehdo-3- P (GA-3- P ) es transformado en lactato por la
va de Embden-Meryerhof:
Pi 2 ADP 2 ATP

Gliceraldehdo-3- P Piruvato Lactato


NAD+ NADH + H+ NADH + H+ NAD+
La fosfotriosa isomerasa puede dar origen a glicerina como sistema 79
de reoxidacin de NADH+ + H+, segn ya ha sido comentado: 6.4 BALANCES DE FERMENTACIN

Gliceraldehdo-3- P Dihidroxiacetona- P Glicerol fosfato Glicerina


NADH + H+ NAD+ Pi

El acetil-P puede dar origen a acetato y a etanol, segn reacciones


que tambin se han descrito:
ADP ATP

Acetil- P Acetato

Acetato Acetaldehdo Etanol


NADH + H+ NAD+ NADH + H+ NAD+

En la fermentacin lctica de las pentosas se hace innecesario el


sistema de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y no se produce CO2:

C5 H10 O5 CH3 CHOH COOH + CH3 COOH

El nico NAD+ que se reduce en la oxidacin del fosfogliceralde-


hdo se reoxida en la formacin de lactato.
Bidobacterium puede transformar una molcula de glucosa en tres
de acetato (captulo 5), pero normalmente se forman tres moles de
acetato y dos de lactato por cada dos moles de glucosa. Por esta razn,
los miembros del gnero Bidobacterium se incluyeron durante algn
tiempo en el grupo lctico. En la va que utiliza Bidobacterium, ade-
ms de la pentosa fosfocetolasa es caracterstica una hexosa fosfoceto-
lasa (g. 6.1 y Lminas 2 y 3).
Muchas cepas de las especies de Bidobacterium producen un
exceso de cido actico con respecto al esquema metablico de la
gura 6.1. El cido actico procede del desdoblamiento del cido
pirvico en cido actico y cido frmico, como hacen las bacterias
entricas. Adems, esto conlleva que cierta cantidad de cido actico
se reduzca a etanol para equilibrar el balance de xido-reduccin.
Otros tipos de bacterias heterofermentativas que producen cido
lctico sern consideradas ms adelante (captulos 7, 8 y 9).

6.4 BALANCES DE FERMENTACIN

Cuando en una fermentacin se producen varios productos nales y


la bacteria dispone de diferentes alternativas para reoxidar el NADH,
no existe a priori una estequiometra denida. En cada caso concreto,
segn sea la bacteria y las condiciones de cultivo, puede cuanticarse
tanto el consumo de glucosa (u otro sustrato) como la produccin de
productos nales. Entre el primero y los ltimos deber poder estable-
cerse un balance correcto de carbono, de xido-reduccin y de mol-
culas de un solo tomo de carbono. Un ejemplo concreto puede ser el
de la fermentacin heterolctica de la glucosa por una cepa de Lacto-
80

Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL


CATABOLISMO
Captulo 6: CIDO LCTICO 2 Glucosa
2 ATP
1
2 ADP

Fructosa-6- P Fructosa-6- P
Pi
2

Eritrosa-4- P Acetil- P
ADP
8
3 ATP

Gliceraldehdo-3- P Sedoheptulosa-7- P Acetato

Xilulosa-5- P Ribosa-5- P
5

Ribulosa-5- P
6

Xilulosa-5- P

2 Pi

2 Gliceraldehdo-3- P 2 Acetil- P

2 Pi 2 NAD+ 2 ADP
8
2 NADH + H+ 2 ATP
9
2 NADH2 4 ADP
2 Acetato
2 NAD+ 4 ATP

2 Lactato

Figura 6.1 Formacin de acetato y lactato por Bidobacterium. 1, hexo-


quinasa y glucosa-6-fosfatoisomerasa; 2, fructosa-6-fosfato fosfocetolasa; 3,
transaldolasa; 4, transcetolasa; 5, ribosa-5-fosfato isomerasa; 6, ribulosa-5-
fosfato 3-epimerasa; 7, xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa; 8, acetato quinasa;
9, enzimas como en la va homofermentativa.
TABLA 6.4 Balance de una fermentacin de la glucosa por Lactobacillus buchneri (vase texto).

A B C D E F

Glucosa
utilizada 112,2 100 600 0 - - -
Produc-
tos for-
mados: 89,2 80 240 0 - - -
c. lctico 19,7 17,56 35,12 0 - - 17,56
c. actico 78,9 70,38 140,76 2 - 140,76 70,38
Etanol 95,1 84,82 84,82 +2 169,4 - -
CO2 43,5 38,80 116,40 1 - 38,80 -
Glicerol

169,4
617,10 179,56 87,94
617,10
% C recuperado ---------------- 100 = 102,7
600
169,4
Balance O/R (%) ---------------- 100 = 94,47
179,56
84,82
% de CO 2 recuperado ------------- 100 = 96,5
87,94

bacillus buchneri (tabla 6.4). Para calcular el balance puede seguirse la


siguiente pauta:
A. Glucosa utilizada y productos formados en milimoles.
B. Expresar las cantidades de sustrato fermentadas y las de produc-
tos nales formadas en milimoles de productos formados por
100 milimoles de sustrato (C6) utilizado (tabla 6.4B).
C. Calcular los milimoles de carbono en el sustrato y en los pro-
ductos nales (tabla 6.4C).
La suma de los milimoles de C de los productos obtenidos divi-
dido por los del sustrato utilizado ( 100) nos permitir conocer el
% de carbono recuperado. Dado los errores admisibles en las deter-
minaciones analticas puede admitirse un 5% no signicativo.
D. Determinar el estado de xido-reduccin del sustrato y de los
productos nales sobre la base de que una relacin del H/O = 2
es un estado de O/R = 0. Por cada 2 H en exceso tendremos una
unidad negativa y por cada dos en defecto una positiva.
E. Multiplicar los milimoles de producto nal por 100 mmol de
sustrato por el nmero de xido-reduccin, colocando los resul-
tados de los productos oxidados en una columna y los de los
reducidos en otra. Calcular el balance porcentual O/R.
F. Calcular los milimoles de CO2 que deben producirse aten-
diendo a las cantidades de los distintos productos nales obte-
nidos. En el presente caso 1 mmol de CO2 por cada mmol de
molculas de C2. Calcular el % de CO2 recuperado respecto al
que debera obtenerse.
81
82 Los balances de fermentacin no slo permiten aceptar como
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL correctos unos resultados experimentales, sino que contienen una
CATABOLISMO informacin importante con respecto a las reacciones qumicas que
Captulo 6: CIDO LCTICO han tenido lugar.

6.5 FERMENTACIONES LCTICAS DE LA FRUCTOSA

Lactobacillus plantarum, que es homofermentativo facultativo, fer-


menta la fructosa siguiendo el modelo heterofermentativo:

Fructosa Lactato + Etanol + CO2

En cambio, Lactobacillus brevis, que es heterofermentativo obligado,


produce una fermentacin del mismo azcar de acuerdo con la
siguiente estequiometra:

3 Fructosa Lactato + Acetato + CO2 + 2 Manitol

El esquema de fermentacin correspondiente sera:

Fructosa
ATP

ADP

Glucosa-6- P
NADP+

NADPH + H+

6- P -Gluconato
NADP+
CO2
NADPH + H+

Xilulosa-5- P
Pi
Gliceraldehdo-3- P Acetil- P
ADP
2 ADP NAD+
ATP
2 ATP NADH + H+
Acetato
Piruvato
NADH + H+

NAD+

Lactato

2 NADH + H+ 2 NAD+

2 Fructosa 2 Manitol

Para la transferencia de H intervienen el NADP+ y el NAD+. Los


aceptores nales de hidrgeno son el piruvato (deshidrogenasa lctica)
y dos moles del propio sustrato (manitol deshidrogenasa) por mol de
fructosa fermentada hasta los dems productos nales, a n de com-
pensar los dos moles de coenzimas reducidos que se produce en exceso.
6.6 FERMENTACIN LCTICA DE LA DESOXIRRIBOSA 83

6.6 FERMENTACIN LCTICA DE LA


L. plantarum fermenta la arabinosa y la xilulosa, pero no a la desoxi- DESOXIRRIBOSA
rribosa. Sin embargo, en presencia de glucosa se induce la sntesis de
aldolasa de la desoxirribosa-5- P (enzima diferente de la fosfopentos-
afosfo-cetolasa), con lo cual tenemos:

Desoxirribosa
ATP

ADP

DR-5- P

Acetaldehdo Gliceraldehdo-3- P
H2O NADP+ NADP+

NADPH + H+ NADPH + H+
2 ADP
Acetato
2 ATP

Piruvato
NADPH + H+

NADP+

Lactato

Se requiere la fermentacin simultnea de glucosa para que propor-


cione aceptores de electrones, con formacin de lactato, glicerina,
CO2 y etanol.

6.7 COFERMENTACIN DE LA LACTOSA Y LA TREONINA

Los estreptococos del grupo N de Lanceeld o estreptococos lcticos


estn constituidos por S. ranolactis y lactis. Esta ltima especie se
subdivide en tres subespecies: lactis, diacetilactis y cremoris, las cuales
fermentan la lactosa y la treonina segn el esquema siguiente:

Lactosa

Gliceraldehdo-3- P Piruvato Lactato

(2) (3) Acetona + CO2


Desoxirribosa-5- P

Acetaldehdo
(1) Glicina
Treonina
84 En esta cofermentacin, la cual puede tener lugar espontneamente
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL en el suero de leche, se presentan tres reacciones caractersticas:
CATABOLISMO
1. Reaccin de la serina hidroximetil transferasa:
Captulo 6: CIDO LCTICO

CH3
H
CHOH CH3
+ H C COOH
H C COOH CHO
NH2
NH2
Tre Acetaldehdo Gli

2. Reaccin de la desoxirribosafosfato aldolasa (vase tambin en 6.6):

P OCH2 O H
CHO H H
CH3
+ H C OH
H OH
CHO
CH2O- P OH H

Acetaldehdo GA-3- P DR-5- P

3. Reaccin de la acetona sintasa:

CH3
CH3
CH3 CO
CO + + CO2
CHO HCOH
COOH
CH3
Piruvato Acetaldehdo Acetona

En S. diacetilactis se ha demostrado que la acetona se forma a par-


tir del diacetilo por accin de la aceton deshidrogenasa
CH3 CH3
NADH + H+ NAD+
CO HC OH
CO CO
CH3 CH3
Diacetilo Acetona
El diacetilo se produce por descarboxilacin del piruvato

CH3
CH3 CH3
+ CO + Lipoato + HS-CoA
CO CO
CO
S CoA lipoato
CH3
Para la formacin de acetil-CoA y acetil-lipoato a partir de dos mol- 85
culas de piruvato se requiere pirofosfato de tiamina ((OH) TPP). Se 6.8 FERMENTACIN DEL MALATO
forman dos moles de CO2 (vase descarboxilacin oxidativa anaero-
bia en el captulo 7). No se requiere NAD+ para la reoxidacin del
lipoato. El material gentico que codica los enzimas que forman dia-
cetilo en S. lactis ssp. diacetilactis se localiza en un plsmido.
El acetaldehdo formado por la serina hidroximetil transferasa a
partir de la treonina tambin se reduce a etanol por la alcohol deshi-
drogenasa, lo cual permite reoxidar NADH+ y cuadrar el balance O/R.
En condiciones anaerobias, los estreptococos del grupo N convier-
ten un 96% de la glucosa presente en lactato, siendo minoritaria la
cofermentacin.
Se ha demostrado la presencia de dos lctico deshidrogenasas, una
NAD+ y otra FAD dependientes. En presencia de oxgeno el FADH2
produce H2O2 por autoxidacin:

Piruvato FADH2 O2

Lactato FAD H2O2

Consecuentemente se para el crecimiento por efecto del H2O2. Sin


embargo, hay una peroxidasa que destruye el perxido de hidrgeno
con NADH:

NADH + H+ H2O2

NAD+ 2 H2O

Esto da lugar a cierta aerotolerancia.


La formacin de diacetilo por los estreptococos lcticos tiene
mucha importancia en la fabricacin de la mantequilla.

6.8 FERMENTACIN DEL MALATO

El cido mlico es un sustrato comn de muchas bacterias del cido


lctico, lo cual tiene importancia en la industria del vino.
Durante el primer ao, los vinos tintos sufren una segunda fer-
mentacin denominada malolctica, causada por diversas bacterias
del cido lctico. El cido mlico, que es uno de los principales com-
ponentes del zumo de uva, se convierte en cido lctico y CO2. Esto
lleva a una reduccin de la acidez que mejora las cualidades organo-
lpticas.
La formacin del lactato a partir del malato puede tener lugar bien
en dos etapas o bien directamente. En el primer caso, tenemos:
86 NAD+ NADH + H+
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL HOOC CH2 CHOH COOH CH3 CO COOH + CO2
CATABOLISMO
Captulo 6: CIDO LCTICO Malato Piruvato
Enzima mlico

NADH + H+ NAD+

CH3 CO COOH CH3 CHOH COOH


Lctico deshidrogenasa

La primera reaccin puede tener lugar, a su vez, en dos pasos:

NAD+ NADH + H+ CO2

HOOC CH2 CHOH COOH HOOC CH2 CO COOH CH3 CO COOH


Malato Oxalacetato
deshidrogenasa descarboxilasa
Malato Oxalacetato Piruvato

puesto que la oxalacetato descarboxilasa se halla presente en extrac-


tos libres de clulas (L. plantarum).
La formacin directa se basa en el hecho de que la formacin de
lactato puede tener lugar sin pasar por piruvato. As, en extractos de
L. plantarum sin lctico deshidrogenasa se obtiene L (+) lactato y CO2
a partir de L (+) malato. Adems, en Leuconostoc mesenteroides de L (+)
malato se forma L (+) lactato, mientras que con piruvato se forma D
() lactato. Tendramos pues una descarboxilacin no oxidativa

HOOC CH2 CHOH COOH CH3 CHOH COOH


CO2
Malato Lactato

La fermentacin malolctica es un proceso lento que puede inter-


venir como regulacin de la va de Embden-Meyerhof.

6.9 FERMENTACIN LCTICA DEL TARTRATO

Al igual que el malato, el tartrato es un buen sustrato para muchas


bacterias lcticas, lo cual tambin tiene cierto papel en la fabricacin
del vino.
87
COOH COOH
CO2 BIBLIOGRAFA
HC OH CO COOH
2 2 2
HO CH H2O CH2 CO
COOH COOH CH3
L (+) Tartrato Oxalacetato Piruvato
Tartrato deshidrasa Oxalacetato descarboxilasa

COOH
NAD+
CHOH
NADH + H+ + NAD+
COOH CH3

CO Lactato
H2O
CH3
Piruvato NAD+
COOH
NADH + H+ + CO2 + NADH + H+
CH3
Acetato

La formacin de acetato tendra lugar a travs de acetil-CoA con


produccin de NADH + H+, al igual que en las bacterias del cido pro-
pinico (ver captulo 7). La proporcin de lactato/acetato permite
equilibrar el balance O/R, sobre todo en los procesos de cofermenta-
cin.
L. plantarum creciendo sobre glucosa y tartrato presenta un desa-
rrollo diaxico, el cual no tiene lugar en L. brevis que utiliza simult-
neamente los dos sustratos. Sin embargo, en esta bacteria el tartrato
no genera cido lctico, lo cual sugiere la existencia de otra va meta-
blica no conocida.

BIBLIOGRAFA

TAUBER, M. y GEIS, A. The family Streptococcaceae (New Medical Aspects). En


The Prokaryotes (Starr, Stolp, Trper, Balows y Schlegel, eds.). Springer Ver-
lag. Berlin. (pp. 16131630), 1981.
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Stolp, Trper, Balows y Schlegel, eds.). Springer Verlag. Berlin. (pp. 1655
1680). 1981.
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Bidobacteria and Their Role (pp. 3542). Birkhuser Verlag. Basel/Boston/
Stuttgart. 1983.
BERGEYS MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY. Vol. II. Williams and
Wilkins. Baltimore/London. 1984.
7 CIDO PROPINICO

7.1 EL CIDO PROPINICO COMO PRODUCTO DE


FERMENTACIN 90
7.2 REACCIN DE SWICK Y WOOD 91
7.3 FERMENTACIN PROPINICA DEL LACTATO 91
7.3.1 Va metablica de Propionibacterium y
Veillonella 91
7.3.2 Formacin de propionato en C. propionicum y
Megasphaera elsdenii 91
7.4 FERMENTACIN PROPINICA DE LA GLUCOSA 92
BIBLIOGRAFA 94
90 7.1 EL CIDO PROPINICO COMO PRODUCTO DE FERMENTACIN
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO
Captulo 7: CIDO PROPINICO El cido propinico (CH3CH2COOH) fue aislado por Nllner en 1841 a
partir de productos de fermentacin del cido tartrico. Ms tarde
(1876, 1884), Fitz puso de maniesto la existencia de bacterias que pro-
ducen cido propinico a partir del malato clcico y del lactato clcico.
Los primeros estudios sobre la fermentacin propinica de azcares
se deben a Orla-Jensen (1889), quien revel que era la causa de la for-
macin de ojos en el queso de Emmenthal. Shelman y Saw (1923,
1924) obtuvieron cultivos puros de bacterias del cido propinico que
seran tiles para asegurar la formacin de ojos en la fabricacin del
queso de Emmenthal cuando esta industria se extendi a otros pases
distintos de su lugar de origen. Virtanen (1925) fue el primero en inves-
tigar el mecanismo de fermentacin posiblemente responsable tanto
de la produccin de cido propinico como de la formacin concomi-
tante de CO2, procesos ambos implicados en la produccin de este tipo
de queso. Finalmente, los estudios taxonmicos de Van Niel permitie-
ron denir el gnero Propionibacterium en el que se incluyen todas las
bacterias del grupo propinico propiamente dicho. Las propionibacte-
rias constituyen una familia de bacterias corineformes dentro de los
bacilos grampositivos no esporgenos, y tienen un perl intermedio
entre el grupo lctico, las corinebacterias y los actinomicetos. Desde el
punto de vista bioqumico, la distincin fundamental con respecto a
las bacterias del cido lctico se halla precisamente en la capacidad de
usar el cido lctico como sustrato. No obstante, en la fermentacin de
los azcares por propionibacterias, este cido puede formarse junto al
propinico y otros cidos orgnicos como el actico, el butrico y el fr-
mico. Los miembros del gnero Propionibacterium son anaerobios, pero
generalmente toleran la presencia de aire, sobre todo en cultivos en los
que se utiliza un inculo abundante.
El cido propinico no es un catabolito exclusivo de este grupo.
Tambin lo producen los miembros del gnero Veillonella a partir del
lactato. Se trata de un grupo de cocos anaerobios gramnegativos (Pr-
vot, 1933), que no fermentan azcares. Tambin hay un bacilo gram-
positivo esporgeno, que presenta esporas subterminales del mismo
dimetro que la clula vegetativa, el cual produce a partir de azcares
cido propinico junto con otros cidos orgnicos. Se trata de Clostri-
dium propionicum, descrito por Cardon y Barker (1946). Finalmente,
existe un grupo de cocos gramnegativos incluido dentro de la familia
de las Veillonelceas, que tambin produce cido propinico del lac-
tato y que puede fermentar azcares, a diferencia del gnero Veillone-
lla. Son los miembros de Megasphaera elsdenii, descritos por Elsden
(1956), Gutirrez (1959) y Rogosa (1971).
En conjunto, se puede considerar al cido propinico como un
catabolito mayoritario resultante de la heterofermentacin de diver-
sos sustratos, segn se seala en la tabla 7.1.
Algunos de los organismos citados tambin pueden producir cido
propinico a partir de polialcoholes, aminocidos y otros cidos org-
nicos distintos del cido lctico.
91
TABLA 7.1 Sustratos utilizables por los microorganismos productores de
cido propinico. 7.2 REACCIN DE SWICK Y WOOD

Sustrato
Organismo productor
Lactato Azcares

Propionibacterium + +
Clostridium propionicum + +
Veillonella +
Megasphaera + +

7.2 REACCIN DE SWICK Y WOOD

Swick y Wood descubrieron una reaccin que es fundamental en la


produccin de cido propinico por Propionibacterium y Veillonella,
tanto en la fermentacin de azcares como del lactato:

COOH
Metilmalonil-CoA-
COOH CH3 piruvato
CO CH3
CO + H C COOH transcarboxilasa CH2 + CH2
CH3 CO S CoA COOH CO S CoA
Piruvato Metilmalonil-CoA Oxalacetato Propionil-CoA

La fuente de metilmalonil-CoA es el propio oxalacetato, que tam-


bin puede derivarse del piruvato por otra reaccin independiente, a
travs de fosfoenolpiruvato como producto intermedio (ver apartados
7.3 y 7.4).

7.3 FERMENTACIN PROPINICA DEL LACTATO

El cido lctico es un sustrato comn a todas las bacterias que produ-


cen cido propinico. Sin embargo, este ltimo se forma siguiendo
dos vas diferentes segn el tipo de microorganismo.

7.3.1 Va metablica de Propionibacterium y Veillonella


Adems de cido propinico se forma acetato, succinato y CO2. La va
metablica se representa en la gura 7.1.

7.3.2 Formacin de propionato en C. propionicum y Megasphaera


elsdenii
En estos microorganismos la formacin de cido propinico no va
acompaada de succinato, pero s de acetato y de CO2 (g. 7.2).
92
CH3 CHOH COOH
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO Lactato
Captulo 7: CIDO PROPINICO NAD+

NADH + H+

HS CoA
CH3 CO COOH CH3 CH2 CO CoA
NAD+ Biotina CO2
CO2
1 1
NADH + H+
Biotina
*
CH3 CO CoA HOOC CH2 CO COOH
Pi NADH + H+
HS CoA
NAD+
H
CH3 CO P
ADP
HOOC CH2 CHOH COOH HOOC C CO CoA
CH3
ATP H2O

CH3 COOH HOOC CH CH COOH


2
Acetato NADH + H+

NAD+
HOOC CH2 CH2 CO CoA
HOOC CH2 CH2 COOH
CH3 CH2 COOH
Succinato
Propionato

* El sustrato de la transcarboxilasa no es el D-Metilmalonil-CoA, sino el L-Metilmalonil-CoA.


Por ello, una racemasa acta sobre el producto de la metilmalonil-CoA mutasa.

Figura 7.1 Formacin de propinico en Propionibacterium y Veillonella. Tal como puede observarse
en la gura, el propinico tiene su origen en una reaccin de transcarboxilacin (reaccin de Swick y
Wood). Enzimas caractersticos de la va son la (S) metilmalonil-CoA-piruvato transcarboxilasa (1), un
enzima de elevado peso molecular (aprox. 80000 da), y la metilmalonil-CoA mutasa (2), que reordena
el esqueleto carbonado del succinil-CoA. Ntese que el acetato y el CO2 que pueden acompaar al pro-
pionato tienen su origen en el piruvato.

7.4 FERMENTACIN PROPINICA DE LA GLUCOSA

En todos los ejemplos conocidos, la glucosa es degradada hasta piru-


vato por la va de Embden-Meyerhof. Una parte del piruvato es descar-
boxilada al igual que sucede en la fermentacin propinica del lactato:

CO2 Pi

Piruvato Acetil-CoA Acetil- P Acetato


HS CoA 2H HS CoA ADP ATP
93
2 CH3 CHOH COOH CH3 CHOH COOH
7.4 FERMENTACIN PROPINICA DE
Lactato Lactato
LA GLUCOSA

2  CH3 CHOH CO CoA


CH3 CO COOH
CoA transferasa

2 H2O HS CoA

2  CH2 CH CO CoA 2
H
CO2

2H
CH3 CO CoA
Pi

HS CoA ADP

ATP

2  CH3 CO COOH CH3 COOH


Propionato Acetato
Figura 7.2 Formacin de propionato, acetato y CO2 a partir de lactato por
Clostridium propionicum y Megasphaera elsdenii. El proceso de formacin de
acriloil-CoA no est todava bien establecido. La oxidacin de lactato a acetato
proporciona el poder reductor para la reduccin del acriloil-CoA. Una avopro-
tena transportadora de electrones reducida acta de dador de hidrgeno.

Otra fraccin del piruvato pasa a oxalacetato por la reaccin de


Wood-Werkman, en la cual el cido pirvico es fosforilado a fosfoe-
nolpiruvato con ATP y la piruvato fosfotransferasa. En las propioni-
bacterias, una carboxitransfosforilasa carboxila el fosfoenolpiruvato
para dar oxalacetato:

CH3 ATP ADP CH2 CO2 COOH


C O C O P CH2 + PPi
Pi
COOH COOH C O
Piruvato PEP COOH

En Propionibacterium, el oxalacetato genera succinato:

Oxalacetato Malato Fumarato Succinato


2H H2O 2H

El succinato, o bien se acumula parcialmente y es excretado al medio, o


bien pasa a metilmalonil-CoA (ver g. 7.1), el cual, a travs de la reac-
cin de Swick-Wood, reacciona con el piruvato para dar oxalacetato y
propionil-CoA. Sin embargo, en Bacteroides sp., Ruminococccus avofa-
ciens y Succinomonas amylolytica no tiene lugar la reaccin de transcar-
boxilacin, y la va lleva solamente a la formacin de succinato.
94 Clostridium propionicum y Megasphaera elsdenii oxidan la glucosa hasta
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL piruvato por la va de Embden-Meyerhof, y, siguiendo la va del acrilato
CATABOLISMO (g. 7.2), producen acetato, CO2 y propionato a partir del piruvato.
Captulo 7: CIDO PROPINICO Al igual que en algunas bacterias del cido lctico, el acetil-CoA se
forma por descarboxilacin oxidativa del piruvato con reduccin de
NAD+, a diferencia de la mayora de las bacterias del cido lctico, que
utiliza para la formacin de acetato la fosfopentosa fosfocetolasa.

BIBLIOGRAFA

SWICK, R. W. y WOOD, H. G. The role of transcarboxylation in propionic


acid fermentation. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. 46, 28, 1960.
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tation. J. Bacteriol. 87, 171, 1964.
BALDWIN, R. L., WOOD, H. G. y EMERGY, R. S. Lactate metabolism by
Peptostreptococcus elsdenii. Evidence for lactyl-coenzyme A dehydrase. Bio-
chim. Biophys. Acta, 97, 222, 1965.
BERGEYS MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY. Vol. II. Williams and
Wilkins. Baltimore/London 1984.
8 CIDO BUTRICO

8.1 PRODUCCIN DE CIDO BUTRICO Y DE


DISOLVENTES NEUTROS POR FERMENTACIN:
PERSPECTIVA HISTRICA 96
8.2 VAS METABLICAS UTILIZADAS POR LAS BACTERIAS
DEL CIDO BUTRICO 97
8.3 FORMACIN DE ACETATO POR FERMENTACIN DE
SUSTRATOS ORGNICOS 99
8.4 FORMACIN DE ACETATO POR REDUCCIN DIRECTA
DE CO2 101
8.5 BACTERIAS ACETGENAS 103
8.6 LA VA DE WOOD PARA LA FIJACIN AUTOTRFICA
DE CO2 103
8.7 LA GENERACIN DE ENERGA EN LAS BACTERIAS
ACETGENAS 106
8.8 OTRAS VAS METABLICAS UTILIZADAS POR LAS
BACTERIAS ACETGENAS 107
8.8.1 Sistemas dependientes del tetrahidrofolato 107
8.8.2 Reduccin indirecta del CO2 107
8.9 FERMENTACIN DEL ETANOL POR Clostridium
kluyveri 108
8.10 FORMACIN DE BUTIRATO A PARTIR DE
GLUCOSA 109
8.11 FORMACIN DE ACETONA Y BUTANOL 110
8.12 OTROS PRODUCTOS FINALES DE FERMENTACIN
PRODUCIDOS POR LAS BACTERIAS DEL CIDO
BUTRICO 110
8.13 PRODUCCIN DE SUCCINATO POR
MICROORGANISMOS 112
BIBLIOGRAFA 114
96 8.1 PRODUCCIN DE CIDO BUTRICO Y DE DISOLVENTES NEUTROS
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
POR FERMENTACIN: PERSPECTIVA HISTRICA
CATABOLISMO
Captulo 8: CIDO BUTRICO Wurtz, en 1852, describi el butanol como un componente de los
medios de fermentacin. Pasteur (1861) fue el primero en sealar la exis-
tencia de un fermento butrico especco que poda sustituir a las bacte-
rias lcticas en los medios contaminados. Debido a su movilidad, pens
inicialmente que era un infusorio y, en todo caso, pudo establecer que el
oxgeno constitua un elemento letal para su desarrollo. Fitz, entre 1876
y 1884, public una serie de trabajos en los que muestra que unas bacte-
rias esporgenas anaerobias estrictas pueden producir cido butrico y
disolventes neutros a partir de azcares y otros sustratos como el cido
lctico y la glicerina. Estas bacterias, estudiadas tambin por muchos
otros autores, recibieron diversas denominaciones antes de que prctica-
mente todas ellas fueran incluidas en el gnero Clostridium. En 1902,
Winogradsky describi C. pasteurianum, que a partir de sacarosa o glu-
cosa produce etanol, butanol, acetato, butirato, CO2 e hidrgeno. Ade-
ms, esta bacteria ja nitrgeno molecular. La acetona como producto de
fermentacin fue descubierta por Schardinger en 1905, la cual era produ-
cida por Bacillus macerans, que no produce ni cido butrico ni butanol.
La utilizacin industrial de las bacterias del cido butrico tuvo su ori-
gen en el hecho de que, ante el temor de que el caucho natural se agotara,
se promovi la obtencin de caucho sinttico. La polimerizacin del buta-
dieno se consider un buen sistema y ste puede obtenerse del butanol.
Un mtodo alternativo era la polimerizacin del isopreno, el cual se deriva
del alcohol isoamlico. Este ltimo es el producto mayoritario del aceite de
fusel que se produce en la fermentacin alcohlica (ver captulo 4).
En 1911, Fernbach y Weizmann desarrollaron un proceso indus-
trial que utilizaba el bacilo de Fitz y fcula de patata como sustrato.
Ms tarde Weizmann, utilizando C. acetobutylicum, obtuvo mejores
resultados, con una produccin adicional de acetona importante para
la fabricacin de cordita, un explosivo muy utilizado durante la Pri-
mera Guerra Mundial. Despus, la produccin de butanol por fermen-
tacin volvi a ser importante para la fabricacin de esmaltes para
automviles. En realidad, el desarrollo de los procesos referidos ante-
riormente implic el que se avanzase tanto en el conocimiento bsico
de la microbiologa como en el de la tecnologa de fermentaciones,
conocimientos que luego han sido tiles para otros objetivos. No obs-
tante, el inters econmico de la produccin de disolventes por fer-
mentacin ha desaparecido prcticamente desde la dcada de los 70.
Las bacterias a las que hacen referencia los estudios anteriores pue-
den distribuirse en cuatro grupos: el constituido por microorganismos
que slo producen cido butrico, actico, CO2 e H2; el de aquellos
que adems generan etanol; el de los que producen acetona y buta-
nol; y el de aquellos otros que produce butanol e isopropanol. Tam-
bin puede incluirse Bacillus macerans, que genera acetona y etanol
pero que no produce ni cido butrico ni butanol. Adicionalmente
produce formiato, lo cual nunca tiene lugar en las fermentaciones
que producen cido butrico.
8.2 VAS METABLICAS UTILIZADAS POR LAS BACTERIAS DEL CIDO 97
BUTRICO 8.2 VAS METABLICAS UTILIZADAS
POR LAS BACTERIAS DEL CIDO
Las bacterias del cido butrico estn constituidas por miembros del BUTRICO
gnero Clostridium, y por Butyribacterium rettgeri y Sarcina maxima. Los
clostridios son bacilos gram positivos esporgenos que pueden presen-
tar forma de mazo o raqueta debido a que la espora terminal es ms
ancha que la clula vegetativa. Muchos son activamente mviles y tie-
nen una ligera tendencia a formar lamentos y cadenas. Son anaero-
bios estrictos y tienen que cultivarse en medios reductores en agar
blando o en atmsfera de CO2 o H2. Se pueden subdividir en dos gran-
des grupos: los clostridios sacarolticos y los proteolticos. Las especies
sacarolticas utilizan azcares para formar cido butrico, cido actico
y alcoholes. En el medio de carne cocida de Robertson estas bacterias lo
vuelven rojo y producen gas (CO2 e H2). Las especies proteolticas ata-
can aminocidos y no pueden utilizar azcares. Estas bacterias ennegre-
cen el medio de Robertson, digieren la carne y producen un olor
desagradable. Existe algn tipo intermedio como Clostridium perfringens
pero, a excepcin de esta especie, slo se incluyen en el grupo de las
bacterias del cido butrico a las especies sacarolticas. Butyribacterium
rettgeri es la actual denominacin de Eubacterium limosum, y est
incluido dentro de las Propionibactericeas anaerobias con carcter
obligado y que producen cido butrico. Sarcina maxima, que tambin
produce cido butrico, es un coco grampositivo que se presenta fre-
cuentemente en paquetes de ocho clulas. Esta especie es estrictamente
anaerobia y est incluida en la familia de las peptococceas.
En la tabla 8.1 se indican los productos nales de la fermentacin de
la glucosa por diferentes bacterias del cido butrico y en la gura 8.1 un
esquema general de las vas metablicas utilizadas para su formacin, el
cual tiene carcter orientativo. En los apartados siguientes se estudiarn
con ms detalle todas las etapas sealadas a partir del piruvato.

TABLA 8.1 Productos nales de la fermentacin de la glucosa por bacterias del cido butrico.
moles/100 moles de glucosa fermentada
C. C. C. C. C. B.
Productos butyricum tyrobutiricum * perfringens acetobutylicum butylicum rettgeri
cido butrico 76 73 9 34 4 17 29
cido actico 42 28 15 60 14 17 88
cido lctico - - 160 33 - - 107
CO2 188 190 24 176 221 203 48
H2 235 182 21 214 135 77 74
Etanol - - 10 26 7 - -
Butanol - - - - 56 58 -
Acetona - - - - 22 - -
Acetona - - - - 6 - -
Isopropanol - - - - - 12 -
% C recuperado 96 91 98 97 99 96 110
Balance O/R 0,97 1,16 0,81 1,05 1,01 1,06 0,74
* La primera columna se reere a un medio deciente en hierro.
98
Hidratos de carbono
Etanol
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO Va Embden-Meyerhof
Captulo 8: CIDO BUTRICO NAD+
NADH + H+
Piruvato
Acetaldehdo
NAD+ CO2
NADH + H+ Acetato
H2

Acetato Acetil-CoA

Butirato Acetil-CoA
Acetoacetil-CoA
NADH + H+
Acetato
Acetato NAD+
Butiril-CoA -Hidroxibutiril-CoA Acetil-CoA
NAD+

NADH + H+ NADH + H+ Acetoacetato


NAD+ Crotonil-CoA
CO2
Butirilaldehdo
NADH + H+ Acetona
NAD+
NADH + H+

Butanol
NAD+

Isopropanol
Figura 8.1 Esquema metablico de la formacin de los productos nales de la
fermentacin de los hidratos de carbono por las bacterias del cido butrico. En
trazo sencillo, produccin de butirato. En trazo grueso, produccin de acetato y
etanol a partir del acetil-CoA. En trazo sencillo discontinuo, produccin de buta-
nol, acetona e isopropanol. En doble trazo discontinuo, produccin de acetato a
partir de CO2 e H2. Los productos nales se muestran en un recuadro.

En la gura 8.1 puede comprobarse que, adems de producir but-


rico o metabolitos derivados caractersticos de la misma va metab-
lica (como el butanol, la acetona o el isopropanol, que aparecen en el
medio de cultivo de algunas cepas como consecuencia de la acidica-
cin del mismo), producen siempre acetato. De hecho, la produccin
de acetato es una caracterstica del grupo de las bacterias del cido
butrico. Debido a la importancia de este tipo de metabolismo en este
grupo de microorganismos, se describe en este captulo de forma glo-
bal la produccin de acetato como producto nal del metabolismo
bacteriano. El grupo de bacterias acetognicas incluye tambin una
serie de microorganismos que pueden asimilar autotrcamente el
CO2 formando acetato.
8.3 FORMACIN DE ACETATO POR FERMENTACIN DE SUSTRATOS 99
ORGNICOS 8.3 FORMACIN DE ACETATO POR
En general, en el mundo microbiano la formacin de acetato por fer- FERMENTACIN DE SUSTRATOS
ORGNICOS
mentacin puede tener lugar bien por la formacin de acetil- P a tra-
vs de las fosfocetolasas, o bien por descarboxilacin del piruvato. En
el primer caso se encuentran las bacterias del cido actico, las bacte-
rias heterofermentativas del cido lctico y los miembros del gnero
Bidobacterium, todos los cuales pueden producir acetato a partir de
hexosas y pentosas a travs de esta va (ver captulos 5 y 6). La 6-fosfo-
hexosa-fosfocetolasa slo se ha detectado en alguna bacteria del cido
actico y en Bidobacterium. La presencia de este enzima posibilita
transformar las hexosas en cido actico exclusivamente (como es el
caso de A. xylinum y muchas especies de Bidobacterium).
El cido pirvico puede producir cido actico por descarboxila-
cin (ver Lmina 4). Como ya ha sido sealado (captulos 4 y 5), en
las levaduras y en las bacterias del cido actico se encuentra una des-
carboxilasa que produce directamente acetaldehdo y CO2 a partir de
piruvato. El acetaldehdo pasa a acetato bien mediante una deshidro-
genasa dependiente de NAD+ o bien a travs de un sistema ligado al
citocromo c553 sin otros cofactores (ver captulo 5). Otros muchos
microorganismos aerobios y facultativos descarboxilan oxidativa-
mente el piruvato para producir acetato mediante reacciones ms
complejas. Por ejemplo, en E. coli se ha descrito un complejo enzim-
tico formado por tres elementos: E1:piruvato deshidrogenasa ligada al
TPP; E2:dihidrolipoato transacetilasa y E3:dihidrolipoato deshidroge-
nasa ligada al FAD. Este complejo recibe el nombre de piruvato deshi-
drogenasa (ver Lmina 4). La descarboxilacin del piruvato tendra
lugar a travs de las siguientes etapas:

E1 TPP E1 TPP CHCH3 + CO2


S S OH
E2 + CH3 CO COOH E2
S S
E3 FAD E3 FAD

E1 TPP E1 TPP
SH S COCH3
E2 + HS CoA E2
SH + CH3COCoA SH
E3 FAD E3 FAD

NAD+ NADH + H+
E1 TPP E1 TPP
S S
E2 E2
S S
E3 FADH2 E3 FAD
100 El enzima avnico se reoxidara con NAD+, lo cual no es muy fre-
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL cuente, estando este ltimo ligado a un citocromo para su reoxida-
CATABOLISMO cin a travs de la cadena de transporte de electrones hasta el oxgeno
Captulo 8: CIDO BUTRICO molecular.
En bacterias facultativas, como E. coli y B. macerans, el complejo de
la piruvato deshidrogenasa es drsticamente inhibido en ausencia de
oxgeno. Su funcin queda sustituida por la piruvato-formiato liasa
que no requiere NAD+ y produce acetil-CoA y formiato.
CH3 CO COOH + HS CoA HCOOH + CH3 CO S CoA
El formiato puede acumularse o desdoblarse parcial o totalmente
en CO2 y H2 por accin de la formiato-hidrgeno liasa (ver captulos
9 y 14).
HCOOH CO2 + H2
El acetil-CoA se transforma en acetato por el sistema de la fosfo-
trans-acetilasa y la acetoquinasa que ya ha sido comentado
Pi
CH3 CO S CoA CH3 CO O P + HS CoA
ADP ATP
CH3 CO O P CH3 COOH
Sin embargo, tambin puede dar etanol por la acetaldehdo deshidro-
genasa (ACDH) y la alcohol deshidrogenasa (ALDH)
NADH + H+ NAD+ NADH + H+ NAD+

CH3 CO S CoA CH3 CHO CH3 CH2O


HS CoA

ACDH ALDH
Todo el sistema resulta mucho ms eciente para poder aumentar el
consumo de sustrato, existiendo sucientes recursos para reoxidar el
NADH + H+. La formacin de cido frmico por descarboxilacin del
piruvato tambin tiene lugar en Clostridium acidi-urici, lo cual es una
excepcin dentro de los miembros de este gnero.
En los gneros Clostridium y Desulfovibrio (en ausencia de sulfato)
no se forma cido frmico y el sistema de descarboxilacin incluye
ferredoxina y biotina como cofactores. El sistema enzimtico recibe el
nombre de piruvato-ferredoxina oxidorreductasa y la reaccin que
cataliza suele denominarse ruptura fosforoclstica del piruvato (g.
8.2 y Lmina 4). C. acidi-urici es una excepcin dentro del gnero
Clostridium, ya que utiliza el sistema que da lugar a formiato.
Aparte de los sistemas de descarboxilacin del piruvato descritos, es
importante resaltar que el enzima CoA transacetilasa puede actuar con-
juntamente con el lipoato transacetilasa en las bacterias que producen
acetoina. No se necesita NAD+ para la reoxidacin del lipoato, tanto si se
produce acetolactato como diacetilo. En las propionibacterias se forma
acetil lipoato a partir de acetaldehdo activo (CH3 CHOH TPP E),
regenerndose E TPP. El acetil lipoato reacciona con el CoA, formando
101
CH3 CO COOH
8.4 FORMACIN DE ACETATO POR
E TPP REDUCCIN DIRECTA DE CO2
CO2

CH3
E TPP C COOH (1)
OH
CO2 Biotina
+
ATP
ADP + Pi Biotina CO2

E TPP CHOH CH3 (2)


2 H2 2  Ferredoxina-Ox

2 H+ 2 Ferredoxina-Red
(3)
E TPP CO CH3
HS CoA
E TPP

CH3 CO S CoA
Figura 8.2 Descarboxilacin del piruvato por el complejo piruvato-ferre-
doxina oxidorreductasa. El piruvato interacciona con el enzima ( E TPP,
que contiene pirofosfato de tiamina) siendo decarboxilado (1). El complejo
lactil-enzima es entonces oxidado, generndose acetil-CoA (2). Los dos elec-
trones son transferidos a la ferredoxina, que se reduce. Debido al bajo
potencial redox de sta ( E0 = 0,41 V), una hidrogenasa puede oxidarla
generando hidrgeno (3).

acetil-CoA. En este caso el lipoato se reoxida con NAD+, no formndose


hidrgeno. Esto es lo que pude ocurrir en la formacin de acetato a par-
tir de piruvato en algunas bacterias del cido lctico, as como en la fer-
mentacin del lactato por las bacterias del cido propinico.

8.4 FORMACIN DE ACETATO POR REDUCCIN DIRECTA DE CO2

Tal y como ha sido referido anteriormente, el acetato puede originarse


tanto en procesos fermentativos de sustratos orgnicos como en el
desarrollo aerobio de diversos microorganismos que crecen utilizando
materia orgnica. Con independencia de estos dos tipos de microorga-
nismos formadores de acetato, existen tambin las bacterias denomina-
das propiamente acetognicas, las cuales sintetizan este cido a partir
de CO2 y/o de otros precursores de un solo tomo de carbono. Este
grupo incluye las bacterias del cido butrico que catalizan esta sntesis.
Los primeros datos de la sntesis de acetato a partir de CO2 se
deben a Fischer (1932), quien obtuvo un cultivo bacteriano que pro-
duca acetato al inocularlo a lodos de aguas residuales despus de una
incubacin en atmsfera de hidrgeno. Wieringa (1940) descubri
102 Clostridium aceticum, que convierte los azcares en acetato y lo sinte-
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL tiza a partir de CO2 y H2:
CATABOLISMO
2 CO2 + 4 H2 CH3 COOH + 2 H2O
Captulo 8: CIDO BUTRICO
La denominada bacteria de Wieringa se perdi y no pudo ser recu-
perada hasta 1981 por M. Braun, F. Mayer y G. Gottschalk a partir de
una preparacin de esporas que se guardaba en el laboratorio de H. A.
Barker. De hecho, durante todo este periodo prcticamente la nica
bacteria acetgena estudiada fue Clostridium thermoaceticum, la cual
convierte los azcares en acetato:
C6 H12 O6 3 CH3 COOH
2 C5 H10 O5 5 CH3 COOH
El acetato deriva tanto de la fermentacin como de la sntesis a
partir de CO2:
C6 H12 O6

4 H+ + 4 e

2 CH3 CO COOH
4 H + 4 e
2 (CO2)

2 CH3 COOH C*O2 C*H3 C*OOH


C* es 14C en la atmsfera de H2/CO2 en la que se lleva a cabo la incu-
bacin de C. thermoaceticum.
La fraccin de radiactividad encontrada en el acetato est de
acuerdo con el esquema metablico sealado. Conviene recordar que
la transformacin global de una molcula de glucosa en tres de ace-
tato tambin tiene lugar en Acetobacter xylinum y en Bidobacterium
(caps. 5 y 6) pero la va metablica es completamente diferente y no
implica reduccin de CO2.
La reaccin de Wieringa tambin se ha demostrado en Clostridium
acidi-urici cuando fermenta la purina, segn la siguiente estequiometra:
C5 H4O3 N4 + 7 H2O 5 CO2 + 4 NH3 + 6 H+
1,5 CO2 + 6 H+ 0,75 CH3 COOH + 1,5 H2O
C5 H4 O3 N4 + 5,5 H2O 0,75CH3 COOH + 4 NH3 + 3,5 CO2
Del mismo modo, la sntesis de acetato a partir de CO2 se lleva a
cabo en la fermentacin del lactato por Butyribacterium rettgeri
4 CH3 CHOH COOH 4 CH3 COOH + 4 CO2 + 16 H+
8 H+ + 2 CO2 CH3 COOH + 2 H2O
8 H+ + 4 CH3 COOH 2 CH3 CH2 CH2 COOH + 4 H2O

4 CH3 CHOH COOH 2 CO2 + CH3 COOH + 2 CH3 CH2 CH2 COOH + 4 H2O
Durante muchos aos se crey que Clostridium thermoaceticum no 103
tena hidrogenasa y que slo poda utilizar el CO2 como aceptor nal 8.5 BACTERIAS ACETGENAS
de electrones en la fermentacin. Sin embargo, Drake en 1982 demos-
tr la presencia de este enzima y consigui que esta bacteria, cre-
ciendo en atmsfera de H2/CO2, produjera acetato a partir de CO2,
CO, HCOOH o CH3OH segn las siguientes estequiometras:

2 CO2 + 4 H2 CH3 COOH + 2 H2O

4 CO + 2 H2O CH3 COOH + 2 CO2


4 HCOOH CH3 COOH + 2 CO2 + 2 H2O
4 CH3 OH + 2 CO2 3 CH3 COOH + 2 H2O
2 CO + 2 H2 CH3 COOH
2 HCOOH + 2 H2 CH3 COOH + 2 H2O

C. thermoaceticum y otras bacterias acetgenas pueden crecer en


una atmsfera de H2/CO2. Ello supone que son capaces de oxidar el
H2 como las bacterias del gas detonante (ver captulo 22) utilizando
CO2 como oxidante y adems realizan tambin un desarrollo autotr-
co. Sin embargo, estas bacterias carecen de ribulosa difosfato car-
boxilasa, enzima clave del ciclo de Calvin, que es el utilizado para la
jacin de CO2 por las verdaderas bacterias del hidrgeno, las cuales
no pueden utilizar este compuesto como aceptor nal de electrones.
Las bacterias acetognicas forman acetil-CoA como primer producto
de la jacin autotrca del CO2, el cual es un intermediario de la
sntesis del acetato.

8.5 BACTERIAS ACETGENAS

Se consideran bacterias homoacetgenas aquellas que producen tres


moles de acetato por mol de glucosa. En otros casos puede formarse
acetato por reduccin del CO2 junto a otros productos de fermenta-
cin. Tales microorganismos constituyen el grupo de las bacterias
heteroacetgenas. Independientemente, tenemos una formacin de
acetato que no incluye la reduccin de CO2.
La mayor parte de las bacterias homoacetgenas son capaces de
crecer de forma autotrca en una atmsfera de CO2/H2, pero en
algunos casos se requiere la adicin de extracto de levadura y/o vita-
minas. Los metales son esenciales para el crecimiento de las acetge-
nas, pero slo a nivel de trazas. En la tabla 8.2 se presentan las
bacterias acetgenas ms estudiadas hasta ahora.

8.6 LA VA DE WOOD PARA LA FIJACIN AUTOTRFICA DE CO2

El actual conocimiento de la va de sntesis de acetato desde CO2 en


C. thermoaceticum se representa en la gura 8.3. Se conoce con el
nombre de va de Wood porque los trabajos de este autor y sus cola-
TABLA 8.2 Propiedades de algunas bacterias homoacetgenas y de otras acetgenas.
Crecimiento sobre C1
Topt G+C Aislado
CO2/H2 CO CH3OH/CO2 HCOOH
(C) pHopt (%) de

Homoacetgenas
Acetoanaerobium noterae 37 7,6-7,8 37 +a nd nd Cienaga
Acetobacterium carbinolicum 27 7 38 + nd + + Lodo
A. wieringae 30 7,2-7,8 43 + nd nd + Aguas residuales
A. boodii 30 nd 39 + + + + Estuario marino
Acetogenium kivui 66 6,4 38 + nd + Sedimento lacustre
Clostridium aceticum 30 8,3 33 + nd + Aguas residuales
C. formicoaceticum 37 7,2-7,8 34 c nd + c Lodo aguas residuales
C. magnum 31 7,0 29 nd Lodo anaerobio
C. thermoaceticum 60 6,8 54 + + + + Estircol de caballo
C. thermoautotrophicum 60 5,7 54 + + + + Lodo, soil
C. CV-AA1 30 7,5 42 + nd + nd Sedimiento
Sporomusa acidovorans 35 6,5 42 + nd + + Residuo de destilera
S. ovata 34 6,3 42 + nd + + Lodo
S. spheroides 36 6,5 47 + nd + + Lodo

Otras acetgenas
Butyribacterium methylotro-
phicumd 39 7,5 49 + + + + Aguas residuales
Eubacterium limosume 39 7,2 49 + + + nd Estircol de rumiantes
Peptostreptococcus productus 37 + + Aguas residuales
Desulfotomaculum orientisg 37 nd nd + + + + ?
Desulfovibrio baarsiih 37 nd nd + + + Lodo
a Requiere extracto de levadura.
b Produce butirato y acetato.
c Se produce butirato y caproato adems de acetato. Se trata de un nuevo aislamiento de una antigua bacteria conocida como Butyribacterium rettgeri.
d Se produce a partir de la glucosa, H , acetato, lactato y succinato, siendo el principal producto acetato con CO o CO /H .
2 2 2
e
Se produce butriato y caproato adems de acetato.
f
A partir de glucosa con CO o con CO2/H2 se produce H2, acetato, lactato y succinato. El acetato es el producto mayoritario.
g
Se forma butriato en el crecimiento sin SO4=. Nutalya formiato en lugar de H2.
nd: no determinado.

boradores se consideran fundamentales para el esclarecimiento de la


misma, si bien tambin se denomina va de los corrinoides. Algunos
enzimas son exclusivos de esta va metablica: la formiato deshidro-
genasa (que contiene tungsteno, selenito y hierro); la monxido de
carbono deshidrogenasa (que tiene nquel, cinc y hierro); la protena
corrinoide (que es un derivado de la vitamina B12), y una metil-trans-
ferasa. Los intermediarios metablicos ms importantes son el for-
miato, los portadores de C1 del tetrahidrofolato y el metil corrinoide.
La fermentacin de una molcula de glucosa dara dos molculas
de piruvato. De stas se derivan dos de acetil-CoA. Por otra parte, las
dos molculas de CO2 resultantes de la descarboxilacin del piruvato
seguiran dos caminos diferentes para acabar produciendo la tercera
molcula de acetil-CoA. Una de las molculas forma metil-tetrahidro-
folato ( CH3 H4 folato), mientras que la otra participa en la reaccin
de la monxido de carbono deshidrogenasa:

CO2 + 2 H+ + 2 e CO + H2O
104
105
Glucosa
8.6 LA VA DE WOOD PARA LA
CO2
FIJACIN AUTOTRFICA DE CO2
2 CH3 CO COOH Material
2 HS CoA celular
Piruvato
deshidrogenasa
2 CH3 CO CoA + 2 H+ + 2 e

CO HS CoA
Acetiltransferasa
deshidrogenasa
CO2 [Co Ni E] CH3 CO S CoA
2 H+
2 e 2 e + 2 H + Pi
Formiato
Fosfotrans-
deshidrogenasa hidrogenasa
CO CH CoE [CoE]
3 acetilasa HS CoA
H COOH H2

H4 folato CH3 CO P
ATP
Formil H4 folat o ADP
Acetato
sintetasa
ADP + Pi Transmetilasa quinasa ATP

HCO H4 folato CH3 COOH

CH H4 folato
ciclohidrolasa

2 H + + 2 e 2 H+ + 2 e

CH H4 folato CH2 H4 folato CH3 H4 folato


CH2 H4 folato CH2 H4 folato
deshidrogenasa reductasa

Figura 8.3 Fermentacin de la glucosa por C. thermoaceticum y jacin autotrca del CO2 por forma-
cin de acetil-CoA.

El metil-tetrahidrofolato pierde el grupo metilo, que pasa al corri-


noide (CoE). Para que esto se lleve a cabo deben tener lugar las dos
reacciones siguientes:

1. (Co3+ E) + 2 Ferredoxina red (Co+ E) + 2 Ferredoxina ox


2. (Co+ E) + CH3 H4 folato CH3 Co E + H4 folato

El grupo metilo del corrinoide se condensa con el monxido de


carbono y el coenzima A para dar acetil CoA:

3. (CH3 Co E) + CO + HS CoA CH3 CO S CoA + (Co E)

El intermediario clave de la CO deshidrogenasa (Co Ni E)


puede formarse tambin a partir de CO y directamente del piruvato
con piruvato-ferredoxina oxidorreductasa, TPP y ferredoxina. Por otra
parte, puede ser el origen del metilo del metil-tetrahidrofolato por la
reaccin de la CO deshidrogenasa.
En C. thermoaceticum se han aislado varios Co-metilcorrinoides,
incluyendo Co-(5-metoxi-bencimidazolil)-Co-metilcobamida y cido
106 Co-metilcobrico. Estos compuestos son los precursores del acetil-CoA
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL y no se encuentran libres, sino unidos a una protena.
CATABOLISMO Dickert y Thauer descubrieron en 1978 la deshidrogenasa del
Captulo 8: CIDO BUTRICO monxido de carbono en C. thermoaceticum y C. formicoaceticum, la
cual lleva nquel. De este modo, el CO puede sustituir al piruvato o al
CO2 como precursor del grupo CH3 del acetato. Ms interesante es
todava una fraccin aislada por Drake y Wood en 1981, la cual con-
tiene una metiltransferasa que puede sintetizar acetil-CoA a partir de
monxido de carbono utilizando ATP y metiltetrahidrofolato. De esta
forma el CO, al igual que el CO2, puede formar tanto el grupo metilo
como el carboxilo del acetato.

8.7 LA GENERACIN DE ENERGA EN LAS BACTERIAS ACETGENAS

Cuando las bacterias acetgenas crecen con glucosa, transformndola


en acetato, la acetoquinasa es responsable de la formacin de ATP (g.
8.3). Por otra parte, la reaccin de formacin de metil-tetrahidrofo-
lato implica un consumo de ATP. Si bien existe una formacin neta de
ATP al crecer con glucosa, el crecimiento con CO2/H2 requiere una
generacin adicional de energa.
En muchas bacterias acetgenas se ha demostrado la presencia de
hidrogenasa. Al parecer hay dos hidrogenasas, una soluble en el cito-
plasma y otra jada a la membrana. La primera se utilizara para reoxi-
dar el NADH, producindose hidrgeno. La segunda reciclara el
hidrgeno, formndose ATP por el sistema de la ATPasa. Cuando crece
con azcares, este sistema genera ATP con independencia del que se
obtiene degradando la glucosa hasta piruvato. Cuando el crecimiento
se realiza sobre CO2/H2, la hidrogenasa citoplasmtica no parece nece-
saria y, de hecho, hay evidencia experimental de que este sistema slo
se induce por la presencia de sustratos orgnicos. En atmsfera de CO2/
H2 funcionara nicamente el sistema catalizado por la hidrogenasa
ligada a membrana y el sistema de la ATPasa (g. 8.4).

Medio Membrana Citoplasma

2 CO2 2 CO2
CH3 COOH
4 H2 8 e
8 H+
8 e

8 H+ ADP + Pi

ATP

Figura 8.4 Esquema de los sistema de transporte de electrones y transposi-


cin de protones-ATPasa en las bacterias acetgenas creciendo con CO2/H2.
8.8 OTRAS VAS METABLICAS UTILIZADAS POR LAS BACTERIAS 107
ACETGENAS 8.8 OTRAS VAS METABLICAS
UTILIZADAS POR LAS BACTERIAS
En las bacterias acetgenas pueden encontrarse otros mecanismos ACETGENAS
bioqumicos que conducen a la formacin de acetato a partir de
diversos compuestos orgnicos y CO2.

8.8.1 Sistemas dependientes del tetrahidrofolato

A partir de metiltetrahidrofolato, amonaco y CO2 puede sintetizarse


glicina, en una reaccin catalizada por la glicincarboxilasa (1). La gli-
cina puede convertirse en acetato mediante la glicina reductasa (2).
Por otra parte, el metiltetrahidrofolato puede dar lugar a piruvato, el
cual se descarboxila posteriormente, dando acetato:

CH3 H4F CO2 + NH3


(1)

Glicina H4F
(2)
NH3 Acetato

La glicina formada por la glicincarboxilasa puede tambin incor-


porar un grupo metilo del tetrahidrofolato, generndose nalmente
piruvato, el cual es descarboxilado a acetato.

2H
CH3 H4F + H2O
CH2OH H4F
5-Hidroxi-metil-H4F
Metil-H4F-hidrolasa

CH2OH H4F + CH2 COOH CH2OH CH COOH + H4F


NH2 NH2
Transhidroximetilasa Serina

CH2OH CH COOH CH3 CO COOH + NH3


NH2
Serin deshidratasa

8.8.2 Reduccin indirecta del CO2

Existen indicios consistentes de que el piruvato puede ser el interme-


diario para una conversin cuantitativa de un mol de glucosa en tres
de acetato segn la siguiente va:
108 + 2H
2  CH3 CO COOH CH3 CH3
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO C O H C OH
Captulo 8: CIDO BUTRICO
CH3 C OH CH3 C OH
COOH COOH
Acetolactato
CO2
H2 O

COOH
CH2 CH3 CH3 CH3

C CH3 C CH3 CH CH3 CH


CH3 + 2H

CH CH H2 O H C OH C O
HS CoA
CO S CoA COOH COOH COOH

-Metilglutacrotonil-CoA
-Metilglutacrotonil-CoA Cetoisovalerato

H2O

COOH CH3 CO S CoA


CH3 CO S CoA
CH2 COOH
CH3 C OH CH2
CH2 C O 2 HS CoA
CH3 CO S CoA
CO S CoA CH3
-Metilglutaconil-CoA
-Metilglutaconil-CoA Acetoacetato

8.9 FERMENTACIN DEL ETANOL POR Clostridium kluyveri

La fermentacin butrica ms simple es la realizada por C. kluyveri,


que convierte el etanol y el acetato en cido butrico y caproico:

CH3 CH2OH + CH3 COOH CH3 CH2 CH2 COOH + H2O


CH3 CH2OH + CH3 CH2 CH2 COOH CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH + H2O

El estudio de esta fermentacin result esencial para conocer el meca-


nismo de formacin de butirato en todas las bacterias del cido but-
rico (g. 8.5). El acetil-CoA se incorpora a la va para formar
acetoacetil-CoA. El cido caproico se forma por una serie de reaccio-
nes anlogas en las que el butiril-CoA reemplaza al acetil-CoA. Es
importante resaltar que no todos los hidrgenos que se derivan de la
oxidacin del etanol a acetato son transferidos al NAD+. Parte, posi-
blemente va ferredoxina, es transferida a la hidrogenasa, producin-
dose hidrgeno molecular.
109
CH3 CH2OH
Etanol 8.10 FORMACIN DE BUTIRATO A
NAD+
PARTIR DE GLUCOSA
(1)
H2
NADH + H+

CH3 CHO
Acetaldehdo CH3 COOH
NAD+ + HS CoA
(2) ATP
H2
NADH + H+
ADP

CH3 CO S CoA CH3 CO P


Acetil-CoA
(3) HS CoA

CH3 CO S CoA CH3 CO CH2 CO S CoA


Acetil-CoA Acetoacetil-CoA
NADPH + H+

CH3 CH2 CH2 COOH (4) NADP+


Butirato
(7) CH3 CHOH CH2 CO S CoA
CH3 COOH -Hidroxibutiril-CoA
-Hidroxibutiril-CoA
Acetato

(5)
H2O

CH3 CH2 CH2 CO S CoA CH3 CH CH CO S CoA


Butiril-CoA Crotonil-CoA

(6)

NAD+ NADH + H+
Figura 8.5 Produccin de butirato a partir de etanol y acetato por C. kluyveri. La condensacin de dos
molculas de acetil-CoA para generar acetoacetil-CoA es una reaccin clave. El acetoacetil-CoA es enton-
ces reducido hasta butirato. (1) Alcohol deshidrogenasa. (2) Acetaldehdo deshidrogenasa. (3) Tiolasa. (4) -
Hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (especco de NADP). (5) Crotonasa. (6) Butiril-CoA deshidrogenasa. (7)
CoA transferasa. En este sistema, la oxidacin de etanol a acetil-CoA puede tambin generar hidrgeno,
por lo que parte del acetil-CoA formado puede utilizarse en vez de para reoxidar coenzimas (va de forma-
cin de butirato), para formar ATP (reacciones sealadas en trazo discontinuo).

Si se transforman a moles de etanol en acetato, formndose b


moles de hidrgeno y 2 (a b) moles de NADH + H+, los mismos se
reoxidan, transformndose 2 (a b) moles de acetil-CoA en butrico. b
moles de acetil-CoA producen acetato, generndose b moles de ATP.

8.10 FORMACIN DE BUTIRATO A PARTIR DE GLUCOSA


En las distintas fermentaciones de la glucosa por parte de las bacterias
del cido butrico hay siempre unos productos nales en proporcin
variable: acetato, butirato, CO2 e H2. De hecho, algunos microorganis-
110 mos como C. butyricum slo se producen estos cuatro catabolitos. En
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL una etapa inicial de la fermentacin slo se forma acetato, CO2 e H2. El
CATABOLISMO pH baja rpidamente y cada vez resulta ms difcil reoxidar el NADH +
Captulo 8: CIDO BUTRICO H+. Entonces se inicia la formacin de butirato, que sigue aumentando
a costa del cido actico formado inicialmente, cuya concentracin dis-
minuye. El pH se estabiliza y la fermentacin puede proseguir porque
la formacin de butirato permite equilibrar el balance O/R.
La va metablica utilizada para la formacin de butirato es la
misma que en C. klyveri a partir del acetil-CoA (g. 8.5), al cual se llega
desde el azcar que se utiliza como sustrato, que es degradado a piru-
vato por la va de Embden-Meyerhof. El piruvato es decarboxilado a
acetil-CoA por la reaccin fosforoclstica, producindose por tanto H2.

8.11 FORMACIN DE ACETONA Y BUTANOL

Clostridium acetobutylicum produce disolventes neutros (acetona,


butanol y etanol) junto a butirato, acetato, CO2 e H2 en la fermenta-
cin de azcares. Es la llamada fermentacin acetona-butanol que ha
sido objeto de gran atencin a escala industrial.
En la primera etapa de la fermentacin se producen los cidos.
Luego aparecen los disolventes, hacindose constante el pH del medio
y aumentando la produccin de CO2 con respecto al H2, as como la
produccin total de gases. Esto es debido a la formacin de acetona. El
acetoacetil-CoA se convierte en acetoacetato que luego se descarboxila
dando acetona y CO2 (g. 8.6). A n de compensar el bloqueo en la
reoxidacin de NADH que se produce al transformarse parte del ace-
toacetil-CoA en acetona, parte del acetoacetilCoA se convierte en buti-
rilCoA. El mismo se reduce a butiraldehdo con la misma aldehdo
deshidrogenasa que reduce el acetil-CoA a acetaldehdo. Posterior-
mente, la alcohol deshidrogenasa dependiente de NADH + H+ con-
vierte el butiraldehdo en butanol (g. 8.6).
Asimismo el butirato del medio puede incorporarse, transformn-
dose en butiril-CoA y nalmente en butanol. Ello conlleva un aumento
del pH del medio.

8.12 OTROS PRODUCTOS FINALES DE FERMENTACIN PRODUCIDOS POR


LAS BACTERIAS DEL CIDO BUTRICO

Adems de los productos referidos hasta ahora, en el medio resultante de


la fermentacin de las bacterias butricas pueden encontrarse, en mayor
o menor cantidad, acetona, isopropanol, etanol, lactato y succinato.
C. acetobutylicum puede formar una pequea cantidad de acetona
del mismo modo que las bacterias del cido lctico (captulo 6):
Acetil-CoA

2 Piruvato 2 Acetil-TPP Diacetilo Acetona

NADH + H NAD+
Acetil-lipoato
111
4 Glucosa
4 NAD+ 8.12 OTROS PRODUCTOS FINALES DE
FERMENTACIN PRODUCIDOS POR
4 NADH + H+ LAS BACTERIAS DEL CIDO BUTRICO

4 Piruvato

4 H2

4 Acetil-CoA

H
+ +2
H
AD 2 Acetoacetil-CoA
+ 2N
AD (1)
2N
Acetato
CH3 CH2 CH2 CO CoA Acetil-CoA CH3 CO CH2 COOH
Butiril-CoA Acetoacetato
NADH + H+
(3) (2) CO2
NAD+

CH3 CH2 CH2 CHO CH3 CO CH3


Butirilaldehdo Acetona
NADH + H+

NAD+

CH3 CH2 CH2 CH2OH


Butanol
Figura 8.6 Produccin de acetona y butanol. (1) CoA transferasa. (2) Acetoacetato
descarboxilasa. (3) Butirilaldehdo deshidrogenasa. (4) Butanol deshidrogenasa.

La acetona slo se forma directamente del piruvato y del acetalde-


hdo en las bacterias del cido actico.
C. butylicum, especie afn a C. acetobutylicum, es la nica que forma
isopropanol a partir de acetona como precursor:

NADH + H+ NAD+

CH3 CO CH3 Isopropanol


CH3 CHOH CH3
deshidrogenasa

C. butylicum no produce etanol ni acumula acetona.


C. acetobutylicum y C. perfringens producen tambin algo de etanol.
El acetil-CoA se reduce a etanol a travs de acetaldehdo.
Bacillus macerans es un esporgeno facultativo que fermenta hidra-
tos de carbono produciendo etanol, acetona, acetato, CO2 e H2. La
descarboxilacin del piruvato sigue el modelo entrico, produciendo
112 cido frmico y acetil-CoA. A diferencia de las levaduras, no dispone
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL de piruvato descarboxilasa, que produce directamente CO2 y acetal-
CATABOLISMO dehdo. B. macerans carece de los enzimas que posibilitan formar buti-
Captulo 8: CIDO BUTRICO rato a partir de acetil-CoA. La produccin de acetona y etanol sigue la
misma va que en C. acetobutylicum.
En el sobrenadante de cultivos de C. perfringens y Butyribacterium
rettgeri aparece lactato, que se forma a partir del piruvato con una lac-
tato deshidrogenasa NADH dependiente. En el primero se incrementa
su produccin en condiciones de deciencia de hierro.
C. kluyveri forma tambin succinato, lo que disminuye la relacin
CO2/H2.

8.13 PRODUCCIN DE SUCCINATO POR MICROORGANISMOS

El succinato puede aparecer como producto nal de fermentacin


siguiendo tres vas diferentes. C. kluyveri utiliza la va del malonato,
va que tambin utilizan las bacterias entricas. El sustrato es el acetil-
CoA que, mediante dos carboxilaciones, acaba transformndose en
succinato (g. 8.7).
Otra alternativa metablica para la produccin de succinato la
constituye la ya descrita para las bacterias del cido propinico (cap-
tulo 6), la cual es tambin utilizada por las enterobacterias como la
del malonato.

Piruvato PEP Oxalacetato Malato Fumarato Succinato


ATP ADP CO2 NADH + H+ NAD+ H2O NADH + H+ NAD+

Finalmente, la va del cido glioxlico tambin puede llevar a la


produccin de succinato en bacterias que pueden utilizar el acetato
como nica fuente de carbono:

Acetil-CoA

Oxalacetato Citrato

2H

Malato Isocitrato

HS CoA
Glioxilato Succinato
Acetil-CoA

De este modo,

2 Acetil-CoA + NAD+ Succinato + NADH + H+ + 2 HS CoA


113

8.13 PRODUCCIN DE SUCCINATO


POR MICROORGANISMOS
COOH CHO
CO2 CH2 H2O CH2
CH3 CO S CoA CO S CoA CO S CoA
(1) (2)
ATP ADP NADH + H+ NAD+
Acetil-CoA Malonil-CoA Malonil-CoA semialdehdo

NADH + H+
(3)
NAD+

CH2OH
CH2
CO S CoA
3-Hidroxi-propionilaldehdo-CoA

(4) H2O

CH2
CH
CO S CoA
Acroil-CoA
FADH + H+
(5)
FAD
COOH COOH
CH2 ATP ADP CH2 CH3 CO2 CH3
(8)
CH2 CH2 CH COOH CH2
(7) (6)
COOH HS CoA CO S CoA CO S CoA ADP ATP CO S CoA
Succinato Succinil-CoA Metilmalonil-CoA Propionil-CoA
Figura 8.7 Formacin de succinato por Clostridium kluyveri. (1) Acetil-CoA carboxilasa. (2) Malonil-CoA
semialdehdo deshidrogenasa. (3) 3-Hidroxi-propionilaldehdo-CoA deshidrogenasa. (4) Acroil-CoA hidratasa. (5)
Propionil-CoA deshidrogenasa. (6) Propionil-CoA carboxilasa. (7) Metilmalonil-CoA mutasa. (8) Succinil-CoA sin-
tetasa.

La reaccin clave en este caso es la catalizada por la isocitrato liasa:


CH2 COOH
CH2 COOH
CH COOH + COH COOH
CH2 COOH
CHOH COOH
Isocitrato Succinato Glioxilato
114 BIBLIOGRAFA
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO
JONES, D. T. y WOODS, D. R. Acetone-Butanol Fermentation Revisited.
Captulo 8: CIDO BUTRICO Microbiological Reviews. Vol. 50, N 4, p. 484524. 1986.
KJUNGDAHL, L. G. The autotrophic pathway of acetate synthesis in acetogenic
bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 40:41550. 1986.
9 CIDO FRMICO

9.1 EL GRUPO ENTRICO 116


9.2 EL DESARROLLO DE LA BIOLOGA DE Escherichia
coli 119
9.3 LA FERMENTACIN CIDO MIXTA 121
9.3.1 Formacin de etanol 122
9.3.2 Formacin de acetato 124
9.3.3 Formacin de CO2 y H2 a partir del
formiato 124
9.3.4 Formacin de succinato 125
9.3.5 Formacin del lactato 125
9.4 LA FERMENTACIN 2,3-BUTILENGLICLICA 127
9.4.1 Formacin de acetona 127
9.4.2 Formacin de 2,3-butanodiol
(2,3-butilenglicol) 129
9.5 FORMACIN DE TRIMETILENGLICOL 130
BIBLIOGRAFA 131

116 9.1 EL GRUPO ENTRICO


Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO Se incluye dentro del grupo entrico una serie extenssima de cepas
Captulo 9: CIDO FRMICO cuyo rasgo metablico comn es el carcter fermentativo facultativo.
Todas ellas estn constituidas por pequeos bacilos gramnegativos,
mviles por agelos peritricos o inmviles. Cuando fermentan azca-
res suelen ser gasognicos, pero hay algunas cepas que no producen
gas. Son catalasa positivas, oxidasa negativas y, con muy pocas excep-
ciones reducen los nitratos a nitritos.
Todas las bacterias entricas crecen bien en los medios bacteriolgi-
cos convencionales en condiciones aerobias, pero algunos miembros
presentan condiciones especiales de crecimiento. Los aminocidos pre-
sentes en el extracto de carne y en la peptona proporcionan la principal
fuente de poder reductor. En condiciones anaerobias, su desarrollo es
dependiente de la presencia de un aceptor de electrones apropiado, el
cual puede ser un producto de la fermentacin de los azcares, pero
pueden tambin utilizar fumarato y nitrato como aceptores nales de
electrones en un sistema que comprende citocromos.
El sustrato fermentable por excelencia es la glucosa, pero pueden
fermentar otros muchos azcares y polialcoholes. Algunos miembros
atacan incluso polisacridos, como los de los gneros Erwinia y Benec-
kea. Muchas cepas del grupo entrico son capaces de crecer en un
medio mineral al que se aade un azcar.
Cuando el nivel de oxgeno disponible es alto, funciona una sola
cadena respiratoria constituida por NAD-deshidrogenasa, ubiquinona,
citocromos b y citocromo oxidasa. El oxgeno accesible puede dismi-
nuir como consecuencia del rpido crecimiento y entonces aparece
citocromo a y un citocromo d que acta de oxidasa terminal. Al mismo
tiempo, se sintetiza menaquinona (MQ). El grupo de citocromos utili-
zado para la respiracin con fumarato en ausencia de oxgeno est
constituido por citocromo b555, citocromo b558, citocromo a y cito-
cromo d. En algunas condiciones puede haber una cierta promiscuidad
metablica entre diversos sistemas de transporte de electrones (g. 9.1).
Las bacterias entricas tienen un ciclo del cido tricarboxlico fun-
cional. Sin embargo, la -cetoglutarato deshidrogenasa es muy sensible
a las condiciones anaerobias, pudiendo disminuir su actividad hasta
interrumpir el ciclo. Entonces el crecimiento slo puede proseguir fer-
mentativamente. En este caso, se acumulan en el medio una serie de
catabolitos orgnicos. De acuerdo con la naturaleza de los mismos, las
bacterias entricas pueden dividirse en tres grandes grupos:
1. Las productoras de una mezcla de cidos orgnicos (rojo de
metilo +, Voges-Proskauer ).
2. Las productoras de productos nales del catabolismo neutros y, en
especial, de 2,3-butanodiol (rojo de metilo , Voges-Proskauer +).
3. Las que pueden reducir la glicerina a trimetilenglicol (rojo de
metilo +, Voges-Proskauer ).
Normalmente, la reaccin del rojo de metilo y la de Voges-Pros-
kauer son opuestas. Sin embargo, Klebsiella edwawarsii var atlantae y el
117
-Glicero-PO4

(anaerobia) 9.1 EL GRUPO ENTRICO
deshidrogenasa

NAD Fumarato
deshidrogenasa reductasa
MQ

Formiato Nitrato
deshidrogenasa reductasa

Succinato Citocromo o
deshidrogenasa O2

Citocromo d
Hidrogenasa
O2

-Glicero-PO4

(aerobia)
deshidrogenasa

Lactato
deshidrogenasa

Figura 9.1 Sistemas respiratorios en el grupo entrico. Las deshidrogena-


sas primarias ms importantes se reeren en los bloques dibujados a la
izquierda de la gura. A la derecha se muestran en un recuadro las oxidasas
ms importantes. Unas y otras estn unidas en la cadena de transporte de
electrones por la menaquinona (MQ) o la ubiquinona (Q). La hidrogenasa
puede funcionar como hidrogenasa y como oxidasa con la formiato deshi-
drogenasa. Los diferentes bloques pueden contener componentes diferentes
de la cadena respiratoria (avinas, centros Fe-SH, citocromos o Mo). No
todos los sistemas estn presentes en cada cepa. Su concentracin est regu-
lada por las condiciones de cultivo.

grupo oxytoca del mismo gnero son rojo de metilo + y Voges-Pros-


kauer +. Tambin los miembros del gnero Enterobacter, que son siem-
pre rojo de metilo , dan una reaccin de Voges-Proskauer + cuando
crecen con glucosa y cuando crecen con glicerina (cuando se forma
trimetilenglicol deja de formarse acetona y 2,3-butilenglicol). En la
tabla 9.1 se consignan los productos nales obtenidos de la fermenta-
cin de la glucosa en diferentes enterobacterias.
118

TABLA 9.1 Productos nales de la fermentacin de la glucosa por las bacterias entricas.

Productores de mezcla de cidos Productores de butanodiol

Escherichia coli Serratia marcescens

pH pH Clulas en Escherichia Enterobacter Enterobacter Serratia Serratia Erwinia


Productos nales 6,2 7,8 reposo aurescens aerogenes indologenes Anaerobio Aerobio plymuthica kiliensis carotovora

2,3-Butanodiol 0,3 0,3 - - 19 58 64 53 47 - 75


Acetona 0,06 0,2 - - - 2 2 8 4 2 -
Glicerol 1,4 0,3 - - 4 - 1 1 2 2 -
Etanol 50 50 77 40 52 70 46 29 51 46 66
Formiato 2 86 121 70 68 54 48 3 3 2 134
Acetato 36 39 78 40 52 8 4 9 5 50 64
Lactato 80 70 20 80 10 6 10 21 34 104 23
Succinato 11 15 39 10 13 - 8 9 7 2 11
CO2 88 2 2 80 140 117 159 145 100 13
H2 75 26 - 11 - 0,2 59 91 -
Balance O/R 1,06 0,91 1,04 1,01 1,02 - 0,98 1,07 0,97

en mol/100 moles de glucosa fermentada


En el grupo entrico son siempre funcionales las vas de Embden- 119
Meyerhof y de Warburg-Dickens. Los enzimas caractersticos de una y 9.2 EL DESARROLLO DE LA BIOLOGA
otra se han conrmado en prcticamente todos los gneros. Parece DE ESCHERICHIA
DE EscherichiaCOLI
coli
razonable asumir que el metabolismo intermediario de los azcares es
el mismo para todas las bacterias entricas y que los distintos modelos
de fermentacin se derivan de diferencias en el sistema enzimtico
que interviene en la degradacin del cido pirvico.
Ya ha sido comentado (captulo 8) que una caracterstica de las
descarboxilacin anaerobia del piruvato en las bacterias del grupo
entrico es la produccin de cido frmico, el cual puede ser desdo-
blado en CO2 e H2 por el sistema de la formiato deshidrogenasa-
hidrogenasa. La produccin de cido frmico en todas ellas justica
llamarlas bacterias del cido frmico, sobre todo, teniendo en cuenta
que la delimitacin taxonmica de las enterobactericeas ha variado
mucho en las ltimas dcadas y que es todava imprecisa. Por lo que
respecta a la descarboxilacin del piruvato, la formacin del formiato
las diferencia de las bacterias del cido butrico, las cuales forman H2
directamente del piruvato. Hay algunas excepciones, como Clostri-
dium acidi-urici, que utiliza el sistema entrico. Aparte de en el grupo
entrico, el formiato tambin puede formarse en otras bacterias,
como en los gneros Bacillus y Sarcina. En este ltimo, Sarcina maxima
utiliza el sistema clostridial y S. ventriculi el sistema entrico.

9.2 EL DESARROLLO DE LA BIOLOGA DE Escherichia coli

El grupo entrico est fundamentalmente incluido dentro de la familia


de las enterobacterias. En la seccin 5 del Bergeys manual of systematic
bacteriology (1984), los bacilos gramnegativos anaerobios facultativos se
subdividen en tres familias: Enterobactericeas, Vibrionceas y Pas-
teurelceas (tabla 9.2). En el presente captulo se hace referencia nica-
mente a bacterias incluidas en la primera familia, si bien hay gneros
separados de ella que pueden presentar muchas caractersticas comu-
nes. Existen incluso esporgenos facultativos como Bacillus polymyxa y
B. macerans, que no estn incluidos en la seccin 5 y que, si no fuese
por la formacin de esporas, podran confundirse a nivel metablico
con miembros del grupo entrico, sobre todo teniendo en cuenta que
en estas especies la reaccin de Gram suele ser negativa.
La historia del grupo entrico se inici hace largo tiempo par-
tiendo del supuesto de que Escherichia coli era el organismo domi-
nante de la ora fecal humana. Despus del desarrollo de las tcnicas
de cultivo de anaerobios, sto ha sido ampliamente desmentido. La
poblacin de E. coli en heces no excede de 108 clulas por gramo, en
tanto que la ora bacteriana total sobrepasa las 1011 clulas por
gramo. Lo que sigue siendo cierto es que la poblacin de E. coli acom-
paa al hombre desde su nacimiento hasta su muerte.
Hay una cantidad enorme de cepas bacterianas patgenas que se
asemejan mucho a E. coli, y otras tantas inocuas tambin muy pareci-
das y que, como ella, pueden encontrarse en aguas contaminadas.
Dada la importancia sanitaria de algunos miembros del grupo ent-

120
TABLA 9.2 Algunas caractersticas diferenciales de las familias de bacilos
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL gramnegativos facultativos.
CATABOLISMO
Captulo 9: CIDO FRMICO Caractersticas Enterobacteriaceae Vibrionaceae Pasteurellaceae

Dimetro celular (m) 0,3-1,5 0,3-1,3 0,2-0,3


Bacilos rectos + D +
Bacilos curvados D
Motilidad D +a
Distribucin agelar
(medios lquidos):
Polar +
Lateral +
Prueba de la oxidasa +a +a
Requerimiento de Na+
o estimula el creci-
miento D
Contienen el antgeno
comn de las ente-
robacterias +
Las clulas contienen
menaquinonas D D
Parsitos de mamfe-
ros y aves D a +
Requerimiento del
grupo hemo y/o
nicotinamida ade-
nina dinucletido
para el crecimiento D
Patgenos de plantas D
Requerimiento de
fuentes orgnicas de
nitrgeno a a +
a
Pueden darse algunas excepciones.
D: Pueden presentarse frecuentemente.

rico, todos los aspectos de su biologa han sido muy estudiados,


habindose producido como consecuencia una taxonoma sobredi-
mensionada en comparacin con otros grupos de bacterias.
E. coli crece fcilmente y con rapidez en cultivo puro en condicio-
nes muy cmodas para su manejo y estudio. Esto ha contribuido a
que haya llegado a ser uno de los organismo ms conocidos desde
todos los puntos de vista, incluyendo el bioqumico. De esta manera,
se ha tomado excesivamente como modelo aplicable a otras bacterias,
las cuales en sus caractersticas propias han sido mucho menos estu-
diadas. En todo caso, el gran conocimiento de la biologa de E. coli ha
producido una visin sesgada de muchos otros aspectos, tanto de la
bioqumica como de la gentica microbiana, sobre todo en los
manuales y obras de carcter general. Esto no quiere decir que E. coli,
al igual que la levadura, la mosca Drosophila, el msculo de paloma y
el propio hombre, entre otros, no haya constituido uno de los siste-
mas mediante los cuales se han logrado los mayores progresos en el 121
conocimiento de los seres vivos. 9.3 LA FERMENTACIN CIDO MIXTA
La historia de las bacterias coliformes se remonta ms de un siglo.
En 1880 Fritsch descubre Klebsiella pneumoniae y K. rhinoescleromatis
como microorganismos caractersticos de la contaminacin del agua
por el hombre. Cinco aos ms tarde, Escherich aade su Bacillus coli
como indicador de contaminacin fecal. Wurtz en 1892 es el primero
en valorar la produccin de cido en la fermentacin de los azcares.
Durham en 1898 aplica un sencillo mtodo para la determinacin de
la produccin de gas. Despus, se utiliza el patrn de fermentacin de
diferentes sustratos para multiplicar ms o menos el nmero de tipos
de coliformes, el cual llega a ser superior a 200. En medio de una can-
tidad ingente de informacin, Eijkman, realiza en 1904 un nuevo
planteamiento y establece que la distincin fundamental entre los
coliformes fecales y los de otro origen se encuentra en la produccin
de gas a partir de la glucosa a 46 C. Smith, en 1895, ya haba puesto
de maniesto que adems, la relacin CO2/H2 es de 1:1 para B. coli y
de 2:1 para B. aerogenes. Clark y Lubs (1915) desarrollaron la prueba
del rojo de metilo para detectar fcilmente la produccin de cido.
Con anterioridad (1898), Voges y Proskauer haban puesto a punto la
prueba para revelar los coliformes productores de 2,3-butanodiol.
En realidad, los estudios referidos constituyen el antecedente sobre
el cual se desarroll en los aos siguientes el conocimiento del meta-
bolismo fermentativo de las bacterias del grupo entrico.

9.3 LA FERMENTACIN CIDO MIXTA

El miembro ms caracterstico de la familia de las enterobactericeas


que da lugar a este tipo de fermentacin es sin duda Escherichia coli. El
metabolismo del piruvato puede esquematizarse como sigue:

Succinato Oxalacetato Fosfoenolpiruvato

Piruvato Lactato

Formiato Acetil-CoA

CO2 H2 Etanol Acetato

Cada producto subrayado puede ser el dominante segn las condicio-


nes en las que transcurre la fermentacin y el organismo.
Prescindiendo del lactato y del succinato, cada mol de piruvato
genera un mol de acetil-CoA y otro de formiato. El acetil-CoA puede
generar acetato o etanol, pero en todo caso
(moles de piruvato) = (moles etanol) + (moles acetato)
122 Por lo tanto:
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO moles (etanol + acetato) = moles de formiato
Captulo 9: CIDO FRMICO
Como el formiato se rompe en H2 y CO2, en cantidades equimolecu-
lares,
moles formiato total = moles formiato presente + moles H2

Por lo tanto:

moles (etanol + acetato) = moles formiato + moles H2

Esta equivalencia es slo vlida para el H2, puesto que todo l se


deriva del formiato. Con el CO2 no se cumple necesariamente, por-
que puede ser reutilizado en la produccin de succinato. En realidad:

moles de H2 = moles de CO2 + moles de succinato

Los clculos anteriores no tienen en cuenta el lactato y no son vlidos


para los productores de butanodiol, los cuales tienen una produccin
adicional de CO2. En la tabla 9.3 pueden observarse los valores encon-
trados para estos balances, los cuales conrman la va metablica.

9.3.1 Formacin de etanol


El sistema de la piruvato descarboxilasa, caracterstico de la levadura,
que produce etanol a partir del piruvato (ver captulo 4), slo parece
tener lugar en un representante del grupo entrico, Erwinia amylovora.
De forma general, en las enterobactericeas la descarboxilacin del
piruvato en condiciones anaerobias produce acetil-CoA o acetil-fos-
fato y formiato (ver 8.3 y Lmina 4). La piruvato formiato liasa
requiere TPP, HS-CoA, lipoato, Mn2+ y Fe2+. Se supone que el acetil-

TABLA 9.3 Productos nales de la fermentacin de la glucosa por diferentes


bacterias entricas.
Milimoles por 100 moles de glucosa
Etanol + H2 + CO2 +
Organismo acetato formiato H2 succinato
E. coli 90 90 0 15
E. coli (pH 6,2) 86 77 75 99
E. coli (pH 7,8) 89 112 26 17
E. aurescens 80 70 0 10
Erwinia carotovora 120 130 0 10
Serratia plymuthica 56 62 60 156
Serratia kiliensis (a) 100 102 100 102
Serratia kiliensis (e) 96 93 91 102
(a) y (e) son distintas cepas de la misma especie.
CoA se forma en primer lugar y la fosfato acetil transferasa da lugar a 123
un equilibrio con acetilfosfato. La formacin de este ltimo se activa 9.3 LA FERMENTACIN CIDO MIXTA
por el piruvato y se inhibe por el NADH + H+ y el ATP:

CH3 CH3
C O H COOH + C O
COO S CoA
Piruvato Acetil-CoA

CH3
C O
P
Acetil fosfato

La formacin de etanol tiene su origen en la produccin de acetal-


dehdo a partir del acetil-CoA mediante una aldehdo deshidrogenasa
NAD+ dependiente:

O
CH3 CO S CoA CH3 C + HS CoA
H
NADH + H+ NAD+

Otro sistema alternativo es la formacin a partir de acetato con


una acetaldehdo deshidrogenasa diferente. Puede estar ligada al
NAD+ o al NADP+:

Acetato Acetaldehdo
O
CH3 COOH CH3 C + H2O
H
NADH + H+ NAD+

El acetaldehdo formado no se acumula, y pasa a etanol con la alco-


hol deshidrogenasa. Este enzima acta indistintamente sobre alcoho-
les primarios y secundarios. Requiere Zn2+:

Acetaldehdo NADH + H+ NAD+


Etanol
O
CH3 C CH3 CH2OH
H

En la formacin de etanol a partir del piruvato se reoxidan dos moles


de NAD+.
124 9.3.2 Formacin de acetato
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
El acetil-CoA puede proporcionar acetato por dos caminos distintos.
CATABOLISMO
Captulo 9: CIDO FRMICO La acetil-CoA hidrolasa cataliza la transformacin:

CH3 CO S CoA + H2O CH3 COOH + HS CoA

Por otra parte, la acetil-CoA sintetasa tambin produce acetato y


adems un mol de ATP a partir de AMP y pirofosfato:

CH3 CO S CoA + AMP + PPi CH3 COOH + ATP + HS CoA

Finalmente, el acetato puede asimismo formarse a partir del acetil-


fosfato, tambin con la formacin de ATP pero ahora a partir de ADP
y la acetato quinasa. Esta reaccin va ligada a la de la fosfato acetil
transferasa y es la ms frecuente como productora de acetato en las
enterobacteri-ceas:

ADP ATP

CH3 CO S CoA + Pi CH3 CO P CH3 COOH


HS CoA

9.3.3 Formacin de CO2 y H2 a partir del formiato

El complejo formiato hidrgeno liasa incluye dos reacciones cataliza-


das por la formiato deshidrogenasa soluble y una hidrogenasa unida a
la membrana:

X1 X2
H COOH cit. c reductasa cit. c H2
CO2 2 H+

donde X1 y X2 son transportadores de e. X1 puede ser una citocromo


c reductasa y X2 un citocromo c de bajo potencial redox (c552) que
nicamente se produce en las bacterias coliformes durante el creci-
miento anaerobio.
El sistema enzimtico vinculado a la produccin de H2 molecular
es distinto al de los clostridios, si bien falta todava claricar sucien-
temente las reacciones que comprende.
Aeromonas hydrophila tiene un metabolismo parecido al de las bacte-
rias entricas y produce un citocromo c de bajo potencial as como for-
miato deshidrogenasa cuando crece en condiciones anerbicas. Los
clostridios poseen ferredoxina, a excepcin de C. thermoaceticum. La
ferredoxina no se ha encontrado nunca en las bacterias entricas y, en
consonancia con este hecho, en C. thermoaceticum encontramos al
nico clostridio que produce formiato y tiene formiato deshidroge-
nasa. Sin embargo, no est todava claro si el citocromo de bajo poten-
cial es o no la propia ferredoxina. C. acidi-urici es otra excepcin.
Algunas bacterias entricas no tienen formiato deshidrogenasa y acu- 125
mulan formiato. Generalmente son agasognicas. Entre ellas encontra- 9.3 LA FERMENTACIN CIDO MIXTA
mos a Salmonella typhi, Shigella, Proteus rettgeri y Serratia marcescens.

9.3.4 Formacin de succinato


Las enterobacterias utilizan un sistema para la formacin del succi-
nato distinto al comprendido en el CAT, que es aerobio y distinto al
mecanismo de los clostridios que ya ha sido referido.
El piruvato es fosforilado a fosfoenolpiruvato por la reaccin de la
fosfoenolpiruvato sintetasa que requiere Mg2+, K+ y ATP:

H2O O P
CH3 CO COOH + ATP CH2 C COOH + AMP + Pi
Piruvato Fosfoenolpiruvato

La fosfoenolpiruvato carboxilasa convierte al cido fosfoenolpi-


rvico en fosfoenoloxalacetato:

CH2 C COOH + CO2 COOH CH C COOH


O~P O~P
Fosfoenolpirvico Fosfoenoloxalacetato

Esta reaccin supone una introduccin de un mol de CO2 y va


seguida de una transferencia del fosfato rico en energa al IDP, resul-
tando la formacin de ITP y oxalacetato. La conversin de oxalace-
tato en succinato tiene lugar a travs de etapas idnticas a las del CAT.
Las enterobactericeas pueden cerrar el ciclo porque poseen
malato deshidrogenasa dependiente de NADP+ que descarboxila oxi-
dativamente al malato para dar piruvato. Sin embargo, esta reaccin
es utilizada en pequea escala. La formacin del succinato por las
enterobacte-rias se representa en la gura 9.2.
E. coli y Enterobacter pueden adems formar succinato por la
misma va que utilizan los clostridios y que ya ha sido descrita con
anterioridad (captulo 8). Esto slo parece ser posible en muy pocas
enterobactericeas y, por lo tanto, puede ser una caracterstica de inte-
rs taxonmico. Esta va del succinato se representa en la gura 9.3.

9.3.5 Formacin del lactato


La produccin del lactato se lleva a cabo por la accin de una lactato
deshidrogenasa que tambin utiliza NADH + H+ (L-lactato: NAD
xido reductasa y D-lactato NAD: xido reductasa)

NADH + H+ NAD+

CH3 CO COOH CH3 CHOH COOH


Piruvato Lactato
126 Piruvato
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL ATP
CATABOLISMO
ADP
Captulo 9: CIDO FRMICO
PEP
NADPH + H+ CO2 CO2

NADP+ Fosfoenoloxalacetato
IDP

ITP

Oxalacetato
NADH + H+

NAD+

Malato

H2O FADH2 FAD

Fumarato Succinato
Figura 9.2 Formacin de succinato por las enterobacterias.

Acetato Piruvato

Acetil-CoA CO2

Succinato
Malonil-CoA

Succinil-CoA
Malonil-semialdehdo-CoA

Metilmalonil-CoA CO2
Propionil-CoA

Figura 9.3 Formacin de succinato por E. coli y Enterobacter.

La cantidad del lactato vara mucho. En Serratia kiliensis llega a


constituir el 50% del piruvato catabolizado y en Enterobacter aerogenes
no lo hay en absoluto. Adems, la cantidad de lactato puede variar
segn las condiciones del desarrollo.
9.4 LA FERMENTACIN 2,3-BUTILENGLICLICA 127

9.4 9.4
LA FERMENTACIN 2,3-
LA FERMENTACIN
La reaccin de Voges-Proskauer se basa en una reaccin entre el ncleo BUTILENGLICLICA
2,3-BUTILENGLICLICA
de la guanidina que se halla presente en la creatina y en la peptona del
medio y el diacetilo formado por la bacteria. Esta reaccin tiene lugar
en medio alcalino. Los productores de butanodiol tambin producen
acetona y estas dos sustancias se convierten en diacetilo cuando son
oxidadas por el aire en una solucin alcalina. Entonces la presencia de
cualquiera de estos productos da lugar a una reaccin Voges-Proskauer
positiva.
NH2
NH C
NH2
Ncleo de la guanidina

Los productores de 2,3-butilenglicol (butanodiol) pueden dividirse en


dos grupos: el gasognico y el agasognico. Este ltimo no tiene formiato
deshidrogenasa y slo forma CO2, que de ordinario queda disuelto en el
medio. Dentro de este grupo encontramos los miembros del gnero
Serratia, Erwinia herbicola, Erwinia carotovora y Beneckea alginolytica. El
grupo gasognico produce ms CO2 que H2, a diferencia de los formado-
res de mezclas de cidos. Comprende los miembros del gnero Enterobac-
ter, Klebsiella, Aeromonas hydrophila y Photobacterium phosphoreum. La
formacin concomitante de cidos es relativamente pequea y el pH no
desciende sucientemente para dar la reaccin positiva del rojo de
metilo. La tabla 9.1 permite comparar la produccin de cidos por las
distintas bacterias entricas a partir de la fermentacin de la glucosa.
Adems de las enterobacterias, otros grupos de microorganismos
incluyen representantes que presentan una reaccin de Voges-Proskauer
positiva. Entre ellas, Bacillus polymyxa y algunas cepas de Bacillus subtilis,
que producen 2,3 butanodiol. La reaccin de Voges-Proskauer tambin
se utiliza para el diagnstico bioqumico de las especies de Neisseria.

9.4.1 Formacin de acetona


Los microorganismos producen acetona (acetilmetilcarbinol) siguiendo
tres vas diferentes.
(1) (2) (3)
Piruvato 2 Piruvato Piruvato
Formiato

Hidroxiacetil-TPP
Acetaldehdo-TPP Acetaldehdo Acetil-lipoato Acetil-CoA

-Acetolactato
-Acetolactato
Acetona Diacetilo

Acetona
Acetona
128 La primera de ellas es caracterstica de las levaduras y depende de
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL la formacin directa de acetaldehdo desde piruvato.
CATABOLISMO La segunda de ellas, que presenta como intermediario al -acetola-
Captulo 9: CIDO FRMICO ctato, tiene como enzima caracterstico la -acetolactato sintasa. Este
enzima, que, adems de encontrarse en las bacterias entricas, tam-
bin se halla en los miembros del gnero Bacillus que producen 2,3-
butanodiol, cataliza la reaccin:
TPP
2 Piruvato -Acetolactato
-Acetolactato+ CO2
Mn2+

La reaccin transcurrira en dos etapas: En la primera de ellas, una


molcula de piruvato es descarboxilada, quedando el grupo C2 res-
tante unido al pirofosfato de tiamina del enzima:

CH3 CO COOH + (H) TPP E CH3 CH TPP E + CO2


OH

Posteriormente, el complejo reacciona con una segunda molcula


de piruvato:

COOH
CH3 CH TPP E + CH3 CO COOH CH3 C CO CH3 + (H) TPP E
OH OH
Acetolactato

El acetolactato es descarboxilado a acetona por la acetolactato des-


carbo-xilasa:

COOH
CH3 C CO CH3 CH3 CH CO CH3 + CO2
OH OH
Acetolactato Acetona

El tercer mecanismo implica la formacin de diacetilo como pre-


cursor de la acetona. Se forma acetil-lipoato a partir del piruvato
mediante la piruvato deshidrogenasa y al mismo tiempo se forma
tambin a partir del piruvato acetil-CoA. Ambas formas de acetato
activo condensan para formar diacetilo. Finalmente, tanto en las bac-
terias lcticas (ver captulo 6) como en las bacterias entricas, la ace-
tona deshidrogenasa reduce el diacetilo a acetona:

lipoato

CH3 CO lipoato + CH3 CO S CoA CH3 CO CO CH3


HS CoA

NADH + H+ NAD+

CH3 CO CO CH3 CH3 CHOH CO CH3


9.4.2 Formacin de 2,3-butanodiol (2,3-butilenglicol) 129

9.4 9.4
LA FERMENTACIN 2,3-
LA FERMENTACIN
El butanodiol es un producto que resulta de la reduccin de la acetona
BUTILENGLICLICA
2,3-BUTILENGLICLICA

CH3 CHOH CO CH3 CH3 CHOH CHOH CH3


Acetona 2,3-Butanodiol
NADPH + H+ NADP+

Taylor y Juni mostraron que hay varias butanodiol deshidrogenasas y


que todas ellas son estereoespeccas. Bacillus polymyxa contiene una
D ()-2,3-butanodiol deshidrogenasa, Enterobacter aerogenes y Aeromo-
nas hydrophila contienen la L (+)-, y Bacillus subtilis contiene ambas D
()- y L (+)-butanodiol deshidrogenasas. Aeromonas hydrophila tiene
adems una aceton racemasa. Esto explica las distintas combinacio-
nes de los tres ismeros que resultan de la fermentacin 2,3-butilen-
gliclica. Cuando se hallan presentes las dos deshidrogenasas y no
hay racemasa se forma el meso-2-butanodiol:

CH3 CH3
C O C O
HO C H H C OH
CH3 CH3
L (+)-Acetona 2H
D (+)-Acetona
+2H

2H +2H + 2H 2H +2H
2H

CH3 CH3 CH3


H C OH H C OH HO C H
HO C H H C OH H C OH
CH3 CH3 CH3
L (+)-2,3-Butanodiol meso-2,3-Butanodiol D (+)-2,3-Butanodiol

Es posible que los distintos tipos de butanodiol formados por cada


especie constituyan una diferencia de valor taxonmico equivalente a
la de los diferentes tipos de cido lctico en las bacterias lcticas
homofermentativas.
La reaccin global para la produccin de 2,3-butanodiol a partir de
piruvato es:

2 Piruvato 2 CO2 + 2,3-Butanodiol


130 9.5 FORMACIN DE TRIMETILENGLICOL
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO La glicerina puede ser un sustrato fermentable por varias enterobacte-
Captulo 9: CIDO FRMICO rias y tambin puede ser producto nal de la fermentacin de azcares.
Al igual que las levaduras las bacterias entricas pueden acumular
glicerina como producto nal, tanto las que realizan una fermenta-
cin cido-mixta como las que llevan a cabo la fermentacin 2,3-buti-
lengliclica. La formacin de glicerina se ve incrementada en
condiciones que anulan o disminuyen la actividad de la formiato des-
hidrogenasa o de la deshidrogenasa alcohlica. El sustrato para la for-
macin de glicerina es la dihidroxiacetona- P :

NADH + H+ NAD+
CH2O P CH2O P CH2OH
C O CHOH CHOH
Deshidrogenasa
CH2OH CH2OH Pi CH2OH
Fosfatasa
Dihidroxiacetona- P Glicerina

Por lo que respecta a la fermentacin de la glicerina, sta puede


hacerse por dos vas independientes. Por un lado, la glicerina puede
oxidarse a dihidroxiacetona y seguir la va de Embden-Meyerhof.
El cambio de glucosa por glicerina como sustrato energtico
supone un incremento neto de los procesos oxidadores referidos al
mismo nmero de carbonos metabolizados. Por lo tanto, la reoxida-
cin de los coenzimas llevar como consecuencia la formacin de
mayor cantidad de productos reducidos nales. Escherichia coli es
incapaz de fermentar la glicerina. Ello es as porque, para cumplir el
balance de oxidorreduccin (cada mol de glicerina genera dos moles
de NADH + H+ al transformarse en piruvato), todo el piruvato for-
mado debera transformarse en acetil-CoA (mediante la piruvato for-
miato liasa) y ste en etanol. La existencia en el citoplasma de otras
enzimas que transforman el acetil-CoA en acetato impide que se cum-
pla el balance de oxidorreduccin.
Adicionalmente, la glicerina presente en el medio puede reducirse
a trimetilenglicol. En esta reaccin se reoxidan coenzimas, y la misma
se lleva a cabo en presencia de otro sustrato fermentable. O, si el creci-
miento se realiza exclusivamente con glicerina, parte de la misma se
transforma en gliceraldehdo-3 P , que sigue la va de Embden-Meyer-
hof. De hecho, la reoxidacin de coenzimas generados en la fermen-
tacin de la glicerina va de Embden-Meyerhof puede realizarse en
parte transformando glicerina en trimetilenglicol. En este caso, las
dos vas que tienen como sustrato la glicerina compiten por la misma.
La formacin de trimetilenglicol estar compensada por una disminu-
cin de etanol o por un incremento de cido actico.
Citrobacter freundii y algunas cepas de Enterobacter aerogenes deshi-
dratan la glicerina mediante un enzima que en presencia de coenzima
B12 y de iones K+ convierte cualquier 1,2 diol en 2-desoxialdehdo.
Esta diol deshidratasa forma 3-hidroxipropionialdehdo a partir de la
glicerina. El 3-hidroxipropionialdehdo es reducido con NADH + H+ a 131
trimetilenglicol mediante una 3-hidroxipropionialdehdo deshidroge- BIBLIOGRAFA
nasa. El 3-hidroxipropionialdehdo tambin puede ser deshidratado
dando acrolena:

H2O CH2OH
NAD+
CH2OH CH2OH CH2
NADH + H+
Diol-deshidrasa do
ldeh
CH OH Vit. B12 + K+
CH2 r o p ionia CH2OH
ip
drox enas
a
3-Hi idrog
d e s h Trimetilenglicol
CH2OH CHO
Glicerina 3-Hidroxi- CH2
propionialdehdo
CH
H2O
CHO
Acrolena

La acrolena, sealada por Voisenet como producto nal de la fer-


mentacin de la glicerina en Bacillus amaracrylus (B. polymixa), tam-
bin se ha encontrado en la fermentacin de la glicerina por
Citrobacter freundii y en Enterobacter aerogenes.
Mickelson y Werkman sealaron que la acrolena se formaba en
una reaccin lateral. Sobolov y Smiley demostraron que la acrolena
se forma espontneamente a partir del 3-hidroxipropionialdehdo y
que su presencia en pequea cantidad junto al trimetilenglicol puede
ser un artefacto.
Desde el punto de vista de sus propiedades fermentativas las ente-
robactericeas pueden ser separadas en tres grupos: las que producen
una mezcla de cidos, las que producen 2,3-butanodiol y las que pro-
ducen trimetilenglicol, caracterstica esta ltima de las bacterias del
gnero Citrobacter.

BIBLIOGRAFA

CLARK, H. F. y KABLER, P. W. The Physiology of the Coliform Group. En Princi-


ples and Applications in Aquatic Microbiology (H. Hekelekian y Norman C.
Dondero, eds.). John Wiley and Sons, Inc. New York/London/Sydney. 1964.
NEIDHARDT, F. C., INGRAHAM, J. L., BROOKS LOW, K., MAGASANIK, B.,
SCHAECHTER, M., UMBARGER, H. E. Escherichia coli and Salmonella typhi-
murium. vol. I. Amer. soc. for. Microbiol. Washington D. C. 1987.
INGLEDEW, W. J. y POOLE, R. K. The Respiratory Chains of Escherichia coli.
Microbiological Review. 48, 3, pp. 222271. 1984.
10 AMONACO

10.1 CLOSTRIDIOS PUTREFACTIVOS 134


10.2 FERMENTACIONES DE UN SOLO
AMINOCIDO 134
10.2.1 Arginina 135
10.2.2 Histidina y cido glutmico 136
10.2.3 Glicina 137
10.2.4 Serina 138
10.2.5 Treonina 138
10.2.6 Triptfano 139
10.2.7 Lisina 139
10.2.8 Ornitina 141
10.2.9 Cistena y metionina 141
10.3 DESCARBOXILACIN DE AMINOCIDOS 142
10.4 FERMENTACIN ACOPLADA DE DOS
AMINOCIDOS 142
10.5 FERMENTACIN DE UN AMINOCIDO JUNTO A UN
CETOCIDO 145
10.6 FERMENTACIN DE LA PURINA 147
10.7 FERMENTACIN DE LA PIRIMIDINA 147
10.8 FERMENTACIN DE LA ALANTONA 149
10.9 FERMENTACIN DEL CIDO NICOTNICO 149
BIBLIOGRAFA 149
134 10.1 CLOSTRIDIOS PUTREFACTIVOS
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO La capacidad de degradar anaerobiamente protenas, peptonas, poli-
Captulo 10: AMONACO pptidos y aminocidos no est distribuida uniformemente por todos
los grupos de bacterias. Las que tienen esta propiedad se llaman bac-
terias putrefactivas porque a menudo generan sustancias de olor des-
agradable. Una bacteria putrefactiva es la que puede llevar a cabo una
degradacin catablica de un compuesto nitrogenado en condiciones
anerbicas. Ocasionalmente, este mismo compuesto puede suminis-
trar el carbono y el nitrgeno necesarios para el desarrollo.
Las bacterias putrefactivas son sobre todo especies del gnero Clos-
tridium, como C. botulinum, C. perfringens, C. sporogenes, C. tetani y C.
tetanomorphum. Adems de este gnero encontramos otras especies
putrefactivas pertenecientes a grupos taxonmicos distintos, como
las de los gneros Fusobacterium, Streptococcus, Micrococcus y Proteus.
Las bacterias putrefactivas son alcallas y a su vez tienden a alcali-
nizar los medios de cultivo. Esto ltimo es debido a que o bien se libera
amonaco con formacin de cidos dbiles, o bien se liberan bases
orgnicas. En este sentido existe una cierta contraposicin con la fer-
mentacin propiamente dicha que es un proceso acidicante. Es cono-
cido el hecho de que los organismos fermentadores y los putrefactivos
son antagnicos y que, una vez que se ha desarrollado uno de ellos en
un medio, difcilmente puede desarrollarse alguno del tipo opuesto.
Teniendo en cuenta que las macromolculas proteicas no pueden
penetrar dentro de la clula bacteriana, los microorganismos que se
nutren de ellas liberan al medio exterior enzimas que las hidrolizan
transformndolas o bien en aminocidos o bien en pptidos de bajo
peso molecular. Hay dos clases de enzimas proteolticos: las endopep-
tidasas y las exopeptidasas. Las primeras pueden romper la cadena
polipeptdica en cualquier punto con una misma probabilidad, en
tanto que las segundas slo lo hacen por los extremos. Las exopepti-
dasas se subdividen en aminopeptidasas, que requieren un grupo
amino terminal y son dependientes de un ion metlico para su activi-
dad, y las carboxipeptidasas, que hidrolizan pptidos con un car-
boxilo terminal.
Los aminocidos y varios compuestos heterocclicos, productos de
la hidrlisis de sustancias nitrogenadas ms complejas, son los verda-
deros sustratos del catabolismo fermentativo de los microorganismos
putrefactivos.

10.2 FERMENTACIONES DE UN SOLO AMINOCIDO

La desaminacin de un aminocido puede ser llevada a cabo por las


bacterias de distintas formas. Existe una desaminacin por insatura-
cin, siendo el producto nal el cido graso insaturado:

R CH COOH R CH CH COOH + NH3


NH2
Normalmente, en anaerobios y facultativos cuando actan anaero- 135
biamente, se lleva a cabo una desaminacin reductora: 10.2 FERMENTACIONES DE UN SOLO
AMINOCIDO
R CH2 CH COOH + 2 H+ R CH2 CH2 COOH + NH3
NH2

Los organismos que tienen hidrogenasa y que pueden utilizar el


hidrgeno molecular como reductor, maniestan preponderada-
mente este tipo de desaminacin.
El compuesto resultante de la desaminacin puede ser oxidado
anaerobiamente. Para ello requiere un aceptor de electrones estable,
el cual puede ser suministrado independientemente, como en la fer-
mentacin acoplada de aminocidos, o puede resultar de la misma
degradacin metablica del cido orgnico. Tambin puede produ-
cirse hidrgeno. En Clostridium tetanomorphum este hidrgeno puede
dar lugar a una desaminacin reductora.
En general, la fermentacin de aminocidos produce como pro-
ductos nales cidos orgnicos, CO2, H2 y NH3.

10.2.1 Arginina
Una cepa de Mycoplasma aislada de cultivos celulares contaminados
ha mostrado la propiedad de transformar rpidamente la arginina
produciendo ATP. La L-arginina es primero desaminada por una argi-
nina-desaminasa que la convierte en citrulina:

NH NH2
C NH2 H2O C O
NH NH
+ NH3
(CH2)3 (CH2)3
CH NH2 CH NH2
COOH COOH
L-Arginina L-Citrulina

La ornitina-carbamoil-transferasa lleva a cabo la siguiente transforma-


cin de la L-citrulina con fosfato inorgnico:

NH2
C O NH2
NH (CH2)3 CO NH2
+ Pi +
(CH2)3 CH NH2 O P
CH NH2 COOH Carbamoil
COOH L-Ornitina fosfato
L-Citrulina
136 La siguiente reaccin de la carbamato-quinasa es la que produce ATP:
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO ADP + CO NH2 NH3 + CO2 + ATP
Captulo 10: AMONACO
O P

Esta reaccin a partir de la arginina ha podido ser demostrada en


Pseudomonas uorescens (lo que permite explicar la capacidad de creci-
miento anaerobio en presencia de arginina de algunos representantes del
gnero Pseudomonas), en Halobacterium salinarium y en Clostridium botuli-
num. Adems, este ltimo degrada la ornitina hasta cidos voltiles.

10.2.2 Histidina y cido glutmico


Clostridium tetanomorphum convierte la histidina en butirato, acetato,
CO2, NH3 y formamida. La primera reaccin es una desaminacin por
insaturacin catalizada por la L-histidina-amonio-liasa (1) que va
seguida por el sistema de la urocanato hidratasa (2). La etapa
siguiente desde el glutamato es an oscura, pero se supone que est
ligada al tetrahidrofolato (X). La rotura del glutamato es una desami-
nacin reductora:

HC N HC N
CH CH
COOH
C NH NH3 C NH 2 H 2O
CH NH CH NH H2O
(1) (2)
CH2 CH CH2
CH NH2 CH CH2
COOH COOH COOH
L-Histidina cido Formimino
urocnico glutamato

COOH COOH
CH3
CO2 CH3 NH3 CH NH2
CH2 CHO
+
CH2 NH2
CH2 + H2O CH3 + H2O
CH2 Formamida
COOH CH3 C O
COOH
Butirato CO X COOH
Glutamato

Clostridium tetanomorphum crece muy bien sobre glutamato. Su uti-


lizacin (g. 10.1) comprende una desaminacin por insaturacin
catalizada por la metil aspartato amonio liasa. El cido citramlico se
forma por la mesaconato hidratasa. La citramalatoliasa da lugar a una
reaccin parecida a la de la aldolasa que convierte el citramalato en
acetato y piruvato. El piruvato experimenta una descarboxilacin oxi-
137
COOH 10.2 FERMENTACIONES DE UN SOLO
COOH AMINOCIDO
NH2 CH NH3
NH2 CH HOOC CH H2O
CH2
(1) CH CH3 (2) H3C C COOH
CH2
COOH cido
COOH
mesacnico H 2O
-Metil
-Metil
L-cido
aspartato (3)
glutmico

CH3 COOH
CH2
Butirato Acetil-CoA C O
(4) H3C C COOH
(ATP) COOH
CO2 + H2 COOH
Acetato cido OH
CH3
pirvico Acetato
cido
citramlico

Figura 10.1 Fermentacin del glutamato por Clostridium tetanomorphum. (1) Glutamato
mutasa. (2) Metil aspartato amonio liasa. (3) Mesaconato hidratasa. (4) Citramalato liasa.

dativa que produce acetil-CoA, el cual da lugar a una fermentacin


butrica. Esta ltima etapa es la que produce energa.

10.2.3 Glicina
Las nicas bacterias anaerobias que llevan a cabo una degradacin de
la glicina son Diplococcus glycinophilus, Micrococcus anaerobius y Micro-
coccus variabilis, en realidad cepas distintas de Peptococcus anaerobius:

4 Glicina + 2 H2O 4 NH3 + 2 CO2 + 3 CH3 COOH

Puede liberarse hidrgeno molecular.


La primera reaccin es una xido-reduccin con desprendimiento
de CO2, NH3 e hidrgeno. Requiere fosfato de piridoxal y NAD+ como
cofactores.

CH2 COOH N N + H2O N N


+ + CO2 + NH3 + H2
NH2 H H CH2 H
Glicina H4-folato OH
5-OH-metil
H4-folato

138 Una segunda molcula de glicina es ahora necesaria para regenerar


Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL el tetrahidrofolato, formndose serina. En realidad, con las dos reac-
CATABOLISMO ciones, el H4-folato se utiliza para transferir el grupo metilo de una gli-
Captulo 10: AMONACO cina a otra molcula de glicina para producir serina:

Folato-H4 CH2OH + CH2 COOH CH2 CH COOH + H4-Folato


NH2 OH NH2
Glicina Serina

La desaminacin de la serina produce piruvato:

CH2 CH COOH CH3 CO COOH + NH3


OH NH2
Serina Piruvato

El piruvato se reduce a acetato por la rotura fosforoclstica con forma-


cin de acetil-CoA, acetil-fosfato y acetato.

10.2.4 Serina
La desaminacin se lleva a cabo por una serina-deshidratasa L-espec-
ca que puede actuar tambin sobre la L-treonina.

CH2OH CH COOH CH3 CO COOH + NH3


NH2 Piruvato
Serina

10.2.5 Treonina
Clostridium propionicum lleva a cabo una desaminacin de la treonina
a -cetobutrico por una treonina-deshidratasa. La etapa ulterior
forma propinico por descarboxilacin oxidativa con liberacin de
hidrgeno molecular:

COOH COOH
H2O H2
COOH
CH NH2 C O
CH2
CHOH CH2
NH3 CO2
CH3
CH3 CH3
Treonina -Ceto-
-Ceto- Propinico
butrico

Clostridium pasteurianum utiliza una serina hidroximetiltransferasa,


con lo que rompe la treonina en glicina y acetaldehdo. El acetalde-
hdo es reducido posteriormente a etanol con reoxidacin de NAD+:

139
CH3 CHOH CH COOH CH2 COOH + CH3 CHO
10.2 FERMENTACIONES DE UN SOLO
NH2 NH2
AMINOCIDO
Treonina Glicina Acetaldehdo

Peptococcus aerogenes forma -cetobutrico que luego se reduce a but-


rico.

10.2.6 Triptfano
El triptfano es fermentado lentamente por Clostridium sporogenes con
la formacin de cido indolpropinico:

NH3

CH2 CH COOH CH2 CH2 COOH


NH2 2 H+
NH NH
Triptfano c. indolpropinico

Muchas bacterias producen indol del triptfano, lo cual tiene un gran


inters taxonmico. Esto es debido a la triptofanasa, que lleva a cabo
una reaccin de desaminacin.

H2O O
CH2 CH COOH + CH3 C COOH
NH2 NH3
NH NH
Triptfano Indol Piruvato

La prueba bioqumica que se utiliza para la demostracin del indol


se basa en la reaccin coloreada que se produce en medio cido con p-
dimetilaminobenzaldehdo. El indol se extrae del cultivo en agua de
peptona con un pequeo volumen de xilol, aadindose luego el reac-
tivo.

10.2.7 Lisina
Clostridium sticklandii y otros clostridios utilizan la lisina como nica
fuente de carbono en condiciones anaerobias. La va metablica se
representa en la gura 10.2. La primera reaccin, que requiere coen-
zima B12 como cofactor, cambia el grupo amino de la posicin 2 a la
posicin 3, dando -lisina; o de la posicin 6 a la 5, dando 2,5-diami-
nohexanoato. Ambos intermediarios se convierten en 3,5-diamino-
hexanoato que sufre una desaminacin oxidativa, la cual forma 3-ceto-
5-aminohexanoato. Esta reaccin requiere NAD+. Sigue un desdobla-
miento que produce acetato y -aminobutiril-CoA. La desaminacin
subsiguiente tiene lugar con formacin de butiril-CoA. Finalmente la
desacilacin produce cido butrico y un mol de ATP a partir de ADP y
fosfato inorgnico.

140
NH2
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL CH2 CH2 CH2 CH2 CH COOH
CATABOLISMO
Captulo 10: AMONACO NH2
L-Lisina

(1) (1)

CH2 CH2 CH2 CH CH2 COOH CH3 CH CH2 CH2 CH COOH


NH2 NH2 NH2 NH2
-Lisina
-Lisina 2,5-Diaminohexanoato

(2)

CH3 CH CH2 CH CH2 COOH


NH2 NH2
3,5 Diaminohexanoato
NAD+ + H2O
(3)
NADH + H+ + NH3

CH3 CH CH2 CO CH2 COOH


NH2
3-Ceto-5-aminohexanoato
(4)

CH3 CH CH2 CO CoA CH3 CO CH2 COOH


NH2 Acetoacetato CH3 CO CoA
-Aminobutiril-CoA
-Aminobutiril-CoA
(7)
(5) NH3
CH3 CO CH2 CO CoA
CH3 CH CH CO CoA Acetoacetil-CoA
Crotonil-CoA
HS CoA
XH2 (8)
(6)
X
CH3 CO CoA
CH3 CH2 CH2 CO CoA Acetil-CoA
Butiril-CoA
ADP + Pi

(7) HS CoA (9) ATP CoA

CH3 CH2 CH2 COOH CH3 COOH


Butrico Acetato

Figura 10.2 Fermentacin de la lisina por los clostridios. (1) L-Lisina, 2,3-aminomutasa. (2)
-lisina mutasa. (3) 3,5-Diaminohexanoato deshidrogenasa. (4) Enzima que hidroliza el 3-
ceto-5-aminohexanoato. (5) Desaminasa. (6) Butiril-CoA deshidrogenasa. (7) CoA transferasa.
(8) -cetotiolasa. (9) Fosfocetolasa acetato quinasa.
10.2.8 Ornitina 141
10.2 FERMENTACIONES DE UN SOLO
Clostridium sticklandii fermenta la ornitina por una va parecida a la AMINOCIDO
de la lisina. No tiene lugar la segunda desaminacin, formndose ace-
tato y alanina:

NH2 CH2 CH3 CH3 COOH


CH2 CH NH2 2 H+ NH3 +
CH2 CH2 CH3
CH NH2 CH NH2 2 H2O CH NH2
COOH COOH COOH
Ornitina cido Alanina
2,4-diamino-
valrico

Clostridium botulinum tiene un sistema de fermentar la ornitina


completamente diferente, que lleva a la formacin de 5-aminovalerato.

NH2 CH2 HC O
H2O NH3
CH2 CH2 H 2C CH2
CH2 CH2 HC C
CH NH2 NAD+ NADH + H+ CH NH2 N H COOH
COOH COOH -Pirrolina-
Ornitina Glutmico--
Glutmico-- 5-carboxlico
semialdehdo NADH + H+

NAD+

H2C CH2
CH2 CH2 CH2 CH2 COOH
H 2C C
NH2 N H COOH
5-Aminovalrico H
Prolina

10.2.9 Cistena y metionina


La fermentacin de la cistena por Proteus vulgaris y otras bacterias ori-
gina SH2, NH3 y piruvato.

CH2 CH COOH + H2O CH3 CO COOH + NH3 + SH2


SH NH2 Piruvato
Cistena

La metionina da metilmercaptano (CH3 SH), NH3 y -cetobuti-


rato:
CH3 S CH2 CH2 CH COOH + H2O CH3 SH + CH3 CH2 CO COOH
NH2 NH3

Metionina -Cetobutirato
-Cetobutirato

Tanto el SH2 como el metilmercaptano contribuyen al olor putrefacto


de las protenas en descomposicin.
Los dos cetocidos son ulteriormente descarboxilados oxidativa-
mente a cidos monocarboxlicos.

10.3 DESCARBOXILACIN DE AMINOCIDOS

Cierto nmero de bacterias catalizan la descarboxilacin de algunos


aminocidos segn la reaccin:

R CH COOH R CH2 NH2 + CO2


NH2

Los aminocidos ms frecuentemente descarboxilados de esta


forma son la histidina, la tirosina, la arginina, la ornitina, la lisina, el
triptfano y el glutamato. La descarboxilacin de la lisina genera
cadaverina, substancia bsica de olor muy desagradable:

NH2 (CH2)4 CH COOH NH2 (CH2)4 CH2 NH2 + CO2


NH2 Cadaverina
Lisina

La reaccin de descarboxilacin se lleva a cabo principalmente en


medio relativamente cido. Las bases producidas tienden a elevar el
pH.
Las reacciones de descarboxilacin de aminocidos han sido utili-
zadas por su signicacin taxonmica.
En la tabla 10.1 se indican los aminocidos fermentados por dis-
tintas bacterias anaerobias.

10.4 FERMENTACIN ACOPLADA DE DOS AMINOCIDOS

Muchos clostridios que crecen con hidrolizados de protenas o con


mezclas de aminocidos obtienen su energa de una reaccin de
xido-reduccin acoplada entre dos aminocidos o entre un amino-
cido y un compuesto ternario. La reaccin acoplada entre dos ami-
nocidos se denomina reaccin de Stickland y se caracteriza porque
los aminocidos por separado no se descomponen en forma aprecia-
ble, en tanto que la apropiada pareja de aminocidos lo hace con gran
rapidez. Uno de los miembros es oxidado mientras que el otro es
reducido:
142
TABLA 10.1 Aminocidos fermentados por bacterias anaerobias.

Reaccin de Stickland
Hidroxiprolina

Fenilalanina
Glutamato

Triptfano
Isoleucina

Metionina
Aspartato

Histidina

Treonina
Arginina

Cistena

Tirosina
Leucina
Alanina

Glicina

Prolina

Serina

Valina
Lisina
Especies
Clostridium botulinum + +
Clostridium cochlearium +
Clostridium perfringens + + + + +
Clostridium propionicum + + + +
Clostridium saccharobutyricum + + + + +
Clostridium sporogenes + + + + + + + + +
Clostridium sticklandii + + + + +
Clostridium tetani + + + +
Clostridium tetanomorphum + + + + + + +

Fusobacterium nucleatum
+ + + + + + +
Pentococcus glycinophilus +

Pentococcus aerogenes + + + +
Pentococcus anaerobius +
Pentococcus variabilis +
Pentococcus prevotii + + + +
Pentococcus activus + + + +
Pentococcus asaccharolyticus + + + +
Escherichia coli + +
+, fermentacin rpida; , fermentacin lenta; , no fermentado.
143
144 4 H+
CH3 CH COOH + 2 H2O NH3 + CH3 COOH + CO2
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO NH2
Captulo 10: AMONACO
Reductor
+ 2 H+
CH2 COOH NH3 + CH3 COOH
NH2
Oxidante

Las bacterias que utilizan la reaccin de Stickland son clostridios


proteolticos, entre los que se encuentran:

C. acetobutylicum C. indolis
C. aerofaetidum C. mitelmani
C. bifermentans C. saprotoxicum
C. botulinum C. sordellii
C. caproicum C. sporogenes
C. carnis C. sticklandii
C. ghoni C. valerianicum
C. histolyticum

Los aminocidos que actan como reductores pueden dividirse en


tres grupos:
1. Aminocidos alifticos que son ms reducidos que los -ceto-
cidos (alanina, leucina, isoleucina, norleucina y valina).
2. Aminocidos alifticos con el mismo grado de oxidacin que
los -cetocidos (serina, treonina, cistena, metionina, arginina,
citrulina y ornitina).
3. Otros aminocidos, generalmente menos oxidados que los -
cetocidos (histidina, fenilalanina, triptfano, tirosina, aspar-
tato y glutamato).
Es posible que en algunos casos se precise -cetoglutarato, el cual
quizs acte en conjuncin con la glutamato deshidrogenasa:

Aminocido -Cetocido

NH3

-cetoglutarato Glutamato

NADH + H+ NAD+

La va oxidativa puede comprender este sistema de transamina-


cin. El mecanismo de la reaccin de Stickland se representa en la
gura 10.3.
145
R CH COOH
NH2 R' CH2 COOH 10.5 FERMENTACIN DE UN
AMINOCIDO JUNTO A UN
H2O NAD+ NH3
(1) CETOCIDO
NH3 (1)
NADH + H+

VA REDUCTORA
R CO COOH R' CH COOH
NH2
VA OXIDATIVA

CO2 R' CH2 COOH


NAD+
(2) (1) NH3
NADH + H+
R CO CoA
R' CH COOH
Pi
HS CoA NH2

R CO P
ADP H2O
ATP

R COOH
Figura 10.3 Reaccin de Stickland. (1) Sistema de la L-aminocido deshi-
drogenasa. (2) Sistema de la 2-cetocido deshidrogenasa. Requiere
lipoamida, TPP y HS CoA. Si R es un grupo metilo y R un tomo de hidr-
geno, entonces el esquema representa la fermentacin conjunta de la glicina
y de la alanina que proporciona acetato y CO2 segn la siguiente estequio-
metra:

2 H2O

Alanina + 2 Glicina 3 Acetato + CO2 + 3 NH3

La reduccin de la prolina o de la hidroxiprolina convierte el com-


puesto cclico en otro lineal sin formacin de NH3.

H2C CH2 H 2C CH2


H2C CH COOH + 2 H+ H 2C CH2 COOH
N NH2
H
Prolina -Aminovalerato
-Aminovalerato

10.5 FERMENTACIN DE UN AMINOCIDO JUNTO A UN CETOCIDO

Clostridium propionicum usa la reaccin de Stickland para metabolizar


la -alanina a cido propinico, utilizando el piruvato como oxi-
dante. El conjunto del sistema degradativo se representa en la gura
10.4.
Un sistema degradativo similar se encuentra en Clostridium amino-
butyricum que convierte -aminobutirato en cido butrico. Como en
el caso anterior tambin se produce acetato (g. 10.5).
146
-Alanina
-Alanina NH3
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL Piruvato Glutamato NAD+
CATABOLISMO
-Alanina
-Alanina 2-Oxoglutarato NADH + H+
Captulo 10: AMONACO
Acetil-CoA Malonato
semialdehdo
Acetato NADH + H+

NAD+

-Hidroxipropionato

Acetato

-Hidroxipropionil-CoA
-Alanil-CoA HS CoA

Acriloil-CoA Acetil-CoA
NH3
NADH + H+

NAD+
Propionil-CoA CO2

HS CoA

Propionato Piruvato

Figura 10.4 Fermentacin de alanina y piruvato.

-Cetoglutarato
2 Glutamato 2 -Cetoglutarato

2  -Aminobutrico
-Aminobutrico 2  Semialdehdo succnico
2 NAD+ 2 NADH + H+

2  2-Hidroxibutirato

2  Acetato
2 HS CoA
2  Hidroxibutiril-CoA

H2O

2  Vinilacetil-CoA

2  Crotonil-CoA 2  Acetil-CoA

NADH + H+

NAD+

Acetoacetil-CoA Butiril-CoA

HS CoA

Butirato

Figura 10.5 Fermentacin del -aminobutirato por Clostridium aminobu-


tyricum.
10.6 FERMENTACIN DE LA PURINA 147
10.6 FERMENTACIN DE LA PURINA
La llevan a cabo un nmero limitado de especies de Clostridium y
Micrococcus. C. acidi-urici fermenta rpidamente el cido rico, la xan-
tina y algunas otras purinas a NH3, CO2, acetato y cantidades muy
pequeas de glicocola y formiato.

O
C N
HN C
CH + 6 H2O 4 NH3 + 3 CO2 + CH3 COOH
C C
O N NH
H
Xantina

Otras purinas fermentadas se convierten probablemente en xan-


tina antes de que se abra el anillo. Las etapas de la fermentacin se
resean en la gura 10.6.
La fermentacin implica la apertura del ciclo hexagonal, seguida
por la conversin del anillo de la imidazolona en el compuesto lineal
formiminoglicina. Esta ltima se convierte en glicina, cido frmico y
NH3. El cido frmico se halla bajo una forma activada unido al cido
tetrahidrofolnico. Este complejo se reduce y la glicina se condensa
con el formaldehdo para formar serina. Luego este aminocido es
desaminado y reestructurado para formar piruvato, el cual nalmente
produce acetato y CO2. Durante la oxidacin del piruvato se genera
probablemente fosfato de alta energa bajo la forma de acetil- P , el
cual producir ATP.

10.7 FERMENTACIN DE LA PIRIMIDINA

Las pirimidinas son probablemente fermentadas pasando previa-


mente a cido ortico. La realizan cepas de Clostridium oroticum y Pep-
tococcus aerogenes.
Clostridium oroticum fermenta el cido ortico lentamente con for-
macin de NH3, CO2 y uno o ms cidos dicarboxlicos de cuatro car-
bonos. En extractos libres de clulas, el cido ortico se transforma en
L-asprtico acompaado de una pequea cantidad de 2,5-carboxime-
tilhidantona, compuesto este ltimo que se forma espontneamente
por hidratacin del cido -ureido succnico (g. 10.7).
Peptococcus aerogenes puede fermentar el uracilo, la citosina y la
timina. En estos ltimos dos casos se acumula uracilo. Adems se pro-
duce CO2, H2, acetato, lactato y NH3.
O HOOC HOOC
C N N
N + H2O H2N C C
HN C CH + H2O CH
CH C C C
C C NH H2N NH
N NH O NH NH3 +
O
H CO2
Xantina c. 4-ureido-5-imidazol c. 4-amino-5-imidazol
carboxlico carboxlico

CO2

H
N N N
CH2 HC
CH2 CH + H2 O
CH + NH3 + H2O
CH
C C
C CH NH NH
O H2N
O OH

Formiminoglicina 4-Imidazolona 4-Aminoimidazol


2 H 2O
NH3

"H COOH" CH2 NH2

2 H+ COOH
Glicina COOH CO2
H2 O
CH NH2 CH3 CO COOH CH3 COOH
"H CHO" CH2OH Piruvato Acetato
NH3 2H

Serina

Figura 10.6 Etapas de degradacin de la xantina.

NH CO NH CO
OC CH + NADH + H+ OC CH2 + NAD+
HN C COOH HN CH COOH
cido ortico cido -dihidroortico
cido -dihidroortico

H2O

COOH H2N COOH HN CH CH2 COOH


H2O
CH2 + CO2 + NH3 OC CH2 OC
H2N CH COOH HN CH COOH HN CO
cido L-asprtico cido -ureido
cido -ureido succnico
succnico 2,5-Carboximetil hidantona

Figura 10.7 Fermentacin del cido ortico por Clostridium orotium.


10.8 FERMENTACIN DE LA ALANTONA 149

10.8 FERMENTACIN DE LA
Streptococcus allantoicus fermenta la alantona en un medio que con- ALANTONA
tenga una pequea cantidad de extracto de levadura. Los productos
nales son NH3, urea, cido oxmico, CO2, formiato, acetato, glico-
lato y lactato. El cido oxmico (monoamida del cido oxlico), no
haba sido observado con anterioridad como producto natural. No se
conoce exactamente la va de la fermentacin de la alantona, pero
probablemente el primer paso es la formacin de cido alantoico:

CO NH COOH
+ H2O
CO CO NH CH NH CO NH2
NH2 CO NH CH NH NH2
Alantona cido alantoico

10.9 FERMENTACIN DEL CIDO NICOTNICO

Una especie no identicada del gnero Clostridium puede utilizar el


cido nicotnico como fuente de carbono, energa y nitrgeno. La
mayor parte del cido nicotnico genera NH3, acetato y propionato,
segn la estequiometra:

COOH
+ 4 H 2O NH3 + CO2 + CH3 COOH + CH3 CH2 COOH
N

cido nicotnico

BIBLIOGRAFA

VOGELS, G. S. y Van der DRIFT, C. Degradation of Purines and Pyrimidines


by Microorganisms. Bacteriol. Rev. 40, pp. 403468. 1976.
BARKER, H. A. Amino Acid Degradation by Anaerobic Bacteria. Ann. Rev. Bio-
chem. 50, pp. 2340. 1981.
11 METANO

11.1 BACTERIAS METANGENAS 152


11.2 REDUCCIN DEL DIXIDO DE CARBONO 155
11.3 EL SISTEMA DE LA METILREDUCTASA 157
11.4 LA PRODUCCIN DE ENERGA 159
BIBLIOGRAFA 159
152 11.1 BACTERIAS METANGENAS
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO El metano (CH4) es conocido desde el siglo XVIII como un gas que se
Captulo 11: METANO desprende de ambientes anaerobios ricos en materia orgnica. Es el
denominado gas de los pantanos, si bien en los mismos se halla mez-
clado con CO2 y N2. Puede ser recogido y quemarse con facilidad. El
metano es el resultado de la actividad de un grupo muy especializado
de bacterias que convierten los productos de fermentacin de otros
microorganismos anaerobios (especialmente CO2, H2, formiato y ace-
tato) bien en metano o bien en metano y CO2.
Las bacterias metanognicas han sido relativamente poco estudia-
das debido a la dicultad que presenta su aislamiento y mantenimiento
en cultivo puro. Son bacilos o cocos, mviles o inmviles, grampositi-
vos o gramnegativos, estrictamente anaerobios, mucho ms sensibles al
oxgeno y los agentes oxidantes, como el nitrato, que las dems bacte-
rias anaerobias. No pueden utilizar como reductores ni los aminocidos
ni los azcares. La metanognesis es obligada, y para reducir el CO2 a
metano slo pueden oxidar H2, formiato, metanol, metilaminas o ace-
tato, y posiblemente el etanol y el propanol en casos muy especiales.
Se ha descrito una serie extensa de fermentaciones metnicas, pero
no es seguro que las realice una sola bacteria del metano, sino ms
bien una asociacin de una bacteria del metano con otra bacteria
anaerobia. Algunos ejemplos clsicos de transformacin de diferentes
sustratos en metano son los siguientes (ver tambin Lmina 5):

4 HCOOH CH4 + 3 CO2 + 2 H2O


2 H2O
2 CH3 COOH 2 CH4 + 2 CO2
2 H2O
2 CH3 CH2 CH2 COOH 5 CH4 + 3 CO2

2 CH3 CHOH COOH 3 CH4 + 3 CO2


18 H2O

4 COOH 15 CH4 + 13 CO2

4 CH3OH 3 CH4 + CO2 + 2 H2O

2 CH3 CH2OH 3 CH4 + CO2


H2O

CH3 CO CH3 2 CH4 + CO2

Un cultivo metanognico que haba sido hace aos uno de los ms


estudiados es el de Methanobacillus omelianskii, el cual lleva a cabo e-
cazmente la oxidacin de alcoholes primarios y secundarios a metano
con la reduccin de CO2:

2 CH3 CH2OH + CO2 2 CH3 COOH + CH4


En realidad, el cultivo referido est formado por la asociacin 153
sinrgica de dos bacterias anaerobias que en conjunto realizan el 11.1 BACTERIAS METANGENAS
siguiente metabolismo:

2 CH3 CH2OH CO2


2 H2O
4 H2

2 CH3 COOH CH4 + 2 H2O

Una de ellas es una bacteria del metano, probablemente idntica a


Methanobacterium formicicum que forma metano con CO2 e H2. La otra
bacteria no est todava identicada y es la que lleva a cabo la oxida-
cin del etanol a acetato con formacin de hidrgeno. Ninguna de las
dos puede vivir a expensas de etanol y CO2. Sin la reduccin de este
ltimo, la misma produccin de H2 inhibe el crecimiento de la bacte-
ria asociada.
Methanobacterium formicicum oxida monxido de carbono segn la
siguiente estequiometra:

CO + H2O CO2 + H2
CO2 + 4 H2 CH4 + 2 H2O
CO + 3 H2 CH4 + H2O

Methanobacterium suboxidans oxida el cido butrico:

2 CH3 CH2 CH2 COOH + 4 H2O 4 CH3 COOH + 8 H+


8 H+ + CO2 CH4 + 2 H2O
2 CH3 CH2 CH2 COOH + 2 H2O + CO2 4 CH3 COOH + CH4

Methanobacterium propionicum oxida el cido propinico:

4 CH3 CH2 COOH + 8 H2O 4 CH3 COOH + 4 CO2 + 24 H+


3 CO2 + 24 H+ 3 CH4 + 6 H2O
4 CH3 CH2 COOH + 2 H2O 4 CH3 COOH + CO2 + 3 CH4

En estos dos ltimos casos puede tratarse de un fenmeno anlogo


a Methanobacillus omelianskii.
Las metangenas son un grupo de arqueobacterias que desde el
punto de vista bioqumico tienen la peculiaridad de presentar una serie
de coenzimas que no se han encontrado en otras bacterias. El anlisis el
rRNA indica que las metangenas se componen de tres grupos. El Grupo
I incluira Methanobacterium y Methanobrevibater, el Grupo II Metanococ-
cus, y el Grupo III los gneros Methanospirillum y Methanosarcina. Cada
154
CH2 O X
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL (a) CH2 O R1 CH2 O R2 O CH
CATABOLISMO
Captulo 11: METANO CH O R1 CH O R2 O CH2
CH2 O X CH2 O X

(b) Fitano

Bifitano

Derivados
pentacclicos
del bifitano

(c) X4 X5 X6

O O O O O O

Figura 11.1 Lpidos de arqueobacterias:


(a) estructura general de los diteres
(izquierda) y tetrateres (derecha); (b) cade-
nas tpicas de hidrocarburo: tano (en dite-
res), y bitano y sus derivados pentacclicos
(en tetrateres); (c) supuesto ordenamiento
de tetrateres para formar una membrana
monocapa. X puede ser H o cualquiera de O O O O O O
una variedad de derivados sacridos o fos-
fato. X1 X2 X3
TABLA 11.1 Metangenos.

Gneros % Lpidos Estructura de la Sustratos


Grupo representativos G+C caractersticos pared celular Gram Motilidad utilizados

I Methanobacterium 3250 Diteres C20 y Pseudomurena + H2; algunos usan for-


Methanobrevibacter 2732 Tetrateres C40 miato

II Methanococccus 3032 Diteres C20 Protena (trazas de


glucosamina) + H2; formiato

III Methanospirillum 4547 Diteres C20 y Vaina proteica; mate-


tetrateres C40 rial estructural desco- + H2; formiato
nocido
Methanosarcina 3851 Diteres C20 Heteropolisacrido + H2; formiato metanol;
metilamina; acetato

grupo tiene adems unas caractersticas peculiares de la pared celular y


de la membrana, que, en todo caso, dieren considerablemente de las
correspondientes a la generalidad de las bacterias (g. 11.1 y tabla 11.1).
Muchas bacterias metangenas son termlas y algunas, hiperterm-
las. Tambin se conocen otros miembros que son hallos.

11.2 REDUCCIN DEL DIXIDO DE CARBONO

Muchos metangenos son capaces de reducir el anhdrido carbnico


pasando sucesivamente a radicales formilo, metenilo, metileno y
metilo, el cual se reduce a metano. La etapa ms importante para la
produccin de energa es esta ltima. El suministro de electrones para
las reacciones de reduccin procede, segn las especies, de la oxida-
cin del hidrgeno, del formiato, del metanol, de metilaminas, del
acetato y, en muy pocos casos, del metanol y del propanol. En los
procesos referidos de reduccin del CO2 se han encontrado seis nue-
vos coenzimas (g. 11.2).
La reduccin del CO2 tiene lugar sobre un radical C1 unido a dife-
rentes coenzimas segn tiene lugar el proceso. El formilmetanofurano
es el primer producto estable de la jacin de CO2 (g. 11.3, reaccin
1). El grupo formilo es luego transferido a la tetrahidrometanopterina,
una pterina exclusiva de los metangenos, por accin de la formilmeta-
nofurano: tetrahidrometanopterina formiltransferasa (g. 11.3, reac-
cin 2). Despus el grupo formilo es convertido a un grupo metenilo
por el enzima 5,10-meteniltetrahidrometanopterinciclohidrolasa (g.
11.3, reaccin 3). Entonces interviene el coenzima avnico F420 que
suministra los electrones para la reduccin del doble enlace del grupo
metenilo para formar un grupo metileno, quedando el coenzima F420
en su forma oxidada (g. 11.3, reaccin 4). Todas estas reacciones han
sido puestas de maniesto en preparados enzimticos homogneos.
155
156
COO
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL CH2 O
CATABOLISMO
Captulo 11: METANO CH2H HN
CH3
H
H2NOC CH2 CH2 CH2 COO
HS CH2 CH2 SO3 N N
Coenzima M (HS CoM) H3C H
Ni+

CH3 S CH2 CH2 SO3 H N N
CH3 S CoM H 12
OOC CH
2
13
CH2 COO
Metil-coenzima M H H
CH2
O CH
2
COO
Factor F430

COOH COOH O COOH O COOH O CH2NH2


CH2CH2CHCHCH2CH2CNHCHCH2CH2CNHCHCH2CH2CNHCH2CH2 OCH2
O
COOH
Metanofurano

H H
H H H H
COOH
O NH 10 C C C C CH2
H CH2
NH CH H OH OH OH O O
HN 5 H H H O CH2
H CH3 H OHHO
C O P O CH
H2N N NH CH3
H H H H OH COOH
Tetrahidrometanopterina (H4MPT)

O CH3 O
HSCH2CH2CH2CH2CH2CH2CNHCHCHOPOH
COOH OH
Fosfato de 7-mercaptaheptanoil treonina
(HS-HTP)

O CH3 O COO O COO


CH2 CH CH CH CH2 O P O CH C NH CH CH2 CH2 C NH CH
OH OH OH O R H CH2
HO 9a N 10a N O HO N N O CH2
9 10 1
8 2
COO
7 3
6
5a
5
4a
4 NH NH
H H
O O
Oxidado Reducido (F420H2)
Coenzima F420
Figura 11.2 Coenzimas que participan en la metanognesis.
157
CH4 CO2
11.2 REDUCCIN DEL DIXIDO DE
CARBONO
S HTP 2 e Metanofurano (MFR)
S CoM
O
Metilrreductasa
2 e 1 CH2NHCH
F430
7 R
O
Formil-MFR

HS-HTP
MFR
2
Tetrahidrometanopterina
CH3 S CoM (H4MPT)

H
H4MPT HCO N 10
5-Formil-H4MPT
6 N CH
5

HS-CoM

H2O
H H 3
H C H N 10 H
Metil-H4MPT
N CH C N+ 10
5

N CH Metenil-H4MPT
5

5 H 4

H C N
2 e 10
F420 red
N CH F420 ox
5

Metileno-H4MPT

Figura 11.3 Ciclo de reduccin del CO2 a CH4 en las bacterias metanognicas. Las uniones de los grupos C1 a los
coenzimas se indican con el fragmento de este ltimo que se localiza fcilmente en la gura 11.2. La unin entre las
reacciones 7 y 1 es una parte del ciclo no completamente esclarecida.

El metileno-H4MPT puede ser reducido qumicamente a metil-


H4MPT y este ltimo produce metano con extractos celulares de meta-
ngenos. Las reacciones 5 y 6 de la gura 11.3 deben considerarse toda-
va especulativas, pero es seguro que est implicado el coenzima
M (SH CoM). Finalmente, la reaccin 7 representa un esquema sim-
plicado del proceso catalizado por la metil-CoM metilreductasa, que
se comenta a continuacin.
158 11.3 EL SISTEMA DE LA METILREDUCTASA
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO El coenzima M (HS CoM, cido 2-mercaptoetanosulfnico) fue el pri-
Captulo 11: METANO mero que se descubri entre los nuevos cofactores que intervienen en la
reduccin del CO2 a CH4. El material de partida fue Methanobacterium
thermoautotrophicum. Su forma metilada ( CH3 S CoM. ) es el sustrato
de la reaccin 7 (g. 10.3), llamado sistema del metilcoenzima M metil-
rreductasa. Se trata de un complejo de fracciones proteicas y cofactores.
El sistema de la metilrreductasa fue primeramente resuelto en tres
fracciones denominadas A, B y C, de acuerdo con su orden de elucin
durante una cromatografa de intercambio inico en condiciones
anaerobias. A y C son fracciones proteicas, en tanto que B es el fosfato
de 7-mercaptoetanoiltreonina (HS HTP) (g. 11.3), una molcula
dializable de pequeo tamao. La fraccin A ha sido resuelta en tres
componentes proteicos (A1, A2 y A3) y FAD. Adems, el ATP es necesa-
rio para restablecer la actividad, y la vitamina B12 y el coenzima F420
tienen efecto activador si bien no son imprescindibles. El sistema se
inactiva aerobiamente y es extraordinariamente sensible al oxgeno.
El componente C, la metilreductasa, consta de tres subunidades, y
representa aproximadamente el 10% de la protena celular, estando alta-
mente conservada en todas las bacterias metangenas. Todas las prepa-
raciones homogneas del componente C presentan un color amarillo
caracterstico que tiene un mximo de absorcin a 421 nm y que decae
paulatinamente hasta 440 nm. El componente cromofrico ha sido ais-
lado; es una porrina altamente reducida y es el primer componente
tetrapirrlico unido a nquel que ha sido descrito en los seres vivos. Pre-
senta el mximo de absorcin a 430 nm, por lo que se le ha llamado fac-
tor F430. La diferencia de longitud de onda entre los picos 421 y 430 se
debe a las interacciones estructurales entre el grupo prosttico y la pro-
tena del componente C. Hay dos molculas de F430 unidas a cada mol-
cula del componente C, ambas funcionales. Adicionalmente, el
componente C est unido a dos molculas de coenzima M, que se incor-
poran al mismo nicamente bajo la forma de CH3 S CoM. Final-
mente, el componente C tambin est unido a dos HS HTP.
La reduccin de CH3 S CoM con H2 requiere, adems del
componente C, las fracciones proteicas A1, A2 y A3, anteriormente
mencionadas. Probablemente, A1 es una hidrogenasa. El dador de
electrones para la reduccin del CH3 S CoM es el HS HTP. El
heterodisulfuro de HS HTP y HS CoM ha sido identicado
como el producto resultante de la reaccin:

CH3 S CoM + HS HTP CH4 + CoM S S HTP

Un modelo que resume el conocimiento actual del sistema de la


metilrreductasa estara constituido por tres reacciones:
a) Reaccin I. Conversin de la metilreductasa inactiva (Ci) a su
estado activo (Ca) por reduccin de NiII a NiI

A2, A3 ATP, TiIII o H2


Ci (NiII) Ca (NiI)
b) Reaccin II. Produccin de metano y del heterodisulfuro 159

11.4 LA PRODUCCIN DE ENERGA


Ca
HS HTP + CH3 S CoM CH4 + CoM S S HTP

c) Reaccin III. Regeneracin de HS CoM y HS HTP por


reduccin del heterodisulfuro. Los electrones pueden ser propor-
cionados bien por el citrato de titanio III, bien por el ditiotreitol
(en ambos casos en presencia de B12), o bien una reaccin enzi-
mtica catalizada por la protena A1 en presencia de H2:

TiIII + CN-B12
DTT + CN-B12
A1 + H2
CoM S S HTP HS CoM + HS HTP

La relacin del CH3 S CoM con la reduccin del CO2 a CH4


fue descubierta por Gunsalus en la dcada de los setenta, pero el des-
cubrimiento posterior del heterodisulfuro ha constituido un progreso
importante para la comprensin de la reaccin 7 y la conrmacin de
la va cclica de la gura 11.3. Sin embargo, la misma formacin del
formilmetanofurano es todava poco conocida.

11.4 LA PRODUCCIN DE ENERGA

La reduccin de CH3 S CoM por H2 es un proceso exoergnico


( G0 = 85 kJ) y es la fuente de energa para la sntesis de ATP. En
Methanosarcina barkeri la metanognesis a partir de metanol e H2
tanto como la que tiene lugar a partir de acetato estn vinculadas a la
sntesis de ATP por una bomba de protones, indicando un mecanismo
quimiosmtico para la sntesis de ATP. Por analoga, se piensa que
este mecanismo es tambin aplicable a otros metangenos. Reciente-
mente, se ha puesto de maniesto que el componente C se encuentra
asociado a la membrana citoplasmtica constituyendo un orgnulo
denominado metanorreductosoma, lo que apoya al modelo quimios-
mtico como el ms probable para las bacterias metanognicas. Por
otra parte, ya ha sido sealado (captulo 8) que la generacin de ATP
puede tener muchos aspectos comunes en acetgenas y metangenas.

BIBLIOGRAFA

KANDLER, O. Archeobacteria. New York. Gustav Fischer. 1982.


ROUVIRE, P. E. y WOLFE, R. S. Novel Biochemistry of Methanogenesis. The
Journal of Biological Chemistry. Vol. 263, 17, pp. 79137916. 1988.
12 DIXIDO DE CARBONO

12.1 EL GAS SILVESTRE 162


12.2 EL CO2 COMO CATABOLITO 163
12.3 EL CICLO DE LOS CIDOS TRICARBOXLICOS
(CAT) 163
12.4 SISTEMAS ENZIMTICOS DEL CAT 164
12.5 ESTEQUIOMETRA DEL CICLO 167
12.6 REACCIONES ANAPLERTICAS 168
12.7 CICLO DEL CIDO GLIOXLICO 170
BIBLIOGRAFA 171
162 12.1 EL GAS SILVESTRE
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO A principios del siglo XVII, Van Helmont consigui demostrar que en
Captulo 12: DIXIDO DE CARBONO la fermentacin se produce un aire idntico al que se origina
cuando se quema carbn de lea y como el que puede hacer irrespira-
ble la atmsfera de las bodegas. Para este tipo particular de aire
invent el nombre de gas, que la ciencia posteriormente adoptara
denitivamente. Van Helmont estableci el concepto de que hay dife-
rentes tipos de gases, pero slo demostr plenamente la existencia del
gas que denomin gas silvestre, que despus se denominara gas
jo y, ms tarde, anhdrido carbnico, la molcula de carbono ms
oxidada (CO2). El trmino fermentacin alude originariamente a un
desprendimiento espontneo de gas semejante a la ebullicin, pero
que se lleva a cabo a temperatura ambiente. Fue primeramente apli-
cado al mosto de la uva, en el cual se produce el vino como resultado
del proceso fermentativo.
En el siglo XVIII, Black demostr cuantitativamente que el gas des-
prendido por la piedra caliza cuando se trata con un cido, puede ser
reabsorbido por agua de cal, produciendo el material original con una
ganancia de peso igual a la prdida que primitivamente se haba pro-
ducido. Con ello se puso de maniesto que un gas poda formar parte
de un slido, de lo que viene la denominacin de gas jo. Ms
tarde, a nales del siglo XVIII, Lavoisier demostr que este gas es el
producto de combustin de la materia orgnica y que los seres vivos
hacen la misma transformacin en el denominado proceso respirato-
rio. Ingenhousz y Senebier, hacia la misma poca, dejaron establecida
la fotosntesis vegetal, en la que se lleva a cabo justamente el proceso
contrario a la respiracin animal.
Los trabajos referidos de Black constituyen la base del desarrollo del
anlisis orgnico llevado a cabo ms tarde por Liebig. Adems, pudo
comprobarse que muchas reacciones de la qumica orgnica consisten
en un desprendimiento o una jacin de anhdrido carbnico.
En los captulos precedentes ha sido reseado que el CO2 acom-
paa a muchos catabolitos microbianos caractersticos, si bien tam-
bin puede ser utilizado para la formacin de muchos productos
nales del catabolismo, entre los que sobresalen el acetato y el
metano. Los microorganismos que crecen aerobiamente pueden
mineralizar diferentes sustratos orgnicos, producindose CO2 como
nico catabolito. Sin embargo, tambin en estas condiciones puede
formarse CO2 junto a productos orgnicos parcialmente oxidados, e
incluso puede ser inexistente en procesos estrictamente aerobios,
como en la mal llamada fermentacin actica. De hecho, el CO2 es un
catabolito habitual resultante del desarrollo microbiano sobre materia
orgnica, tanto en condiciones aerobias como anaerobias. Si el
balance global de materia entre el crecimiento y el medio puede
expresarse como:

AH2 + B + X0 BH2 + A + X
X0 + (AH2 B) BH2 + A + X

siendo X la biomasa (X > X0), en muchos casos A es CO2. Sin 163


embargo, en otros el anhdrido carbnico es B. De esto se deduce que CO2 COMO CATABOLITO
12.2 EL CO2
el CO2 puede ser tanto el producto nal oxidado como el oxidante
inorgnico y, en este ltimo caso, tanto para la produccin de energa
como para el suministro de carbono para el aumento de biomasa.

12.2 EL CO2 COMO CATABOLITO

El CO2 puede formarse en muchas reacciones de descarboxilacin. En


los procesos anaerobios se genera mayoritariamente en la descarboxila-
cin del piruvato (captulo 8.3) o del cido 6-fosfoglucnico (apartado
5.9.1). En las bacterias aerobias, el CO2 tambin puede derivarse de la
reaccin catalizada por la 6-fosfogluconato deshidrogenasa, pero prin-
cipalmente se forma de la mineralizacin del acetil-CoA por la va
cclica conocida con el nombre de ciclo de los cidos tricarboxlicos
(CAT), ciclo de Krebs o tambin ciclo del cido ctrico. Los enzimas res-
ponsables de las dos descarboxilaciones que se dan a lo largo del ciclo
son la isocitrato deshidrogenasa y la -cetoglutarato deshidrogenasa.

12.3 EL CICLO DE LOS CIDOS TRICARBOXLICOS (CAT)

El CAT es la va metablica ms importante para la generacin de ATP


en las bacterias aerobias. La oxidacin completa de una molcula de
acetato a CO2 genera tres molculas de NADH + H+, una molcula de
ATP y un par de e. Estos ltimos entran en las cadenas respiratorias
directamente, reduciendo el FAD. Los nucletidos de la piridina redu-
cidos se reoxidan tambin a travs de las cadenas respiratorias.
En las bacterias anaerobias se encuentra la mayor parte de los enzi-
mas del CAT, pero stos no tienen la capacidad de transformar el -
cetoglutarato en cido succnico. El ciclo queda interrumpido en este
punto y no es funcional como sistema terminal de oxidacin.
Las bacterias auttrofas obligadas tampoco tienen un CAT funcio-
nal. Carecen de -cetoglutarato deshidrogenasa y tienen niveles muy
bajos de las deshidrogenasas succnica y mlica.
El CAT tampoco es funcional en los metilotrofos obligados que tie-
nen sistemas membranosos transversales al eje mayor como Methylo-
monas, Methylobacter y Methylococcus.
Adems de sistema terminal de oxidacin, el CAT tiene una impor-
tante funcin biosinttica. A partir del cido -cetoglutrico se forma
cido glutmico, que es un compuesto clave para la biosntesis de
otros aminocidos y para la asimilacin de NH3. El cido fumrico es
tambin el precursor del cido asprtico y los aminocidos que se
derivan de l. El oxalacetato tambin es precursor del aspartato. Del
succinil-CoA se derivan tambin las porrinas, la lisina y la metio-
nina (g. 12.1).
Catablicamente, el CAT funciona alimentndose exclusivamente
de acetato activo. Sin embargo, en el desarrollo bacteriano tiene lugar
simultneamente su funcin biosinttica. Como consecuencia de ello
sufre un drenaje de varios intermediarios. La continuidad del ciclo

164
Acetil-CoA
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL
CATABOLISMO
Captulo 12: DIXIDO DE CARBONO

Aspartato Oxalacetato Citrato

Malato

Fumarato Isocitrato
Arginina
Aminocidos
de la familia
del aspartato
Succinato -Cetoglutarato Glutamato

Glutamina Prolina
Succinil-CoA

Porfirinas
Figura 12.1 Metabolitos del CAT que son precursores biosintticos. En trazo continuo se
representan reacciones del ciclo y en trazo discontinuo reacciones biosintticas.

metablico puede exigir la formacin de oxalacetato u otros interme-


diarios con independencia del suministro de acetato activo.
Cuando las bacterias crecen aerobiamente sobre hexosas y pentosas,
el relleno de los intermediarios del CAT se lleva a cabo por las llamadas
reacciones anaplerticas. Estas juegan un importante papel regulador
entre el metabolismo biosinttico y el energtico. Las fuentes de oxala-
cetato son, de hecho, reacciones anaplerticas. Sin embargo, se hace
referencia a ellas en un sentido ms estricto cuando incluyen la asimi-
lacin de CO2 para formar intermediarios C4 del CAT.
Cuando la fuente de carbono est constituida por cidos grasos de
cadena corta o por acetato, el suministro de oxalacetato se lleva a
cabo por la va del cido glioxlico (ver apartado 12.7).
En algunas bacterias anaerobias el sistema que suministra energa
comprende varias reacciones del CAT. Esto es lo que ocurre en las bac-
terias del cido propinico y constituye un indicio del origen loge-
ntico del CAT.
12.4 SISTEMAS ENZIMTICOS DEL CAT
En el CAT existen siete sistemas enzimticos. En la gura 12.1 se
representa una visin de conjunto de las reacciones del ciclo. Todos
los sistemas enzimticos son reversibles excepto la oxidacin del -
cetoglutarato, la cual requiere TPP, cido lipoico, CoA, FAD y NAD+.
Una excepcin la constituye Chlorobium thiosulfatophilum, donde se
ha encontrado una reaccin de carboxilacin del succinil-CoA depen-
diente de la ferredoxina, unida a una 2-oxoglutarato sintasa.

El oxalacetato es el compuesto clave del CAT porque es el aceptor 165


de acetil-CoA. Esta reaccin est catalizada por la citrato sintasa. 12.4 SISTEMAS ENZIMTICOS DEL
O CH2 COOH CAT
H2O
O C COOH C CH3 HO C COOH + HS CoA
1 +
H2C COOH S CoA CH2 COOH
Oxalacetato Acetil-CoA Citrato
Este sistema es inhibido por el -cetoglutarato, por el NADH + H+,
ATP y el succinil-CoA.
La segunda etapa est constituida por unas reacciones de hidrata-
cin catalizadas por la enzima aconitato hidratasa.
CH2 COOH CH2 COOH
2 COH COOH CH COOH
CH2 COOH CHOH COOH
Isocitrato
Citrato CH2 COOH
H O
H 2
+
2O
C COOH + O
H H2
2O
CH COOH
cis-Aconitato
Se forma una mezcla en equilibrio de cido ctrico, cis-acontico e iso-
ctrico. Se conocen varias aconitasas. Se requiere Fe2+.
El tercer sistema es el de la isocitrato deshidrogenasa (ICDHasa):
CH2 COOH CH2 COOH CH2 COOH
3 CH COOH CH COOH CH2
2H CO2
CHOH COOH CO COOH CO COOH
Isocitrato Oxalsuccinato
-Cetoglutarato
-Cetoglutarato

No se ha demostrado la existencia de una oxalsuccnico descarboxi-


lasa por lo que el mismo enzima debe catalizar las dos reacciones.
Se conocen varias ICDHasas. El ATP y el GTP pueden inhibir este
sistema. Algunos microorganismos poseen una ICDHasa dependiente
de NADP+; en otros es dependiente de NAD+, pudindose hallar
ambos tipos en la misma bacteria. Se requiere la presencia de Mg2+ o
Mn2+. Esta reaccin constituye un punto clave del CAT, puesto que
por el isocitrato hay un bypass al ciclo del cido glioxlico y por el -
cetoglutarato a una reaccin de drenaje. En esta reaccin se libera el
primer CO2 de los dos que dar la mineralizacin del acetato activo.
La cuarta reaccin est constituida por el sistema de la -cetogluta-
rato deshidrogenasa:
HS CoA
CH2 COOH CH2 COOH CH2 COOH
4 CH2 CO2
CH2 + H2O
CH2 COOH
CO COOH 2H CO S CoA Succinato

-Cetoglutarato
-Cetoglutarato
a
Succinil-CoA
b +
HS CoA

166 El sistema de la -cetoglutarato deshidrogenasa comprende un com-


Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL plejo de enzimas que llevan a cabo una descarboxilacin oxidativa
CATABOLISMO del -cetoglutarato semejante a la del piruvato.
Captulo 12: DIXIDO DE CARBONO En esta reaccin se produce la segunda molcula de CO2. Partici-
pan el NAD+, Mg2+, el cido lipoico y el TPP en a y el ADP y Pi en b .
Se origina ATP. El FAD interviene para la regeneracin del lipoico:

R + FAD R + FADH2
SH SH S S
Dihidrolipoildeshidrogenasa

El sistema de la -cetoglutarato deshidrogenasa juega un impor-


tante papel regulador en las bacterias anaerobias facultativas. Es
extraordinariamente sensible a la deciencia de oxgeno y est sujeto
a represin por la glucosa. En condiciones anaerobias, el CAT deja de
existir como va metablica cclica y la formacin de -cetoglutarato
tiene un sentido puramente biosinttico; el succinato para las necesi-
dades biosintticas se forma a partir del oxalacetato por lo que se
denomina un brazo reductor del CAT.
La quinta etapa es la deshidrogenacin del succinato, catalizada
por la succinato deshidrogenasa.

CH2 COOH 2H CH COOH


5
CH2 COOH +2H CH COOH
Succinato Fumarato

La succinato deshidrogenasa toma los dos e y queda en estado redu-


cido. Su reoxidacin requiere FAD. Tambin se requiere Fe2+. Es el
nico enzima del CAT que se encuentra en la fraccin particulada. La
succinato deshidrogenasa es inhibida por el oxalacetato.
La sexta reaccin es la formacin de malato por la fumarato hidra-
tasa:

CH COOH + H2 O CH2 COOH


6 H2O
CH COOH CHOH COOH
Fumarato Malato

La reaccin nal del CAT es la deshidrogenacin del malato a oxa-


lacetato, catalizada por la malato deshidrogenasa que requiere NAD+:

CH2 COOH CH2 COOH


7
CHOH COOH 2H CO COOH
Malato Oxalacetato

En E. coli, la malato deshidrogenasa dependiente de NAD+ es solu-


ble, pero en Azotobacter agilis y Micrococcus luteus hay, adems, un sis-
tema particulado. La primera puede estar ausente en Serratia

marcescens, Pseudomonas uorescens y P. ovalis, que tienen el sistema 167


particulado ligado directamente al O2. Este sistema tambin puede 12.5 ESTEQUIOMETRA DEL CICLO
hallarse en Lactobacillus.
En E. coli se encuentra una malato deshidrogenasa dependiente de
NAD+ constitutiva y, adems, otra dependiente de NADP+ inducible.
Esta ltima cataliza la reaccin:

NADP+ NADPH + H+
CH3
CH2 COOH C O
CHOH COOH CO2 COOH
Malato Piruvato

Malato deshidrogenasa (descarboxilante (NADP+))

Este enzima es inhibido por el oxalacetato y el acetil-CoA. Tam-


bin es inhibido por el AMP cclico. Al parecer tiene una funcin bio-
sinttica en relacin con la formacin de cidos grasos. En Micrococcus
sp. es la nica deshidrogenasa del malato presente y juega un impor-
tante papel en la carboxilacin del cido pirvico a malato.
En Chromatium no hay ninguno de los dos sistemas antes seala-
dos de deshidrogenacin del mlico. Sin embargo, el malato se con-
vierte en oxalacetato por una descarboxilacin a piruvato seguida de
una recarboxilacin del piruvato a oxalacetato.

12.5 ESTEQUIOMETRA DEL CICLO

La reaccin neta del ciclo del cido ctrico es:

Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + ADP + Pi + 2 H2O


2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + ATP + 3 H+ + CoA

Comprende dos descarboxilaciones sucesivas en los sistemas de la iso-


citrato deshidrogenasa (3) y -cetoglutarato deshidrogenasa (4) (g.
12.2).
Comprende cuatro deshidrogenaciones. Las de los sistemas 3 y 7
son del tipo:

2H
CHOH CO

La de la cuarta reaccin es una descarboxilacin oxidativa con


coenzima A:

R CO COOH HS CoA

CO2 + 2 H+ + R CO S CoA
168 C2
C6
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL 2
CATABOLISMO 1 Citrato
Captulo 12: DIXIDO DE CARBONO C4 C6
Oxalacetato Isocitrato
NAD (P)+
7 NADH + H+
CO2
3
NAD+ NAD (P) H + H+
C4 C5
Malato
-Cetoglutarato
-Cetoglutarato
NAD+ CO2
6 NADH + H+

FADH2
ADP
4

FAD
C4 C4
ATP
Fumarato Succinato
5
Figura 12.2 Reacciones de descarboxilacin y de oxidorreduccin del
CAT. Los nmeros encerrados dentro de un crculo hacen referencia a los
sistemas enzimticos que se explican en el texto.

En la reaccin quinta:

CH2 2H CH
CH2 CH

La reaccin cuatro es anloga a la descarboxilacin del piruvato y


la 6 y 7 anlogas, respectivamente, a la de la crotonasa y -hidroxi-
acil-CoA deshidrogenasa de la -oxidacin de los cidos grasos.
El CAT tiene un sentido anblico. Como sistema suministrador
de energa est unido al O2 a travs de las cadenas respiratorias:

Acetil-CoA + 2 O2 2 CO2 + 2 H2O + CoA SH

12.6 REACCIONES ANAPLERTICAS

En la oxidacin del piruvato se libera una molcula de CO2 y por lo


tanto slo dos tomos de C ingresarn en el CAT. El drenaje de -ceto-
glutarato, succinato y oxalacetato con nes biosintticos produce una
disipacin importante de intermediarios que puede agotar el ciclo.
Hay dos sistemas para impedir que esto ocurra:
a) Las reacciones anaplerticas, que generan compuestos C4 por
jacin de CO2. Estas reacciones tienen lugar principalmente
cuando se utilizan azcares como sustratos (ver Lmina 6).
b) El relleno de compuestos C4 a partir del metabolismo de com-
puestos C2 por la va del glioxilato (ver Lmina 6).
En bacterias se han caracterizado cinco enzimas para las reacciones 169
anaplerticas: 12.6 REACCIONES ANAPLERTICAS
1. La llamada reaccin de Wood-Werkman, en la cual el cido
pirvico es fosforilado a fosfoenol pirvico con ATP y la piru-
vato fosfotransferasa. La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa
(ATP) forma oxalacetato, requirindose ADP para formar ATP.

ADP ATP
ATP ADP

CH3 CO COOH CH2 C COOH COOH CH2 CO COOH


Piruvato O CO2 Oxalacetato

P
Fosfoenol
piruvato

El cido fosfoenolpirvico es el verdadero aceptor de CO2 y el


ADP o el IDP funcionan como aceptores de fosfato.
2. Hay una reaccin muy parecida a la anterior catalizada por una
fosfoenol piruvato carboxilasa que requiere bicarbonato y fos-
fato inorgnico, el cual es convertido en pirofosfato:

CO2

PEP Oxalacetato
Pi PPi

3. Una piruvato carboxilasa dependiente de la biotina que pro-


duce oxalacetato desde el piruvato con ATP:

ATP ADP + Pi

CH3 CO COOH COOH CH2 CO COOH


CO2 H2O

Hay un enzima diferente en los mamferos que lleva a cabo esta


reaccin con acetil-CoA y no es dependiente de la biotina.
4. La reaccin de los enzimas mlicos (malato deshidrogenasa des-
carboxilante (NADP+/NAD+) que catalizan la carboxilacin
reductora del piruvato a malato, utilizando bien NADPH + H+ o
bien NADH + H+:

COOH
NAD(P)H + H+ NAD(P)+
CH3 CH2
CO CHOH
COOH CO2 COOH
Piruvato Malato
170 No hay duda de que no todos estos enzimas se hallan presentes
Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL a la vez en el mismo microorganismo.
CATABOLISMO
Captulo 12: DIXIDO DE CARBONO
12.7 CICLO DEL CIDO GLIOXLICO

Es la fuente ms importante de oxalacetato cuando la bacteria se ali-


menta exclusivamente de fracciones de dos tomos de carbono. Esta
va implica dos enzimas: la isocitrato liasa y la malato sintasa.
Comprende una condensacin de acetil-CoA con cido glioxlico
que da cido mlico con intervencin del enzima malato sintasa. El
malato es subsiguientemente oxidado a oxalacetato.
La isocitrato liasa cataliza el desdoblamiento del isocitrato en suc-
cinato y glioxilato:

CH2 COOH
CH2 COOH
CH COOH + CHO COOH
Isocitrato CH2 COOH
CHOH COOH liasa Glioxilato
Succinato
Isocitrato

El glioxilato condensa entonces con acetil-CoA para formar


malato:

H2O

CHO COOH + CH3 CO S CoA COOH CH2 CHOH COOH


Malato
sintasa Malato

El malato es subsiguientemente oxidado a oxalacetato (g. 12.3).


La combinacin de estas dos reacciones constituye un bypass de las
reacciones de descarboxilacin del CAT y un proceso cclico a travs
del cual se metabolizan dos grupos acetilo a oxalacetato:

2 Acetato + 12 O2 Oxalacetato + 2 H2O

El ciclo del glioxilato regula el drenaje del CAT y adicionalmente


proporciona una fuente de cido pirvico para la gluconeognesis
como consecuencia de la oxidacin de cidos C4 (ver Lmina 6).
Los enzimas del ciclo se sintetizan durante el crecimiento sobre
acetato o sus precursores metablicos inmediatos. La mineralizacin
tiene lugar cuando el isocitrato sigue el ciclo del CAT y no es el sus-
trato de la isocitrato liasa.
El funcionamiento del ciclo del cido glioxlico se halla sujeto a un
control muy estricto, tanto a nivel de actividad como a nivel de snte-
sis de sus enzimas. Los trabajos ya clsicos de Kornberg han demos-
trado que el control no de la actividad se localiza en la isocitrato
liasa, siendo sta inhibida totalmente por bajos niveles de PEP. La sn-
tesis de este enzima se reprime a nivel de transcripcin pudiendo ser
el correpresor el PEP, el piruvato o uno de sus derivados metablicos.
171
BIOSNTESIS
Acetil-CoA (C2) BIBLIOGRAFA

Oxalacetato (C4)
Oxolacetato (C4)
Citrato (C6)
2  Malato (C4)

Acetil-CoA (C2) Fumarato (C4)


Isocitrato (C6)
Glioxilato (C2)
Succinato (C4)

Succinil-CoA (C4)

Figura 12.3 Ciclo del cido glioxlico. Obsrvese cmo se generan mol-
culas C4 a partir de acetil-CoA (ver en el texto los detalles de las reacciones).
La condensacin de oxalacetato con acetil-CoA sigue algunas reacciones
del ciclo de Krebs. La isocitrato liasa desdobla el isocitrato, produciendo
succinil-CoA, que se transforma en oxalacetato siguiendo las reacciones del
CAT. Por su parte, el glioxilato condensa con una segunda molcula de ace-
til-CoA, generando malato. El resultado del proceso es la transformacin
neta de dos molculas de acetil-CoA en una de oxalacetato, que queda dis-
ponible para nalidades biosintticas. En trazo continuo se representan las
reacciones del CAT, y en trazo discontinuo las del ciclo del glioxilato.

BIBLIOGRAFA

KORNBERG, H. L. The role and control of the glioxylate cycle in Escherichia


coli. Biochemical Journal. 99, 111, 1966.
LOWENSTEIN, J. M. Citric acid cycle. Marcel Dekker, Inc. New York, 1969.
PARTE D
OXIDANTES INORGNICOS
13 OXGENO MOLECULAR

13.1 RESPIRACIN AEROBIA 176


13.2 ASIMILACIN DE O2 177
13.3 OXIDASAS Y PEROXIDASAS 178
13.4 SUPERXIDO DISMUTASA Y CITOCROMO c
PEROXIDASA 179
13.5 LAS FLAVOPROTENAS AUTOOXIDABLES 179
13.6 BALANCE ENERGTICO DE LAS REACCIONES
OXIDATIVAS 180
13.7 LA CADENA RESPIRATORIA 181
13.8 FOSFORILACIN OXIDATIVA 188
BIBLIOGRAFA 189
176 13.1 RESPIRACIN AEROBIA
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS
Captulo 13: OXGENO MOLECULAR El concepto de respiracin aerobia se deriva del clsico proceso respi-
ratorio de Lavoisier, segn el cual los organismos vivos consumen
oxgeno de un modo anlogo a la combustin de la materia orgnica.
De hecho, muchos microorganismos llevan a cabo dicho proceso en
el cual el oxgeno molecular se convierte en agua en tanto que algn
sustrato orgnico desaparece del medio y todo su carbono se recupera
como CO2. El desarrollo de muchos microorganismos en cultivo puro
en un medio con glucosa se realiza de acuerdo con la estequiometra:

C6 H12 O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O

Todo el hidrgeno de la glucosa ha pasado al oxgeno para formar


agua. Sin embargo, ya ha sido referido que las bacterias del cido ac-
tico pueden reducir el O2 a H2O sin formar CO2 (captulo 5). En
muchos hongos microscpicos se lleva a cabo una degradacin par-
cial de la glucosa anloga a la oxidacin del etanol, con la acumula-
cin de productos orgnicos caractersticos que estn parcialmente
oxidados y son diferentes del acetato. Algunos ejemplos ilustrativos
pueden ser los siguientes:

C6 H12 O6 + 5 O2 2 HOOC COOH + 2 CO2 + 4 H2O


cido oxlico

C6 H12 O6 + 1,5 O2 HOOC CH2 C COOH + CO2 + 3 H2O


CH2
cido itacnico

C6 H12 O6 + 1,5 O2 HOOC CH2 COH CH2 COOH + 2 H2O


COOH
cido ctrico

C6 H12 O6 + O2 CH2OH CO CHOH CHOH CHOH COOH + H2O


cido 5-cetoglucnico

C6 H12 O6 + O2 CH2OH CHOH CHOH CHOH CHOH COOH


cido glucnico

C6 H12 O6 + 0,5 O2 CH2OH C CH CO COH CH + 3 H2O


O
cido kjico

Por lo tanto, es consistente considerar que la reduccin del ox-


geno en la respiracin puede llevar tanto a la mineralizacin como a
la degradacin parcial de los sustratos orgnicos.
El oxgeno tambin puede reducirse biolgicamente con reducto- 177
res inorgnicos como H2, compuestos reducidos de nitrgeno o con O2
13.2 ASIMILACIN DE O2
compuestos reducidos de azufre o hierro. Esto tiene lugar en el desa-
rrollo de bacterias que pueden crecer en medios minerales utilizando
CO2 como nica fuente de carbono (captulos 20, 21 y 22).
De hecho, el mismo proceso respiratorio puede considerarse inde-
pendiente del O2, porque existen microorganismos que pueden utilizar
en su lugar NO3, SO42 o CO2. De ah que se distinga una respiracin
aerobia de otra anaerobia.
En todo caso, la respiracin est ligada a un proceso generador de
energa para el crecimiento. No obstante, la reduccin biolgica del
O2 no siempre va unida a la produccin de ATP.
La fosforilacin que se lleva a cabo con la reduccin de oxgeno y
el sistema de transposicin de protones y la reaccin ATPsica es una
caracterstica obligada de algunas bacterias estrictamente aerobias
como Azotobacter, Caulobacter y muchas Pseudomonas. Sin embargo,
ya hemos visto que este mismo sistema puede funcionar anaerobia-
mente en la reduccin del CO2 a cido actico o a metano, y tambin
tiene lugar en la reduccin de NO3 y de SO42.

13.2 ASIMILACIN DE O2

La asimilacin directa del oxgeno molecular se lleva a cabo a travs


de las oxigenasas. Hay dos tipos de oxigenasas:

1. A + O2 AO2 (dioxigenasas)
2. AH + 2 H+ + O2 AOH + H2O (monooxigenasas)

Un ejemplo caracterstico del primer tipo lo constituye la oxida-


cin del catecol a cido cis,cis-mucnico por la pirocatecasa:

OH
COOH
+ O2
COOH
OH
Catecol cis,cis-Muconato

Un ejemplo de monooxigenasa es el de la fenol 2-monooxigenasa


que convierte el fenol en catecol:

OH OH
OH
+ NADPH + H+ + O2 + NADP+ + H2O

Fenol Catecol
178 Las monooxigenasas se llaman tambin oxidasas de funcin mixta,
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS porque slo la mitad de la molcula de oxgeno se incorpora a un com-
Captulo 13: OXGENO MOLECULAR puesto orgnico mientras la otra mitad forma agua. En cambio, la reac-
cin oxidsica.
1
O AH2
2 2

H2O A

supone la reduccin completa del O2 a H2O.


Las oxigenasas son muy importantes para la utilizacin de deter-
minados sustratos orgnicos, especialmente compuestos aromticos,
as como en algunas vas biosintticas, pero no juegan ningn papel
en el sistema productor de energa.

13.3 OXIDASAS Y PEROXIDASAS

La citocromo oxidasa cataliza la reaccin irreversible:

O2 + 4 H+ + 4 e 2 H2O

Sin embargo, algunas citocromo oxidasas transeren slo un par


de tomos de hidrgeno al oxgeno molecular, formando perxido de
hidrgeno:

O 2 + 2 H+ + 2 e H2O2

El H2O2 es muy txico para las bacterias si no se destruye rpida-


mente. Esto puede llevarse a cabo por la catalasa:

2 H2O2 2 H2O + O2

La catalasa es un enzima hemnico que se encuentra en la mayora


de los microorganismos aerobios. Ya se ha descrito (captulo 6) que en
las bacterias del cido lctico no hay enzimas hemnicos, pero algunos
miembros del grupo tienen pseudocatalasas, enzimas no hemnicos
que catalizan la misma reaccin. La prueba de la catalasa es inespecca
y se basa en el desprendimiento de oxgeno gaseoso. La prueba de la
bencidina es especca del grupo hemo y puede ser utilizada comple-
mentariamente para diferenciar los falsos catalasa positivos.
El perxido de hidrgeno puede ser igualmente destruido por las
peroxidasas, enzimas que catalizan la reaccin:

H2O2 + H2A A + 2 H2O

En este caso no se desprende oxgeno gaseoso. En realidad, la


catalasa es un tipo particular de peroxidasa en la que el H2O2 puede
actuar de oxidante y de reductor. En otras peroxidasas el reductor 179
suele ser NADH + H+, NADPH + H+, glutatin o citocromo c. 13.4 SUPERXIDO DISMUTASA Y
Adems del propio perxido de hidrgeno, la catalasa puede reali- CITOCROMO c PEROXIDASA
zar una reaccin peroxidsica con otros dadores de hidrgeno, como
el etanol, el metanol, el formaldehdo, el formiato y el nitrito. La
reaccin catalsica o peroxidsica tiene una primera etapa en comn
en la que se forma un complejo enzima-H2O2. En un exceso de H2O2
tiene lugar la primera reaccin con formacin de O2. Para concentra-
ciones dbiles de H2O2 se lleva a cabo la reaccin peroxidsica con la
participacin de un tipo u otro de reductores.

13.4 SUPERXIDO DISMUTASA Y CITOCROMO c PEROXIDASA

La molcula de oxgeno no es txica por s misma, pero puede dar


lugar a productos parcialmente reducidos altamente reactivos y txi-
cos. La reduccin con un solo electrn da lugar a la formacin del
radical superxido O2, y la reduccin con dos electrones al perxido
de hidrgeno. Con la citocromo-oxidasa se toman cuatro electrones
formndose directamente agua, sin pasar por intermediarios menos
reducidos.
Los iones superxido son transformados en H2O2 por el enzima
superxido dismutasa, descubierto por McLeod y Friedovich en 1969.

O2 + O2 + 2 H+ H 2O 2 + O 2

Lenhoff y Kaplan descubrieron una citocromo c peroxidasa en


Pseudomonas uorescens que cataliza la reoxidacin del citocromo c
con agua oxigenada. En esta bacteria no hay citocromo a ni cito-
cromo oxidasa, por lo que el verdadero aceptor nal de electrones de
la cadena respiratoria es el agua oxigenada:

2 AH2 2 NAD+ 2 cit. c red H2O2

2A 2 NADH + H+ 2 cit. c ox 2 H 2O

13.5 LAS FLAVOPROTENAS AUTOOXIDABLES

En el grupo uorescens de las especies del gnero Pseudomonas puede


requerirse un suministro de H2O2 para el normal funcionamiento de
la cadena respiratoria. Esto se consigue normalmente con la interven-
cin de avoprotenas autooxidables:

NADH + H+ FAD H2O2

NAD+ FADH2 O2

En estos casos el carcter aerobio del organismo puede estar ligado


al sistema productor de H2O2, necesario para el funcionamiento de la
cadena respiratoria y la generacin de ATP para el crecimiento.

180 Adems del FAD y FMN existen otras avoprotenas que reducen
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS parcialmente el oxgeno molecular:
Captulo 13: OXGENO MOLECULAR
FP + XH2 X + FPH2
FPH2 FP + 2 H+ + 2 e
2 H+ + 2 e + O2 H2O2

XH2 + O2 X + H2 O 2

Entre las avoprotenas ms conocidas susceptibles de actuar


como generadores de H2O2 guran la aldehdo oxidasa, la glucosa
oxidasa, las L- y D-aminocido oxidasas, la xantina oxidasa y la dihi-
droorotato oxidasa:

R CHO + H2 + 1 12 O2 R COOH + H2O2


Glucosa + O2 D-Glucono-lactona + H2O2
Aminocido + H2O + O2 2-Cetocido + NH3 + H2O2
Xantina + H2O + O2 Urato + H2O2
Dihidrooroato + O2 Oroato + H2O2

Es muy probable que el perxido de hidrgeno no se forme directa-


mente en estas reacciones sino que sea el radical superxido, el cual
subsiguientemente forme H2O2 por efecto de la superxido dismutasa.

13.6 BALANCE ENERGTICO DE LAS REACCIONES OXIDATIVAS

Cuando se sacan un par de protones y un par de electrones de un sus-


trato orgnico se libera energa libre cuyo valor G0 es aproximada-
mente equivalente a la energa de la combustin de una molcula de
hidrgeno gaseoso.
La tendencia de una sustancia a dar o aceptar e puede ser descrita
cuantitativamente por su potencial de xido-reduccin, el cual consiste
en el voltaje necesario para sacar un electrn de dicho compuesto en la
forma reducida. Este potencial de xido-reduccin se expresa con rela-
cin a un potencial tipo que es el del electrodo de hidrgeno:

1 H2 H+ + e
2

al cual se asigna un valor de 0,00 voltios (V). El valor de V depende de


la concentracin, del pH y de la temperatura. A pH = 7,25C y con-
centracin 1,0 molar, el potencial tipo es 0,42 V. El smbolo E0
designa el potencial de xido-reduccin en voltios medido en estas
condiciones y se designa como potencial OR especco.
Si tenemos los valores de E0 de la reaccin que libera electrones y el
de la que los acepta, el cambio de energa libre resultante del acopla-
miento de ambas reacciones puede ser calculado por la frmula G0 =
nFE0, donde G0 es el cambio de energa libre, n es el nmero de elec- 181
trones transferidos, F es la constante de Faraday (23 000 cal/voltios) y 13.7 LA CADENA RESPIRATORIA
E0 es la diferencia algebraica entre los potenciales de xido-reduccin
de las dos reacciones. As:

H2 2 H+ + 2 e (E0 = 0,42 V)
1
O2 O2 2 e (E0 = + 0,82 V)
2

Entonces, en la combustin del H2 tendremos un cambio de ener-


ga libre:
G0 = 2 23 000 (0,82 (0,42)) = 57 040 cal

En la oxidacin del malato a oxalacetato E0 = 0,17 V y el paso


concomitante de citocromo c oxidado a reducido supone un valor de
E0 = 0,22 V. Por lo tanto,
G0 = 2 23 000 (0,22 ( 0,17)) = 18 007 cal
Tericamente, si sustituimos la reduccin del citocromo c por la del
O2, siendo en este ltimo caso E0 = 0,82 V, obtendremos G0 = 45
715 cal. Como con otros sustratos, cuando la oxidacin del malato va
unida a la reduccin del oxgeno a H2O, esta energa es utilizable en
condiciones siolgicas para el desarrollo de la clula microbiana.

13.7 LA CADENA RESPIRATORIA

Cuando se reduce el oxgeno molecular a H2O en una nica etapa, la


cantidad de energa que se produce es tan grande que resultara difcil
regularla para su aprovechamiento para el desarrollo. La estrategia
celular para conseguirlo pasa normalmente por el fraccionamiento en
una serie de etapas de liberacin de energa a travs de reacciones bio-
qumicas sucesivas de transporte de H+ y de e, desde el sustrato
reductor hasta el oxgeno. Estas reacciones constituyen la denomi-
nada cadena respiratoria. El orden de los sucesivos portadores de elec-
trones est determinado por su concentracin y el potencial de xido-
reduccin especco E0. De este modo cada compuesto es capaz de
ser reducido por el anterior y oxidado por el siguiente.
El sistema general de transporte de electrones que utiliza el O2
como aceptor nal comprende el NAD+ ( E0 = 0,32 V), el FAD ( E0 =
0,26), una quinona ( E0 = 0,26), los citocromos b, c y a y la cito-
cromo oxidasa ( E0 = 0,81). No obstante, en tanto que en el sistema
mitocondrial la cadena de transporte de electrones es muy uniforme
en todos los eucariotas, en las bacterias presenta una gran diversidad.
En ambos casos se halla asociado a membranas, en los microorganis-
mos eucariotas asociado a las mitocondrias o a los cloroplastos, y en
los procariotas a la propia membrana protoplasmtica o a invagina-
ciones de la misma. Esto hace que muchos de los componentes de la
cadena respiratoria sean insolubles en agua y difciles de separar man-
teniendo su estado funcional.
Centro
reactivo
O
C NH2
+
O N
O P O CH2 O

H H
H H H
H H
HO OH CONH2 CONH 2
O NH2 + 2 H+ + 2 e + H+
+ ..
C N N
N
N C R R
CH NAD+ NADH + H+
HC C
N N
O P O CH2 O (b)
O H H
H H
HO OR
(a)
Figura 13.1 (a) Nicotinamida adenindinucletido. En el NAD+, R = H; en el NADP+, R = PO32. (b) Forma oxidada
y reducida del centro reactivo.

El primer componente de la cadena respiratoria suele ser el nicoti-


namida adenindinucletido (NAD+) (g. 13.1). El avina adenindinu-
cletico (FAD) es el grupo prosttico de muchas avoprotenas. Es un
pigmento amarillo derivado de la riboavina (g. 13.2). El NADH +
H+ y el NADPH + H+ pueden ser reoxidados por el enzima avnico,
pero ste generalmente no puede ser reoxidado con NAD+ o NADP+.
Adems de su reoxidacin siguiendo la cadena respiratoria, el FAD
pueden ceder directamente el hidrgeno al oxgeno molecular for-
mando perxido de hidrgeno.
Otro de los componentes ms caractersticos de la cadena respira-
toria est constituido por las quinonas. En el sistema mitocondrial
tenemos la ubiquinona:

O
CH3O CH3

CH3
CH3O (CH2 CH C CH2)n H
O
El nmero de unidades isoprenoides vara entre los distintos organis-
mos de 6 a 10. La forma oxidada y reducida es:
182
H O H O
C N C C N C
H 3C C C C N H H3C C C C N H
H3C C C C C O H3C C C C C O
C N N C N N
H H C H H R
H C OH Forma oxidada
H C OH NH2 (FAD)

H C OH C N
N C H H O
H C H CH
HC C C N C
O O N N H3C C C C N H
O P O P OCH2 O H3C C C C C O
C N N
O O H H
H R H
H H
OH Forma reducida
HO
(FADH2)
(a) (b)
Figura 13.2 (a) Flavina adenindinucletido (FAD). (b) Formas oxidada y reducida.

O OH
CH3O CH3 CH3O CH3
+2H

2H
CH3O R CH3O R
O OH

Existe una gran diversidad de quinonas en los sistemas de trans-


porte de electrones de las bacterias. Generalmente son portadores
intermediarios entre las avoprotenas y los citocromos.
Los citocromos son protenas hemnicas. El grupo prosttico es un
tetrapirrol con un tomo de Fe quelado. La transferencia de electro-
nes por los citocromos comprende la oxidacin reversible del tomo
de hierro:

Fe2+ Fe3+ + e

La estructura del grupo hemo es la siguiente:


183
184
CH2
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS
CH3 CH
Captulo 13: OXGENO MOLECULAR

N
CH3 CH3
N Fe2+ N
HOOC CH2 CH2 N CH CH2

CH2 CH3
CH2
COOH

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2


0,1

250 300 350 400 450 500 550 600 nm

Figura 13.3 Espectros del citocromo c551 de Pseudomonas aeruginosa.


Trazo continuo, forma oxidada. Trazo discontinuo, forma reducida.
185
TABLA 13.1 Longitud de onda (nm) de las bandas de Soret de diversos
citocromos. 13.7 LA CADENA RESPIRATORIA

Banda 

Citocromos de cit. a cit. b cit. c Banda Banda


Mitocondrias
Levadura 605 563 552 525 426
Msculo cardaco 605 563 552 525 426
Bacterias
Bacillus subtilis 604 564 552 523 422
Micrococcus luteus 605 562 552 523 422
Micrococcus lysodeikticus* 600 562 552 523 430
Pseudomonas acidovorans 600 - 552 520 432
Pseudomonas aeruginosa - 560 552 520 428
Pseudomonas putida - 560 552 530 427
Gluconobacter suboxidans - - 554 523 428
Acetobacter pasteurianum 588 - 554 523 428
Enterobacter aerogenes 628-592 560 - 530 430
Escherichia coli 630-593 560 - 533 433
Proteus vulgaris 630-595 560 - 533 430
Pseudomonas maltophilia 622-597 558 - 530 430

* Formalmente incluido en M. entens.

Los citocromos se reconocen por su espectro de absorcin (g. 13.3).


Hay cuatro tipos distintos: a, b, c y d (a3). En su forma reducida, se carac-
terizan por la banda de absorcin que es la de mayor longitud de onda.
Los tres picos , y se conocen con el nombre de bandas de Soret.
En la tabla 13.1 se indican las longitudes de onda de las bandas de
absorcin de los citocromos obtenidos de las mitocondrias y de dis-
tintas bacterias. Los del gnero Bacillus se corresponden con los de las
eucariotas, en los dems casos se presentan diferencias importantes.
Adems de las diferencias correspondientes a la longitud de onda para
los picos del espectro de un mismo citocromo, puede asegurarse que
en las enterobacterias falta el citocromo c terminal. Esto corresponde
al resultado del test de la oxidasa. El diclorofenol indofenol o el N,N-
dimetil parafenilendiamina son incoloros en estado reducido. Se
colorean cuando se oxidan por especies oxidasa positivas que son las
que contienen citocromo c.
Hay algunas cadenas respiratorias bastante bien conocidas, entre
las cuales se describen los siguientes ejemplos:
1. Mycobacterium phlei
Uno de los sistemas de transporte de electrones mejor estudiados es
el de Mycobacterium phlei. El mismo puede representarse como
sigue:
186 Malato
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS
Captulo 13: OXGENO MOLECULAR
Malato-vit K1-reductasa

Dicumarol (o luz de 360 nm)


CN
AH2 NAD+ FP K9H

S2
Atebrina NOQNO CO

cit. b cit. c1 cit. c cit. a + cit. a3
CN

Succinato FP Me x y O2

Atebrina

x representa un componente fotolbil a 360 nm.


y un componente no hemnico con hierro.
indica inhibicin por el correspondiente compuesto o por efecto de la radiac

La oxidacin del malato es catalizada por dos sistemas enzimti-


cos distintos, uno en la fraccin soluble y otro en la particulada. En
la primera se ha identicado una malato-vitamina K1 reductasa que
es activada por FAD y que cataliza la reduccin de la vitamina K9H
de una fraccin particulada.
La irradiacin a 360 nm inhibe la oxidacin del malato y del suc-
cinato, pero slo la primera es reversible con adicin de vit K1. La
oxidacin del succinato comprende un compuesto metlico que se
inhibe con cianuro. En el esquema se incluyen los enzimas avni-
cos (FP) inhibidos por la atebrina y el punto de accin de otros inhi-
bidores. La NOQNO es la N-xido-2-n-nonilhidroxiquinolena.
2.Bacillus
El sistema de transporte de electrones en el gnero Bacillus sera:

Succinato FP
cit. b560 cit. c554

NADH + H+ FP Vit K2
cit. c556
O2
cit. a601

O2

Como en el caso anterior la oxidacin del succinato no incluye


vit K. La menaquinona (K2) ocupa el lugar de la naftoquinona (K9).
3.Enterobactericeas (ver captulo 9) 187
No tienen citocromo c terminal. En condiciones aerobias utilizan 13.7 LA CADENA RESPIRATORIA
preferentemente ubiquinonas y en anaerobias menaquinonas. Con
nitrato utilizan ubiquinona-8, cit. b y nitrato reductasa. A continua-
cin se representan las cadenas respiratorias con nitrato y oxgeno
como aceptores terminales de electrones respectivamente (ver tam-
bin captulo 14).

CITOPLASMA
NO3 reductasa
NADH + H+ Formiato --Glicerofosfato
LL--Glicerofosfato D-Lactato 2 H+

FP Fe/S
cit. b
FP Mo/Se Fe/S Fe/S o Mo
Fe/S Q [MK]
NO3
Membrana cit. b556

2 H+ 2 H+
NO3 NO2 + H2O
NO3

CITOPLASMA

NADH + H+ --Glicerofosfato
L--Glicerofosfato
D-Lactato 1
2
O2 + 2 H+ H2O
Succinato

FP Fe/S cit. o cit. d

FP Fe/S Q8 cit. b566 cit. b558


Membrana

2 H+ 2 H+
O2

4.Azotobacter
Contiene ubiquinona-8 y citocromos a1, a2 y citocromo oxidasa. En el
bypass sobre UQ-8, tambin citocromo c4, citocromo c5 y citocromo a1.
El sistema de transporte de electrones en Azotobacter es:

cit-oxi
cit. c4 cit. c5 cit. a1 O2
NADH + H+ FP UQ-8 cit-oxi
cit. b cit. a2 O2
188 Los estudios de inhibicin con KCN que afecta principalmente
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS al cit. a1, han revelado la existencia de la rama lateral.
Captulo 13: OXGENO MOLECULAR
5.Bacterias hallas
En el esquema siguiente se representa el sistema de transporte de
electrones en Halobacterium:

Complejo cit. c549


NADH + H+ FP Q-8 cit. b cit. a
563 cit. d
Succinato FP
559 cit. a1
-Glicerofosfato-FP 555 cit-oxi
Ascorbato

O2

13.8 FOSFORILACIN OXIDATIVA

La generacin de ATP puede tener lugar bien por fosforilacin a nivel


de sustrato, a travs de un nmero relativamente reducido de reaccio-
nes que ya han sido descritas en los captulos referentes a la forma-
cin de productos nales del catabolismo, o bien por fosforilacin
oxidativa. Este ltimo sistema es realmente el de tipo ms generali-
zado y es tambin el que est ligado a la cadena respiratoria. El trans-
porte de dos protones y dos electrones desde el NAD hasta el O2 va
unido a la formacin de tres molculas de ATP a partir de ADP, corres-
pondiendo a la reduccin de 1--- O2 a H2O. Tericamente, en la respira-
2
cin aerobia la relacin P/O es de 3, aparte de la posible generacin
concomitante de ATP por fosforilacin a nivel de sustrato.
La fosforilacin oxidativa slo ocurre cuando el transporte de elec-
trones tiene lugar en una estructura inalterada de membrana. La oxida-
cin de portadores de electrones va acompaada de la transposicin de
protones hacia el exterior con la creacin de un gradiente de concen-
tracin que determina la nueva entrada de protones a travs de puntos
especcos, con la protena ATPasa dando lugar a la reaccin:

ADP + Pi + H+ ATP + H2O

La teora quimiosmtica puede considerarse ampliamente com-


probada en la respiracin aerobia y en sistemas anaerobios ligados a
citocromos o sin ellos. La actividad ATPsica est circunscrita a pun-
tos especcos de la membrana y, como consecuencia de la actividad
metablica, resulta efectivamente un gradiente de pH entre fuera y
dentro de la clula.
La relacin entre las concentraciones de ADP y ATP es crtica para
la velocidad de respiracin. De hecho, en el efecto Pasteur el factor
limitante de la penetracin de glucosa es la disponibilidad de ADP.
En bacterias, los valores de la relacin P/O encontrados en prepara- 189
dos libres de clulas enteras es siempre inferior a 3 y, con frecuencia, BIBLIOGRAFA
un poco mayor que 1. Es evidente que en las clulas enteras dichos
valores pueden ser superiores. No obstante, es posible que en las bac-
terias tenga lugar una respiracin aerobia con una relacin P/O infe-
rior a la que se consigue en los microorganismo eucariotas gracias al
sistema mitocondrial.

BIBLIOGRAFA

MANDESTAM, J., McQUILLEN, K. y DAWES, I. (editores). Biochemistry of


Bacterial Growth. 3 ed. New York. John Wiley. 1982.
INGLEDEW, W. J. y POOLE, R. K. The Respiratory Chains of Escherichia coli.
Microbiological Reviews, 48, pp. 222271, 1984.
14 NITRATO

14.1 DESNITRIFICACIN Y RESPIRACIN DEL


NITRATO 192
14.2 BACTERIAS DESNITRIFICANTES 193
14.3 FISIOLOGA Y BIOQUMICA DE LA
DESNITRIFICACIN 194
14.4 LA RESPIRACIN DEL NITRATO EN LAS BACTERIAS
FACULTATIVAS 195
14.4.1 Catabolismo de la glucosa 196
14.4.2 Respiracin del nitrato y fermentacin 197
14.4.3 Ciclo de los cidos tricarboxlicos (CAT) 197
14.4.4 Respiracin anaerobia 198
14.4.5 Mutantes clorato resistentes 198
14.4.6 Metabolismo del nitrito 198
BIBLIOGRAFA 199
192 14.1 DESNITRIFICACIN Y RESPIRACIN DEL NITRATO
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS
Captulo 14: NITRATO La reduccin del nitrato fue descubierta por Gayon y Dupetit en
1886, pero el papel del nitrato en la produccin de energa no
empez a ser comprendido hasta principios del siglo XX.
En las plantas y algunas bacterias hay una reduccin asimiladora del
nitrato, el cual pasa a nitrito que luego se reduce a amonaco, pasando
por hidroxilamina:

NO3 NO2 x NH2OH NH+4


El amonaco es incorporado al material celular. El sistema enzimtico
implicado en el proceso asimilador del nitrato incluye avina, molib-
deno, NAD y NADP reducidos como dadores de hidrgeno y electro-
nes. A pesar de que algunas bacterias utilizan nitrato como fuente de
nitrgeno, en la mayora de los casos el nitrgeno se asimila par-
tiendo de amonaco.
La desnitricacin se reere a una reduccin desasimiladora de los
xidos de nitrgeno inicos (nitrato: NO3 y nitrito: NO2) que llevan a
cabo algunas bacterias aerobias obligadas en ausencia de oxgeno. En
condiciones anaerobias no hay crecimiento en ausencia de NO3 o de
NO2 . Los productos de reduccin son xidos de nitrgeno gaseosos
(xido ntrico: NO y xido nitroso N2O), los cuales pueden ser reduci-
dos a N2. En la mayor parte de las bacterias desnitricantes, el nitr-
geno molecular es el producto nal ms importante (ver Lmina 7):
NO3 NO2 NO N 2O N2
En 1925, Quastel demostr que el nitrato puede sustituir al oxgeno
en algunas bacterias fermentativas, las cuales entonces pueden utilizar
para el crecimiento sustratos no fermentables como el lactato. En estos
casos puede ocurrir otra reduccin desasimiladora del nitrato parecida
a la reduccin asimiladora y que lleva a la excrecin de NH4+. Tambin
puede tener lugar la acumulacin de nitritos. Se ha pensado que se
trata de una respiracin incidental del NO3 que permitira la elimina-
cin de hidrgeno y una mayor disponibilidad de NAD+. Sin embargo,
hay evidencia de un mayor rendimiento energtico. La respiracin del
NO3 por bacterias fermentativas es caracterstica de las enterobacteri-
ceas y tambin de algunos miembros de los gneros Bacillus y Clostri-
dium. En algunos de estos casos se han llegado a detectar pequeas
cantidades de N2O, a partir de NO3 y de hidroxilamina.
Hay dos grandes grupos de bacterias que pueden utilizar el nitrato
como oxidante inorgnico: las aerobias obligadas desnitricantes (en
ausencia de NO3 son aerobias estrictas) y las fermentativas reductoras
de nitratos. Las primeras requieren NH3 para el crecimiento y las
segundas no. Adems, deben considerarse dos casos en los que el
NO3 sustituye al oxgeno permitiendo el desarrollo autotrco por el
ciclo de Calvin. Por un parte se encuentra Paracoccus denitricans que
puede oxidar H2:

5 H2 + 2 NO3 N2 + 4 H2O + 2 OH
193
TABLA 14.1 Factores de enriquecimiento para diferentes bacterias reductoras
de NO3 en un medio mnimo en condiciones anaerobias. 14.2 BACTERIAS DESNITRIFICANTES

Factor de enriquecimiento Bacteria

Con NH3
- Trazas de peptona y etanol o propionato Pseudomonas aeruginosa
- Glucosa Pseudomonas uorescens
- Tartrato, succinato o malato Pseudomonas stutzeri
- cidos orgnicos, etanol y extracto de carne
con alta concentracin de NO3 (5-12%) Bacillus licheniformis
- Trazas de extracto de levadura y atmsfera de
H2 Paracoccus denitricans
Sin NH3
- Lactato y piruvato Enterobacterias

Por otra, Thiobacillus denitricans, que oxida azufre y tiosulfato con


NO3 en sustitucin del O2:

5 S + 6 NO3 + 2 H2O 5 SO42 + 3 N2 + 4 H+


Estos dos casos se incluyen dentro de las bacterias desnitricantes.
Para el aislamiento de bacterias que utilizan el NO3 como oxi-
dante pueden utilizarse medios de enriquecimiento apropiados para
cada uno de los distintos tipos, dada la gran diversidad taxonmica
de las especies que presentan esta propiedad. Suele utilizarse un
medio mnimo con NO3 en condiciones anaerobias (tabla 14.1).

14.2 BACTERIAS DESNITRIFICANTES

En este tipo de bacterias existe una diversidad taxonmica sorpren-


dente, sobre todo despus de los estudios llevados a cabo en los lti-
mos aos. Muchas especies son quimioorganotrofas, pero algunas
utilizan compuestos C1 y otras, como ya ha sido consignado, crecen
autotrcamente con H2 o compuestos reducidos de azufre. Tambin
hay un grupo fotosinttico. La mayora puede reducir NO3 a N2, pero
algunas no tienen NO3 reductasa y son dependientes de NO2 , otras
no tienen N2O reductasa y producen, por tanto, N2O como producto
nal. Finalmente, se han encontrado cepas con N2O reductasa pero
que no pueden producir N2O de NO3.
Existen especies de Achromobacter (algunas de las cuales actual-
mente se incluyen en el gnero Alcaligenes) que oxidan metano con
NO3 y otras que son dependientes del NO2 . Tambin se han descrito
otras que slo poseen N2O reductasa.
Alcaligenes incluye muchas especies desnitricantes. A. eutrophus
oxida H2 con NO3 y crece autotrcamente, como Hydrogenomonas
eutrophus. Existen especies dependientes de NO2 y jadoras de N2
(Azospirillum brasilense).
194 Dentro del gnero Bacillus, aparte de B. licheniformis, hay otras
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS especies desnitricantes, quizs las ms abundantes, y tipos que no
Captulo 14: NITRATO pueden reducir NO2, as como otros que pueden crecer anaerobia-
mente con NO.
Tambin se encuentran desnitricantes en los gneros Chromobac-
terium, Flavobacterium y Corynebacterium. En este ltimo caso con
especies que producen N2O como producto terminal. Algunas espe-
cies de Hyphomicrobium son desnitricantes, comprendiendo los ni-
cos casos conocidos que pueden utilizar el metanol como reductor. Se
ha descrito tambin la desnitricacin en Halobacterium.
En Moraxella el nitrato puede oxidar benzoato, produciendo N2.
Tambin se ha descrito la reduccin de NO3 en especies de Neisseria,
Paracoccus, Propionibacterium y Bacteroides.
Las especies desnitricantes de Pseudomonas se encuentran entre
las ms estudiadas y junto a las de Alcaligenes son probablemente las
de ms importancia en los medios naturales. Las hay con N2O como
producto terminal.
Finalmente, hay que considerar a Rhodopseudomonas sphaeroides,
que se encuentra entre los fototrofos no pertenecientes al grupo de las
bacterias del azufre, y a Thiobacillus denitricans, quimiolitotrofo ya
citado. Recientemente se ha descrito actividad desnitricante en
Vibrio succinogenes y en varias especies de Xanthomonas.

14.3 FISIOLOGA Y BIOQUMICA DE LA DESNITRIFICACIN

Las reductasas de los xidos de nitrgeno se hallan reprimidas


durante el crecimiento aerobio. En condiciones anaerobias, la fase de
desrepresin en presencia de NO3 es de unas 3 horas. En la gura
14.1 se muestra el modelo de transporte de electrones basado princi-

NO3 NO2 (NO) N2O N2


(O2)

Nitrato Nitrito
reductasa reductasa NOR N2OR
FeSMo cit. c d

NADH Fp (FeS) UQ-10 Cit b Cit c

Formiato
Succinato Fp
H2 Cit o Cit cco Cit aa3

O2 Metanol O2
Figura 14.1 Modelo de las probables cadenas de transporte de electrones de Paracoccus
denitricans. Abreviaturas: NOR, reductasa del xido ntrico; N2OR, reductasa del xido
nitroso; Fp, enzima avnico; FeS, centro de hierro y azufre; UQ-10, ubiquinona-10; Cit, cito-
cromo; Mo, molibdeno.
palmente en Paracoccus denitricans, que puede tomarse como 195
esquema general de la reduccin del NO3 en las bacterias desnitri- 14.4 LA RESPIRACIN DEL NITRATO
cantes. El punto ms discutido y probablemente variado de un caso a EN LAS BACTERIAS FACULTATIVAS
otro es el que afecta al NO.
Paracoccus denitricans puede reducir NO3 tanto con H2 como con
compuestos orgnicos. Las fuentes de carbono utilizadas son seme-
jantes a las de Desulfotomaculum (lactato, piruvato y formiato), pero
tambin puede utilizar el glicolato como precursor de cidos C4 dicar-
boxlicos, sin pasar por intermediarios con coenzima A (g. 14.2).

14.4 LA RESPIRACIN DEL NITRATO EN LAS BACTERIAS FACULTATIVAS

La respiracin del nitrato desempea un papel importante en el meta-


bolismo de las bacterias entricas y es un punto clave para la regula-
cin de la gran variedad de sistemas disponibles de produccin de
energa (captulos 9 y 13).

2  CH2OH COOH
Glicolato
(1)

CHO COOH CHO COOH


Glioxilato Glioxilato
+ 2 H+
NH3 (2)
H2O

CH2 COOH
NH2
Glicina

(3)

COOH CH CHOH COOH


NH2
Eritro--hidroxiaspartato
Eritro--hidroxiaspartato

NH3 (4)

COOH CH2 CO COOH


Oxalacetato
Figura 14.2 Metabolismo del glicolato por Paracoccus denitricans. (1)
Glioxilato reductasa dependiente de NAD. (2) Glicinoamino transferasa. (3)
Eritro-2-hidroxiaspartato aldolasa. (4) Eritro-3-hidroxiaspartato deshidratasa.
196 Las cadenas respiratorias de las bacterias entricas pueden utilizar
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS una gran variedad de sustratos (g. 14.1 y apartado 13.7). Cada una de
Captulo 14: NITRATO las distintas deshidrogenasas unidas a la membrana (NADH + H+, lac-
tato, succinato, formiato o L-glicerol-3-fosfato deshidrogenasas) pue-
den dar electrones a un pool comn de quinona (ubiquinona-8 en
condiciones aerobias y menaquinona-8 en condiciones anaerobias). La
quinona da a su vez electrones a las reductasas terminales y a los com-
plejos citocromo o y citocromo d. Hay una gran nmero de posibilida-
des para una simple cadena constituida por deshidrogenasa-quinona-
reductasa (captulo 9).
Los complejos citocromo o y citocromo d tienen un mecanismo
similar para la transposicin protnica. La ubiquinol oxidasa libera
en el periplasma 2 H+ + 2 e en tanto que la insercin de la oxidasa del
oxgeno molecular consume 2 H+ + 2 e en el citoplasma.
Durante el crecimiento aerobio, el NADH + H+ puede ser reoxidado
por la cadena respiratoria, pero en condiciones anaerobias el NAD+ se
regenera de otro modo y tienen lugar cambios metablicos importantes.

14.4.1 Catabolismo de la glucosa


En condiciones aerobias se utiliza preponderantemente la va oxidativa
de la hexosa monofosfato, mientras que anaerobiamente domina la va
de Embden-Meyerohf. Sin embargo, al disminuir el suministro de ox-
geno, se incrementa la concentracin de los enzimas de ambas vas. Este
incremento es ms importante sobre los niveles de fosfofructoquinasa,
enolasa, gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa y piruvato quinasa.
La anaerobiosis disminuye la formacin de piruvato deshidroge-
nasa, que produce NADH. La funcin de este enzima es reemplazada
por la piruvato formiato liasa (que no depende del NAD+), la cual pro-
duce acetil-CoA y formiato. El formiato es, a su vez, convertido en
CO2 e H2 por la formiato-hidrgeno liasa. Este complejo enzimtico
est constituido por formiato deshidrogenasa, un transportador no
identicado, e hidrogenasa (g. 14.3). La formiato-hidrgeno liasa es
el factor responsable del fuerte desprendimiento de gas.

Formiato-hidrgeno liasa
1 2 H+
2
Glucosa CO2
FDH-H ? HYD-3
NAD+ ADP
Formiato H2 NO3
NADH + H+ ATP NR
Piruvato-formiato
liasa
NADH + H+ NAD+ NADH + H+ NAD+ NO2
Piruvato Acetal-
Etanol
Acetaldehdo dehdo Alcohol
NADH + H+
Lactato deshidrogenasa deshidrogenasa
deshidrogenasa Ac ~ CoA
NAD+ Fosfotrans- Acetato
acetilasa Ac ~ P quinasa Acetato
Lactato
Pi CoA ADP ATP

Figura 14.3 Catabolismo de la glucosa por las bacterias fermentativas que respiran nitrato. FDH-H, for-
miato deshidrogenasa-H; HYD-3, hidrogenasa isoenzima 3; CoA, coenzima A.; NR, nitrato reductasa.
14.4.2 Respiracin del nitrato y fermentacin 197

14.4 LA RESPIRACIN DEL NITRATO


En presencia de nitrato, el formiato es oxidado por una formiato des-
EN LAS BACTERIAS FACULTATIVAS
hidrogenasa diferente, siendo transferidos entonces los electrones al
nitrato y no formndose hidrgeno. La cadena de transporte que se
establece desde el formiato al nitrato permite generar ATP por fosfori-
lacin oxidativa. As, una bacteria entrica que fermenta la glucosa en
presencia de nitrato obtiene ATP tanto por fosforilacin a nivel de
sustrato (metabolismo fermentativo) como por fosforilacin oxida-
tiva (respiracin anaerobia).

14.4.3 Ciclo de los cidos tricarboxlicos (CAT)


Las bacterias entricas tienen un CAT funcional en condiciones aero-
bias. Anaerobiamente se reducen los niveles de citrato sintasa, aconitasa
e isocitrato deshidrogenasa (g. 14.4), pero se genera el -cetoglutarato
necesario para la biosntesis.
Tal como ya ha sido comentado previamente (captulo 12), la
2-oxoglutarato deshidrogenasa es drsticamente reprimida en anaero-
biosis, impidindose la formacin de succinato. Este ltimo, necesa-
rio para la biosntesis, se forma por reduccin del oxalacetato (g.
14.4), el cual, a su vez, se genera por carboxilacin del piruvato. La
fumarato reductasa, uno de los enzimas implicados en la generacin
de succinato a partir de oxalacetato, es un enzima respiratorio que
genera fuerza protomotriz. De este modo, las bacterias entricas pue-
den crecer anaerobiamente con un sustrato no fermentable siempre y
cuando est presente el fumarato como aceptor de electrones ex-
geno. Hay tambin que mencionar que en condiciones anaerobias el
CAT no genera NADH.

AcCoA

Oxalacetato Oxalacetato Citrato


Citrato sintasa

Transaminasa NADH + H+ Malato


Aconitasa
deshidrogenasa

Aspartato Malato Isocitrato

Aspartasa Isocitrato
Fumarasa NADPH + H+
deshidrogenasa

Fumarato Fumarato -Cetoglutarato


-Cetoglutarato

Fumarato
FADH2 Succinato -Cetoglutarato
-Cetoglutarato
reductasa deshidrogenasa NADH + H+
deshidrogenasa

Suc-CoA sintetasa
Succinato Succinato Succinil-CoA

Figura 14.4 Ciclo de los cidos tricarboxlicos y brazo reductor (reacciones indi-
cadas con una echa de trazo discontinuo) que posibilita la sntesis en condiciones
anaerobias de succinato a partir del oxalacetato.
198 En contraste con el efecto de la fermentacin, la respiracin del
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS nitrato no afecta al CAT. No obstante, la aconitasa y la fumarasa son
Captulo 14: NITRATO inhibidas por efecto del nitrito. La alcohol deshidrogenasa y la for-
miato-hidrgeno liasa se hallan a un nivel muy bajo pero se excreta
acetato.

14.4.4 Respiracin anaerobia


Una gran variedad de sustratos pueden utilizarse como dadores de
electrones tanto para la respiracin aerobia como anaerobia, inclu-
yendo lactato, glicerol-3-fosfato, NADH y formiato. Las deshidrogena-
sas unidas a la membrana que actan en cada caso son las mismas en
condiciones aerobias y anaerobias, con la excepcin de la glicerol-3-
fosfato deshidrogenasa, que presenta dos enzimas genticamente dis-
tintos.
Como aceptores de electrones en condiciones anaerobias pueden
actuar, adems del nitrato, el nitrito, el fumarato, el N-xido de trime-
tilamina (TMAO), el dimetil sulfxido, el xido-1-tetrahidrotiofeno y
el tetrationato. En general, la actividad de las correspondientes reduc-
tasas disminuye por efecto represor del nitrato.

14.4.5 Mutantes clorato resistentes


La seleccin de clones resistentes al clorato ha sido muy utilizada para
obtener mutantes denominados chl que carecen de actividad nitrato
reductasa. El clorato es un sustrato de la nitrato reductasa, y tanto el
clorito como el cloro formados tienen efecto letal. Las mutaciones chl
espontneas se presentan con frecuencias elevadas.
Pichaud y De Groot seleccionaron mutantes chl de varias bacte-
rias entricas y demostraron que muchos de ellos no slo no tienen
nitrato reductasa, sino que tambin han perdido otros enzimas anae-
robios tales como la formiato deshidrogenasa y la formiato-hidrgeno
liasa. Azoulay fue capaz de reconstruir la actividad nitrato reductasa
mezclando extractos libres de clulas de diferentes mutantes chl. La
actividad reconstruida corresponde a una nueva fraccin microparti-
culada. Este resultado est de acuerdo con la hiptesis de que la
nitrato reductasa forma parte de un complejo enzimtico ubicado en
una estructura proteica de varios componentes insertada en la mem-
brana protoplasmtica.

14.4.6 Metabolismo del nitrito


El nitrito procedente de la reduccin del nitrato puede acumularse o
ser reducido a su vez. En las enterobacterias no hay nitrito reductasa
desnitricante que forme xidos de nitrgeno o N2. Una ligera pro-
duccin de xido nitroso que se ha detectado en algunos casos se
debe a la propia nitrato reductasa. En cambio, el nitrito puede redu-
cirse a amonaco a travs de la transferencia de seis electrones. En las
enterobacterias esto puede tener tres signicados: asimilacin de
nitrgeno, eliminacin de hidrgeno para reoxidar NADH, o genera- 199
cin de potencial de membrana en condiciones anaerobias. BIBLIOGRAFA
En presencia de nitrito no se produce etanol y se incrementa el
acetato. Se excretan grandes cantidades de amonaco, incluso cuando
el nitrito es la nica fuente de nitrgeno.

BIBLIOGRAFA

KNOWLES, R. Denitrication. Microbiological Review. 46. pp. 4370. 1982.


STEWART, U. Nitrate Respiration in Relation to Facultative Metabolism in
Enterobacteria. Microbiological Review, 52. pp. 190232. 1988.
BARET, E. L. y KWAN, H. S. Bacterial reduction of trimethylamine oxide. Ann.
Rev. Microbiol. 39, pp. 131149, 1985.
15 SULFATO

15.1 REDUCTORES DE SULFATO Y BACTERIAS


SULFURGENAS 202
15.2 REDUCCIN DEL SULFATO CON LACTATO 204
15.3 HIDROGENASAS Y TRANSPORTADORES DE
ELECTRONES 205
15.4 REDUCCIN DEL SO24 CON H2 205
15.5 METABOLISMO DEL CARBONO EN LOS SULFATO
REDUCTORES 208
15.6 BISULFITO REDUCTASAS 210
BIBLIOGRAFA 211
202 15.1 REDUCTORES DE SULFATO Y BACTERIAS SULFURGENAS
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS
Captulo 15: SULFATO Los reductores de sulfato fueron descubiertos por Beijerinck a princi-
pios de siglo. Hasta 1970 se consideraron constituidos por un
pequeo grupo de bacterias estrictamente anaerobias con una activi-
dad metablica limitada a la capacidad de oxidar unos pocos cidos
orgnicos de bajo peso molecular hasta acetato, o bien hidrgeno
molecular; en ambos casos, con la concomitante reduccin de sulfato
a sulfuro. Los reductores de sulfato fueron clasicados en dos gneros:
Desulfovibrio y Desulfotomaculum y a lo largo de los aos sesenta se
asuma que el mecanismo bioqumico y la generacin de energa liga-
dos a la respiracin del SO42 eran idnticos en los dos gneros. No
obstante, el gnero Desulfovibrio se caracterizaba por poseer citocro-
mos del tipo c y por producir una intensa uorescencia roja en medio
alcalino y bajo iluminacin con rayos ultravioleta (365 nm), debido a
la presencia del pigmento verde desulfoviridina, el cual presenta acti-
vidad bisulto reductasa. El gnero Desulfotomaculum carece de cito-
cromos del tipo c y de desulfoviridina y, adems, tiene la capacidad de
formar endosporas. Se distinguan varias especies de ambos gneros
(tabla 15.1), todas ellas capaces de crecer anaerobiamente con lactato
y sulfato.

TABLA 15.1 Caractersticas distintivas de las especies clsicas de Desulfovibrio y Desulfotomaculum.

Crecimiento con

Formiato ms sulfato
Piruvato sin sulfato

Malato ms sulfato

Colina sin sulfato


Desulfoviridina
Citocromo

Termlos
Especie Forma Flagelacin

Desulfovibrio
Grupo I (G + C 60-62%)
D. vulgaris Vibrio Polar monotrica c3 + + +
D. africans Vibrio Polar lofotrica c3 + +
D. gigas Vibrio Polar lofotrica c3 +
Grupo II (G + C 54-56%)
D. desulfuricans Vibrio Polar monotrica c3 + + + +
Grupo III (G + C 46-47%)
D. salexigens Vibrio Polar monotrica c3 + +

Desulfotomaculum (G + C 42-46%)
D. nigricans Bacilo Peritrica b + +
D. orientis B. curvado
grueso Peritrica b
D. ruminis Bacilo Peritrica b + +

Posteriormente se han llegado a describir seis nuevos gneros de 203


bacterias reductoras de sulfatos: Desulfobacter, Desulfosarcina, Desulfo- 15.1 REDUCTORES DE SULFATO Y
nema, Desulfobulbus, Desulfococcus y Thermodesulfobacterium, los cua- BACTERIAS SULFURGENAS
les presentan una importante diversidad bioqumica, nutricional y
morfolgica. Consecuentemente, el concepto de reductores de sulfato
como relativo a un pequeo grupo de bacterias con limitadas capaci-
dades metablicas ha sido profundamente transformado. Los miem-
bros de los dos antiguos gneros junto con los correspondientes a los
nuevos, conservan las caractersticas comunes de utilizar el sulfato
como aceptor nal de electrones y de un desarrollo estrictamente
anaerobio. Tambin se han descubierto unas pocas especies como
Desulfuromonas acetoxidans que no pueden usar sulfato, pero que son
capaces de reducir el azufre a sulfuro. Como la produccin de sulfuro
es un carcter absolutamente comn, se ha llegado a sugerir que
deberamos considerarlos conjuntamente con los antiguos reductores
de SO42 como un nuevo grupo siolgico de bacterias sulfurgenas,
cuyo conocimiento contina amplindose en la actualidad y que
congura un importante y variado grupo siolgico de microorganis-
mos comparable al de las bacterias metanognicas o al de las bacterias
fototrcas.
Desde hace tiempo se sabe que algunas especies de Desulfovibrio
pueden crecer con piruvato o con colina en ausencia de sulfato (tabla
15.1). El crecimiento fermentativo puede considerarse como una
alternativa opcional de algunos reductores de sulfatos, as como el
uso del nitrato y del fumarato como aceptores nales de electrones
alternativos al sulfato, de acuerdo con las propiedades de las especies
descritas ms recientemente (tabla 15.2).

TABLA 15.2 Nuevas especies identicadas de bacterias reductoras de sulfato.

Tincin Aceptor de
Especie Gram Morfologa Nutricin electrones

Desulfovibrio saprovorans Bacilo curvado cidos grasos (C18)


Acetato Propionato SO42 S2
Desulfobulbus propionicus Forma de limn Propionato Acetato SO42 S2
NO3 NO2
Desulfotomaculum acetoxidans Bacilo esporgeno Acetato CO2 SO42 S2
Desulfuromonas acetoxidans Bacilo Acetato CO2 So S2
Desulfobacter postgatei Bacilar a elptica Acetato CO2 SO42 S2
Desulfosarcina varibilis Irregular en paquetes Orgnico CO2 SO42 S2
CO2 Clula
Desulfonema magnum + Filamentos (7 m dim.) Orgnico CO2 SO42 S2
204 15.2 REDUCCIN DEL SULFATO CON LACTATO
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS
Captulo 15: SULFATO El lactato y el piruvato pueden ser dadores de electrones para la reduc-
cin del sulfato (ver Lmina 8). El lactato es oxidado a piruvato por la
lactato deshidrogenasa y los electrones producidos son utilizados para
producir hidrgeno molecular. El piruvato es convertido en CO2, H2 y
acetil fosfato por un proceso anlogo al utilizado por los clostridios
(g. 15.1). Se requiere siempre una hidrogenasa citoplasmtica. El
hidrgeno producido difunde rpidamente a travs de la membrana
protoplasmtica, siendo recapturado gracias a otra hidrogenasa peri-
plasmtica y su cofactor, el citocromo c3. Los electrones producidos
entran en el citoplasma y los protones crean un gradiente protnico a
travs del cual puede producirse ATP por la ATP-asa. En el citoplasma
los electrones producidos son utilizados para la reduccin del APS a
sulfuro por la APS reductasa y la bisulto reductasa.
Odom y Peck pusieron de maniesto que en esferoplastos de D.
gigas que han perdido la hidrogenasa periplasmtica y el citocromo c3
no se oxida el lactato con sulfato. Aadiendo hidrogenasa puricada
del mismo microorganismo y citocromo c3 se restaura parcialmente la
actividad (40%).
Verjan demostr que D. desulfuricans, creciendo en el quimiostato,
puede simultneamente fermentar un exceso de piruvato produ-
ciendo H2 en tanto que el SO42 a concentracin limitante sigue
siendo reducido. Aadiendo ms SO42 deja de producirse H2. Tsuji y
Yagui han mostrado que en el cultivo discontinuo de D. vulgaris, en
las primeras etapas de crecimiento, se libera H2 y no se forma sulfuro.
Este ltimo slo aparece despus de que se inicia una recaptacin de
H2. No obstante, una elevada concentracin exterior de H2 puede
inhibir completamente la oxidacin del lactato y el piruvato.

MEMBRANA
PERIPLASMA CITOPLASMA

2 Lactato

Hidrogenasa [4 H]
soluble
4 H2 2 Piruvato
2 CoA
4 H2
[4 H] 2 CO2

Hidrogenasa 2 Acetil-CoA
periplasmtica SO42 + 8 H+
2 Pi
8 e
2 CoA

HS + 4 H 2O 2 Acetil- P
8 H+
2 ADP

2 ATP

2 Acetato

Figura 15.1 Ciclo del hidrgeno en las bacterias reductoras del azufre.
15.3 HIDROGENASAS Y TRANSPORTADORES DE ELECTRONES 205

15.3 HIDROGENASAS Y
El metabolismo del hidrgeno ha jugado un papel esencial en nuestro TRANSPORTADORES DE ELECTRONES
conocimiento de los reductores de sulfato. En las bacterias que oxidan
acetato hay una hidrogenasa soluble que genera H2 de la oxidacin
del lactato o del piruvato. Este hidrgeno difunde hacia el exterior.
Hay adems una deshidrogenasa periplasmtica, la cual con sulfato
disponible permite la transferencia de electrones al citoplasma para
su reduccin y adems genera un gradiente protnico (g. 15.1). Este
ltimo permite la generacin de ATP por la reaccin ATPsica de
forma semejante a las bacterias acetgenas (captulo 8) y metange-
nas (captulo 11). En ausencia de sustrato orgnico reductor la hidro-
genasa periplasmtica puede generar ATP y reducir SO42. La energa
disponible puede utilizarse para la asimilacin de CO2 por la va de
Wood (captulo 8) o para la formacin de acetil-CoA a partir de ace-
tato por la reaccin de la acetil-CoA sintetasa.

Acetato + ATP + HS CoA Acetil-CoA + AMP + PPi

En los microorganismos que acumulan acetato, el acetil-CoA se


forma a partir del piruvato y puede asimilarse acetato del succinil-
CoA por una transferasa (g. 15.2, pg. 209).
Se han caracterizado dos hidrogenasas periplasmticas en diferen-
tes especies de Desulfovibrio: una protena no hemnica con Ni y Fe
(Ni Fe hidrogenasa), y otras con Fe (Fe hidrogenasa). Las dos hidroge-
nasas dieren adems por su actividad especca, por la estructura de
sus subunidades, por su sensibilidad a inhibidores y por su antigenici-
dad. La deshidrogenasa periplasmtica puede diferir entre cepas de
una misma especie, como ocurre en D. vulgaris.
En cuanto a los citocromos, existe tambin una importante hete-
rogeneidad interespecca en los reductores de sulfato (tabla 15.3). Es
curioso que entre distintos citocromos c de miembros del gnero Des-
ulfovibrio existen ms diferencias que entre el citocromo c del hombre
y el de la paloma. Esto sugiere que esta protena ha evolucionado pro-
fundamente en los microorganismos anaerobios como consecuencia
de las diversas condiciones en las que se puede desarrollar un trans-
porte de electrones acoplado a la produccin de energa.
Se ha demostrado la presencia de diferentes ferredoxinas (tabla
15.3), las cuales estn asociadas al sistema fosforoclstico. Pueden ser
sustituidas por avodoxina o rubredoxina.

15.4 REDUCCIN DEL SO42 CON H2

Clulas enteras de D. desulfuricans reducen rpidamente el SO42 en


presencia de H2 (ver tambin Lmina 8).

4 H2 + SO42 S2 + 4 H2O

TABLA 15.3 Distribucin de hidrogenasas y protenas de transporte de electrones en diferentes especies de


Desulfovibrio.

Protenas de transporte de electrones

Hidrogenasa* Citocromos Ferredoxina

Organismo c553 o c3 c3
(Fe) (NiFe) monohemo (13000) (26000) [Fe4S4] 2 [Fe4S4] [Fe3S4] Fl Rb

D. vulgaris + + + + 1 NE NE + +
(Hildenborough)

D. gigas + + + + + +

D. desulfuricans + + + + 1 1 1 +
(Norway 4)

D. desulfuricans + + + NE NE NE + +
(ATCC 27774)

D. africanus NE NE NE + + 2 1 NE +

* +, presente; , ausente; Fl, avodoxina; Rb, rubredoxina; NE, no estudiado.

El SO42 debe ser activado pasando a adenosina-5-fosfosulfato (APS):

NH2

N N
O O
O S O P O CH2 O N N
O O

OH OH
Adenosina-5-fosfosulfato

La formacin de APS requiere ATP. La reaccin se lleva a cabo con


la sulfato adenilil-transferasa (1) y la pirofosfatasa (2):

(1)
ATP + SO42 APS + PPi
(2)
PPi 2 Pi
H2O

206
El APS se reduce con citocromo c3, el cual es autooxidable. La ade- 207
nilil-sulfato reductasa cataliza la reaccin: 15.4 REDUCCIN DEL SO42 CON H2

APS + Citocromo c3 (red) + 2 H+ AMP + SO32 + H2O


Citocromo c3 (ox)

El citocromo c3 (oxi) se reduce con una hidrogenasa:

H2 + Citocromo c3 (ox) Citocromo c3 (red) + 2 H+

La reduccin del sulto tendra lugar con una sulto reductasa:

SO2
3 +6H
+ S2 + 3 H2O

La generacin de energa slo puede llevarse a cabo en la oxida-


cin del H2, la cual puede funcionar con SO32 o con fumarato como
aceptores nales de electrones. En este ltimo caso, entre el hidr-
geno y el fumarato puede mediar una 6-menaquinona.
La reduccin del SO32 con 6 e sugiere la existencia de tres etapas
sucesivas con 2 e de transferencia en cada una. Por ello se postul la
va del cido sulfoxlico que no ha sido conrmada:
OH OH H OH
O S H S + H2O S SH2 + 2 H2O
OH 2 e
O 2 e
H OH 2 e
2 H+ 2 H+ 2 H+

cido cido Hidrato


sulfuroso sulfoxlico de azufre
El APS tambin puede reducirse a bisulto:

APS + Citocromo c3 (red) + H+ AMP + HSO3 + Citocromo c3 (ox)

el cual se reducira a sulfuro pasando a tritionato y tiosulfato


mediante la bisulfato reductasa.
En la mayor parte de las bacterias tiene lugar una reduccin asimi-
ladora de SO42 en la cual se forma APS que se transforma en PAPS por
efecto de una adenilil sulfato transferasa.
El PAPS se reduce con una PAPS reductasa que utiliza NADPH + H+:

NH2

N N
O O
O S O P O CH2 O N N
O O

O OH
Adenosina-3-fosfato-5 O P O
fosfosulfato (APS)
O
208 Esta reaccin es un sistema enzimtico complejo en el que inter-
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS viene el cido dihidrolipoico. El bisulto se reduce luego a SH por un
Captulo 15: SULFATO sistema anlogo al sealado anteriormente.
En Desulfovibrio y Desulfotomaculum se ha encontrado una tiosul-
fato reductasa que acta en conjuncin con el citocromo c3 (red) y el
H2 y que da lugar a la reaccin:

SO32
S2O32
S2

El sulto puede ser reducido como en el caso del formado por reduc-
cin del SO42 o puede ser reducido a S2 O32. Para esto ltimo se
requiere citocromo c3, ferredoxina o avodoxina e hidrogenasa.
En Thiobacillus denitricans creciendo anaerobiamente se ha
encontrado una va distinta para la reduccin del S2O32 que utiliza
una tiosulfato sulfurotransferasa llamada rodonasa:

SH S S SH
S2O32 + SO3 + S
SH S S SH

15.5 METABOLISMO DEL CARBONO EN LOS SULFATO REDUCTORES

Los reductores de sulfatos pueden utilizar un nmero muy limitado de


fuentes de carbono. Este reducido espectro de sustratos utilizables se
debe a que la oxidacin con sulfato tiene un bajo rendimiento energ-
tico. El sulfato es el nico aceptor nal de electrones que debe ser pri-
meramente activado reaccionando con ATP para dar adenosina
fosfosulfato (APS). El APS es reducido a sulto por transferencia de 2 e
(E0 = 60 mV) y el sulto es reducido luego a sulfuro (E0 = 116 mV).
Esto supone la transferencia de 6 e o de tres transferencias de 2 e, con
tritionato y tiosulfato como intermediarios. Como consecuencia de
estos relativamente bajos potenciales de xido-reduccin, la energa
que puede obtenerse de la oxidacin del sustrato es pequea. Comp-
rese con el O2 (E0 = +820 mV) y el NO3 (E0 = +433 mV).
La eliminacin del acetato de los medios anaerobios se consider
durante mucho tiempo restringida a los metangenos. Sin embargo,
Pfennig y Biebl mostraron que los miembros del nuevo gnero Desul-
furomonas producen sulfuro y oxidan acetato a CO2 en presencia de
azufre elemental. Por otra parte, Desulfobacter postgatei slo puede uti-
lizar acetato como sustrato orgnico para el crecimiento. En esta bac-
teria se han encontrado todos los enzimas del ciclo de los cidos
tricarboxlicos, por lo que se ha propuesto para la oxidacin del ace-
tato la va referida en la gura 15.2.
Acetato

Succinato Succinil-CoA
CO2

2  Oxoglutarato Biosntesis
Fumarato CO2
Acetil-CoA
Isocitrato

Va anaplertica
CO2 Malato Citrato
Acetato Acetil-CoA Piruvato PEP Oxalacetato

Biosntesis
Figura 15.2 Metabolismo del acetato en Desulfobacter postgatei.

La fosforilacin a nivel de sustrato no puede suministrar el ATP


necesario para la reduccin de sulfato y para el crecimiento. De este
modo, se requiere el concurso de otro sistema generador de energa
concomitante con la oxidacin del acetato.
Actualmente se cree que la principal distincin taxonmica entre
los reductores de sulfato debe situarse entre aquellos que pueden oxi-
dar acetato y los que lo acumulan como resultado de la oxidacin
parcial de otros sustratos orgnicos.
Las fuentes de carbono sobre las que pueden crecer los reductores
de sulfato pueden ser CO2, cierto nmero de compuestos orgnicos
incluyendo el benzoato pero excluyendo azcares e hidrocarburos y,
nalmente, cidos orgnicos desde el acetato al estearato. Sin
embargo, hay un grupo que slo puede oxidar parcialmente un
nmero muy reducido de compuestos, como el lactato, y otro que
puede oxidar una amplia variedad de fuentes de carbono, tales como
cidos grasos de peso molecular relativamente alto. En este ltimo
caso se encuentran los que acumulan acetato y los que pueden llevar
a cabo su mineralizacin.
Aunque la glucosa no puede ser normalmente utilizada por los
reductores de sulfatos, se han conseguido adaptar algunas cepas de
Desulfotomaculum nigricans. En estas cepas son simultneamente
funcionales las vas de Embden-Meyerhof y la de Entner-Doudoroff,
lo cual es excepcional a pesar de que esta ltima va se haya encon-
trado con carcter exclusivo en algunas bacterias anaerobias. En el
caso referido, Desulfotomaculum nigricans lleva a cabo un proceso
209
210 anlogo a la oxidacin del piruvato con SO42 con un aporte adicional
Parte D: OXIDANTES INORGNICOS de produccin interna de H2 con electrones de baja energa.
Captulo 15: SULFATO Muchas especies, incluyendo Desulfovibrio vulgaris y D. desulfuri-
cans, pueden oxidar H2 con SO42. En estos casos, la asimilacin del
carbono, se reparte generalmente entre CO2 y acetato en la propor-
cin del 30% y del 70%, respectivamente. Sin embargo, hay especies
que pueden crecer autotrcamente reduciendo CO2.
En diversas condiciones, muchos reductores de sulfato producen
H2. Por lo tanto, al igual que ocurre con el acetato, el H2 puede ser
tanto sustrato como producto nal del catabolismo.

15.6 BISULFITO REDUCTASAS

Todos los reductores de sulfatos tienen actividad bisulto reductasa.


Este enzima cataliza la reaccin:

5 H+ + 2 e 3 H2O

3 HSO3 S3O62
Bisulfito Tritionato

Luego, el tritionato se reduce a tiosulfato y ste a sulfuro:

2 e + H+ HSO3 2 e + 2 H+ HSO3

S3O62 S2O32 SH

Sin embargo, no est totalmente aclarada su intervencin en la


cantidad de SH2 que puede formarse in vivo.
La bisulto reductasa de Desulfovibrio se ha identicado a travs
del pigmento desulfoviridina, el cual se detecta por uorescencia a la
radiacin ultravioleta. Sin embargo, se conocen tres especies de Desul-
fovibrio que no presentan esta caracterstica: D. baculatus, D. saporovo-
rans y una cepa de D. desulfuricans. La desulfoviridina ha sido
reemplazada por la desulforrubidina, que no es uorescente a la radia-
cin ultravioleta y que tiene color pardo rojizo en lugar de verde.
Ambos pigmentos son protenas con hierro no hemnico en un grupo
prosttico denominado sirohemo, el cual est constituido por un
tetrapirrol quelado con hierro con dos anillos pirrol reducidos.
La desulfoviridina ha sido detectada en Desulfococcus multivorans y
Desulfonema limicola, y la desulforrubidina en Desulfobacter postgatei.
Por lo tanto, se han reconocido dos bisulto reductasas en algunos
reductores de sulfatos, pero en contra de lo que se crey durante
muchos aos, ninguna de ellas constituye una caracterstica distin-
tiva a nivel de gnero.
BIBLIOGRAFA 211

BIBLIOGRAFA
ODOM, J. M. y PECK, H. D. Hydrogenase, electrontransfer proteins, and
energy coupling in the sulfate-reducing bacteria Desulfovibrio. Ann. Rev.
Microbiol. 38, pp. 55192, 1984.
HAMILTON, W. A. Sulfate-Reducing Bacteria. (En Anaerobic microbial corro-
sion). Ann. Rev. Microbiol. 39, pp. 206215, 1985.
PARTE E
REDUCTORES ORGNICOS Y
COMPUESTOS C1
16 COMPUESTOS ALIFTICOS

16.1 ATAQUE PRIMARIO DE LAS FUENTES ORGNICAS DE


PODER REDUCTOR 216
16.2 OXIDACIN DE ALCANOS Y ALQUENOS 216
16.3 SISTEMA DE LA -HIDROXILASA 218
16.4 OXIDACIN DE LOS CIDOS GRASOS 218
16.5 LA -OXIDACIN 218
16.6 LA -OXIDACIN 219
16.7 FORMACIN DE PROPIONIL-CoA 220
16.8 OXIDACIN A -HIDROXICIDOS 221
BIBLIOGRAFA 222
216 16.1 ATAQUE PRIMARIO DE LAS FUENTES ORGNICAS DE PODER
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y
REDUCTOR
COMPUESTOS C1
Captulo 16: COMPUESTOS La formacin de productos nales del catabolismo (tratado en la parte
ALIFTICOS C) requiere un reductor que, normalmente, es un sustrato orgnico
externo. El desarrollo de la biomasa en el cultivo puro va unido a la
desaparicin paulatina de dicho sustrato. Ya ha sido referida la forma
en que diversos sustratos orgnicos de bajo peso molecular pueden
mineralizarse o dar lugar a diferentes productos orgnicos, general-
mente ms reducidos, junto a CO2.
El nmero de compuestos orgnicos susceptibles de oxidacin por
las bacterias es mucho mayor que el que ha sido considerado en los
captulos correspondientes a la formacin de productos nales del cata-
bolismo. En todos los casos tiene lugar una serie de reacciones, denomi-
nadas de ataque primario, a partir de las cuales los ms diversos
sustratos orgnicos se convierten en alguno de los productos que ha
sido considerado como sustrato para la produccin de productos nales.
Cuando el oxgeno es el oxidante terminal, en casi todos los casos se
produce un ataque primario que conduce a la produccin de acetil-CoA.
Dejando aparte la oxidacin de compuestos C1, pueden distin-
guirse tres tipos fundamentales de ataque primario: el de los com-
puestos alifticos, el de los compuestos aromticos y el de los
compuestos nitrogenados. En cuanto al primer grupo, que es el objeto
de este captulo, los dos sistemas que cabe considerar fundamental-
mente son el ataque primario de alcanos y alquenos y la oxidacin de
los cidos grasos de elevado peso molecular.
El ataque primario aerobio puede conducir a la mineralizacin, pero
en otros casos se acumulan productos resultantes de la oxidacin par-
cial del sustrato, tal como ya ha sido comentado anteriormente, sobre
todo al tratar de las bacterias del cido actico (captulo 5). Puede sea-
larse que la prediccin que Pasteur realiz despus de sus estudios sobre
distintas fermentaciones (llegar un da, estoy convencido, en el que
los microbios sern utilizados en ciertas operaciones industriales
debido a su habilidad para atacar la materia orgnica) se ha conr-
mado ampliamente.
No se considerar aqu de forma especial la utilizacin de aquellos
sustratos orgnicos que slo pueden ser utilizados por el microbio
despus de una digestin exgena previa. No obstante, sto tiene una
gran importancia ecolgica, pero est fuera del marco desarrollo
microbiano/medio de cultivo sobre el que se ha circunscrito funda-
mentalmente la perspectiva de este libro.

16.2 OXIDACIN DE ALCANOS Y ALQUENOS

La oxidacin de alcanos y alquenos implica la asimilacin de O2 molec-


ular. Esta asimilacin puede ser llevada a cabo por un grupo relativa-
mente reducido de bacterias, entre las que se encuentran miembros del
gnero Pseudomonas y miembros del grupo corineforme y actinomice-
tos, especialmente de los gneros Mycobacterium y Nocardia.

El tipo ms comn de oxidacin de los hidrocarburos parafnicos 217


(cadena larga), es la oxidacin monoterminal hasta cido graso, seguida 16.2 OXIDACIN DE ALCANOS Y
por la -oxidacin de este ltimo. El primer producto de esta secuen- ALQUENOS
cia es un alcohol primario. Cuando el hidrocarburo capta el O2
molecular se forma, probablemente, el hidroperxido intermediario.
+2H
R CH2 CH3 + O2 R CH2 CH2 R CH2 CH2OH + H2O
O OH
Hidrocarburo Hidroperxido

Los alcanos gaseosos (cadena corta), tambin pueden ser oxidados


en un carbono subterminal para dar metilcetonas. Este tipo de oxida-
cin se llama oxidacin subterminal.
+2H 2H
R CH2 CH3 + O2 R CH CH3 R CH CH3 R C CH3
H2 O
O OH OH O
Alcano Hidroperxido Alcohol Metilcetona
gaseoso secundario

Este es el caso encontrado en una cepa de Brevibacterium que oxida el


propano hasta acetona.
Pseudomonas aeruginosa crece sobre 2-metilhexano y produce una
mezcla de cidos:

2-Metilhexano cido 5-metilhexanoico + cido 2-metilhexanoico


Esto sugiere que el organismo debe ser capaz de atacar la cadena de
hidrocarburos por los dos extremos. Un fenmeno parecido se ha des-
crito en la oxidacin del decano y el dodecano por una cepa de Cory-
nebacterium. Este tipo de oxidacin se llama oxidacin biterminal.
En ltimo extremo, tanto en un caso como en el otro, tiene lugar
inicialmente la oxidacin del grupo metilo con la formacin del
correspondiente alcohol o cetona (oxidacin subterminal).
Los alcoholes primarios formados inducen la sntesis de una alcohol-
deshidrogenasa independiente de NAD+ y NADP+, unida a la estructura
celular. La misma bacteria dispone de deshidrogenasas constitutivas que
son solubles y dependientes del NADP+ (Pseudomonas aeruginosa).
Algunas bacterias producen ceras de palmitato cuando se desarro-
llan en alcanos lquidos de cadena larga. La fraccin alcohol del ster
corresponde al hidrocarburo del sustrato.
Hay cepas bacterianas que pueden utilizar hidrocarburos como
nica fuente de carbono, si bien conservan la propiedad de utilizar ms
rpidamente otros sustratos para el crecimiento. Ciertos hidrocarburos
se utilizan nicamente como cosustratos. Esto es, el organismo utiliza
otro sustrato como fuente de energa y simultneamente oxida al
hidrocarburo. Este ltimo no es oxidado completamente sino slo en
una o dos etapas. Este mecanismo se llama co-oxidacin o cometabo-
lismo de los hidrocarburos.

218 16.3 SISTEMA DE LA -HIDROXILASA


Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y
COMPUESTOS C1 La hidroxilacin del grupo metilo constituye un sistema oxidsico de
Captulo 16: COMPUESTOS funcin mixta o de monooxigenasa. El ms conocido es el sistema de
ALIFTICOS la -hidroxilasa de Pseudomonas oleovorans. Comprende 3 protenas
que han sido puricadas e identicadas como rubredoxina-NAD
reductasa, rubredoxina y -hidroxilasa

NADH2 Reductasa Rubredoxina CH3 R


oxid. (Fe2+) O2

H2O
NAD+ Reductasa Rubredoxina HOCH2 R
red. (Fe3+)

En Corynebacterium el sistema -hidroxilasa activador del O2 no


est constituido por la rubredoxina sino por el citocromo P450. En
ambos casos la formacin del hidroperxido intermediario est toda-
va por demostrar.

16.4 OXIDACIN DE LOS CIDOS GRASOS

Los tomos de carbono del cido graso se numeran a partir del carboxilo.

3 2 1 O
CH3 (CH2)n CH2 CH2 C

  OH

Los tomos de carbono 2 y 3 se indican como y y el carbono del


metilo del extremo distal de la cadena se llama carbono .
Los cidos grasos pueden formarse a partir del ataque primario de
hidrocarburos por el sistema de la -hidroxilasa y luego la carboxila-
cin oxidativa en dos etapas, pasando por el aldehdo. Ulteriormente,
el cido graso puede ser oxidado en el carbono , en el o en el .

16.5 LA -OXIDACIN

La -oxidacin de los cidos grasos de elevado peso molecular se lleva


a cabo mediante un sistema enzimtico que cataliza la hidroxilacin
en el carbono 2. El resultado de esta reaccin oxidativa es de ordina-
rio la descarboxilacin con formacin de un cido graso de un car-
bono menos. La primera etapa de la formacin del -hidroxicido es
una reaccin de una oxidasa de funcin mixta y la segunda es una
descarboxilacin oxidativa. Sin embargo, el mecanismo de la -oxida-
cin de los cidos grasos es todava poco conocido.

16.6 LA -OXIDACIN 219

16.6 LA -OXIDACIN
La -oxidacin es un sistema de oxidacin de los cidos grasos muy
bien conocido y probablemente el que tiene lugar con mayor frecuen-
cia. De la -oxidacin resulta la formacin continuada de unidades de
cido actico (acetil CoA), a medida que la longitud del cido graso
original se reduce en dos carbonos cada vez.
La primera etapa es la activacin del cido graso por formacin del
correspondiente acil-CoA. Esta activacin ocurre en dos reacciones.

O O
R C + ATP R C AMP + PPi
OH
Acil-AMP

O O
R C AMP + HS CoA R C S CoA + AMP
Acil-CoA

Estas dos reacciones se hacen irreversibles porque la pirofosfatasa


hidroliza el pirofosfato (PPi) a fosfato inorgnico. Se requieren iones
magnesio.
La formacin del tioster del cido graso (acil-CoA) tambin puede
tener lugar directamente, por transferencia del coenzima A, a partir
de otro acil-CoA, que puede ser el producto nal de la oxidacin del
cido graso inicial:

O O O O
R' C S CoA + R C R' C +R C S CoA
OH OH

Despus viene una secuencia repetitiva de cuatro reacciones. En la


primera el acil-CoA es deshidrogenado entre los carbonos y por la
acil-CoA deshidrogenasa, formndose el acil-CoA insaturado entre los
carbonos 2 y 3:

O O
R CH2 CH2 CH2 C S CoA R CH2 CH CH C S CoA
FAD FADH2

Se conocen por lo menos dos formas de este enzima, ambas


metalo-protenas. El grupo prosttico es el FAD. Hay una E (Cu)-FAD
que ataca los cidos grasos de cadena corta y otra E (Fe)-FAD para los
de cadena ms larga.
La siguiente reaccin es la hidratacin del doble enlace entre los
carbonos 2 y 3. Se lleva a cabo por accin de la crotonasa:

220
O H2O OH H O
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y
R CH2 CH CH C S CoA R CH2 C C C S CoA
COMPUESTOS C1
Captulo 16: COMPUESTOS H H
ALIFTICOS
Acil- CoA
Acil-CoA ,,
 insaturado L-3-Hidroxiacil-CoA
(trans 2)

No parece intervenir ningn coenzima y slo produce los L-isme-


ros a partir del enlace trans-2. Este enzima tambin acta sobre el
doble enlace cis-2, pero entonces slo produce el D-ismero. La cro-
tonasa (acil-CoA hidratasa) proporciona asimismo un medio reversi-
ble de conversin de los cidos - insaturados (3) en - insaturados
(2), a travs del -hidrxido comn:

O OH O O
H2O
R CH CH CH2 C S CoA R CH2 C CH2 C S CoA R CH2 CH CH C S CoA
H2O
H

La tercera reaccin es la oxidacin del -hidroxi-acil-CoA por la


3-hidroxi-acil CoA deshidrogenasa que utiliza NAD+:

OH H O O O
R CH2 C C C S CoA R CH2 C CH2 C S CoA
H H
NAD+ NADH + H+

Slo se oxida el L-ismero.


La cuarta y ltima reaccin de la secuencia es la reaccin de la
-tiolasa. El -cetoacil-CoA es escindido entre los carbonos 2 y 3 con
la incorporacin concomitante de un mol de CoA. El CoA original
permanece en la molcula C2:

HS CoA
O O O O
R CH2 C CH2 C S CoA R CH2 C S CoA + CH3 C S CoA

La reaccin de la -tiolasa forma un nuevo tioster con una cadena


de dos tomos de carbono menos que la original. El acil-CoA acortado
puede seguir oxidndose partiendo de la reaccin de la acil-CoA deshi-
drogenasa.

16.7 FORMACIN DE PROPIONIL-CoA

Los cidos grasos que contienen un nmero par de tomos de car-


bono y que tienen la composicin general C2n 1H4n 1COOH, pue-
den producir n molculas de acetil-CoA. Los de nmero impar de
frmula C2nH4n + 1COOH, proporcionarn una molcula de propionil-
CoA y n 1 de acetil-CoA.
El propionil-CoA puede metabolizarse de dos maneras para su ulte- 221
rior oxidacin. Por una carboxilacin inicial a metil malonil-CoA que
16.8 OXIDACIN A
luego se convertir en succinil-CoA, el cual puede incorporarse al CAT: -HIDROXICIDOS

CO2 H O
CH3 CH2 CO S CoA CH3 C C S CoA HOOC CH2 CH2 CO S CoA
ATP ADP + Pi COOH

O bien, tal como sucede en E. coli, el propionato se condensa con el


glioxilato para dar -hidroxiglutarato, que luego se desdobla en lac-
tato y acetato.
El succinato puede ser oxidado por el CAT.
En E. coli el propionato se condensa con el glioxilato para dar
-hidroxiglutarato que luego se desdobla en lactato y acetato:

Propionato

Propionil-CoA

2-Hidroxiglutarato sintasa Glioxilato


HS CoA

-Hidroxiglutarato
-Hidroxiglutarato

Lactato Acetato

El destino ulterior del lactato es desconocido en este caso.


Algunas bacterias acumulan acetil fosfato, aparentemente como
reserva energtica. El acetil fosfato se convierte fcilmente en acetil-
CoA mediante la fosfotransacetilasa:

O O
2 2
CH3 C OPO3 + HS CoA CH3 C S CoA + OHPO3

Por otra parte, como ya ha sido comentado anteriormente, puede


producir ATP y acetato.

16.8 OXIDACIN A -HIDROXICIDOS

Aparte la y oxidacin, los cidos grasos tambin pueden oxidarse a


-hidroxicidos que ulteriormente pueden pasar a cidos dicarboxlicos:
1
O2 4 H+
2
CH3 (CH2)n COOH CH2OH (CH2)n COOH COOH (CH2)n COOH
+ H2O
Monooxigenasa Dehidrogenasas
222 La -oxidacin requiere la participacin de las cadenas respirato-
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y rias, posiblemente con citocromo P450 o tiorredoxina y NADPH-cito-
COMPUESTOS C1 cromo P450 reductasa.
Captulo 16: COMPUESTOS En las especies de Pseudomonas los cidos grasos producidos por
ALIFTICOS hidrocarburos se oxidan simultneamente por y oxidacin.

-oxidacin
-

Alcanos cido graso Acetato


-oxidacin
- -oxidacin
-

cidos dicarboxlicos

Cuando no tiene lugar la -oxidacin es cuando se acumulan ceras.

BIBLIOGRAFA

BOYD, G. S. y SMELLIE, R. M. S. (eds.). Biological Hydroxylation mechanisms.


Academic Press. New York. 1972.
17 COMPUESTOS AROMTICOS

17.1 PROCESOS AEROBIOS Y ANAEROBIOS 224


17.2 CARACTERSTICAS GENERALES DE LA DEGRADACIN
AEROBIA 224
17.3 LA ORTO-RUPTURA DEL ANILLO BENCNICO 224
17.4 LA META-RUPTURA DEL ANILLO BENCNICO 226
17.5 OXIDACIN DEL GENTISATO 228
17.6 OXIDACIN DEL D-MANDELATO Y OTROS
PRECURSORES DEL CATECOL 229
17.7 OXIDACIN DEL p-HIDROXIBENZOATO Y OTROS
PRECURSORES DEL CIDO
PROTOCATQUICO 231
17.8 RELACIN ENTRE LAS DISTINTAS VAS AEROBIAS DE
OXIDACIN DE LOS COMPUESTOS
AROMTICOS 232
17.9 INDUCCIN DE LOS ENZIMAS IMPLICADOS EN LA
DEGRADACIN DE COMPUESTOS
AROMTICOS 233
17.10 DEGRADACIN ANAEROBIA DE COMPUESTOS
AROMTICOS 234
17.10.1 Obtencin de metabolitos centrales a partir de
intermediarios activados 236
17.10.2 Fotometabolismo anaerobio 237
17.10.3 Catabolismo por desnitrificantes 238
17.10.4 Fermentacin 239
17.10.5 Degradacin por reductores de sulfatos 239
17.10.6 Metabolismo en condiciones
metanognicas 239
BIBLIOGRAFA 240

224 17.1 PROCESOS AEROBIOS Y ANAEROBIOS


Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y
COMPUESTOS C1 Las condiciones ms apropiadas para el ataque primario de los com-
Captulo 17: COMPUESTOS puestos aromticos son fundamentalmente aerobias. Por este motivo
AROMTICOS han sido extensamente estudiadas desde hace tiempo y las vas meta-
blicas establecidas parecen ser los modelos vlidos de la biodegrada-
cin de compuestos aromticos, tanto naturales como xenobiticos.
Por el contrario, el conocimiento de la degradacin anaerobia ha per-
manecido largamente restringido a los pocos datos que se posean rela-
tivos a los metangenos y a algunas bacterias fototrofas. En los ltimos
diez aos se han intensicado los esfuerzos destinados a comprender la
biodegradacin anaerobia de este tipo de compuestos orgnicos, tanto
desde el punto de vista taxonmico como desde el de las vas metabli-
cas implicadas, habindose llegado a la conclusin de que su importan-
cia en condiciones naturales debe ser realmente grande.

17.2 CARACTERSTICAS GENERALES DE LA DEGRADACIN AEROBIA

La mayor parte de la informacin disponible sobre la respiracin bac-


teriana de compuestos aromticos se ha derivado del estudio de espe-
cies del grupo Pseudomonas, pero, tambin puede ser llevada a cabo
por corineformes, actinomicetos y, posiblemente, por miembros del
gnero Spirillum y bacilos esporgenos facultativos.
De forma general, la degradacin aerobia de un compuesto arom-
tico implica la accin de mono- y dioxigenasas que lo transforman en
un fenol dihdrico. El nmero de este tipo de molculas es relativa-
mente pequeo en comparacin con la amplia variedad de sustratos
susceptibles de ser degradados.
Se trata, por tanto, de vas catablicas convergentes. Entre los
intermediarios a los que convergen tales vas, hay que considerar tres
como los ms frecuentes: el catecol, el protocatecuato y el gentisato.

OH HOOC OH OH COOH

OH OH OH
Catecol Protocatecuato Gentisato

Estos compuestos son el sustrato de dioxigenasas que provocan la


ruptura oxidativa del anillo aromtico (Lmina 9).

17.3 LA ORTO-RUPTURA DEL ANILLO BENCNICO

Es la forma ms general (g. 17.1). El producto de la oxidacin del


protocatecuato es lactonizado por la 4-carboxi-cis,cis-muconato-ciclo-
isomerasa (enzima lactonizante). La descarboxilacin ulterior con-
vierte la -carboxi-muconolactona en -ceto-adipato enol lactona
mediante la 4-carboxi-muconolactona descarboxilasa. Una hidrolasa
transforma este ltimo intermediario en -cetoadipato.

225
HOOC OH HOOC
O2 COOH 17.3 LA ORTO-RUPTURA DEL ANILLO
BENCNICO
Protocatecato COOH
OH 3,4-dioxigenasa

Protocatecuato -carboxi-
cido 3-carboxi-
cis,cis-mucnico

O
COOH
COOH

cido-cetoadpico
cido -cetoadpico

OH
O2 COOH
Catecol 1,2- COOH
OH dioxigenasa

Catecol cido cis,cis-


mucnico
Figura 17.1 Orto-ruptura del anillo bencnico.

HOOC HOOC CO2 O


COOH COOH COOH COOH
O O
COOH CO CO COOH

-Carboxi-cis,cis-
-
-Carboxi
-Carboxi- -Cetoadipato
-Ceto adipato -Cetoadipato
-
muconato muconolactona enol-lactona

Por lo que respecta al cis,cis-muconato, un enzima lactonizante


produce muconolactona que a su vez es convertida en -cetoadipato
enol lactona mediante una isomerasa:

O
COOH COOH COOH COOH
O O
COOH CO CO COOH
cis,cis Muconato
cis,cis-Muconato Muconolactona -
-Cetoadipato -
-Cetoadipato
enol-lactona

El -cetoadipato se convierte en acetil-CoA y succinil-CoA, lo cual


se lleva a cabo en dos etapas. La primera implica la formacin de -
cetoadipil-CoA a partir de succinil-CoA:

226
Succinil-CoA -
-Cetoadipato
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y
COMPUESTOS C1
Captulo 17: COMPUESTOS cido succnico -
-Cetoadipil-CoA
AROMTICOS
El -cetoadipil-CoA forma acetil-CoA y succinil-CoA gracias a la
acetil-CoA acil transferasa y HS CoA.
El ciclo completo puede esquematizarse de la siguiente forma:

-
-Cetoadipato

-
-Cetoadipil-CoA

HS CoA
HS CoA

Succinato Succinil-CoA Acetil-CoA Acetato

CAT

17.4 LA META-RUPTURA DEL ANILLO BENCNICO

Tanto el catecol como el cido protocatquico tambin son suscepti-


bles de una meta-ruptura que puede ser predominante en catecoles
sustituidos como el 3-metilcatecol. Los productos nales de esta va
son el piruvato y el acetaldehdo.
El catecol es roto por la catecol 2,3-oxigenasa, dando el semialde-
hdo del cido 2-hidroximucnico. La ruptura del anillo bencnico
no ocurre entre los dos hidroxilos, sino entre uno de stos y el
siguiente tomo de carbono.

CHO
OH
+ O2 COOH

OH OH
Catecol Semialdehdo del
cido 2-hidroximucnico
Una hidrolasa acepta una molcula de H2O y produce formiato y
2-cetopentano-4-enoato.
CHO H2O H H
COOH C COOH
HC CO
OH HCOOH C
H2
Semialdehdo del 2-Cetopentano-4-enoato
cido 2-hidroximucnico
El 2-cetopentano-4-enoato se hidroliza a 4-hidroxi-2-cetovalerato con 227
la 2-cetopentano-4-enoato hidratasa (1). Sigue la transformacin a 17.4 LA META-RUPTURA DEL ANILLO
piruvato y acetaldehdo por la 4-hidroxi-2-cetovalerato aldolasa (2): BENCNICO

COOH
H H
C COOH C O
(1) (2)
C CO CH2 CH3 CO COOH
CH C H2O
H2 HO CH CH3COH Piruvato
Acetaldehdo
2-Cetopentano-4-enoato CH2
4-Hidroxi-2-
cetovalerato

Esta meta-sin del anillo del catecol se encuentra en Pseudomonas


putida y Pseudomonas arvilla. En estas bacterias se lleva a cabo tambin
una va totalmente oxidativa del semialdehdo del cido 2-hidroximu-
cnico, que es la nica que tiene lugar en Pseudomonas acidovorans. En
ellas el semialdehdo del cido 2-hidroximucnico se oxida a 4-oxalo-
crotonato (forma enlica) por la semialdehdo del cido 2-hidroximuc-
nico deshidrogenasa que utiliza el NAD+. Mediante la 4-oxalocrotonato
tautomerasa se forma luego la forma cetnica del 4-oxalocrotonato, la
cual se descarboxila por la 4-oxalocrotonato descarboxilasa formndose
el 2-cetopentano-4-enoato.

OH
CHO
COOH COOH
COOH
OH
NAD+ NADH + H+
Semialdehdo del 4-Oxalocrotonato
cido 2-hidroximucnico (forma enlica)

O
CO2
H H
C COOH COOH
HC CO COOH
C
H2
2-Cetopentano-4-enoato 4-Oxalocrotonato
(forma cetnica)

La oxidacin meta del cido protocatquico es relativamente poco


conocida. En Pseudomonas desmolytica y Pseudomonas testosteroni se
forma el semialdehdo del cido 2-hidroxi-4-carboximucnico con la
protocatecuato 4,5-oxigenasa. Este intermediario debe seguir una
transformacin similar a la del semialdehdo del cido 2-hidroximu-
cnico.
228
OH COOH
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y
COOH
COMPUESTOS C1
Captulo 17: COMPUESTOS HOOC OH HOOC OH
AROMTICOS
cido protocatquico Semialdehdo del cido
2-hidroxi-4-carboximucnico

17.5 OXIDACIN DEL GENTISATO

El gentisato es el tercer tipo de intermediario de oxidacin de los


hidrocarburos aromticos. Esta va fue descubierta en Pseudomonas
acidovorans creciendo sobre m-hidroxibenzoato. La m-hidroxiben-
zoato-6-hidroxilasa lo convierte en gentisato
COOH COOH
OH
+ O2 + XH2

OH H2O + X OH
m-Hidroxibenzoato Gentisato

Este enzima es especco para la posicin 6. En Pseudomonas testoste-


roni se hidroxila el cido p-hidroxibenzoico en posicin 4 para dar
cido protocatquico.

Gentisato
COOH
OH

OH Piruvato
CH3 CO COOH
+ O2
COOH
HOOC H
O + H2 O
COOH HOOC C OH
HOOC HOOC CH2
O
Maleilpiruvato Maleato Malato

HOOC HOOC
CO COOH + H2O + CH3 CO COOH
COOH
OH
Fumarilpiruvato Fumarato Piruvato
Figura 17.2 Hidrlisis del maleilpiruvato y del fumarilpiruvato.
229
Fenilalanina Tirosina
Hidroxilasa de L-Aminocido
fenilalanina oxidasa
17.6 OXIDACIN DEL D-MANDELATO
D
Y OTROS PRECURSORES DEL CATECOL
cido p-hidroxifenilpirvico cido homogentsico
oxidasa
COOH
COOH
CH2
CH2 O
OH
Homogentisato
C O
oxigenasa
C
+ O2 OH
OH O
cido homogentsico cido 4-maleilacetoactico

COOH
CH2
CH3 CO CH2 COOH O
Acetoacetato + H2O
C O
C
+ OH
COOH CH CH COOH O
cido fumrico
cido 4-fumarilacetoactico
Figura 17.3 Oxidacin de la fenilalanina.

El gentisato es oxidado por la gentisato 1,2-dioxigenasa a maleilpi-


ruvato. La siguiente isomerizacin a fumarilpiruvato requiere una
concentracin elevada de glutatin reducido. En Pseudomonas acido-
vorans el maleilpiruvato es fundamentalmente hidrolizado a piruvato
y maleato que subsecuentemente se transforma en malato. En otras
especies de Pseudomonas que forman fumarilpiruvato ste se hidroliza
a fumarato y piruvato (g. 17.2).
Una va parecida es utilizada para la oxidacin de la fenilalanina
en la que se forma cido homogentsico, el cual se abre de la misma
forma a cido maleilacetoactico (g. 17.3).

17.6 OXIDACIN DEL D-MANDELATO Y OTROS PRECURSORES DEL


CATECOL

El D-mandelato es primero isomerizado a L-mandelato por una race-


masa (1). Luego es oxidado a benzoilformiato por la L-mandelato des-
hidrogenasa que utiliza NAD+ (2). La tercera etapa es una
descarboxilacin a benzaldehdo por la benzoilformiato descarboxi-
lasa (3). La cuarta etapa es una oxidacin ligada al NADP+ catalizada
por la benzaldehdo deshidrogenasa que forma benzoato (4). El ben-
zoato se transforma en catecol por la benzoato 1,2 dioxigenasa (5).
230 El benzoato es tambin el intermediario de la oxidacin del
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y tolueno y de alquilbencenos.
COMPUESTOS C1
Captulo 17: COMPUESTOS NAD+ NADH + H+ CO2
AROMTICOS (1) (2) (3)

OH C H H C OH C O CHO
COOH COOH COOH Benzaldehdo
D-Mandelato L-Mandelato Benzoilformiato NADP+

NADH + H+ H2O
CH3
(4)

Tolueno COOH
Benzoato

(5)
(CH2)n CH3

OH

Alquilbencenos
OH
Catecol

La reaccin (5) de la benzoato 1,2 dioxigenasa sigue el mecanismo


de dioxidacin:

COOH COOH COOH


O OH
O OH
+ O2
H H

cido benzoico cido 3,5-ciclohexadieno-


1,2-diol-1-carboxlico
NAD+

NADH + H+

OH
OH CO2

Catecol
Este enzima es anlogo al del que se requiere para la oxidacin del 231
benceno a catecol, en un proceso que no requiere de descarboxilacin: 17.7
17.7 OXIDACIN
OXIDACIN DELDEL
P-
p-HIDROXIBENZOATO
HIDROXIBENZOATO YY OTROS
OTROS

OH 2 H+ OH
O2 H
H
OH OH
Benceno cis-benceno
cis-Benceno dihidrodiol Catecol

Estas reacciones han sido estudiadas principalmente en extractos de


Acinetobacter calcoaceticus, Alcaligenes eutrophus, Azotobacter vinelandii
y varias especies de Pseudomonas. En miembros de este ltimo gnero
se ha podido estudiar la oxidacin del fenol, del cido antranlico y
del naftaleno a catecol:

COOH OH

NH2
cido antranlico Fenol

OH OH

COOH OH
Naftaleno cido saliclico Catecol

17.7 OXIDACIN DEL p-HIDROXIBENZOATO Y OTROS PRECURSORES DEL


CIDO PROTOCATQUICO

El p-hidroxibenzoato y otros compuestos aromticos dan -cetoadi-


pato despus de la orto-ruptura, pasando por el intermediario cido
protocatquico en lugar de catecol (g. 17.4). La primera reaccin es
una mono-oxigenacin con la 4-hidroxibenzoato-3-monooxigenasa
dependiente de FAD (1). Se forma 3,4 dihidroxibenzoato, el cual es
oxidado por la 3,4-dioxigenasa del cido protocatquico dando -car-
boxi-cis,cis-muconato (2). El mecanismo de esta reaccin es anlogo
al del catecol. Se realiza en Pseudomonas putida y de forma parecida en
Acinetobacter calcoaceticus.
El 2,4-xilenol tambin se oxida a cido protocatquico, como el
quinato, el siquimato y el vanilato. El toluato se oxida a p-hidroxiben-
zoato (g. 17.4).
232

Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y


COMPUESTOS C1 COOH
Captulo 17: COMPUESTOS
HOOC HO COOH
AROMTICOS

OH HO OH
CH3 OH
Toluato p-Hidroxibenzoato Quinato

(1)

CH3 COOH
HO HOOC OH

CH3 OH HO OH
OH
2,4-Xilenol Protocatecuato Siquimato

HOOC OCH3

OH
Vanilato

Figura 17.4 Oxidacin del p-hidroxibenzoato y otros precursores del cido pro-
tocatquico.

17.8 RELACIN ENTRE LAS DISTINTAS VAS AEROBIAS DE OXIDACIN DE


LOS COMPUESTOS AROMTICOS

Los diversos hidrocarburos aromticos pueden oxidarse aerobia-


mente hasta acetato y otros cidos que se oxidan en el CAT. El semial-
dehdo del cido 2-hidroxi-4-carboximucnico da productos nales
que tambin deben entrar en el mismo sistema de oxidacin termi-
nal.
CO2 233
Piruvato
17.9 INDUCCIN DE LOS ENZIMAS
+
Acetato CAT IMPLICADOS EN LA DEGRADACIN
Acetaldehdo DE COMPUESTOS AROMTICOS
CO2
Formiato

Semialdehdo del Semialdehdo del Piruvato CAT


cid o 2-hidroximucnico cido 2-hidroxi-4-
carboximucnico
meta-ruptura
meta-ruptura COOH
OH HOOC OH OH

OH OH OH
Catecol cido protocatquico Gentisato

orto-ruptura
orto-ruptura
Malato
O Fumarato
COOH +
COOH Piruvato

-Cetoadipato
- CO2

Succinil-CoA
Acetato
-Cetoadipil-CoA
-Cetoadipil-CoA

Acetil-CoA Succinato
CAT CAT

17.9 INDUCCIN DE LOS ENZIMAS IMPLICADOS EN LA DEGRADACIN DE


COMPUESTOS AROMTICOS
Los enzimas de las vas metablicas implicadas en la degradacin de
compuestos aromticos suelen ser inducibles y, corrientemente de
codicacin plasmdica. Teniendo en cuenta que en muchos casos las
vas catablicas son ramicadas, con intermediarios comunes a la
degradacin de molculas diferentes, la induccin de la sntesis de
enzimas especcos se realiza de ordinario de forma secuencial, en
funcin de la presencia de un determinado sustrato o intermediario
de la va. Adems, microorganismos diferentes presentan modelos de
regulacin diferentes. As, para la degradacin de protocatecuato
siguiendo la va del 3-oxoadipato en P. putida, el protocatecuato
induce el primer enzima, su oxigenasa. El resto de los enzimas es
inducido por el 3-oxoadipato (g. 17.5). En cambio, en Acinetobacter
el protocatecuato induce la totalidad de los enzimas. En la misma va,
la degradacin del catecol presenta una estrategia diferente: mientras
234
Protocatecuato Catecol
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y
COMPUESTOS C1 Protocatecuato cis,cis-Muconato
Captulo 17: COMPUESTOS
Protocatecuato cis,cis-Muconato
AROMTICOS

-Carboximuconato cis,cis-Muconato

3-Oxoadipato cis,cis-Muconato

Protocatecuato cis,cis-Muconato

-Carboximuconolactona Muconolactona

3-Oxoadipato cis,cis-Muconato

Protocatecuato cis,cis-Muconato

4-Oxoadipato enol-lactona
3-Oxoadipato 3-Oxoadipato

Protocatecuato cis,cis-Muconato

3-Oxoadipato
3-Oxoadipato 3-Oxoadipato

Protocatecuato cis,cis-Muconato

3-Oxoadipil-CoA

Succinato + Acetil-CoA
Figura 17.5 Esquema de la induccin de los enzimas de la va del
3-oxoadipato en Pseudomonas y Acinetobacter. A la izquierda se indican
los inductores cuando el sustrato es el protocatecuato (en rectngulo conti-
nuo, en Pseudomonas; en discontinuo, en Acinetobacter) y a la derecha los
inductores cuando el sustrato es el catecol.

que en P. putida es el cis,cis-muconato el inductor de la oxigenasa del


catecol y de los dos enzimas siguientes, siendo el 3-oxoadipato el
inductor de los restantes, en Acinetobacter es el cis,cis-muconato el
nico responsable de la induccin de todos los enzimas (g. 17.5).

17.10 DEGRADACIN ANAEROBIA DE COMPUESTOS AROMTICOS

A diferencia de la degradacin aerobia, en ambientes anaerobios la


degradacin de compuestos aromticos implica la reduccin de los
dobles enlaces del ncleo aromtico (Lmina 10).
235
Sustrato Sustrato
17.10 DEGRADACIN ANAEROBIA DE
COMPUESTOS AROMTICOS
I

O SCoA
C OH

Intermediarios aromticos centrales


OH

II REDUCCIN

O SCoA
C O

Compuestos alicclicos

III HIDRLISIS

Metabolitos centrales CH3 CO SCoA


Figura 17.6 Etapas de la degradacin anaerobia de compuestos aromti-
cos.

La degradacin anaerobia tiene lugar en tres etapas (g. 17.6). En


la primera de ellas, el sustrato ha de ser activado. Esta activacin
implica carboxilaciones, hidroxilaciones anaerobias o formacin de
tiosteres del correspondiente cido aromtico con el acetil-CoA. La
segunda etapa implica el ataque enzimtico mediante reductasas de
los intermediarios activados. Los compuestos alicclicos resultantes
son ulteriormente hidrolizados. Finalmente, los compuestos no ccli-
cos son convertidos en metabolitos centrales mediante vas metabli-
cas convencionales, y probablemente generan acetil-CoA y CO2.
Anaerobiamente, los compuestos aromticos pueden ser oxidados
a CO2 por cultivos puros de bacterias que realicen respiracin anaero-
236 bia (p. ej. del nitrato o del sulfato) o por bacterias fototrcas. En
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y cambio, las bacterias metangenas degradan los compuestos aromti-
COMPUESTOS C1 cos en cultivos mixtos.
Captulo 17: COMPUESTOS
AROMTICOS 17.10.1 Obtencin de metabolitos centrales a partir de intermediarios
activados
Los intermediarios aromticos activados que se encuentran en los
procesos anaerobios son en la mayora de los casos el benzoil-CoA, el
resorcinol y el oroglucinol. En la gura 17.7 se representa la trans-
formacin de algunos compuestos aromticos en tales intermediarios.
Por lo que respecta a la reduccin del anillo aromtico, en el caso
del benzoil-CoA se ha podido demostrar recientemente in vitro a par-
tir de una especie desnitricante de Pseudomonas. La reaccin, adems
del benzoil-CoA requiere agentes reductores fuertes tales como el Ti
(III), Na2SO4 o NaBH4. Los intermediarios en la degradacin del ben-
zoil-coA se representan en la gura 17.8. El ltimo compuesto alic-

O SCoA O SCoA
COOH C C
CO2 CoA 2 H+

(a)
ATP AMP + PP
H2O

OH OH OH
Fenol cido 4-hidroxi- Benzoil-CoA
benzoico

COOH OH
OH CO2

(b) OH
OH
cido 2,4-hidroxi- Resorcinol
benzoico
COOH OH
CO2

HO OH HO OH HO OH
(c) OH OH Floroglucinol
cido 3,4,5-hidroxibenzoico
Figura 17.7 Transformaciones de algunos compuestos aromticos en benzoil-CoA (a),
resorcinol (b) y oroglucinol (c).
O SCoA O SCoA O SCoA
C C C
O
+ H2O 2H

Benzoil-CoA Ciclo ex-1-eno- 2-Oxociclohexano-


carboxil-CoA carboxil-CoA

H2O

O SCoA O SCoA O SCoA


C C C

2H COOH
CO2 Acetil-CoA
HOOC
Crotonil-CoA Glutaril-CoA Pimelil-CoA

2 Acetil-CoA
Figura 17.8 Degradacin anaerobia del benzoil-CoA.

clico parece ser el 2-oxociclohexano-1-carboxil-CoA. Probablemente,


el mismo es hidrolizado a pimelil-CoA, el cual puede ser degradado
mediante -oxidacin a glutaril-CoA.
El oroglucinol resulta de la degradacin de algunas molculas
con estructura de trihidroxibenceno. Puede ser fcilmente reducido
mediante reductores dbiles. El producto nal es el acetil-CoA (g.
17.9a).
El resorcinol resulta de la degradacin de cidos dihidroxibenzoi-
cos y es reducido a 1,3-dioxiciclohexano por un Clostridium fermenta-
dor (g. 17.9b).

17.10.2 Fotometabolismo anaerobio


Las bacterias rojas no sulfreas (Rhodospirilaceae) utilizan compuestos
orgnicos como fuente principal de poder reductor y carbono para el
crecimiento. Algunas especies tambin pueden crecer aerobiamente
en la oscuridad a travs del metabolismo oxidativo de sustratos org-
nicos.
Rhodopseudomonas palustris puede utilizar el benzoato como nica
fuente de carbono y poder reductor en condiciones anaerobias. El
benzoato puede ser utilizado tambin aerobiamente, pero otros ben-
cenoides slo pueden ser degradados de una sola manera, bien sea por
respiracin o por fotometabolismo anaerobio. Los compuestos de la
va reductora de Dutton y Evans han sido identicados como inter-
237
OH O O
2H
(a)

HO OH HO O HO O
Floroglucinol Dihidrofloro-
glucinol

H2O

COOH
3 Acetil-CoA
HO O

cido carboxlico del


5-oxo-3-hidroxiciclohexano

OH O O
2H H2O
(b)

OH O O
Resorcinol Ciclohexano-1,3-dion

COOH
3 Acetil-CoA
O

cido carboxlico del 5-oxociclohexano


Figura 17.9 Degradacin del oroglucinol (a) y del resorcinol (b).

mediarios de la degradacin anaerobia del benzoato por R. palustris.


Los enzimas utilizados son inducidos por el sustrato y la reduccin
inicial se lleva a cabo por una reductasa acoplada a un componente
de bajo potencial redox del sistema de transporte de electrones indu-
cido por la luz, probablemente ferredoxina.

17.10.3 Catabolismo por desnitricantes


Algunas bacterias desnitricantes pueden crecer en condiciones anae-
robias con nitrato y utilizando un bencenoide como nico sustrato.
As, Tayor demostr que la cepa PN-1 de Pseudomonas puede crecer
sobre varios compuestos aromticos, tanto aerobia como anaerobia-
mente, respirando nitrato.
238
17.10.4 Fermentacin 239

17.10 DEGRADACIN ANAEROBIA DE


Recientemente se han descubierto bacterias anaerobias capaces de COMPUESTOS AROMTICOS
degradar compuestos aromticos, unas en cultivo puro y otras en con-
sorcio. En el primer caso tenemos especies del nuevo gnero Pelobacter
que fermentan cido glico, pirogalol, 2,4,6-trihidroxibenzoato o o-
roglucinol. Estos organismos no fermentan azcares ni compuestos
aromticos como el protocatecuato o el benzoato. Los productos na-
les de fermentacin de los compuestos aromticos citados son acetato
(3 mol) y CO2 (1 mol por mol de sustrato). En especies de Pelobacter y
Coprococcus la etapa inicial de la fermentacin del oroglucinol
parece ser una reduccin a dihidrooroglucinol dependiente del
NADH + H+.
Cultivos mixtos de Pelobacter acidigallici y de Acetobacterium woodii
convierten cuantitativamente el cido sirngico en CO2 y acetato, lo
cual no pueden hacer ninguno de ellos en cultivo puro. Cualquiera de
ellos cocultivado con Methanosarcina barkeri metaboliza completa-
mente algunos sustratos aromticos a CO2 y CH4.
Syntrophococcus sucromutans utiliza hidratos de carbono como
fuente de poder reductor y como aceptores nales de electrones al for-
miato y los grupos metoxilo de metoxibencenoides. En cocultivo con
Methanobrevibacter smithi, esta ltima bacteria acta como sistema
aceptor de electrones. Finalmente, Eubacterium oxidoreducens, aislada
del rumen, degrada galato, pirogalol y oroglucinol hasta acetato,
pero requiere hidrgeno o formiato como fuente de poder reductor.

17.10.5 Degradacin por reductores de sulfatos

Widdel aisl un nuevo reductor de sulfatos (Desulfonema magnum) de


sedimentos marinos capaz de mineralizar cidos grasos y benzoato a
CO2 en presencia de compuestos reducibles de azufre. Estos sustratos
se oxidan a expensas del sulfato, el cual es reducido estequiomtrica-
mente a SH2.

17.10.6 Metabolismo en condiciones metanognicas


Ya ha sido referido que las bacterias metangenas en cultivo puro slo
pueden utilizar sustratos muy sencillos y preferentemente CO2 e H2
(captulo 11). Sin embargo, la asociacin sintrca con microorganis-
mos fermentadores puede permitir la biodegradacin anaerobia de
una gran diversidad de sustratos orgnicos.
Desde hace tiempo se conoce la transformacin del benzoato y
otros compuestos aromticos a CH4 y CO2. En todo caso esta transfor-
macin es el resultado del consorcio de un metangeno y un fermen-
tador. Los intermediarios comprobados son el butirato, el propionato,
el acetato, CO2 e H2. Actualmente se cree que existe un proceso reduc-
tor que llevara al sustrato hasta ciclohexanona o ciclohexano car-
boxilato, los cuales permitiran la sin del anillo bencnico (Fig.
17.10).
CH2CH2COOH COOH COOH

-oxidacin
- 3 H2

Fenilpropionato

OH OH O
H2 3 H2
METANOGNESIS
H2O
OH
Catecol

CH2COOH CH2COOH O

3 H2 -oxidacin
-

Fenilacetato
Figura 17.10 Proceso reductor propuesto por Balba y Evans previo a la sin del anillo bencnico en con-
diciones metanognicas.

BIBLIOGRAFA
DAGLEY, S. Biochemistry of aromatic hidrocarbons in Pseudomonas (In the
Biology of Pseudomonas. Volum X. The Bacteria. J. R. SOCATCH ed.). Acade-
mic Press. 1986.
BERRY, D. F., FRANCIS, A. J. y BOLLAG, J. M. Microbial Metabolism of
Homocyclic and Heterocyclic Aromatic Compounds under Anaerobic Con-
ditions. Microbiological Reviews. 51, pp. 4395, 1987.
EVANS, W. C. y FUCHS, G. Anaerobic degradation of aromatic compounds.
Ann. Rev. Microbiol. 42, 289317, 1988.
RATLEDGE, C. (ed.). Biochemistry of Microbial Degradation. Kluwer Acade-
mic Publishers. 1994.
SPAIN, J. C. Biodegradation of nitroaromatic compounds. Ann. Rev. Microbiol.
49, 523555, 1995.

240
18 COMPUESTOS
NITROGENADOS

18.1 DIGESTIN DE PROTENAS Y PPTIDOS 242


18.2 DEGRADACIN OXIDATIVA DE LOS
AMINOCIDOS 242
18.2.1 Aminocido oxidasas 242
18.2.2 Deshidrogenasas 243
18.2.3 Aspartasa 243
18.3 OXIDACIN DE LA HISTIDINA 243
18.4 OXIDACIN DE LA HIDROXIPROLINA 244
18.5 OXIDACIN DEL TRIPTFANO 245
18.6 OXIDACIN DE LA TREONINA 248
18.7 OXIDACIN DE PURINAS Y PIRIMIDINAS 249
18.8 OXIDACIN DE LA VITAMINA B6 251
242 18.1 DIGESTIN DE PROTENAS Y PPTIDOS
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y En los hbitats naturales, la proteolisis es un proceso importante que
COMPUESTOS C1 produce aminocidos utilizables como fuente de energa o como
Captulo 18: COMPUESTOS
NITROGENADOS
subunidades para la biosntesis.
Muchos gneros de distintos grupos de bacterias son capaces de
producir enzimas proteolticos, generalmente exoenzimas, que difun-
den al medio exterior. sta es la causa de que frecuentemente se
encuentren altas concentraciones de aminocidos en los medios en
que se desarrollan bacterias.
Las proteasas naturales son ms activas frente a las protenas des-
naturalizadas que frente a las nativas. Muchas proteasas bacterianas
han sido cristalizadas. En el medio extracelular tambin se encuen-
tran peptidasas que hidrolizan los fragmentos oligopeptdicos resul-
tantes de la accin de las proteasas. Tambin se ha puricado una
serie de peptidasas bacterianas.
Es caracterstica la actividad proteoltica de los bacilos grampositi-
vos esporgenos, de algunos estreptococos y micrococos y de los
miembros del gnero Proteus.
De Bacillus subtilis se ha obtenido cristalizada una proteasa alcalina
llamada subtilisina que ha sido bien caracterizada. De la misma espe-
cie se ha aislado otra proteasa que acta a pH neutro y que contiene
zinc. La subtilisina ataca indistintamente los enlaces peptdicos inter-
nos y terminales y, por lo tanto, libera a la vez aminocidos y ppti-
dos. Al parecer, la clasicacin de varias proteasas bacterianas en
endopeptidasas y exopeptidasas no resulta adecuada.
Las peptidasas pueden localizarse tanto intracelular como extrace-
lularmente. En Lactobacillus casei y E. coli se encuentran peptidasas
intracelulares que aparentemente hidrolizan pequeos pptidos
tomados del medio exterior.
El transporte activo de pptidos y aminocidos al interior de la clula
bacteriana ha sido conclusivamente demostrado y tiene parecidos con
el transporte de azcares. Hay un grado notable de especicidad.

18.2 DEGRADACIN OXIDATIVA DE LOS AMINOCIDOS

Muchas bacterias aerobias y anaerobias facultativas, como las pseudo-


monas y las enterobacterias, son capaces de oxidar protenas y ami-
nocidos en condiciones aerobias y de utilizarlos como nica fuente
de carbono, nitrgeno y energa.
La oxidacin de los aminocidos, as como la de otras sustancias
nitrogenadas, suele producir la liberacin de todo el nitrgeno en
forma de amonaco. Se conocen varios tipos de desaminacin segn
el aminocido y la especie bacteriana. En la respiracin anaerobia con
NO3 o SO42 tienen lugar procesos semejantes y en algunos casos hay
reacciones fermentativas comunes (captulo 10).

18.2.1 Aminocido oxidasas


Son avoprotenas con un potencial redox de 0,004 V que estn impli-
cadas en la primera etapa de oxidacin de muchos aminocidos, espe-

cialmente D-aminocidos. En los L-aminocidos generalmente hay una 243


reaccin de transaminacin antes de la reaccin de liberacin de NH3. 18.3 OXIDACIN DE LA HISTIDINA
Las L- y D-aminocidos oxidasas catalizan la reaccin

R H2O2 + H+ R H2O + H+ R
+H
3N CH + O2 HN C O C + NH4+
COOH COOH COOH

El iminocido se hidroliza espontneamente.


Existen -D-aminocido oxidasas que actan sobre varios amino-
cidos y otras como la glicina oxidasa que son especcas.
La sntesis de -D-aminocido oxidasas se suprime tan pronto
como un segundo sustrato energtico como glucosa o succinato se
halla al alcance de la bacteria.

18.2.2 Deshidrogenasas

La glutamato deshidrogenasa y la alanina deshidrogenasa son dos


enzimas ligados al NAD+ o al NADP+ que convierten al respectivo sus-
trato en cido -cetoglutrico y pirvico y liberan NH3. El oxgeno no
es esencial.

NH+3 O
H C COOH Glutamato C COOH
deshidrogenasa
+
CH2 +NAD+ + H2O NH4 + CH2 + NADH + H+
CH2 (o NADP+) CH2 (o NADPH + H+)

COOH COOH
Glutamato -Cetoglutarato
-

NH+3 Alanina O
deshidrogenasa
+
H C COOH + NAD+ + H2O NH4 + C COOH + NADH + H+
CH3 CH3
Alanina Pirvico

18.2.3 Aspartasa
Cataliza la desaminacin del cido asprtico a cido fumrico y NH3.

COOH CH CH2 COOH HOOC CH CH COOH + NH3


NH2

18.3 OXIDACIN DE LA HISTIDINA

La utilizacin de la histidina est muy extendida dentro de los micro-


organismos, y existen muy pocas diferencias entre la utilizacin aero-
bia y la anaerobia.

244 La histidina es primero desaminada hasta cido urocnico por la


Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y histidina-amonaco-liasa (1). La urocanasa (urocanato hidratasa), que
COMPUESTOS C1 presenta fotoactivacin, convierte el cido urocnico en la imidazo-
Captulo 18: COMPUESTOS lona del cido propinico (2). La ruptura del anillo tiene lugar va
NITROGENADOS imidazolona propionasa, formndose formiminoglutmico (3). Una
segunda hidrolasa escinde la molcula en cido glutmico y forma-
mida (formimino glutamasa) (4). Como ya ha sido referido anterior-
mente, el cido glutmico puede ser desaminado a -cetoglutrico y
ste descarboxilado a succnico dentro del CAT.

H NH3 H
C C
N NH N NH
(1)
HC C CH2 CH COOH HC C CH CH COOH
NH2
Histidina cido urocnico

H2O
(2)

H
HN CH H2O C
(3) N NH
NH
C C CH2 CH2 COOH
HOOC CH CH2 CH2 COOH
O
Formiminoglutmico Imidazolona del cido propinico
O
(4)
HC NH2 Formamida

NH2 NH3 O CO2

HOOC CH CH2 CH2 COOH HOOC C CH2 CH2 COOH HOOC CH2 CH2 COOH
+ H2O + H2O
cido glutmico 2H
-Cetoglutrico
- 2H cido succnico

La formamida genera cido frmico y NH3.


En las pseudomonas el cido urocnico es el inductor y el cido suc-
cnico es un inhibidor de retroaccin. En las enterobacterias tambin es
el cido urocnico el principal inductor, pero la histidina amonaco-
liasa se produce en cantidades muy dependientes de factores ambienta-
les y existe un sistema de control catablico regulado por la glutamina
sintetasa. En Bacillus subtilis el inductor siolgico es la histidina.

18.4 OXIDACIN DE LA HIDROXIPROLINA

La hidroxiprolina puede ser oxidada por Pseudomonas putida, P. con-


vexa y P. uorescens formando -cetoglutarato. La primera reaccin es
catalizada por una 2-epimerasa que convierte la hidroxiprolina en D-
alo-hidroxiprolina (1). El siguiente paso es una oxigenacin que lleva
a la formacin del 1-pirrolina-4-hidroxi-2-carboxilato (2). Este com-
puesto se desamina y forma -cetoglutarato.
245
HO HO O2
HO
18.5 OXIDACIN DEL TRIPTFANO

N (1) N (2) N
COOH COOH COOH
H H
Hidroxiprolina D-alo-Hidroxiprolina 1-Pirrolina-4-hidroxi-2-
carboxilato

NH4+

NADPH + H+ NADP+
O H2O O
COOH CH2 CH2 C COOH HOC CH2 CH2 C COOH
-Cetoglutarato
- Semialdehdo del cido cetoglutrico

Los dos epmeros son inductores coordinados de todo el sistema, el


cual es insensible a la represin catablica.

18.5 OXIDACIN DEL TRIPTFANO

Se distinguen varios grupos de pseudomonas segn la va degradativa


del triptfano utilizada:

I II III IV
Grupo armatico Grupo quinolina Grupo aromtico racemasa Grupo quinazolina
P. fluorescens P. acidovorans P. aeruginosa

L-Triptfano L- y D-Triptfano L- y D-Triptfano L-Triptfano

O2
(L)
Formil-L-quinurenina Formil-D-quinurenina cido antranlico Formilquinurenina

L-Quinurenina (L- o D-) Quinurenina Formilaminoacetofenona


O2

cido antranlico cido 7,8-Dihidroxiquinurnico Aminoacetofenona


+ alanina
O2
2-Cetoglutarato Quinazolina
Catecol +
NH3
O2
+
Oxalacetato
Succinato
+
Acetil-CoA

El primer grupo metaboliza el triptfano a catecol va cido antra-


nlico. Es representativo P. uorescens.

O
H H H H
O2 C
C C COOH
C C COOH
Triptfano
H NH2
H NH2 2,3-dioxigenasa
NH NH C O
H
L-Triptfano O Formil-L-quinurenina
H H
C COOH
HCOOH C C COOH
+ H2O
H NH2 + CH3 CH COOH
quinenurinasa
H2O
NH2 NH2 NH2
Quinurenina
formamidasa L-Quinurenina cido antranlico Alanina

El cido antranlico es descarboxilado y desaminado por incorpo-


racin de dos tomos de oxgeno mediante una dioxoquinasa dando
catecol, cuya oxidacin ya ha sido estudiada.
El segundo grupo de pseudomonas est representado por P. acidovo-
rans. El D y L-triptfano es metabolizado por sus respectivas oxigenasas
estereoespeccas y la quinurenina formamidasa a cido D- o L-quinur-
nico. ste se convierte en cido 7,8-dihidroxiquinurnico mediante la
quinurenato 7,8-hidroxilasa. Los productos nales de la utilizacin de
este intermediario son -cetoglutarato, oxalacetato y amonaco, pero
las etapas individuales de la va no han sido an dilucidadas.

O O
H NH2 H H
C C
C C COOH C C COOH
H H H NH2
NH2 NH2
D-Quinurenina L-Quinurenina

O OH OH
H O
C O2
C C COOH
H
N COOH OH N COOH
NH2
OH
cido quinurnico cido 7,8-dihidro-
xiquinurnico


-Cetoglutarato
-
+
Oxalacetato
+
NH3

246
El tercer grupo llamado aromtico racemasa, degrada el D y L- 247
triptfano va cido antranlico, como el primer grupo, pero tiene la 18.5 OXIDACIN DEL TRIPTFANO
triptfano racemasa que le hace capaz de atacar los dos ismeros.
Un cuarto grupo est caracterizado por P. aeruginosa. Los metaboli-
tos de esta va se conocen, pero hasta el momento no se han descrito
las enzimas. Es posible que la 4-metilquinazolina sea ulteriormente
hidroxilada para permitir el ataque dioxigensico. Se han identicado
los intermediarios sealados a continuacin pero no se han aislado
las enzimas ni se conocen los productos nales.

H H
O2
C C C COOH
CH2 CH COOH
O H NH
NH2 2
N N CH
H H O
HCOOH
L-Triptfano N-Formilquinurenina

+ H2
Glicina

C CH3 CH3
CH3
O C
N O
NH2
CH
o-Aminoacetofenona N NH O
4-Metil-
quinazolina N-Formilamina
acetofenona
CH3 CH3
C
O N
O
N
H
C R
N R ?
o-Acilaninoacetofenona 4-Metil-2-alquilquinazolina

Estas vas son caractersticas de la oxidacin del triptfano por los


gneros Pseudomonas y Flavobacterium y son completamente distintas
de las correspondientes al metabolismo del triptfano en los tejidos
de los mamferos. En Streptomyces y Bacillus cereus el D-triptfano se
metaboliza por la va del cido antranlico y juega un importante
papel durante la esporulacin.
En las pseudomonas que tienen varias posibilidades de oxidar el
triptfano hay una regulacin monocoordinada.
248 18.6 OXIDACIN DE LA TREONINA
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y
COMPUESTOS C1 Pueden distinguirse varios tipos:
Captulo 18: COMPUESTOS
1. Pseudomonas.
NITROGENADOS

CH3 COH CH3 COOH


CH3 CHOH CH COOH Acetato
NH2 CH2 COOH
Treonina NH2
Glicina

Serina hidroximetiltransferasa

2. Arthrobacter.

Acetil-CoA
Treonina CH3 CO CH COOH
NAD+ NADH + H+ NH2 Glicina
-
-Amino--cetobutirato
-
L-Treonina deshidrogenasa

3. Pseudomonas oxalaticus. La glicina se transforma en glioxilato el


cual, despus de una serie de transformaciones, se incorpora al
CAT (g. 18.1).

NAD+ NADH + H+
CH2 COOH
CHO COOH
NH2
H2O NH3
Glicina Glioxilato
(1)

TPP, FAD+, Mp2+


2 CHO COOH CHO CHO COOH
Glioxilato CO2 Semialdehdo tartrnico

(2)

Semialdehdo tartrnico Glicerato 3 P -glicerato


Piruvato Acetil CoA + CO2

Acetil CoA + Glioxilato Malato CAT


(3)
Figura 18.1 Degradacin de la glicina por P. oxalaticus. (1) Glicina ami-
notransferasa; (2) glioxilato carboligasa; (3) malato sintasa. Ntese que cada
dos molculas de glioxilato que se transforman en acetil-CoA permiten la
entrada de una tercera al CAT.
Algunos microorganismos carecen de glioxilato carboligasa, 249
pero disponen de una serina-glioxalato aminotransferasa, que 18.7 OXIDACIN DE PURINAS Y
les posibilita sintetizar piruvato a partir de la glicina: PIRIMIDINAS

THF
C1-THF + Glicina Serina Piruvato

En B. subtilis, el -amino--cetobutirato procedente de la fermen-


tacin de la treonina se convierte en aminoacetona (g. 18.2).

(1) (2)
CH3 CO CH COOH CH3 CO CH2 CH3 CO CH3
CO2
NH2 NH2 Metilglioxal

Aminoacetona

CAT Piruvato Lactaldehdo


Figura 18.2 Transformacin del -amino--cetobutirato por B. subtilis. (1) Ami-
noacetona carboxilasa; (2) Aminoacetona transferasa.

18.7 OXIDACIN DE PURINAS Y PIRIMIDINAS

La oxidacin purnica que ms se conoce es la del cido rico. En el


gnero Pseudomonas hay una primera etapa comn a varias especies
que conduce a la formacin de cido alantoico

O
H O H
C N O2 N
HN C H2N C
C O C O
C C C C
O N N O N H N H2O
CO2
H H H H
cido rico Alantona

H2N NH2
O C COOH C O
HN C NH
H
cido alantoico

La primera reaccin es catalizada por la uratooxidasa y la segunda


por la alantoinasa.
El grupo Pseudomonas aeruginosa, P. uorescens y P. putida convierte
el cido alantoico en cido ()-ureidogliclico y urea en una sola
250 etapa con la alantoicasa. Una segunda molcula de urea es liberada
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y por la accin de la ()-ureidoglicolato liasa, dando adems glioxilato
COMPUESTOS C1
Captulo 18: COMPUESTOS O Urea O Urea
NITROGENADOS
H2N NH2 H2N C NH2 NH2 H2O C NH2

O C COOH C O COOH C O COOH


Alantoicasa
HN C NH HOC NH HC O
H H
cido alantoico cido ()-ureido- cido
gliclico glioxlico

Pseudomonas acidovorans no tiene alantoicasa pero posee una alan-


toato-amidohidrolasa que transforma el cido alantoico en cido (+)-
ureido-gliclico, NH3 y CO2. Se ha postulado que en esta conversin
la ureidoglicina es un intermediario. El cido (+)-ureidogliclico es
metabolizado a cido glioxlico y urea por la (+)-ureidoglicolato liasa.
Es la misma va utilizada por Streptococcus alantoicus para la degrada-
cin de la () alantona.

H2N NH2 H2N


O C COOH C O O C COOH + NH3 + CO2
HN C NH HN C NH2
H H
cido alantoico Ureidoglicina

O Urea
H2N C NH2 H2N
COOH O C COOH + NH3
HC O HN COH
H
cido glioxlico cido (+)-ureidogliclico

En E. coli y Arthrobacter alantoicus se utiliza una tercera va en la


cual el cido alantoico es transformado a ()-ureidoglicolato con la
liberacin de dos moles de NH3 y un mol de CO2 por la accin de la
alantoatoamidohidrolasa. El cido ()-ureidogliclico se transforma
en cido glioxlico y urea como en los casos anteriores.
El uracilo se transforma en cido barbitrico por una reaccin mono-
oxigensica. La barbiturasa hidroliza el barbitrico a urea y cido mal-
nico. La degradacin del uracilo ha sido estudiada en Mycobacterium

HN C O HN C O H2N COOH
O C CH O C CH2 O C + CH2
HN CH HN C O 2 H2O H2N COOH
Uracilo cido barbitrico Urea cido
malnico
El cido malnico se convierte en acetato ms CO2. Tambin 251
en Mycobacterium se ha comprobado que la timina se oxida a B6
18.8 OXIDACIN DE LA VITAMINA B6
cido 5-metilbarbitrico.

18.8 OXIDACIN DE LA VITAMINA B6

Se conocen dos vas segn sea la piridoxina o la piridoxamina la


nica fuente de carbono utilizada (g. 18.1). Se han estudiado en
miembros del gnero Pseudomonas.
La piridoxina se oxida mediante una piridoxina-5-deshidrogenasa
dependiente de FAD que utiliza 2,6 dicloroindofenol como aceptor de
electrones. Se forma isopiridoxal. Se ha encontrado otro enzima dis-
tinto que tambin es dependiente de FAD, la piridoxina-4-oxidasa, que
cataliza la conversin de piridoxina a piridoxal. El isopiridoxal es des-
hidrogenado a 5-piridoxilactona que rpidamente se transforma en
cido 5-piridxico. A este nivel se abre el anillo con la 5-piridoxato
dioxigenasa formndose -hidroxilmetil- -(N-acetilaminometilen)-
succnico. Ulteriormente se forma acetato, CO2, NH3 y 2-hidroximetil-
semialdehdo succnico.
La segunda va comprende una primera reaccin en la que la piri-
doxamina produce piridoxal, convirtiendo al mismo tiempo piruvato
en alanina. Es una reaccin de transaminacin. Sigue la formacin de
la 4-piridoxilactona por una piridoxal deshidrogenasa dependiente de
NAD+, la cual se hidroliza a cido 4-piridxico. A diferencia del cido
5-piridxico el cido 4-piridxico no puede ser atacado por una oxi-
genasa. El grupo alcohlico es oxidado en dos etapas a carboxilo for-
mndose el cido 2-metil-3-hidroxipiridina-4,5-dicarboxlico. La
descarboxilacin de este ltimo produce el cido 2-metil-3-hidroxipi-
ridina-5-carboxlico. ste puede ser atacado por una dioxigenasa que
rompe el anillo dando el cido -(N-acetilaminometilen)-succnico.
Esta reaccin requiere NADH + H+. La hidrlisis subsecuente produce
acetato, CO2, NH3 y semialdehdo succnico.
Una y otra va pueden ser utilizadas por distintas especies de Pseu-
domonas. Ambas se esquematizan en el mapa metablico de la gura
18.1 (pgina siguiente).
CH2OH CH2NH2
OH CH2OH OH CH2OH

CH3 N CH3 N
Piridoxina Piridoxamina
NAD+ Piruvato

NADH + H+ Alanina

CH2OH CHO
OH CHO OH CH2OH

CH3 N CH3 N
Isopiridoxal Piridoxal
X NAD+

XH2 NADH + H+

O
H2C O C O
OH C O OH CH2

CH3 N CH3 N
5-Piridoxolactona 4-Piridoxolactona
H2O

CH2OH COOH
OH COOH OH CH2OH

CH3 N CH3 N
5-Piridxico 4-Piridxico
O2 NADPH + H+ X

NADP+ XH2

HOOC CH2OH COOH


C COOH OH
H CHO
O
C
CH3 N N
H CH3
-Hidroximetil
- 2-Metil-3-hidroxi-
-(N-acetilamino-
- 5-formilpiridona-4-carboxlico
metilen)-succnico

COOH
CH3 COOH + CO2 + NH3 OH CO2 OH
COOH COOH
+ O CH CH2 CH COOH
CH2OH
CH3 N CH3 N
2-Hidroximetil 2-Metil-3-hidroxi- O2
semialdehdo succnico piridina-4,5-dicarboxlico NADH + H+

NAD+
H2
C
C COOH
H2O
HOOC NH3 + CH3 COOH + CO2
O
C CH O CH CH2 CH2 COOH
CH3 N
H Semialdehdo succnico
Figura 18.1 Vas de oxidacin de la -(N-Acetilamino-
-
vitamina B6. metilen)-succnico
252
19 COMPUESTOS C 1 COMO
SUSTRATOS

19.1 CRECIMIENTO SOBRE COMPUESTOS DE UN SOLO


TOMO DE CARBONO 254
19.2 CICLO REDUCTOR DE LAS PENTOSAS 254
19.3 UTILIZACIN DEL FORMIATO POR EL CICLO DE
CALVIN 257
19.4 CICLO REDUCTOR DEL CIDO
TRICARBOXLICO 258
19.5 FIJACIN DE CO2 EN CHROMATIUM 259
19.6 BACTERIAS METILOTROFAS 260
19.7 OXIDACIN DEL METANO 263
19.8 VAS DE LA RIBULOSA-5-P Y DE LA SERINA 265
19.9 CRECIMIENTO SOBRE METILAMINA 267
BIBLIOGRAFA 268
254 19.1 CRECIMIENTO SOBRE COMPUESTOS DE UN SOLO TOMO DE
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y
CARBONO
COMPUESTOS C1 Los organismos que pueden desarrollarse utilizando como fuente de
Captulo 19: COMPUESTOS C1 COMO carbono un sustrato constituido por molculas que contienen un solo
SUSTRATOS
tomo de carbono (C1), se caracterizan por su capacidad de transfor-
mar dicho sustrato en compuestos de tres tomos de carbono (C3)
(Lmina 11). La maquinaria biosinttica con la cual estos organismos
transforman los compuestos C3 en todas las dems subunidades nece-
sarias para la sntesis de los componentes celulares no es diferente de
la de otros microorganismos.
La asimilacin de CO2 mediante el ciclo de la ribulosa difosfato, que
ya hemos citado repetidamente, fue la primera sntesis absoluta de com-
puestos C3 a partir de compuestos C1 que se analiz y, por ello, constituye
la base del concepto de desarrollo autotrco. El ciclo de la ribulosa difos-
fato es una va metablica comn en muchos organismos que pueden
desarrollarse indenidamente utilizando CO2 como nica fuente de car-
bono, pero es menos frecuente en aquellos otros que utilizan compuestos
C1 ms reducidos. En este caso, podemos distinguir organismos que con-
servan cierto grado de reduccin del compuesto de carbono de otros que
primeramente lo oxidan hasta CO2 para luego reducirlo a (CH2O)n.
La utilizacin de CO2 como nica fuente de carbono est amplia-
mente distribuida y constituye la caracterstica del desarrollo autotrco
de algas, cianobacterias y muchas bacterias fototrofas y quimiolitotrofas.
Tambin hay que mencionar a los organismos que utilizan CO2
formado a partir de compuestos ms reducidos, como el propio
metano. Asimismo, ha sido referido que las bacterias acetgenas (cap.
8) y las metanognicas (cap. 11) pueden crecer a partir de CO2, pero
no a travs de intermediarios C3, sino del acetil-CoA. Este tipo de
autotrosmo no ser considerado en este captulo.
19.2 CICLO REDUCTOR DE LAS PENTOSAS
La reduccin del CO2 tiene lugar en una secuencia cclica conocida
con el nombre de ciclo de Calvin, cuyo balance es:
+ 12 H O
6 CO2 + 18 ATP + 12 (NADPH + H+) 2

C6H12O6 + 18 ADP + 12 NADP+ + 18 Pi


La incorporacin del CO2 se lleva a cabo en la reaccin de la ribu-
losa difosfato carboxilasa:
CH2 O H2PO3
CH2 O H2PO3 H C OH
CO COOH
+
H C OH + CO2
COOH
H C OH H C OH
CH2 O H2PO3 CH2 O H2PO3
D-Ribulosa-1,5-difosfato 3-Fosfoglicerato
(RuPP) (PG)
La reaccin siguiente requiere energa que proviene del ATP y est 255
catalizada por la fosfoglicerato quinasa. 19.2 CICLO REDUCTOR DE LAS
PENTOSAS

CH2 O H2PO3 CH2 O H2PO3


CHOH + ATP CHOH + ADP
CHOH CO O H2PO3
3-Fosfo-D-glicerato 1,3-Difosfo-D-glicerato
(1,3-PPG)

Esta reaccin tiene lugar en la va de Embden-Meyerhof pero en


sentido inverso, al igual que la siguiente, en la que el 1,3-difosfo-D-gli-
cerato se reduce a 3-fosfogliceraldehdo mediante la gliceraldehdo
fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP+. Sin embargo, en la va
de Embden-Meyerhof la gliceraldehdo fosfato deshidrogenasa no uti-
liza NADP+ sino NAD+.
Estas reacciones son dos fases esenciales de la asimilacin del CO2:
la jacin por el sistema de la ribulosa difosfato carboxilasa y la
reduccin del 1,3-difosfo-D-glicerato.
El resto de las reacciones del ciclo de Calvin son comunes al ciclo
de la hexosa monofosfato con una caracterstica adicional que es la
formacin del aceptor de CO2, esto es, la regeneracin de la Ribulosa-
1,5-difosfato (Ru-1,5-PP).
La ribulosa-5-fosfato forma Ru-1,5-PP con ATP por la reaccin de la
fosforribulosa quinasa:

CH2OH CH2 O H2PO3


C O C O
H C OH + ATP H C OH + ADP
H C OH H C OH
CH2 O H2PO3 CH2 O H2PO3
Ribulosa-5-fosfato Ribulosa-1,5-difosfato
(Ru-1,5-PP)

El ciclo completo se esquematiza en las guras 19.1 y 19.2. Las


reacciones caractersticas de este ciclo son la jacin de CO2 y la rege-
neracin de ribulosa-1,5-difosfato. Por lo tanto, si consideramos que
el ciclo de Calvin es comn a muchos organismos auttrofos, su iden-
ticacin estar vinculada a la presencia de fosforribulosa quinasa y
de ribulosa-1,5 difosfato carboxilasa. Naturalmente estas dos reaccio-
nes no estn directamente relacionadas ni con la fuente de ATP ni
con la fuente de poder reductor, ambas necesarias para que el ciclo sea
funcional. El ATP y el poder reductor pueden provenir de distintos
tipos de mecanismos.
256
CO2
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y
COMPUESTOS C1
Captulo 19: COMPUESTOS C1 COMO
SUSTRATOS Ru-1,5-PP 2 x PG

2 x 1,3-di-PG

Ru-5P
2 x GA-3P

Figura 19.1 Reacciones del ciclo de Calvin. Las reacciones resumidas en


A corresponden a las transformaciones caractersticas de la va de las pento-
sas.

CO2

Ru-1,5-PP PG
*
ATP
ADP
*
ATP ADP

1,3-PPG
Ru-5-P Ru-5-P
NADPH + H+

Pi NADP+

GAP DAP
Xu-5-P Xu-5-P

R-5-P E-4-P
F-1,6-PP

Pi
S-7-P

GAP F-6-P

Figura 19.2 Ciclo de Calvin. Las reacciones caractersticas jacin de


CO2 y regeneracin de ribulosa-1,5-difosfato se indican con un asterisco (*).

El control de la actividad enzimtica en el ciclo de Calvin est


determinado primariamente por el NADPH + H+. En la fotosntesis
anoxignica se utiliza el NAD+ reducido en lugar del NADP+, que es
quizs la diferencia esencial del ciclo reductor de la hexosa monofos-
fato con respecto al que acta en la fotosntesis oxignica. El NADH +
H+ acta como efector positivo de la fosforribulosa quinasa en P. faci-
lis y en otros quimiolitotrofos. Este enzima es inhibido por el AMP y
por el PEP. En P. facilis la acumulacin de PEP impide totalmente la 257
formacin de ribulosa-1,5-difosfato. 19.3 UTILIZACIN DEL FORMIATO
La ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa aislada de distintas bacterias POR EL CICLO DE CALVIN
fototrofas o quimiolitotrofas diere en su composicin. Este enzima se
descompone en subunidades grandes, de alrededor de 54000 daltons, y
subunidades pequeas, de alrededor de 13 000 daltons. Algunos orga-
nismos contienen una carboxilasa constituida por ocho subunidades
grandes y ocho subunidades pequeas como Alcaligenes eutrophus y P.
facilis. En Thiobacillus intermedius slo est constituida por ocho unida-
des grandes. En Rhodospirillum rubrum se ha encontrado, sorprendente-
mente, que slo contiene dos subunidades grandes. En todo caso, es
evidente que la actividad cataltica depende de la subunidad de mayor
peso molecular, la cual constituye el elemento constante. La funcin de
las subunidades de menor peso molecular an no ha sido determinada.
La ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa slo tiene el sentido funcional
asignado en un sistema en el que se hallen presentes Mg2+, ribulosa-
1,5-difosfato y CO2. En ausencia de este ltimo y en condiciones
aerobias, el mismo enzima cataliza la ruptura de la ribulosa-1,5-difos-
fato segn la reaccin:

CH2O P
C O O2 COOH
CH2O P
H C OH + H COH
COOH
H C OH CH2O P
CH2O P

El fosfoglicolato es convertido en glicolato por una fosfatasa, el cual


es excretado por muchas bacterias quimiolitotrcas y fototrcas.
La ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa es inhibida activamente por el
fosfogluconato. Este compuesto es un intermediario del ciclo de la
hexosa monofosfato que utilizan los quimiolitotrofos facultativos
cuando stos se encuentran en presencia de un azcar fermentable,
con lo cual se inhibe el ciclo de Calvin.

19.3 UTILIZACIN DEL FORMIATO POR EL CICLO DE CALVIN

Cuando P. oxalaticus crece sobre formiato utiliza el ciclo de Calvin. Este


organismo contiene una deshidrogenasa frmica particulada que es res-
ponsable de la oxidacin del formiato a CO2. El crecimiento de Bacterium
formoxidans sobre formiato puede considerarse similar al de P. oxalaticus.
Rhodopseudomonas palustris es capaz de crecer sobre formiato,
anaerobiamente y en presencia de luz. Se ha podido demostrar que
antes de la asimilacin del carbono del sustrato ste pasa por el estado
de CO2. Mediante experimentos en los que se suministra 14CO2 a
intervalos de tiempo sucesivamente ms cortos se ha encontrado un
modelo de jacin caracterstico del ciclo de la ribulosa difosfato. Por
otra parte, los extractos libres de clulas obtenidos de estos organis-
258 mos, cuando crecen fotosintticamente sobre formiato, contienen los
Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y dos enzimas clave del ciclo de Calvin. En otros casos no es seguro que
COMPUESTOS C1 la asimilacin fototrca del formiato est ligada, por lo menos exclu-
Captulo 19: COMPUESTOS C1 COMO sivamente, al ciclo de Calvin. El hecho de que el carbono marcado se
SUSTRATOS acumule principalmente en el glutamato y otros aminocidos, como
ocurre en alguna cepa del mismo Rhodopseudomonas palustris, sugiere
la intervencin exclusiva o dominante del ciclo de Arnon. En otros
casos pueden formarse reservas orgnicas que posteriormente podrn
ser utilizadas como fuente del poder reductor necesario para asimilar
el CO2, como posiblemente ocurre en Rhodopseudomonas palustris.
Independientemente, una parte del sustrato da lugar al CO2 que ali-
menta a la reaccin de la ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa.

19.4 CICLO REDUCTOR DEL CIDO TRICARBOXLICO

Evans, Buchanan y Arnon propusieron un nuevo ciclo metablico


mediante el cual se obtiene una ganancia neta de carbono a partir de
CO2. En dicho ciclo existen dos reacciones fundamentales: por una
parte la catalizada por la piruvato sintasa.

Acetil-CoA + CO2 + Ferredoxina red.


Piruvato + HS CoA + Ferredoxina oxid.
y por otra, la de la 2-oxoglutarato sintasa

Succinil-CoA + CO2 + Ferredoxina red.


2 -Oxoglutarato CoA + Ferredoxina oxi.
Estas reacciones hacen reversible el ciclo del cido tricarboxlico,
dando lugar a la sntesis de una molcula de oxalacetato a partir de
cuatro molculas de dixido de carbono. El acetil-CoA, que acta
como aceptor primario de CO2, se regenera a partir de acetato, ATP y
HS CoA. El ciclo se esquematiza en la gura 19.3.
Este ciclo se conoce tambin con el nombre de ciclo de Arnon.
Suministrando 14CO2 a intervalos sucesivamente ms cortos, el pri-
mer producto marcado que aparece es el glutamato (75% del carbono
ligado despus de 30 segundos). Este ciclo es operativo en algunas
bacterias fototrofas y en algunas bacterias anaerobias.
Todos los enzimas del ciclo de Arnon se han identicado en extractos
de Chlorobium thiosulfatophilum o de Rhodospirillum rubrum. Aunque la
velocidad de jacin del CO2 es proporcional a la concentracin media
de los mismos, algunos de ellos se encuentran a concentraciones muy
bajas que probablemente no representan la actividad que tiene lugar en
la clula entera, sobre todo en organismos que presentan algunas de-
ciencias en el ciclo reductor de la pentosa fosfato y que deben utilizar el
ciclo de Arnon como base fundamental para el desarrollo autotrco.
Chlorobium thiosulfatophilum contiene todos los enzimas del ciclo
reductor de la pentosa fosfato, pero un 75% del 14CO2 jado en las
primeras muestras se encuentra en el glutamato. La importancia rela-
tiva de las dos vas de jacin no est totalmente aclarada, pero es
Oxalacetato 259
Citrato H2O
19.5 FIJACIN DE CO2 EN
cis-Aconitato CHROMATIUM
[Acetato]
H 2O
ATP
SH CoA Isocitrato

NADH + H+ CO2
Acetil-CoA
2-Oxoglutarato
CO2
SH CoA
Ferredoxina
red. Ferredoxina red. CO2

Succinil-CoA
Piruvato ATP
CoA-SH
ATP
Succinato
Flavina red.

Fumarato
Fosfoenolpiruvato H 2O
Pi NADH + H+ Malato
CO2 Oxalacetato
Figura 19.3 Ciclo de Arnon. Los productos que entran en el ciclo estn
enmarcados en trazo continuo. El proceso se inciara a partir de una mol-
cula de acetato (en negrilla).

indudable que el ciclo de Arnon tiene una importancia sustancial en


Chlorobium thiosulfatophilum creciendo a la luz en presencia de tiosul-
fato. En todo caso no hay que olvidar que, al igual que el ciclo reduc-
tor de las pentosas, el ciclo de Arnon requiere una fuente de poder
reductor y de ATP para que prosiga la asimilacin de CO2 como
soporte del desarrollo autotrco.
Se han obtenido extractos de Rhodospirillum rubrum, creciendo en
presencia de luz con CO2, succinato e hidrgeno como reductor, que
contienen todos los enzimas del ciclo de Arnon. Estos extractos tambin
poseen los enzimas del ciclo de la ribulosa fosfato, por lo que se plantea
el mismo problema antes referido de cul de los dos ciclos soporta real-
mente el metabolismo autotrco. En todo caso hay que tener en
cuenta que R. rubrum puede utilizar tambin sustratos orgnicos, cuya
presencia modica sustancialmente el total de la actividad metablica.
19.5 FIJACIN DE CO2 EN CHROMATIUM
La autorradiografa de los productos de reaccin en Chromatium
indica que los primeros productos formados tras la jacin del CO2
son el fosfoglicerato y el cido asprtico. La alta proporcin de aspar-
tato seala la existencia de una etapa de carboxilacin independiente
de la que tiene lugar en la formacin de cido fosfoglicrico. Al pare-
cer Chromatium utiliza una doble jacin de CO2 en la que el ciclo del
cido glioxlico juega un papel muy importante. Este proceso se
esquematiza en la gura 19.4.
260 CO2 ATP ADP

Parte E: REDUCTORES ORGNICOS Y Ribulosa-1,5-PP 2 x PG 2 x 1,3-di-PG


COMPUESTOS C1
Captulo 19: COMPUESTOS C1 COMO ADP
PEP
SUSTRATOS CO2
ATP
CO2

Piruvato CO2 Oxalacetato Aspartato


CO2
Malato Citrato
Acetil-CoA

Fumarato Isocitrato

Glioxilato Succinato 2-Oxoglutarato

Figura 19.4 Fijacin del CO2 en Chromatium, PG, cido 3-fosfoglicrico;


1,3-diPG, cido 1,3-difosfoglicrico; PEP, fosfoenolpiruvato.

19.6 BACTERIAS METILOTROFAS


Bacterias metilotrofas
Bsicamente las bacterias metilotrofas se subdividen en dos grandes
grupos: las metilotrofas obligadas, que utilizan exclusivamente com-
Metilotrofas Facultativas Metilotrofas
puestos C1, y las facultativas, las cuales, adems de compuestos C1,
obligadas restringidas facultativas
pueden utilizar sustratos formados por cadenas multicarbonadas. Las
metilotrofas obligadas se subdividen a su vez en dos grupos: las que
Metanotrofas Utilizadoras utilizan metanol y aminas metiladas pero no metano y las que slo
de metanol y utilizan metano (metanotrofas) (Lmina 5). Se distingue tambin un
metilaminas
grupo intermedio entre las metilotrofas obligadas y las facultativas
caracterizado por utilizar, adems de compuestos C1, un nmero muy
limitado de compuestos muticarbonados.
Dentro de las metanotrofas encontramos el grupo I, constituido
por bacilos que en los cortes al microscopio electrnico muestran
paquetes o discos vesiculares y utilizan la va de la ribulosa fosfato
para la asimilacin de los compuestos C1, tienen un ciclo de los ci-
dos tricarboxlicos incompleto y cidos grasos predominantes de 16
carbonos. Por otro lado, el grupo II presenta membranas perifricas
debajo de la membrana celular en las secciones nas al microscopio
electrnico, tienen un CAT funcional y dos cidos grasos constituti-
vos dominantes de ms de 18 carbonos. El grupo I incluye los gneros
Methylomonas y Methylobacter y el grupo II los