Aislamiento de enzimas

Las clulas vivas no son indispensables para

tener actividad enzimtica (in vitro?)
Enzimas estn dentro de la clula pero
algunos microorganismos la secretan al medio
(enzimas extracelulares)
Para estudiar in vitro a una enzima, la clula
debe ser rota.
Deben tomarse criterios para seleccionar los
tejidos u organismos para extraer enzimas.
 Criterio de seleccin de tejidos
Buscar un recurso rico en enzimas. En que
reino, clasificacin est presente la enzima.
Es ms fcil trabajar con enzimas de
microorganismos y de animales.

Plantas: fenoles + aire -> quinonas (inactivan a la

enzima)
 Tcnicas de solubilizacin
Muchas enzimas no son estables a T
ambiente -> 0-4C.
La homogenizacin con hielo.
Enzimas pueden estar presentes en el
citoplasma, organela, membranas.
En organela hay que extraer la organela antes
de romper membranas (medio de aislamiento
isotnico)
Seleccin del medio de aislamiento
En tejidos animales y microorganismos -> agua
destilada
Buffer con carga inica adecuada.
Buscar pH adecuado (actividad mxima de
enzimas)
En plantas el uso de buffer es primordial
debido a las vacuolas.
 Si una enzima tiene grupos sulfidrilos para iniciar
su actividad (en plantas tambin) se necesitan
agentes reductores:
- mercaptoetanol
- Metabisulfito de sodio
- Ditiotreitol
- Glutationa reducida
- Etc
Mantienen fenoles en forma reducida. Tambin se
usa Tritn X 100 (disocia complejo protena -
quinona).
Frecuentemente usados entre 10-50 mM
 Hay agentes fijadores de fenoles PVP.
Rompimiento de clula -> proteasas -> usar
PMSF (fenil metil sulfonil fluoruro).
Metales pueden desnaturalizar las protena ->
usar EDTA (etileno diamina tetra acetato).
A veces Mg, Mn, Zn, etc. se necesitan en el
medio para la actividad enzimtica.
Si se desea destruir membrana y pared celular
y mantener organelas mantener condiciones
isotnicas (manitol o sucrosa)
 Tcnicas de aislamiento de enzimas
Morteros moderada homogenizacin. Con
arena purificada o bolas de cristal
Licuadoras Para tejido de plantas. No
recomendable para organelas.
Ultrasonido para microorganismos
Homogenizador Vir-Tis suave, para
tejidos animales.
Homogenizador Potter Elvejm suave
para tejido animal
 Extrusin clulas en suspensin sometidas a
alta presin y atomizadas. En bacterias.

Enzimas lticas Para romper pared y

membrana celular (ej. Celulasas, pectinasas,
xylanasas, etc..), no muy usadas.
Congelar y descongelar - Daa la membrana.
Para microorganismos y clulas ecucariotas.
Polvo de acetona Rompe membrana celular.
 Mtodos de purificacin de enzimas
Proceso muy costoso y lento.
Hay que remover otras substancias
Proceso de muchos pasos que incluye:
- Concentracin
- Solubilidad
- Carga
- Tamao
- Hidrofobicidad

Objetivos: Recuperar mucha enzima, altamente pura,

mtodos reproducibles, usar qumicos poco costosos y
acortar el tiempo de purificacin.
 Buscar concentrar la protena en la mezcla
ms que purificarla. Luego se la purifica.
El primer paso de la purificacin es el
fraccionamiento de la protena (solubilidad en
sales y compuestos orgnicos)

Solubilidad .- Interacciones polares de la

protena con el solvente acuoso, interacciones
inicas con sales y fuerzas electrostticas
repulsivas entre molculas cargadas.
 Precipitacin y fraccionamiento
Adicin de sales
- Sulfato de amonio, sulfato sdico.
- Ocurre deshidratacin del ambiente protico.
- Remueve impurezas presentes en la enzima.
- Se mantiene a un pH constante mientras se
mezcla y se aade sal (0-30%, 30-60%, 60-
90%).
- Se guarda a bajas temperaturas para que
precipite la enzima.
- Se centrifuga, precipitado es la enzima que debe
ser almacenada en el medio apropiado

Adicin de solventes orgnicos

Generalmente acetona a -20C a diferentes
concentraciones 10, 20, 30%, etc
El precipitado se lo guarda en el medio apropiado
Adicin de polmeros no inicos
Polietileno Glicol (PEG) de bajo peso
molecular
El precipitado puede ser cargado a una
columna de intercambio inico

Fraccionamiento por calor

Mtodo poco usado
Cuando las protenas son estables a 55 o 60C.
 Separacin por cromatografa
Separacin de la protena de una fase mvil a
una fase estacionaria.
Cromatografa de intercambio inico, de
adsorcin, filtracin en gel y de afinidad.
Mtodo: la muestra con la protena es puesta
en una columna, se eluye con buffer, la
columna tiene un ligando especfico para la
protena, el efluente se colecta en diferentes
fracciones.
Cromatografa de intercambio inico
Liga protenas cargadas por atracciones
electrostticas (enlaces inicos) con un
intercambiador inico (intercambiador aninico y
catinico)
Para desligar, aumentar concentracin inica de
buffer o cambiar pH.
Intercambiador aninico: DEAE ceulosa
Intercambiador catinico: CM celulosa
Tambin se usa Sephadex
o Sepharosa
Cromatografa de adsorcin
Ligar la protena por adsorcin fsica de una
matriz insoluble por ligaduras dbiles como
H+ y van der Waals.
Se eluye la enzima con buffer cambiando el pH
o concentracin inica.
Gel de fosfato de calcio, gel de almina y gel
de hidroxilapatita.
Cromatografa de filtracin en gel
Basado en el tamao y forma de las protenas
El gel es empaquetado en la columna de
cromatografa. Gel con partculas esfricas y
porosas. Grandes molculas se eluyen fuera
de la columna.
Ej. Sephadex, agarosa, poliacrilamida.
Cromatografa de afinidad
La enzima se liga con un anlogo del sustrato,
activador.
Usan matrices de afinidad como celulosa,
agarosa, etc.
Protena anticuerpo
Matriz Green A especfica para
enzimas.
 Electroforesis
No se usa para purificar, sino para anlisis de
pureza de la protena.
Generalmente se usa PAGE en donde
protenas se separan por carga y tamao.

https://www.youtube.com/watch?v=oIFoRQG_cis
 Ultrafiltracin
Para concentrar la muestra, remueve
sustancias de bajo peso molecular.
A travs de una membrana pasa el solvente y
compuestos de bajo peso molecular.
Membranas con poros grandes y pequeos
 Dilisis
Para remover sales, contaminantes de bajo
peso molecular.
Membrana: pelcula delgada de sustancias
altamente polimerizada, inerte y sin carga.
(tamiz molecular) ej: Membranas animales,
celofano, etc
 Cristalizacin
Despus de purificar la enzima, se la debe
cristalizar (muy difcil)
Sulfato de amonio y sulfato sdico hacen
turbia la mezcla -> bajar T -> despus de 24h
aparecen cristales.
 Criterio de pureza de una enzima
Hay muchas tcnicas para determinar
impurezas, es mejor usarlas en su conjunto.
- Deteccin de contaminantes no proticos Ej.
cidos nuclicos. Por espectrofotmetro OD 280
OD 260
- Deteccin de contaminantes proticos:
Cambio de actividad protica
Cromatografa
Electroforesis
Centrifugacin
 Tabla de purificacin por etapas de
fraccionamiento
Mostrar pasos de purificacin de la enzima
 Caracterizacin de enzimas
Parte importante del estudio de la enzima
Se busca:
-pH optimo
-T ptima
- Energa activacin
- Cintica
- Propiedades fsicas