PRACTICA 5

ENSAYO COLORIMETRICO DEL TETRAZOLIUM NITROBLUE

(NBT):EVALUACION DE LA PRODUCCION DE ANION SUPEROXIDO
(O2-)

I. INTRODUCCIN
Los neutrfilos juegan un rol clave en proteger al cuerpo, utilizando una
amplia variedad de mecanismos microbiocidas dependientes e
independientes de oxigeno para eliminar los agentes infecciosos. Los
mecanismos dependientes de oxigeno implican la produccin de
especies reactivas de oxigeno (ROS), atravez de lo que se conoce como
la explosin respiratoria oxidativa, que implica un elevado consumo de
oxigeno por estas clulas, y que son escenciales para la proteccin
contra los patgenos invasores. Mientras que los mecanismos
independientes de oxigeno incluyen muchas otras funciones del
neutrfilo, tales como quimiotaxais , fagocitosis, desgranulacion y
liberacin de enzimas lticas y pptidos bactericidas
El sistema responsable de esta explosin respiratoria oxidativa es la
NADPH oxidasa, que es un sistema de transferencia electrnica
multicomponente, que cataliza la reduccin del O 2 molecular Los
electrones son transferidos desde el citosol y entregados al oxigeno
presente en un compartitmiento intracelular (fagosoma) o extracelular El
producto primario de la NADPH oxidasa es el O 2- y su metabolito inicial el
H2O2,adems estos ROS son metabolizados en otros metabolitos
reactivos de oxigeno, que son fuertes microbiocidas.

La importancia de la produccin de ROS por los neutrfilos es

ejemplificada por la enfermedad granulomatosa crnica (CGD),
caracterizada por recurrentes infecciones bacterianas y fngicas a lo
largo de la vida y la formacin de granulomas tisulares
El ensayo del NBT se basa en la acumulacin del precipitado formazan
azul oscuro El NBT, permeable a la membrana es reducido al formazan
por el O2- el cual es generado luego de la activacin de los neutrfilos
Este ensayo es colorimetrico, sensible y cuantitativo y puede detectar
pequeas cantidades de O2-

II. OBJETIVOS
Evaluar la produccin de anion superoxido (O2-) por neutrfilos activados

III. REACTIVOS Y MATERIALES

Materiales
- Tubos de centrifuga de 15ml (falcon)
- Centrfuga
- Micropipetas
- Tubos eppendofts
- Hemocitometro
- Espectrofotometro

Reactivos
- Ficoll hypaque
- dextrano
- medio de cultivo RPMI 1640
- PBS
- Sangre con anticoagulante ( EDTA )
- Azul de trypan
- NaCl 1,8 %
- NBT
- Dimetilformamida
- KOH 2M
- DMSO
- EDTA
IV. PROCEDIMIENTO
1. Aislar neutrfilos humanos apartir de sangre entera
2. Sembrar 1x 105 neutrofilos por pozo en una placa de cultivo
celular de 24 pocillos en 500 ul de medio DMEM
3. Adicionar 100ul de solucin de NBT a cada pozo
4. Adicionar 1ul de PMA (200ng/ml) o buffer (control no
estimulado) a los pozos e incubar por 30 min a 37 oC
5. Lavar las celulas dos veces con PBS (37oC )
6. Fijar las celulas con metanol y dejar secar las placas al aire
7. Agregar 120ul de KOH 2M por pozo
8. Agregar 140ul de DMSO por pozo y disolver el formazan
precipitado por pipeteo
9. Tansferir la solucin de NBT disuelta a una cuveta de
espectrofotmetro y medir la absorbancia a 620nm
10. Comparar la absorbancia entre lo neutrfilos estimulados y los
no estimulados para cuantificar la producion de O 2- en cada
muestra

V. RESULTADOS
1. Esquematice el ensayo del NBT
 2. Hacer los clculos para determinar la cantidad de O2- producida

120 -------------100% la cantidad de O2 que aumento

fue en 342%
410-------------x respecto al control
X=342

VI. CUESTIONARIO
1. Indique el fundamento del ensayo del NBT
El NBT es un oxidante poderoso en medio acuoso, en especial en condiciones cidas,
por lo que debe ser tratado con mucho cuidado para evitar su reduccin una vez
disuelto, mantenindolo al abrigo de la luz y el calor.
El NBT es una sal de tretrazolio soluble en agua, de color amarillo, con frmula
emprica CHNOCl y con peso molecular de 817,674 g/mol. El mtodo se fundamenta
en el hecho de que el NBT en presencia de O 2 es reducido a formazn, una
sustancia de color azul-negro que se deposita como partculas insolubles
dentro de las clulas. Este ensayo es una prueba indirecta utilizada para
evaluar desrdenes de la fagocitosis y del sistema bactericida dependiente
del oxgeno, y constituye la prueba esencial para el diagnstico de la enfermedad
granulomatosa crnica, inmunodeficiencia congnita caracterizada por el defecto de la
capacidad oxidativa.

2. Qu es la explosin respiratoria?
Al activarse el neutrfilo anion superoxdo, perxido de hidrogeno, siendo
el mas importante el anion superoxido, que produducido como el
producto de un complejo enzimtico NADPH .
EL NADPH saca un electron suyo para pasrselo al O2, y asiqueda omo
anion superoxido , Para cumplir esta funcin el neutrofio debe consumir
bastante oxigeno a esta accio se le llama explosin respiratoria.

3. indique los tipos de ROS producidos por los neutrfilos

 Se
Se han identificado al menos 5 componentes de la oxidasa. Dos unidos a la membrana
plasmtica: gp91-phox(phagocyte oxidase) y p22-phox, que juntos forman el
citocromo b558; y tres componentes citoslicos p47-phox, p67-phox y p40-phox
4. Qu importancia diagnostica tiene la determinacin de O2-?
Al producir O2 nos indica que el neutrfilo esta activado , ya que
se aislo el neutrfilo , y posteriormente se le mezclo co PMA que es
quien activa las vas de sealizacin de ls vas de protein cinsa .
Al activarse el neytrofilo quiere decir q este se a activado.

5. Indique la reaccin catalizada por la NADPH oxidasa

La actividad de la NADPH oxidasa fagoctica constituye una de las fuentes
endgenas ms importantes de especies reactivas del oxgeno en el
organismo. Ella cataliza la transferencia de un electrn desde el NADPH hacia
el O2 con la formacin del radical superxido (O2 -) y reacciones posteriores
producen perxido de hidrgeno (H2O2), cido hipocloroso (HOCl) y otros
productos microbicidas (OH, 1O2), ya sea en el espacio extracelular o en la
vacuola fagoctica, que son capaces de ejercer efectos txicos sobre los
organismos ingeridos o microbios extracelulares.
Conclusiones :
Los neutrfilos tienen una funcin fundamental en los mecanismos de
defensa contra los agentes microbianos .
Son las clulas que ms rpidamente llegan al sitio de la infeccin en
la respuesta inmune innata y tienen una actividad fundamental en la
destruccin de los microorganismos.
La destruccin de los patgenos por los neutrfilos es mediada por
dos procesos fundamentales: la activacin del sistema enzimtico
NADPH oxidasa que permite la produccin de especies reactivas del
oxgeno durante el fenmeno conocido como estallido respiratorio; y
la formacin del fagolisosoma con destruccin de los patgenos por
accin de las enzimas lisosomales