Volume1 Bioequivalencia

Gerente-Geral de Inspeo e Controle de Medicamentos e Produtos
Antnio Carlos da Costa Bezerra
Coordenao de Inspeo em Centros de Bioequivalncia

Cludia Franklin de Oliveira
E-mail: bioequivalencia@anvisa.gov.br
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
Manual de Boas Prticas em

Biodisponibilidade
Bioequivalncia
Volume I
Braslia
2002
Direitos reservados da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
SEPN 515, Edifcio mega, Bloco B, Braslia (DF), CEP 70770-502.
Internet: www.anvisa.gov.br
Copyright 2002. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.

Permitida a reproduo total ou parcial desta obra, desde que citada a fonte.
1 edio - 2002
ISBN: 85-88233-07-X
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

Realizao: Coordenao de Inspeo em Centros de Bioequivalncia - Gerncia-Geral de
Inspeo e Controle de Medicamentos e Produtos
Coordenao Geral: Cludia Franklin de Oliveira / Coordenao de Inspeo em Centros de
Bioequivalncia
Reviso: Karla de Arajo Ferreira / Coordenao de Inspeo em Centros de Bioequivalncia
Divulgao: Unidade de Divulgao
Capas: Joo Carlos de Souza Machado / Gerncia de Comunicao Multimdia
Diagramao, composio e impresso: Dupligrfica Editora Ltda./DF
Impresso no Brasil
Manual de boas prticas em biodisponibilidade: bioequivalncia/Agncia

Nacional de Vigilncia Sanitria. Gerncia-Geral de Inspeo e
Controle de Medicamentos e Produtos. Braslia: ANVISA, 2002.
2 v.
QV38
1. Equivalncia teraputica. 2. Bioequivalncia. 3. Disponibilidade

biolgica. 4 . Medicamentos. I. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.
Gerncia-Geral de Inspeo e Controle de Medicamentos e Produtos.
PREFCIO
Atualmente se acham em execuo no Brasil inmeros estudos clnicos com o objetivo de avaliar a
Biodisponibilidade/Bioequivalncia de produtos farmacuticos. A partir de junho de 2001, a Anvisa,
por meio da Coordenao de Inspeo em Centros de Bioequivalncia ligada Gerncia-geral de
Inspeo e Controle de Medicamentos e Produtos passou a avaliar estes centros em inspees
peridicas, a fim de garantir a qualidade dos estudos.
No decorrer das atividades de inspeo, que a princpio tinham carter orientativo, a Coordenao
observou a necessidade de esclarecer alguns pontos que restavam como dvidas tcnicas para os
centros, em especial a relativa padronizao de mtodos analticos, anlise estatstica dos estudos,
armazenamento de amostras biolgicas, confinamento de voluntrios e estudos de estabilidade de
frmacos, entre outros.
A partir da identificao desta necessidade, e buscando prevenir o comprometimento da qualidade

dos trabalhos realizados, surgiu a iniciativa da criao pela Coordenao de ncleos de discusso,
com o objetivo de esgotar o esclarecimento de todos os aspectos relevantes conduo dos estudos
e integrao de suas fases. Esses ncleos contaram com a participao de 40 especialistas das reas
de Farmcia, Medicina, Estatstica e Qumica.
neste contexto que surge este Manual de Boas Prticas em Biodisponibilidade/Bioequivalncia,

composto por seis grandes tpicos apresentados de maneira didtica, buscando transpor as
dificuldades dos centros, e, por conseguinte, complementar as diretrizes j previstas na legislao
sanitria brasileira para a realizao dos estudos.
Os ncleos de trabalho iniciaram as discusses em setembro de 2001, cada um deles cuidando de

uma das trs etapas do processo Clnica, Analtica e Estatstica sob a coordenao da Dra.
Cludia Franklin de Oliveira e inestimvel colaborao da professora Slvia Storpirts. Nos meses
subseqentes, foram realizadas diversas reunies, de modo a promover debates tcnicos e a alcanar
consenso nas questes. Desta forma, cada grupo elaborou um conjunto de tpicos relevantes que
devessem constar no manual. Posteriormente, todos foram objeto de cuidadosa pesquisa e os
resultados relatados de modo a propiciar um bom entendimento por parte do pblico-alvo.
O manual completo levou 11 meses para ser concludo. Este processo envolveu a participao, no
total, de cerca de 50 profissionais de diversas reas do conhecimento, entre pesquisadores de
universidades pblicas, tcnicos da Anvisa e fabricantes de instrumentao laboratorial e
equipamentos. A todos estes colaboradores a Anvisa registra sua gratido pela contribuio impar a
um trabalho to singular.
A estrutura final consta de dois volumes e cada qual possui trs mdulos. O primeiro volume traz
detalhadas tecnicamente cada uma das etapas dos estudos de Biodisponibilidade/Bioequivalncia
na seqncia natural de sua conduo: Mdulo 1: Etapa Clnica, Mdulo 2: Etapa Analtica e
Mdulo 3: Etapa Estatstica. O segundo volume abrange aspectos importantes no que diz respeito
instrumentao laboratorial e equipamentos utilizados na execuo da etapa analtica, considerados
crticos no processo. Neste volume, o Mdulo 1 refere-se Fundamentos e Operao de Micropipetas,
o Mdulo 2 aborda a gua para Anlises Qumicas Instrumentais e o Mdulo 3 possui contedo
relacionado Espectrofotometria de Ultra Violeta Visvel, Cromatografia em Fase Lquida (LC),
Cromatografia em Fase Gasosa (GC), Sistemas de Cromatografia Acoplados a Detectores de Massa
e Verificao de Desempenho de Instrumentos Analticos.
importante ressaltar o ineditismo, mesmo em nvel internacional, da reunio de informaes

provenientes de diversas disciplinas em um nico compndio, buscando a sintetizao de todos os
aspectos que envolvem as Boas Prticas em Biodisponibilidade/Bioequivalncia.
Claro fica que o objetivo maior deste trabalho o de aperfeioar a qualidade dos ensaios de
Biodisponibilidade/Bioequivalncia realizados no Brasil, e, por conseguinte, contribuir em parte
com a qualidade dos medicamentos genricos disponveis no mercado, por meio do fornecimento
de subsdios tcnicos amplamente estudados e minuciosamente elaborados. Neste sentido, esperamos
contribuir para a capacitao dos Centros de Biodisponibiliade/Bioequivalncia, alm de promover
a formao de monitores de estudos para a indstria farmacutica nacional e ajudar a formar agentes
multiplicadores de conhecimento nas universidades brasileiras.
A realizao deste manual s foi possvel graas ao importante trabalho de inmeras pessoas e
antecipadamente peo desculpas por eventual esquecimento de algum nome. Foram fundamentais
os editores Jos Pedrazzoli Jnior (USF/Unifag) e Joo Antnio Saraiva Fittipaldi (Pfizer), e os
colaboradores Fernanda Maria Villaa Boueri (Anvisa), Eliana Regina Marques Zlochevsky (Anvisa),
Cludia Simone Costa da Cunha (Ministrio da Sade) e Beatriz Helena Carvalho Tess (Ministrio
da Sade), no mdulo Etapa Clnica; os editores Cludia Franklin de Oliveira (GGIMP/Anvisa),
Rui Oliveira Macedo (UFPA), Flvio Leite (T&E Analtica) e Pedro Eduardo Froehlich (UFRGS), e
os colaboradores Pedro de Lima Filho (GGMEG/SP), Davi Pereira de Santana (UFPE), Rafael
Eliseo Barrientos Astigarraga (Cartesius), Silvana Calafatti de Castro (Unifag), Thas Reis Machado,
Jaime Oliveira Ilha (Cartesius), Itapuan Abimael Silva (Anvisa), Karen Noffs Brisolla (Anvisa),
Marcelo Cludio Pereira (Anvisa), no mdulo Etapa Analtica; os editores Arminda Lucia Siqueira
(UFMG), Chang Chiann (GGMEG/SP), Cicilia Yuko Wada (Unicamp), Karla de Arajo Ferreira
(Anvisa) e Gilberto Bernasconi (USF/Unifag), e os colaboradores Reinaldo Charnet (Unicamp) e
Renato Almeida Lopes (Anvisa), no mdulo Etapa Estattica; os editores Melissa M. Silva (Nova
Analtica) e Walter Pereira (Nova Analtica), Fundamentos e Operao de Micropipetas; o editor
Jos Muradian Filho (Millipore), gua para Anlises Clnicas; os editores Ivan Jonaitis (Agilent),
Renato Garcia Peres (Flowscience), Ricardo Lira (Flowscience), Renato Gouveia, Jos Aparecido
Soares (Varian), Josu D.M. Neto (Sync Brasil) Juarez Arajo Filho (Sync Brasil), Alexandre Rosolia
(Waters), Adauto Silva (Varian) e Reinaldo Castanheira (Agilent), Instrumentao Analtica; e a
equipe de coordenao formada por Cludia Franklin de Oliveira (GGIMP/Anvisa), Marcelo Cludio
Pereira (GGIMP/Anvisa), Max Weber Marques Pereira (GGIMP/Anvisa), Karla de Arajo Ferreira
(GGIMP/Anvisa), Karen Noffs Brisolla (GGIMP/Anvisa), Itapuan Abimael da Silva (GGIMP/
Anvisa) e Renato Almeida Lopes (GGIMP/Anvisa).
Dr. Gonzalo Vecina Neto

FICHA TCNICA
Volume I Mdulo 1 Etapa Clnica
Editores:
Joo Antnio Saraiva Fittipaldi Pfizer
Jos Pedrazzoli Jnior UNIFAG USF
Colaboradores:
Beatriz Helena Carvalho Tess Ministrio da Sade
Cludia Simone Costa da Cunha Ministrio da Sade
Eliana Regina Marques Zlochevsky ANVISA
Fernanda Maria Villaa Boueri ANVISA
Gilberto de Nucci USP
Coordenao:
Cludia Franklin de Oliveira ANVISA
Itapuan Abimael da Silva ANVISA
Karen de Aquino Noffs Brisolla ANVISA
Karla de Arajo Ferreira ANVISA
Marcelo Cludio Pereira ANVISA
Max Weber Marques Pereira ANVISA
Renato Almeida Lopes ANVISA
Apoio Logstico:
Daniela Salles de A. B. Corra ANVISA
Diva Sales Freitas ANVISA
SUMRIO
1. PESQUISA CLNICA .................................................................................................................. 05

1.1. Histrico .................................................................................................................................. 05
1.2. Novos medicamentos ............................................................................................................. 07
1.3. Biodisponibilidade/ Bioequivalncia.................................................................................... 08
1.4. Estudos clnicos ...................................................................................................................... 09
1.5. Aspectos de segurana ........................................................................................................... 10
1.5.1. Eventos adversos .......................................................................................................... 10
1.5.2. Eventos adversos srios............................................................................................... 11
1.5.3. Resultados de testes laboratoriais anormais.............................................................. 13
1.6. Das responsabilidades ............................................................................................................ 14
1.6.1. Patrocinador .................................................................................................................. 14
1.6.2. Investigador principal .................................................................................................. 15
2. ESTUDOS DE BIODISPONIBILIDADE/BIOEQUIVALNCIA DE
MEDICAMENTOS ETAPA CLNICA .............................................................................. 16
2.1. Introduo ............................................................................................................................... 16
2.2. Instalaes ................................................................................................................................ 16
2.3. Recrutamento e seleo dos voluntrios ............................................................................. 17
2.4. Internao e alta dos voluntrios .......................................................................................... 17
2.5. Administrao do medicamento e coleta de material biolgico ...................................... 18
2.6. Manuseio das amostras biolgicas ........................................................................................ 19
2.7. Documentao ........................................................................................................................ 19
2.7.1. Protocolo de pesquisa .................................................................................................. 19
2.7.2. Protocolo clnico .......................................................................................................... 19
2.7.3. Termo de consentimento livre e esclarecido ............................................................ 21
2.7.4. Ficha clnica ................................................................................................................... 23
2.8. Das responsabilidades ............................................................................................................ 24
2.8.1. Patrocinador .................................................................................................................. 24
2.8.2. Investigador Principal .................................................................................................. 24
3. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................................... 25

Volume I / Mdulo 1 - Etapa Clnica
1. PESQUISA CLNICA
1.1. Histrico
Quando se analisam os procedimentos necessrios para a conduo de pesquisas em seres humanos,

muitas vezes se tem a falsa impresso de uma burocracia desnecessria e normas que apenas servem
para retardar o processo de investigao cientfica.
Um breve conhecimento da origem destes regulamentos demonstra de maneira inequvoca a

importncia dos mesmos e a necessidade contnua de pesquisas no campo da biotica.
At o ano de 1906 no havia qualquer regulamentao quanto venda de medicamentos ou alimentos.

Exibies que percorriam cada povoado promoviam e vendiam medicamentos maravilhosos, os
quais careciam de qualquer comprovao cientfica quanto sua eficcia e segurana.
Em 1906, Upton Sinclair publica o livro The Jungle no qual descreve de maneira realstica as
pssimas condies de higiene dos matadouros de Chigaco. Esta publicao levou a uma onda de
indignao da populao norte americana, cujos protestos chegaram ao Congresso, que aprova a lei
conhecida como Pure Food and Drug Act. Esta lei cria o FDA (Food and Drug Administration),
que seria a Agncia responsvel pela regulamentao da produo, transporte e venda de produtos
medicinais e alimentares dentro dos Estados Unidos. Infelizmente neste primeiro momento, a Lei
apenas exigia uma correta rotulao dos produtos, no fazendo qualquer referncia s condies de
eficcia e segurana destes.
Um novo avano neste campo s voltou a acontecer em face de novo episdio ocorrido em 1937.
Neste ano, a Sulfanilamida (Prontosil) conhecida desde 1932 e utilizada com sucesso, na forma de
pastilhas, para o tratamento das infeces por estreptococos, foi lanada na forma de xarope, tendo
o dietilenoglicol como solvente. Este xarope apesar de ter sido testado quanto a sua aparncia,
gosto e odor no teve qualquer teste de segurana realizado antes do lanamento. O produto provoca
a morte de 105 pessoas (34 crianas e 71 adultos) e o dietilenoglicol incriminado. Este acontecimento
fez com que em 1938 o Congresso Americano aprovasse o Food Drug and Cosmetic Act no qual
se estabelece que os fabricantes de produtos farmacuticos deveriam apresentar provas cientficas
da segurana dos medicamentos antes de liber-los para venda.
Com o final da Segunda Guerra Mundial, vieram tona as atrocidades cometidas em nome da
cincia, contra seres humanos, por mdicos alemes. Dentre as inmeras atrocidades cometidas,
podemos destacar os experimentos de vacinao contra o tifo, na qual se infectava indivduos
sos com a bactria, as esterilizaes no cirrgicas em massa de mulheres judias atravs da injeo
na cavidade uterina de solues de formalina e as experincias de hipotermia prolongada e
despressurizao, para se avaliar as respostas do organismo a estas condies.
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Como uma reao aos abusos cometidos em nome do conhecimento, o Cdigo de Nrembeg foi
elaborado em 1947, estabelecendo parmetros a serem cumpridos de forma a se evitar as situaes
ento evidenciadas. Este cdigo foi o primeiro a introduzir o conceito de um consentimento por
parte dos sujeitos da pesquisa. Infelizmente, foi necessrio ainda mais um acontecimento de profundo
pesar para que as normas de pesquisa recebessem um aprimoramento.
Em 1957 introduzida no mercado a Talidomida indicada como sonfero. Esta droga havia sido
administrada a aproximadamente 300 pacientes sem que houvesse qualquer relato de efeito txico.
Em 1962, a Talidomida retirada do mercado aps denncias de milhares de casos de focomelia.
No mesmo ano a emenda Kefauver-Harris, com requerimentos de provas cientficas de eficcia e
segurana antes de testes em seres humanos foi aprovada.
Em 1964, a Associao Mdica Mundial aprova em Helsinque um documento com princpios para
proteo de indivduos em pesquisa biomdica. So introduzidos conceitos de responsabilidades do
investigador, comits de tica e consentimento livre e esclarecido. Com revises peridicas posteriores
(1975, 1983, 1989 e 2000), a Declarao de Helsinki constitui-se, atualmente, no documento universal
que rege os parmetros para o desenvolvimento cientfico e tecnolgico envolvendo seres humanos.
Em 1977, o FDA publica as primeiras diretrizes para pesquisas clnicas com o objetivo de garantir
qualidade dos dados e proteger os participantes das mesmas. Entre 1977 e 1981, novas diretrizes
sobre Boas Prticas Clnicas so publicadas. Em 1988, uma consolidao de um Cdigo de Boas
Prticas Clnicas (GCP) publicada pelo FDA.
As Boas Prticas Clnicas tambm foram adotadas em outros pases:

1985 - Japo e Canad
1986 - Inglaterra
1991 - Austrlia e Comunidade Europia
1995 - Publicao do cdigo de Boas Prticas Clnicas (GCP) pela OMS.
Em 1996, a realizao da Conferncia Internacional de Harmonizao (ICH) e posterior introduo

das alteraes propostas serviram de alicerce para que os estudos clnicos pudessem ser conduzidos
de acordo com normas e regulamentos similares em diferentes pases e em conformidade com
elevados padres ticos e cientficos.
No Brasil, a implantao de normas definindo a pesquisa em seres humanos deu-se com a Resoluo
n 01/88, atravs de iniciativa do Professor Elisaldo Carlini. Em outubro de 1996, esta foi revogada
pela resoluo n 196/MS/CNS, sendo posteriormente complementada pela Resoluo n 251/97.
Por meio destas Resolues, o Ministrio da Sade define diretrizes e normas objetivando promover
a proteo de sujeito de pesquisas envolvendo seres humanos.
A Resoluo 196/96, baseada nos quatro referenciais bsicos da biotica, autonomia, no maleficncia,
beneficncia e justia, traz comunidade cientfica, bem como sociedade brasileira, reflexes
sobre os aspectos ticos da pesquisa envolvendo seres humanos e estabelece as diretrizes para a
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implantao de um sistema de reviso tica em pesquisa, composto por Comits de tica em Pesquisa
(CEP) e pela Comisso Nacional de tica em Pesquisa (CONEP), do Conselho Nacional de Sade.
Assim, a Resoluo 196/96, bem como as demais que a complementam, traz ao pesquisador as
orientaes para que o mesmo possa desenvolver, de forma tica, pesquisas envolvendo seres
humanos.
Esta Resoluo estabelece que todas as pesquisas desenvolvidas com seres humanos devem ser
submetidas apreciao de um Comit de tica em Pesquisa (CEP), credenciado pela CONEP
(Comisso Nacional de tica em Pesquisa). A resoluo tambm preconiza que todas as instituies
que realizem pesquisas implantem um CEP, a fim de se promover em toda a rede o desenvolvimento
cientfico e tecnolgico fundamentados nos princpios de tica e do respeito cidadania. Na
impossibilidade de constituir um CEP, a instituio ou o pesquisador principal dever submeter o
projeto a apreciao do CEP de outra instituio, dentre os indicados pelo CONEP.
Considerando a importncia dos estudos de biodisponibilidade/bioequivalncia no contexto da

estratgia da poltica de implantao de medicamentos genricos no Brasil, os pesquisadores devero
estar atentos s diretrizes estabelecidas pelo Ministrio da Sade na rea de tica em pesquisas.
1.2. Novos medicamentos
Quando estudos em animais sugerem que uma nova molcula pode ser til, ou seja, efetiva e
segura quando correlacionada com seus efeitos, geralmente a mesma indicada para estudos
envolvendo seres humanos. Novas drogas so introduzidas na prtica mdica atravs de estudos de
farmacologia clnica, nos quais um nmero crescente de pacientes ou voluntrios sadios avaliado,
at que um volume adequado de informao tenha sido obtido e um estudo teraputico formal
possa ser justificado.
Assim, estudos envolvendo seres humanos podem ser classificados em:
teraputicos: nos quais os sujeitos da pesquisa podem apresentar um ganho direto.

no teraputicos: nos quais os sujeitos da pesquisa no se beneficiam dos resultados durante o
desenrolar do protocolo.
Quando consideramos a existncia de novo medicamento, podemos considerar 3 perodos de vida

til. O primeiro deles anterior a sua aprovao para uso pblico, quando estudos pr-clnicos e
clnicos so realizados, visando avaliar eficcia e segurana. O segundo centra-se no perodo de
vigncia de sua patente, na qual a exclusividade de comercializao ainda existe. O ltimo perodo
inicia-se aps o trmino da patente, quando outras empresas podem comercializar o produto, seja
como similar ou como medicamento genrico. Assim, vrias companhias podem manufaturar e
comercializar diferentes formulaes de uma mesma substncia ativa, apresentando qualidade e
performance semelhantes, de tal forma que a intercambiabilidade entre as diferentes formulaes,
quando administradas em doses equivalentes, apresente as mesmas segurana e eficcia.
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Bases cientficas e tecnolgicas possibilitam a produo regular e reprodutvel de formulaes com

as mesmas caractersticas farmacuticas, bem como fornecem a confirmao de segurana, eficcia
e intercambiabilidade destas.
A confirmao de intercambiabilidade dada atravs dos estudos de equivalncia farmacutica e/

ou bioequivalnca. Tanto do ponto de vista dos rgos regulatrios quanto da indstria, estudos de
biodisponibilidade/bioequivalncia podem ser solicitados mesmo aps a concesso do registro do
medicamento.
1.3. Biodisponibilidade/Bioequivalncia
Pode-se afirmar que a era de estudos de biodisponibilidade iniciou-se a partir de 1945, com a primeira
publicao do conceito de disponibilidade biolgica. O desenvolvimento, durante a dcada de 1960,
de tcnicas analticas possibilitou o desenvolvimento de mtodos sensveis o suficiente para permitir
a quantificao de drogas ou metablitos, inicialmente na urina, e posteriormente no plasma, o que
possibilitou a avaliao e comparao da biodisponibilidade de diferentes formulaes em voluntrios,
bem como a demonstrao de que diferenas significativas entre estas podem ocorrer.
Aps a legislao de registro compulsrio de medicamentos em 1969, que facilitou a entrada de

medicamentos genricos no mercado canadense, o Drugs Directorate do Canadian Federal
Department of Health and Welfare comeou a utilizar bioequivalncia como uma medida para
aprovar o registro de um medicamento durante a dcada de 1970. Este programa, juntamente com
outras informaes, foi analisado pelo FDA, rgo a editar as primeiras diretrizes para a realizao
de estudos de bioequivalncia em 1977. A aplicao destas diretrizes foi ampliada no Drug Price
Competition and Patent Term Restoration Act de1984, o qual concedia ao FDA poderes para
autorizar a aprovao de drogas genricas sem evidncias clnicas de segurana ou eficcia, desde
que a droga seja bioequivalente ao produto inovador.
A realizao de estudos de biodisponibilidade e bioequivalncia, de forma rotineira, no Brasil, pode

ser creditada Lei dos genricos n 9787/99. O pioneirismo coube ao Dr. Gilberto de Nucci, na
ltima dcada, atravs da implantao da Unidade Miguel Servet no Departamento de Farmacologia
da Faculdade de Cincias Mdicas da Unicamp. Muitos dos profissionais que atuam na rea de
farmacologia clnica no Brasil realizaram parte de sua formao acadmica sob orientao do professor
Dr. Gilberto de Nucci.
O termo biodisponibilidade , na verdade, uma contrao de disponibilidade biolgica. Considera-

se biodisponibilidade como sendo a taxa e a extenso na qual uma molcula ativa absorvida e
torna-se disponvel no stio de ao da droga. Considerando-se que a quantidade do frmaco contida
no fluido biolgico est em equilbrio com o stio de ao, a biodisponibilidade determinada
atravs da medida da concentrao do princpio ativo da droga em sangue total, soro ou outro
fluido biolgico apropriado, em funo do tempo.
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Os principais parmetros farmacocinticos utilizados para a avaliao da biodisponibilidade so:
O pico de concentrao mxima Cmx;

O tempo para ocorrer o pico Tmx;
A rea sob a curva ASCt.
Essas medidas so obtidas diretamente das curvas de concentrao sangnea versus tempo,
construdas no estudo.
Biodisponibilidade absoluta
a frao da dose que efetivamente absorvida aps administrao extravascular de um
medicamento. calculada tendo como referncia a administrao do mesmo frmaco por via
intravascular, que possui por definio biodisponibilidade igual a 100%.
Biodisponibilidade relativa (Bioequivalncia)

A bioequivalncia entre medicamentos administrados pela mesma via extravascular pode ser avaliada
pela comparao de parmetros farmacocinticos relacionados biodisponibilidade, ou seja,
quantidade absorvida e velocidade do processo de absoro. Compara-se dois produtos,
administrados por via extravascular, tendo um deles como referncia.
Medicamentos bioequivalentes so equivalentes farmacuticos (mesma forma farmacutica e

quantidade do mesmo princpio ativo) que, ao serem administrados na mesma dose molar, nas
mesmas condies experimentais, no apresentam diferenas estatisticamente significativas em relao
biodisponibilidade.
Medicamento genrico um medicamento similar a um produto de referncia ou inovador, que

pretende ser com este intercambivel, geralmente produzido aps expirao ou renncia da proteo
patentria ou de outros direitos de exclusividade, comprovada a sua eficcia, segurana e qualidade,
e designado pela DCB ou, na sua ausncia, pela DCI.
1.4. Estudos clnicos
Estudos clnicos utilizando drogas em seres humanos so divididos convencionalmente em 4 fases:
Fase I
o primeiro estudo em seres humanos. Envolve cerca de 20 a 50 indivduos, sendo geralmente
voluntrios sadios, de acordo com a classe da droga a ser avaliada. So estudos de farmacologia
clnica, nos quais se busca avaliar suas caractersticas de segurana e do perfil farmacocintico.
Fase II
Estes estudos constituem a primeira administrao do medicamento a pacientes, envolvendo cerca
de 50 a 300 indivduos. Tm como objetivo estudar o potencial teraputico e os efeitos colaterais do
medicamento, alm de estabelecer as suas relaes dose-resposta para empreg-las em ensaios
teraputicos mais definitivos.
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Fase III
So estudos teraputicos multicntricos, envolvendo no mnimo 250 indivduos (usualmente este
nmero chega a 3000/4000 pacientes), avaliando a eficcia da droga, sua segurana e comparando-
as com placebo ou drogas j disponveis no mercado com a mesma finalidade teraputica. Exploram-
se nesta fase o tipo e perfil das reaes adversas maisfreqentes.
Fase IV
Geralmente, so estudos de vigilncia ps-comercializao, para estabelecer o valor teraputico, o
surgimento de novas reaes adversas e/ou confirmao da freqncia de surgimento das j
conhecidas, e as estratgias de tratamento. So realizados com base nas caractersticas com que foi
autorizado o medicamento e/ou especialidade medicinal.
Assim, entre os estudos que buscam identificar parmetros iniciais de eficcia e segurana, esto os
estudos de biodisponibilidade, quando os dados de absoro, distribuio, metabolizao e eliminao,
bem como efeitos adversos ainda no so totalmente conhecidos. Nestes estudos, uma monitorizao
mdica rigorosa durante toda fase de investigao da droga faz-se necessria. Estudos de
bioequivalncia, por outro lado, apresentam, como principal propsito, obter evidncias de que
uma formulao teste no diferente, do ponto de vista farmacocintico, de uma dada formulao
referncia. Estes estudos so realizados geralmente como base para solicitao de registro de um
medicamento genrico. Conduzidos habitualmente em voluntrios sadios, ou seja, um estudo no
teraputico, as caractersticas farmacocinticas e farmacodinmicas da droga estudada j so
conhecidas, apresentando assim um risco menor que estudos iniciais de biodisponibilidade.
1.5. Aspectos de segurana
1.5.1. Eventos adversos
A conceituao de evento adverso em estudos clnicos e sua correta e pronta notificao, quando
necessrio, so fundamentais para que um estudo clnico seja corretamente conduzido.
Todos os eventos adversos observados ou voluntariamente relatados, independentemente do grupo

de tratamento ou de suspeita de relao causal com a medicao em estudo, devero ser registrados
na(s) pgina(s) correspondentes a Eventos Adversos, necessariamente presentes na Ficha Clnica.
Situaes que envolvam eventos adversos a medicamentos, doenas que se iniciem durante o estudo
ou exacerbaes de doenas preexistentes tambm devero ser registrados.
Exacerbao de doena preexistente, incluindo a doena em estudo, definida como manifestao

(sinal ou sintoma) da doena que indique piora significativa da gravidade da mesma em comparao
gravidade observada no incio do estudo. Pode incluir piora na gravidade, aumento na freqncia
ou novos sinais ou sintomas.
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Exacerbao de doena pr-existente dever ser considerada, quando o paciente/indivduo necessitar

de novas medicaes ou terapias no medicamentosas adicionais, concomitantes ao tratamento
dessa doena durante o estudo.
Resposta clnica insuficiente ou ausncia de resposta, benefcio, eficcia, efeito teraputico ou ao

farmacolgica no devem ser registrados como evento adverso. O investigador dever distinguir
entre exacerbao de doena preexistente e ausncia de eficcia teraputica.
Adicionalmente, alteraes clinicamente significativas no exame fsico, assim como, achados anormais
em testes objetivos (por ex: laboratrio, raio-x, ECG) tambm devem ser registrados como eventos
adversos.
Qualquer resultado anormal de um teste, que seja confirmado como um erro, no precisa ser reportado
como evento adverso.
O investigador deve se esforar para obter informaes adequadas para todos os eventos adversos,
a fim de determinar a evoluo do mesmo e avaliar se este preenche os critrios para evento adverso
srio, necessitando notificao imediata. Para todos os eventos adversos, o investigador deve obter
informaes suficientes para determinar sua causalidade (verificar se a causa do evento a medicao
em estudo ou outra doena). O investigador dever avaliar a causalidade do evento adverso e indicar
tal avaliao na Ficha Clnica. O acompanhamento do evento adverso, aps a descontinuao do
tratamento, necessrio se este ou sua seqela persistirem. O acompanhamento necessrio at a
resoluo do evento adverso ou de sua seqela ou at que estes se estabilizem em nvel aceitvel
pelo investigador.
1.5.2. Eventos adversos srios
Todos os eventos adversos srios (conforme definio abaixo), independentemente do grupo de

tratamento ou de suspeita de relao causal com a medicao, devero ser notificados ao Comit de
tica em Pesquisa que aprovou o protocolo, alm de seu registro na ficha clnica.
Um evento adverso srio qualquer evento adverso que:
Resulte em morte;
Coloque em risco a vida do voluntrio/paciente;
Resulte em hospitalizao ou prolongamento de hospitalizao;
Resulte em incapacidade persistente ou significativa;
Resulte em anomalias congnitas ou mal formao ao nascimento.
Eventos mdicos importantes podem no resultar em morte, colocar em risco a vida do paciente ou
requerer hospitalizao, mas podem ser considerados eventos adversos srios quando, com base em
julgamento mdico adequado, possam comprometer o paciente/indivduo e requerer interveno
clnica ou cirrgica para evitar a ocorrncia de um dos desfechos listados na definio anterior.
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Exemplos de tais eventos incluem broncoespasmo alrgico que necessite de tratamento intensivo em
pronto socorro ou em casa, discrasias sangneas ou convulses que no resultem em hospitalizao
ou o desenvolvimento de dependncia ou abuso de droga.
Independente dos critrios acima mencionados, qualquer evento adverso adicional considerado
srio pelo investigador dever ser notificado e includo na ficha clnica.
Hospitalizao inicial definida como qualquer admisso hospitalar (mesmo que dure menos do
que 24 horas). Para hospitalizaes crnicas ou de longa durao, a admisso tambm inclui a
transferncia, dentro do prprio hospital, para uma unidade de terapia intensiva.
Em algumas ocasies, a admisso hospitalar pode no ser considerada como um evento adverso.
Por exemplo:
Admisso para tratamento de condio preexistente no associada ao desenvolvimento de um

novo evento adverso ou com piora da condio preexistente;
Admisso social (por exemplo, o indivduo no tem lugar para dormir);
Admisso administrativa (por exemplo, para o exame clnico anual);
Admisso especificada em protocolo durante o estudo clnico (por exemplo, para realizao de
procedimento solicitado pelo protocolo do estudo);
Admisso opcional no associada ao evento adverso clnico precipitante (por exemplo, para
cirurgia cosmtica eletiva).
Entretanto, ocorrendo hospitalizao por um evento desconhecido, esta dever ser considerada
como evento adverso srio.
No entanto, no sero considerados admisso hospitalar os seguintes casos:
Atendimento em Pronto Socorro ou Unidades de Emergncia;

Procedimentos em regime ambulatorial/externos realizados no mesmo dia;
Unidades de observao de permanncia curta;
Unidades de reabilitao;
Casas de repouso;
Clnicas com enfermagem especializada;
Asilos e Casas de Sade;
Unidades de Pesquisa Clnica Fase I.
Prolongamento da hospitalizao definido como qualquer extenso da internao alm do

tempo previsto/necessrio em relao razo original para a admisso inicial, conforme
determinado pelo investigador principal ou pelo clnico. Para as hospitalizaes especificadas
no protocolo do estudo clnico, prolongamento definido como qualquer extenso no perodo de
internao alm da durao requerida em protocolo.
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Tratamentos ou procedimentos cirrgicos pr-planejados devem estar registrados na

documentao inicial durante o perodo do protocolo e para cada indivduo em particular.
Incapacidade a perda substancial da competncia de uma pessoa desempenhar normalmente as

funes da vida diria.
Qualquer evento adverso srio ou morte devem ser imediatamente notificados, independentemente
das circunstncias ou de suspeita de relao causal com a medicao, caso ocorra ou venha a ser
conhecida pelo investigador a qualquer momento durante o estudo at a ltima visita de
acompanhamento solicitada pelo protocolo ou at 30 dias aps a ltima tomada da medicao em
estudo, o que ocorrer por ltimo. Qualquer evento adverso srio que ocorra a qualquer momento
aps o trmino do estudo deve ser imediatamente notificado caso haja suspeita de relao causal
com a medicao em estudo. A nica exceo a estes procedimentos requeridos de relato refere-se
a eventos adversos srios que ocorrerem durante o perodo de washout durante o qual est sendo
administrado placebo isoladamente, ou nenhuma medicao ativa do estudo esteja sendo administrada,
como tambm nenhuma medicao de fundo especificada pelo protocolo .
Para todos os eventos adversos srios, o investigador tem o dever de fornecer as informaes mais
completas possveis. Em geral, isto inclui a descrio do evento adverso, com detalhes suficientes
que permitam avaliao clnica completa do caso, e avaliao independente de possvel relao
causal com a medicao em estudo. Devem ser fornecidas informaes sobre outras possveis causas
do evento, incluindo medicaes e doenas concomitantes. A avaliao do investigador em relao
causalidade tambm precisa ser fornecida. Se a causalidade desconhecida e o investigador no
sabe se foi ou no a droga em estudo que causou o evento, esta dever ento ser atribuda droga
em estudo. Se a avaliao de causalidade por parte do investigador desconhecida, porm, no
relacionada droga em estudo, isto dever estar claramente documentado nos registros do estudo.
Em caso de morte, um resumo dos achados da necrpsia dever ser arquivado junto com os
documentos do estudo. O investigador dever garantir que a informao notificada e que a informao
contida na Ficha Clnica sejam precisas e consistentes.
1.5.3. Resultados de testes laboratoriais anormais
Os resultados de todos os exames laboratoriais solicitados pelo protocolo devero ser registrados na
Ficha Clnica. Todos os resultados laboratoriais anormais clinicamente importantes que ocorrerem
durante o estudo devero ser repetidos a intervalos adequados de tempo at retornarem aos valores
do perodo basal ou a um nvel aceitvel pelo investigador ou at que seja feito um diagnstico que
explique tais alteraes.
Os critrios para determinar se um achado anormal de um teste deve ser reportado como evento
adverso so os seguintes:
Quando o resultado do teste est acompanhado de sintoma associado;

Quando o resultado do teste necessita de um exame diagnstico adicional ou interveno mdica/
cirrgica;
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Quando o resultado do teste leva a uma alterao da dose da medicao do estudo ou

descontinuao do estudo, introduo de um tratamento medicamentoso concomitante
significante ou outra terapia;
Quando o resultado do teste leva a qualquer um dos desfechos includos na definio de evento
adverso srio;
Quando o resultado do teste considerado pelo investigador principal ou pelo patrocinador
como evento adverso.
1.6. Das responsabilidades
1.6.1. Patrocinador
O Patrocinador responsvel por providenciar as informaes necessrias ao Investigador Principal

e seu grupo, de maneira que eles possam compreender os procedimentos do estudo, bem como
concordar com os requisitos do Pesquisador.
responsabilidade do Patrocinador a escolha do Centro de Pesquisa e do Investigador Principal.
O Patrocinador dever certificar-se de que o estudo seja conduzido de acordo com as normas de
Boas Prticas Clnicas e as regulamentaes locais, confirmando a aprovao do estudo pelo CEP,
antes do incio do mesmo.
Todos os medicamentos requeridos pelo estudo, de acordo com o protocolo, devero ser fornecidos
sem nus para os sujeitos da pesquisa e assegurar os benefcios resultantes do projeto, seja em
termos de retorno social, acesso aos procedimentos, produtos ou agentes da pesquisa (Resoluo
196/96CNS).
Ainda so obrigaes:
Providenciar tratamento para intercorrncias clnicas com os sujeitos da pesquisa;
Compensao por leses;
Relato dos eventos adversos para as Agncias Reguladoras;
Relatrio final do estudo;
Assinatura do contrato e protocolo c/ o investigador;
Monitorao do estudo;
Controle qualidade;
Verificao do acesso dos monitores aos dados;
Superviso da conduo da pesquisa;
Arquivo dos documentos;
Assegurar acesso ao medicamento em teste, caso se comprove sua superioridade em relao ao
tratamento convencional (Resoluo 251/97, CNS).
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1.6.2. Investigador principal
O Investigador principal deve ser qualificado por sua formao educacional, treinamento e experincia
para assumir a responsabilidade pela correta conduo dos estudos, bem como possuir todas as
qualificaes especificadas pelas legislaes vigentes. recomendvel que tais qualificaes sejam
documentadas.
responsabilidade do investigador principal garantir que os direitos e bem estar dos sujeitos da
pesquisa estejam garantidos, obtendo de forma correta, e no momento adequado, a assinatura do
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
Tambm so responsabilidades do investigador principal:
Supervisionar ou conduzir pessoalmente a pesquisa de acordo com as Normas de Boas Prticas

Clnicas;
Assegurar que todos os participantes dos estudos foram informados de suas obrigaes referentes
ao protocolo de pesquisa;
Assegurar que os sujeitos da pesquisa recebam os medicamentos sem nus;
Providenciar recursos, pessoal e instalaes necessrias e adequadas para a concluso a bom
termo do estudo;
Conhecimento do produto, protocolo e contedo da brochura do investigador;
Avaliao dos eventos adversos e evoluo;
Estar ciente das decises mdicas e tratamento dos eventos adversos;
Aderncia ao protocolo;
Uso adequado do medicamento da pesquisa;
Coleta, registro e notificao dos dados;
Assinatura do contrato e do protocolo;
Relato dos eventos adversos;
Manuteno do arquivo com os documentos necessrios;
Facilitar o acesso aos documentos para o monitor ou nas auditorias;
Delegao de responsabilidades aos subordinados, ou autorizar a realizao de etapas do estudo
em centros terceiros. Tal autorizao dever ser documentada de maneira formal e submetida
aos rgos competentes;
Garantir a aprovao pelo CEP e as revises necessrias;
Relatos peridico e final ao CEP.
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2. ESTUDOS DE BIODISPONIBILIDADE/BIOEQUIVALNCIA
DE MEDICAMENTOS ETAPA CLNICA
2.1. Introduo
A etapa clnica compreende desde a seleo dos voluntrios at a alta hospitalar e o ltimo retorno
para acompanhamento.
Ao ser montado um centro de estudos de biodisponibilidade/bioequivalncia que realize a etapa

clnica, deve se considerar que os participantes de tais estudos no tero benefcios teraputicos
diretos pela participao nos estudos. Dessa forma, todos os cuidados sero tomados para minimizar
os riscos inerentes administrao de medicamentos ou internao, alm de propiciar aos participantes
o maior conforto possvel.
Na instalao de um centro de pesquisa clnica para realizao de estudos de biodisponibilidade/

bioequivalncia, deve se levar em conta que tal centro no somente constitudo de suas instalaes
fsicas, que seguem uma legislao especfica, mas principalmente da interao de uma equipe que,
por princpio, multidisciplinar. Tendo em vista a multidisciplinaridade da equipe profissional
necessria para a realizao da etapa clnica de estudos, bem como a importncia desta fase nas
etapas seguintes (analtica e estatstica) e no resultado final do estudo. necessrio que os profissionais
envolvidos tenham conhecimentos gerais sobre os passos analticos e estatsticos, pois sua atuao
pode influenciar o resultado final dos estudos.
2.2. Instalaes
O centro deve estar com sua situao legal regularizada, possuindo um responsvel legal, bem como
autorizao de funcionamento junto ANVISA e apresentar condies de segurana em
conformidade com a legislao vigente. O investigador principal, responsvel pela conduo dos
estudos, dever estar definido, sendo que este no necessita ser simultaneamente seu representante
legal.
As instalaes devero ser, preferencialmente, exclusivas para pesquisa clnica. No dever ser realizado
o confinamento conjunto de voluntrios e enfermos.
Os quartos, ou enfermarias, devero possuir boa ventilao e iluminao, alm do espao mnimo,
exigido pelas legislaes sanitrias pertinentes, para o nmero de leitos instalados. Os sanitrios
devero estar em boas condies de higiene e uso e ser em nmero suficiente para o nmero mximo
de voluntrios a serem internados. O conjunto de quartos ou as enfermarias devero possuir posto
de enfermagem prximo. O pessoal de apoio dever ter a sua disposio vestirio, sala de estar e
sanitrios, em nmero suficiente e em boas condies de uso.
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O local destinado a realizao da etapa clnica dever possuir uma Unidade de Terapia Intensiva
(UTI), localizada em ponto de fcil acesso a partir do local de internao. Se o centro no possuir
UTI prpria, uma UTI mvel dever estar disposio dos voluntrios durante todo o perodo de
confinamento, bem como uma instituio de apoio, com UTI, dever estar ciente da realizao do
estudo clnico e concordar com o encaminhamento e recebimento de voluntrios para a mesma,
caso seja necessrio. Esta anuncia dever estar devidamente documentada.
A ala de internao dever contar com carrinho de emergncias, contendo ambu, laringoscpio,
cnulas de entubao oro-traqueal, cardioversor, seringas descartveis e medicamentos necessrios
para realizao de procedimentos de reverso de parada crdio-respiratria, ou para o tratamento de
eventos que potencialmente possam originar uma parada crdio-respiratria. Tais itens devero
estar disponveis durante todo o perodo referente Etapa. necessrio ainda que o local de
internao disponha de gerador eltrico de emergncia, bem como os equipamentos eltricos
imprescindveis sejam ligados a estabilizadores de voltagem e no breaks.
2.3. Recrutamento e seleo dos voluntrios
Os voluntrios podem comparecer espontaneamente a um centro clnico de biodisponibilidade/

bioequivalncia ou serem recrutados por meio de anncios, desde que os anncios sejam previamente
aprovados por um CEP. Aps ser informado da natureza do estudo e assinar o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido, o voluntrio ser submetido a uma consulta mdica e a exames
complementares de acordo com a legislao vigente e o protocolo de pesquisa em questo.
Caso alguma anormalidade (enfermidade) seja constatada durante o processo de seleo o indivduo
dever ser encaminhado para um servio de sade para o devido acompanhamento. Estes dados
devero estar devidamente documentados na ficha clnica do estudo em questo.
Todo o processo de recrutamento e seleo de voluntrios dever estar devidamente descrito, ser
conhecido e seguido por todos os profissionais envolvidos.
2.4. Internao e alta dos voluntrios
Os voluntrios selecionados para um ensaio de biodisponibilidade/bioequivalncia devero ser

internados na noite anterior ao incio do estudo, sendo reavaliados por mdico, no momento da
internao, preferencialmente em consultrio da unidade clnica, onde tero seus dados vitais (pulso,
presso arterial e temperatura) avaliados. Tal medida busca reduzir as eventuais interferncias que
possam ocorrer na farmacocintica do medicamento a ser administrado, devido ingesto de bebidas
alcolicas, poucas horas de sono ou atividade fsica intensa nas horas que antecedem ao estudo, bem
como identificar acontecimentos entre a seleo e a internao de possveis fatores de excluso que
possam impedir o voluntrio de participar da fase clnica naquele momento.
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Os procedimentos relativos internao e alta dos voluntrios devero ser padronizados em

documento especfico e seguidos pelos responsveis pela admisso e liberao. Os equipamentos
utilizados na avaliao pr- internao (esfigmomanmetro, estetoscpio e termmetro) devero
estar em boas condies de uso. recomendvel que ao ser admitido, o voluntrio receba uma
programao dos eventos a serem realizados durante o perodo de confinamento, na qual conste,
no mnimo, os horrios previstos para a administrao do medicamento, refeies, coletas e liberao.
Aps o trmino das fases de administrao do medicamento e coletas de material biolgico previstas
no protocolo, o individuo dever obrigatoriamente ser submetido a uma nova avaliao mdica e
aos exames subsidirios previstos no protocolo de estudo para diagnstico de possveis intercorrncias
que por ventura tenham sido ocasionadas pela participao no ensaio clnico.
2.5. Administrao do medicamento e coleta de material biolgico
Os voluntrios devero permanecer em jejum por um perodo mnimo de 8 h antes da administrao

dos medicamentos a serem estudados. Imediatamente antes do incio da administrao do
medicamento, dever ser assegurada uma veia perifrica para a obteno do material biolgico, a
qual dever ser mantida pelo perodo necessrio.
As coletas devero ser realizadas de acordo com as caractersticas farmacocinticas do medicamento

a ser estudado, conforme protocolo de pesquisa, sendo que a primeira coleta (coleta basal) dever
ser obrigatoriamente realizada antes da administrao do medicamento (em torno de trinta minutos).
Todos os procedimentos de administrao do medicamento, coleta, preparo e armazenamento de

amostras devero estar registrados em documento especfico, com identificao do responsvel. Os
tempos determinados pelo protocolo para a coleta das amostras devero ser rigorosamente seguidos.
Qualquer intercorrncia na coleta dever ser registrada na planilha correspondente.
O medicamento dever ser administrado conforme descrito no protocolo, sob superviso mdica,
por enfermeiro, farmacutico ou profissional habilitado. Os voluntrios devero ser supervisionados
por mdico nas horas posteriores aps administrao do medicamento, em perodo suficiente para
assegurar suporte mdico a eventuais efeitos adversos. Os dados vitais dos voluntrios devero ser
controlados durante todo o perodo de confinamento. Medidas complementares devero ser adotadas
caso o protocolo da pesquisa assim o determine. Eventuais intercorrncias devero ser devidamente
documentadas.
A unidade clnica dever manter mdico plantonista durante todo o perodo de internao, que
dever estar ciente da realizao do estudo de biodisponibilidade/bioequivalncia, quando no
diretamente envolvido com este. Neste caso, o mdico responsvel pela etapa clnica dever ser
facilmente localizvel e estar disponvel para resoluo de eventuais intercorrncias. A ocorrncia
de eventos adversos, sua intensidade, bem como as medidas tomadas para sua reverso, devero ser
devidamente registradas em documento apropriado, com identificao e assinatura do responsvel
pelo atendimento ao voluntrio, bem como pelo pesquisador principal. A ocorrncia de efeitos
adversos graves dever ser documentada e notificada s autoridades competentes.
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Durante o perodo de internao, a dieta dos voluntrios dever ter a superviso de um nutricionista
e ser definida de modo a no interferir com a anlise e farmacocintica do medicamento estudado.
2.6. Manuseio das amostras biolgicas
As amostras biolgicas devero ser preparadas para armazenamento, de forma padronizada e seguindo
as caractersticas conhecidas do frmaco e metodologia de dosagem (p. ex.: plasma, sangue total ou
soro, sensibilidade temperatura ou luz, entre outras). Os freezers utilizados devero ter sua
temperatura monitorada de modo a garantir a integridade das amostras. Todos os procedimentos
devero ser padronizados, realizados por profissionais qualificados e todos os passos do processo,
bem como os responsveis pelos mesmos, devero ser identificados e registrados.
2.7. Documentao
Todos os projetos de pesquisas, a fim de comprovar a biodisponibilidade de um medicamento em

relao ao produto de referncia, devero compor um protocolo de pesquisa, com todos os
documentos preconizados pelas Resolues n 196/96 e n 84/02 e seus Guias e apresent-lo a um
CEP para apreciao.
Todo estudo dever seguir as normas de boas prticas clnicas e os regulamentos locais em vigor,
devendo ser realizado em conformidade com o protocolo do estudo.
2.7.1. Protocolo de pesquisa
O protocolo de pesquisa, em sua forma mais abrangente, conforme a Resoluo 196/96 item II
Termos e Definies, o conjunto de documentos que contm a descrio da pesquisa em seus
aspectos fundamentais, informaes relativas ao sujeito da pesquisa, qualificao dos pesquisadores
e a todas as instncias responsveis.
O contedo de um protocolo de pesquisa pode variar na dependncia do tipo de estudo, sendo que
a Resoluo 196/96 explicita as informaes que devem estar contidas neste.
2.7.2. Protocolo clnico
Por definio, o protocolo clnico o documento que descreve os objetivos, desenho, metodologia,
consideraes estatsticas, e organizao de um estudo clnico. Os protocolos tambm contm o
histrico para o estudo clnico e sua justificativa.
Uma outra fonte de informaes para a montagem de um protocolo clnico a Conferncia

Internacional de Harmonizao (ICH). Segundo a lCH as sees que podem estar contidas em um
protocolo so:
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Informaes gerais:
o Ttulo, nmero e data do protocolo;
o Pargrafo de Confidencialidade;
o Nome e endereo do patrocinador e monitor (caso no seja o patrocinador);
o Nome, endereo dos laboratrios clnicos;
o Nomes e ttulos dos investigadores e co-investigadores;
Informaes do Desenho do Estudo:
o Tipo de estudo e desenho;
o Objetivos primrios e objetivos secundrios;
o Descrio dos procedimentos de randomizao e blinding ;
o Tratamentos do estudo e regime de doses incluindo as informaes de
embalagem e rtulo;
Informaes da Populao do estudo:
o Nmero de pacientes;
o Durao da participao dos sujeitos;
o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido;
o Manuteno dos cdigos de randomizao e procedimentos para abertura dos
cdigos (estudo duplo-cego);
Seleo e Descontinuao:
o Critrios de incluso;
o Critrios de excluso;
o Critrios de descontinuao de pacientes;
! quando e como descontinuar;
! tipo de dados a serem coletados;
! substituio dos sujeitos;
! follow-up dos sujeitos descontinuados;
o Tratamento dos Sujeitos;
! nomes de todos os produtos, doses, escalas de doses, via de administrao,
perodo de tratamento e perodo de acompanhamento;
! medicaes/tratamentos permitidos e no-permitidos antes e durante o
estudo;
o Procedimentos de monitorizao da aderncia;
Avaliaes de Eficcia e Segurana:
o Especificao dos parmetros de eficcia e segurana;
o Mtodos e tempo para avaliar, registrar e analisar estes parmetros;
o Procedimentos para registro e reporte de eventos adversos e doenas
intercorrentes;
o Tipo e durao do acompanhamento dos sujeitos aps a ocorrncia de evento
adverso;
Conduta do estudo:
o Freqncias das monitorizaes;
o Auditoria;
o Manuteno dos dados e dos registros;
o Poltica de Publicao;
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o Procedimentos para monitorizar a aderncia dos sujeitos (compliance);

Outros:
o Parmetros laboratoriais clnicos;
o Terapia concomitante;
o Documentao da aprovao do investigador e data (pgina de assinaturas);
o Financiamento e seguro;
o Acesso direto;
o tica.
Todos os documentos solicitados a compor o protocolo constituem-se em ferramentas fundamentais

para o exerccio da apreciao tica pelos membros do CEP. Dentre estes, especial ateno deve ser
dada ao Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) a ser assinado pelo voluntrio da
pesquisa.
2.7.3. Termo de consentimento livre e esclarecido
A Resoluo 196/96 no item IV Consentimento Livre e Esclarecido aborda todos os aspectos

que devem ser contemplados no TCLE, aos quais o pesquisador deve atentar quando de sua
confeco. Especial ateno deve ser dada ao processo de obteno do TCLE, que, a despeito
somente da obteno de uma assinatura, compreende um verdadeiro processo educativo para o
sujeito de pesquisa.
O Termo de Consentimento Livre e Esclarecido deve fornecer ao sujeito do estudo toda a informao
necessria sobre o estudo para que o mesmo possa decidir sobre sua participao na pesquisa. O
sujeito do estudo deve ter liberdade para fazer perguntas livremente, esclarecendo qualquer dvida
que exista, bem como ter tempo adequado para refletir sobre sua participao.
O consentimento Livre e Esclarecido deve ainda:
Ser aderente Resoluo 196/96/GCP/Declarao de Helsinki;

Ser aprovado por um Comit de tica antes de sua utilizao;
Ser revisado toda vez que informaes novas surgirem;
Ser escrito em linguagem acessvel ao sujeito do estudo;
No levar o sujeito a abdicar de nenhum de seus direitos legais;
Uma cpia do termo de consentimento assinado ser entregue ao sujeito;
Ser escrito em linguagem acessvel;
Abordar que o estudo envolve pesquisa;
Que a participao do sujeito no estudo voluntria;
Fornecer a justificativa, os objetivos e procedimentos que sero utilizados na pesquisa,
incluindo todos os procedimentos invasivos;
Os desconfortos e riscos possveis e os benefcios esperados e caso no haja benefcio clnico
pretendido ao sujeito, o mesmo deve ter conscincia deste fato;
Os mtodos alternativos existentes, bem como seus benefcios e riscos potenciais;
As responsabilidades do sujeito participante do estudo;
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Os aspectos experimentais do estudo;

A forma de acompanhamento e assistncia, assim como seus responsveis;
A durao esperada da participao do sujeito no estudo;
O nmero aproximado de sujeitos envolvidos no estudo;
A garantia de esclarecimentos, antes e durante o curso da pesquisa, sobre a metodologia,
informando a possibilidade de incluso em grupo controle ou placebo e a probabilidade de
incluso em cada brao;
A pessoa de contato no caso de esclarecimentos adicionais em relao ao estudo e direitos
dos sujeitos envolvidos. Quem contatar no caso de eventuais danos decorrentes da pesquisa;
As formas de ressarcimento das despesas decorrentes da participao na pesquisa;
As formas de indenizao diante de eventuais danos decorrentes da pesquisa;
Que o(s) monitores, auditor(es), Comits de tica em Pesquisa e autoridades regulatrias
tero acesso direto aos registros mdicos originais do sujeito para verificao dos
procedimentos do estudo clnico e/ou seus dados, sem violar sua confidencialidade frente
s leis e regulamentaes aplicveis e que, assinando o Consentimento Livre e Esclarecido,
o sujeito ou seu representante legal autorizam este acesso;
Os registros que identificam o sujeito sero mantidos confidenciais em conformidade com
as leis e regulamentaes aplicveis, e no se tornaro de uso pblico. Se os resultados do
estudo forem publicados, a identidade do sujeito ter sua confidencialidade resguardada;
O sujeito ou seu representante legal ser informado se alguma informao nova que possa
ser relevante para a deciso do sujeito em relao a sua participao no estudo venha a
surgir;
Fornecer proteo para populaes vulnerveis.
Como exemplos de populaes vulnerveis, temos:
Crianas;
Membros das foras armadas;
Empregados subordinados a hospitais e laboratrios;
Estudantes de medicina;
Minorias tnicas;
Pessoas em casas de repouso;
Pessoas mentalmente incapacitadas;
Pacientes com doenas incurveis ou em situaes de emergncia;
Desempregados, mendigos, desabrigados, refugiados, nmades, menores, etc.
muito importante ressaltar, dentre os vrios itens acima, que a obteno do Consentimento Livre
e Esclarecido dever ocorrer antes que qualquer procedimento seja realizado com o sujeito da
pesquisa, bem como se exige que o esclarecimento aos sujeitos da pesquisa se faa em linguagem
acessvel.
O Consentimento Livre e Esclarecido dever ser datado e assinado pelo participante do estudo,
bem como pelo responsvel pela aplicao do mesmo.
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2.7.4. Ficha clnica
Uma ficha clnica do estudo que inclua as informaes necessrias para a identificao do estudo e
do sujeito participante dever existir. Este documento contm os dados referentes ao
acompanhamento do voluntrio. Estes dados so considerados confidenciais, preservando a
identidade do voluntrio.
necessrio que o Protocolo Clnico e seu respectivo Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
sejam aprovados por um Comit de tica em Pesquisa (CEP) Registrado pela CONEP (Comisso
Nacional de tica em Pesquisa) antes do incio da pesquisa.
Qualquer emenda que este protocolo clnico ou Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
venha a sofrer no decorrer do estudo tambm dever ser encaminhada ao CEP para aprovao.
Caso a emenda vise resguardar a segurana do sujeito do estudo, a mesma poder ser implementada
imediatamente, sendo de maneira concomitante encaminhada ao CEP para a devida aprovao.
Havendo alterao do Consentimento Livre e Esclarecido, os sujeitos da pesquisa que ainda estiverem
participando da mesma devero assinar tambm a nova verso do consentimento.
As caractersticas do Comit de tica em Pesquisa esto na Resoluo 196/96 item VII Comit de
tica em Pesquisa CEP.
O Comit dever ter ao menos 7 membros, no devendo haver mais que metade de seus membros
pertencentes mesma categoria profissional. Sua constituio ter carter multi e transdisciplinar,
incluindo pessoas dos dois sexos e a participao de profissionais da rea de sade, das cincias
exatas, sociais e humanas, incluindo, por exemplo, juristas, telogos, socilogos, filsofos, bioeticistas
e, pelo menos, um membro da sociedade representando os usurios da instituio. Poder variar na
sua composio, dependendo das especificidades da instituio e das linhas de pesquisa a serem
analisadas.
O Comit de tica em Pesquisa poder ou no pertencer a Instituio na qual o estudo realizado,

podendo valer-se de consultores ad hoc para anlises especficas. Caso a Instituio no tenha um
CEP, um CEP independente ou de outra Instituio poder ser utilizado, desde que este CEP seja
registrado pela CONEP.
Membros do CEP envolvidos em estudos clnicos no podero participar da votao de projetos

dos quais estejam participando.
Os documentos acima referidos, originais ou cpia, conforme aplicvel, devero estar devidamente
arquivados junto a outros documentos do estudo disposio para inspees, pelo patrocinador e/
ou agncia reguladora, que por ventura venham a ocorrer.
Todos os documentos relativos a biodisponibilidade/bioequivalncia de um estudo clnico devero

ser arquivados por um prazo mnimo de 15 anos, e devero estar disponveis para possveis verificaes
por parte das autoridades regulatrias.
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2.8. Das responsabilidades
2.8.1. Patrocinador
Monitorao do estudo.
Controle de qualidade.
Superviso da conduo da pesquisa.
Arquivo dos documentos.
Subveno financeira e logstica.
2.8.2. Investigador principal
O investigador principal responsvel perante a ANVISA por todas as fases do estudo, mesmo
aquelas no realizadas em seu centro, pela exatido dos dados apresentados, bem como pelo
cumprimento do delineamento experimental apresentado no protocolo de pesquisa.
24 de 25
3. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Goldman DS. Principles of the Good Laboratory Practice Regulations Applied to Pharmacokinetics.
In Welling PG e Tse FLS (eds). Pharmacokinetics. Regulatory-Industrial-Academic Perspectives.
Second Edition Marcel Dekker, Inc, New York, Basel, Honk Kong, 1995, pgs 1-20
Gomes, GR. Manual de Investigacin Clnica. Editorial ICIC, 1999, 25-210.
Hutchinson, D. The Trial Investigators GCP Handbook: a pratical guide to ICH requerements.
Brookwood Medical Publications Ltd., 1997, 4-47.
Hutchinson, D. Which documents, why? A guide to essential clinical trial documentation for
investigators. Brookwood Medical Publications Ltd., 1997, 3-36.
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J. Jackson (ed). Generics and Bioequivalence. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo,
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Narang PK. Issues in bioequivalence: An industrial Scientists Perspective. In Andr J. Jackson (ed).
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Shargel L, Yu ABC. Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics. Fourth Edition. Appleton &
Lange , USA, 1999
25 de 25
FICHA TCNICA
Volume I Mdulo 2 Etapa Analtica
Editores:
Flvio Leite PUC Campinas
Pedro Eduardo Froehlich UFRS
Rui Oliveira Macedo UFPA
Colaboradores:
Davi Pereira de Santana UFPE
Itapuan Abimael Silva ANVISA
Jaime Oliveira Ilha Cartesius
Karen Noffs Brisolla ANVISA
Max Weber Pereira ANVISA
Pedro de Lima Filho ANVISA
Rafael Eliseo Barrientos Astigarraga Cartesius
Silvana Calafatti de Castro UNIFAG
Thas Reis Machado
Coordenao:
Apoio Logstico:
SUMRIO
1. FUNDAMENTAO TERICA - MATERIAIS E REAGENTES ............................. 05

1.1. Introduo ................................................................................................................................ 05
1.2. Substncias qumicas de referncia (SQR) e padro interno ............................................. 06
1.2.1. SQR disponvel comercialmente ............................................................................... 06
1.2.2. SQR no disponvel comercialmente ....................................................................... 06
1.2.3. Laboratrio analtico autorizado (LAA) .................................................................. 07
1.3. Metablitos ............................................................................................................................... 07
1.4. Padres internos ....................................................................................................................... 07
1.5. Armazenamento e manuseio .................................................................................................. 07
1.6. Reagentes e solventes .............................................................................................................. 08
1.6.1. Estocagem .................................................................................................................... 08
1.6.2. gua grau cromatogrfico ......................................................................................... 08
1.7. Vidraria ...................................................................................................................................... 08
1.8. Balanas ..................................................................................................................................... 09
1.8.1. Instalao...................................................................................................................... 09
1.8.2. Manuteno e conservao ........................................................................................ 10
1.9. Equipamentos com temperatura controlada........................................................................ 10
1.10. Tubos de amostragem e anlise ............................................................................................. 10
2. MTODO BIOANALTICO ..................................................................................................... 11

2.1. Introduo ................................................................................................................................ 11
2.2. Pr-validao............................................................................................................................. 11
2.2.1. Exatido, preciso e recuperao .............................................................................. 11
2.2.2. Linearidade e limites de quantificao ..................................................................... 12
2.2.3. Especificidade/Seletividade ....................................................................................... 12
2.3. Estabilidade dos frmacos em fluidos biolgicos ............................................................... 13
2.3.1. Introduo.................................................................................................................... 13
2.3.2. Reviso da literatura .................................................................................................... 13
2.3.3. Cintica de degradao ............................................................................................... 15
2.3.4. Problemas analticos relacionados estabilidade .................................................... 18
2.4. Armazenamento das amostras ............................................................................................... 19
2.5. Validao do mtodo ............................................................................................................... 19
2.5.1. Introduo.................................................................................................................... 19
2.5.2. Mtodo bioanaltico .................................................................................................... 20
2.5.3. Ferramentas para a validao ..................................................................................... 21
2.5.4. Glossrio ...................................................................................................................... 23
2.6. Fluxograma operacional da etapa analtica da bioequivalncia ......................................... 26
3. RECOMENDAES PARA A ETAPA ANALTICA ........................................................ 28

3.1. Materiais de referncia ............................................................................................................ 28
3.1.1. Reagentes e solventes ................................................................................................. 28
3.1.2. Balanas e pesos de calibrao .................................................................................. 28
3.1.3. Termmetros e outros dispositivos de verificao de temperatura ..................... 28
3.1.4. Peagmetro (pHmetro) .............................................................................................. 28
3.1.5. Centrfuga ..................................................................................................................... 28
3.1.6. Sistema de evaporao de amostras .......................................................................... 29
3.1.7. Vidraria ......................................................................................................................... 29
3.1.8. Pipetas ........................................................................................................................... 29
3.2. Recebimento de amostras ....................................................................................................... 29
3.3. Estudo de estabilidade ............................................................................................................ 30
3.3.1. Estabilidade de curta durao ................................................................................... 30
3.3.2. Estabilidade de mdia durao .................................................................................. 31
3.3.3. Estabilidade de longa durao ................................................................................... 31
3.4. Validao ................................................................................................................................... 32
3.4.1. Seletividade .................................................................................................................. 32
3.4.2. Recuperao ................................................................................................................. 32
3.4.3. Limites .......................................................................................................................... 33
3.4.4. Linearidade ................................................................................................................... 34
3.4.5. Preciso......................................................................................................................... 34
3.4.6. Exatido ....................................................................................................................... 36
3.4.7. Aceitao da validao................................................................................................ 36
3.5. Aplicao do mtodo validado no estudo ............................................................................ 36
4. REFERNCIAS BILBIOGRFICAS ........................................................................................ 38

Volume I / Mdulo 2 - Etapa Analtica
1. FUNDAMENTAO TERICA MATERIAIS E REAGENTES
1.1. Introduo
O uso de substncias qumicas de elevado grau de pureza fundamental para assegurar a qualidade
dos dados analticos (GARFIELD, 1997; CROSBY et al., 1997).
Assim como os reagentes qumicos utilizados, o uso de SQR fundamental para uma correta
quantificao dos frmacos e/ou seus metablitos.
Para uma melhor compreenso deste material, algumas definies so importantes:
Padro primrio: de acordo com SKOOG & WEST (1979), uma substncia deve apresentar as
seguintes caractersticas:
deve apresentar elevado grau de pureza, que deve ser determinado;

deve ser estvel;
no deve ser higroscpico ou eflorescente;
deve ser de fcil obteno e preferencialmente de baixo custo;
deve apresentar um peso molecular relativamente elevado.
Como exemplos de padro primrio temos o dicromato de potssio, carbonato de sdio e biftalato
de potssio.
Esta ltima definio parece ser a mais adequada para frmacos, uma vez que a maioria destes no
satisfaz as condies descritas por Skoog & West.
As definies abaixo so baseadas em publicaes do National Institute of Standards and Technology

(NIST) e a Farmacopia Americana (USP 25) e aceitos pela AOAC (Association of Officials Analytical
Chemists), conforme resumidas por GARFIELD (1997):
Material de referncia certificado (MRC): material com uma ou mais propriedades certificadas
por procedimentos tcnicos vlidos, acompanhados por ou rastreveis a um certificado ou outro
tipo de documentao emitida por um rgo certificador.
Material de referncia padro (MRP): material produzido pelo NIST. MRPs so certificados em
relao a propriedades fsico-qumicas especficas e acompanhados de certificados que reportam os
resultados e indicam o uso do material.
Padres de referncia USP (USP Reference Standards): so frmacos purificados ou em elevado

grau de pureza, distribudos pela USP aps recomendao do USP Reference Standards Committee.
A seleo dos lotes de matrias-primas utilizadas na preparao destes padres esto baseadas nas
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caractersticas crticas de cada frmaco, analisados por trs ou mais laboratrios, entre os laboratrios
da USP, FDA, acadmicos ou privados. (USP 25)
Padro de trabalho ou padro secundrio: preparado a partir da anlise de um lote de material de

pureza adequada contra um do padro ou SQR certificado, utilizando metodologia oficial e mantendo
o registro das anlises. Quando este padro de trabalho utilizado na anlise de uma amostra, a
SQR a partir da qual ele foi preparado deve ser mencionada.
Alm da USP, vrias outras farmacopias, como a Europia e a Britnica, produzem seus padres.
Estas instituies chamam seus padres de substncias qumicas de referncia (do ingls
chemical reference substance, ou simplesmente CRS). Alm destas, padres qumicos e
biolgicos de vrios frmacos tambm so distribudos pela Organizao Mundial da Sade (OMS).
Procedimento semelhante foi adotado, recentemente, pela Farmacopia Brasileira (F.Bras.) Em 2000,
foi nomeada a Comisso de Material de Referncia (Port. 733, DOU 201-E, de 18/10/2000), que
iniciou a produo das primeiras substncias qumicas de referncia (SQR) da Farmacopia Brasileira.
Conforme Resoluo RDC n 56, de 26 de fevereiro de 2002, D.O. de 27/02/2002, aps disponveis,
as SQR da F. Bras. so as SQR oficiais em territrio nacional e devem ser utilizadas obrigatoriamente
em relao s demais anteriormente citadas.
1.2. Substncias qumicas de referncia (SQR) e padro interno
O grau de pureza das substncias qumicas utilizadas como referncia nos estudos analticos pode
afetar a qualidade dos resultados. O termo SQR refere-se aos padres do frmaco em estudo e
seu(s) metablito(s), quando for o caso. So substncias de elevado grau de pureza, devidamente
certificadas. Podem ser de dois tipos:
1.2.1. SQR disponvel comercialmente
Sempre que disponveis, devero ser utilizadas SQRs da Farmacopia Brasileira ou aquelas fornecidas
por outras instituies/empresas reconhecidas nacional ou internacionalmente, desde que possibilitem
seu rastreamento.
1.2.2. SQR no disponvel comercialmente
Deve ser obtida a partir de substncias de grau farmacutico, acompanhado do respectivo certificado
de anlise do lote e em quantidade suficiente para a produo de um padro de trabalho que ser
utilizado nos estudos como referncia. Este padro de trabalho somente poder ser produzido por
um Laboratrio Analtico Autorizado (LAA), que dever manter os registros analticos. Existem
aqui duas possibilidades para desenvolver o roteiro de anlises para quantificar a matria-prima
como padro de trabalho:
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Existe monografia farmacopica disponvel
Neste caso o LAA dever realizar todos os ensaios previstos na monografia e emitir um certificado
de anlise, sendo o teor obtido no ensaio de doseamento o valor de pureza adotado para o padro
de trabalho;
Obs.: Caso a monografia no esteja disponvel na ltima edio da Farmacopia Brasileira, utilizar
preferencialmente as edies mais recentes das farmacopias Europia, Britnica, Americana ou
Portarias do INMETRO.
No existe monografia farmacopica
Sero admitidos estudos com substncias qumicas desde que comprovado sua certificao.
1.2.3. Laboratrio analtico autorizado (LAA)
LAA so os laboratrios REBLAS e Centros Analticos de Bioequivalncia, desde que apresentem

capacidade tcnica comprovada para o desenvolvimento da metodologia analtica indicada.
1.3. Metablitos
No caso de metablitos, o centro analtico dever comprovar, atravs de certificado de anlise do

fornecedor ou ensaios realizados no prprio centro, que estes apresentam um grau de pureza definido
e adequado para ser utilizado como padro de trabalho.
1.4. Padres internos
Os padres internos utilizados devem apresentar grau analtico (p.a.) ou superior, de maneira que
no interfiram na anlise.
1.5. Armazenamento e manuseio
As SQRs devem ser armazenadas conforme instrues do distribuidor. Normalmente, devem ser
armazenadas em local fresco, ao abrigo da luz e com baixa umidade, sempre em frascos bem vedados.
No ato do recebimento deve ser aberta uma cadeia de custdia para cada frasco recebido, na qual se
controle o uso da SQR por meio de registro de massa utilizada para cada finalidade, com visto de
quem utilizou. Junto cadeia de custdia devem ser guardados os certificados de anlise das
substncias. Deve ser registrado tambm o fim dado massa que sobrou da SQR aps o vencimento
do prazo de validade.
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1.6. Reagentes e solventes
Os reagentes e os solventes utilizados nos estudos no devem interferir nos resultados. Isto deve ser
verificado atravs de procedimentos adequados.
Devem ser estabelecidos procedimentos de controle de fornecedores de maneira a assegurar que

solventes e reagentes adquiridos tenham a qualidade desejada. Recomenda-se que os fornecedores
apresentem certificados analticos, assim como evidncias documentadas para assegurar a
confiabilidade dos mesmos.
1.6.1. Estocagem
As reas de estocagem de substncias, reagentes, solventes e solues devem ser adequadas.
1.6.2. gua grau cromatogrfico
Deve ter qualidade compatvel com o uso em HPLC. Pode ser:
- deionizada
- destilada
- bi-destilada
- ultra-pura
A pureza da gua deve ser comprovada atravs de testes adequados.
1.7. Vidraria
A medida precisa de volume to importante em muitos mtodos analticos como a medida de

massa. Para tanto, preciso considerar alguns pontos imprescindveis para a medio exata de um
determinado volume como manuteno dos instrumentos de medio, qualidade dos instrumentos
e calibrao peridica.
As marcas de volume so feitas pelos fabricantes com os equipamentos volumtricos bem limpos.
Um nvel de limpeza anlogo deve ser mantido no laboratrio se estas marcas forem usadas com
confiana. Somente superfcies de vidro limpas sustentam um filme uniforme de lquido. Poeira ou
leo rompe este filme. Portanto, a existncia de rupturas no filme uma indicao de uma superfcie
suja.
O volume ocupado por dada massa de lquido varia com a temperatura, assim como varia tambm
o recipiente no qual est colocado o lquido, durante a medida. Entretanto, a maioria dos equipamentos
de medida de volume feita de vidro, o qual felizmente tem pequeno coeficiente de expanso.
Conseqentemente, as variaes no volume em funo da temperatura de um recipiente de vidro
no precisam ser consideradas em trabalhos em qumica analtica. As medidas volumtricas devem
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tomar como referncia alguma temperatura padro; este ponto de referncia geralmente 20C. O
coeficiente de expanso para lquidos orgnicos pode requerer correes para diferenas de
temperatura de 1C ou at menos, o que torna extremamente importante o controle de temperatura
ambiente dos laboratrios.
De uma maneira geral, os procedimentos analticos so conduzidos a uma temperatura que varia
entre 15 e 25oC. (British Pharmacopoeia, 2000)
A vidraria volumtrica pode ser calibrada individualmente pelo INMETRO, ou laboratrio certificado
pelo INMETRO. Porm, vidraria Classe A satisfaz os padres internacionais estabelecidos pela
International Organisation for Standardization. (British Pharmacopoeia, 2000; GARFIELD, 1997;
USP 25)
O laboratrio deve verificar periodicamente os volumes dispensados pela vidraria volumtrica,

utilizando para isso a massa da gua. Para as pipetas, deve ser observado o tempo de escoamento,
normalmente impresso no vidro e, ao final, tocar a parede do recipiente para onde est sendo
transferido o volume com a ponta da mesma para escoar todo o contedo. (USP 2002)
A exatido da vidraria Classe A a seguinte:
1.8. Balanas
Balanas (de acordo com Port. 236, de 22 de dez de 1994, do Inmetro)

Pesos padro (de acordo com Port. 233, de 22 de dez de 1994, do Inmetro)
1.8.1. Instalao
As balanas analticas devem estar instaladas em local adequado, niveladas, livres de correntes de ar,
em bancada exclusiva para as mesmas e estvel. Sempre que possvel em sala com temperatura
controlada.
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1.8.2. Manuteno e conservao
A balana deve ser imediatamente limpa aps cada uso. Deve haver um programa de manuteno e
conservao da balana, que inclua calibraes peridicas (no mnimo, anualmente), com todas as
informaes registradas em um livro de registros.
Para as balanas analticas utilizadas em laboratrio (Classe I), o valor da diviso real de verificao
(d) deve ser de 0,1 mg ou inferior. (Port. 236, de 22 de dez de 1994, do Inmetro)
A carga mnima (min) da balana no deve ser inferior a 100 x d.
Ex.: Balana analtica com capacidade para 200 g e sensibilidade de 0,1 mg.
min = 100 x 0,1 = 10,0 mg
Porm, de acordo com a USP 25 (2002), a incerteza da pesagem (erro sistemtico + randmico) no
deve ser superior a 0,1% da massa pesada.
No caso de balanas eletrnicas que no possuam sistema de auto-calibrao, a aferio deve ser
feita diariamente, no incio do trabalho, e os registros adequadamente armazenados. Os pesos
utilizados devem ser recertificados anualmente.
1.9. Equipamentos com temperatura controlada
Refrigerador e freezer devero ter suas temperaturas verificadas diariamente e registradas no livro
de uso. Deve haver um termmetro de mxima e mnima, sendo que a temperatura mxima e
mnima do perodo dever ser anotada. O local mais adequado para colocar os termmetros na
parte central interna do equipamento. Caso a leitura da temperatura seja feita por pares trmicos,
estes devem ser calibrados anualmente junto a RBC. Deve haver um POP para refrigerador/freezer
descrevendo uso, manuteno, limpeza e descontaminao.
Em caso de equipamentos que faam registros automticos de temperatura, estes devem permitir
uma verificao diria da temperatura e os dados impressos ou anotados sero armazenados para
controle.
1.10. Tubos de amostragem e anlise
Podem ser de polipropileno ou polietileno de alta densidade e no devem ser reaproveitados. Deve-
se evitar o uso de tubos de vidro, que podem quebrar durante o armazenamento ou transporte. Ao
trocar fornecedor e/ou tipo de material, realizar teste de recuperao e branco para verificar se no
existe interferncia do material no resultado das anlises.
10 de 41
2. MTODO BIOANALTICO
2.1. Introduo
A realizao de uma pesquisa bibliogrfica a primeira etapa para a busca do mtodo bioanaltico.
Uma vez existindo o mtodo, ele dever ser testado quanto a sua reprodutibilidade. Na inexistncia
de um mtodo bioanaltico para um determinado frmaco, o centro analtico deve desenvolver um
mtodo que responda satisfatoriamente ao estudo desejado.
A realizao prvia das etapas necessrias no desenvolvimento do mtodo analtico para os estudos
de bioequivalncia assegura ao centro analtico e ao seu contratante que os servios contratados
sero realizados no tempo previsto e com a confiabilidade necessria dos resultados, os quais sero
avaliados para fins de registro do medicamento em estudo. Neste contexto pode-se afirmar que
contratado e contratante no perdero tempo e nem recursos financeiros adicionais se por acaso os
estudos realizados forem rejeitados no seu trmino em funo da inadequabilidade do mtodo
utilizado e das condies de armazenamento no determinadas.
2.2. Pr-validao
Os estudos de bioequivalncia empregam a utilizao de voluntrios humanos, em nmero

relativamente elevado, que no podem ser envolvidos no estudo sem a certeza de que os seus
sacrifcios resultem num benefcio para a sociedade. A certeza desses resultados para os voluntrios
s pode ser garantida se o mtodo analtico para realizao do estudo tiver sido desenvolvido
previamente de forma a assegurar que os fludos biolgicos obtidos dos voluntrios sero devidamente
analisados.
No desenvolvimento de um mtodo necessrio verificar toda a metodologia de preparao da

amostra, a qual envolve os processos de extrao, separao, purificao, identificao e quantificao
do frmaco na matriz biolgica. Para tanto, alguns estudos preliminares de validao devem ser
efetuados visando determinao dos seguintes parmetros: (3) exatido, preciso e recuperao;
(2) linearidade e limites de quantificao; (1) seletividade.
2.2.1. Exatido, preciso e recuperao
A exatido de um mtodo analtico descreve a proximidade dos resultados mdios obtidos pelo
mtodo em relao ao valor verdadeiro (concentrao) do frmaco. A exatido determinada pela
anlise de amostras em replicata, contendo quantidades conhecidas do analito. A exatido deve ser
medida usando um mnimo de 5 determinaes por concentrao.
A preciso de um mtodo analtico descreve a proximidade entre as diferentes medidas individuais

de um frmaco. O parmetro de repetitividade da preciso obtido quando as amostras so
preparadas nas mesmas condies de manuseio: lote, operador, equipamento, instrumento e ocasio.
11 de 41
Quando as amostras so preparadas com diferentes condies de manuseio, o parmetro da preciso

medida a reprodutibilidade. No desenvolvimento do mtodo, a preciso deve ser medida usando
um mnimo de 03 concentraes com 5 repeties.
A recuperao de um frmaco de uma matriz biolgica a quantidade do analito obtida aps o

processo de separao. A quantificao comparada com a concentrao nominal de um padro
adicionada matriz biolgica antes do processo de separao. A recuperao indica a eficincia de
todos os processos envolvidos no mtodo analtico e deve ser tratada dentro de um limite de
variabilidade. A recuperao de um frmaco no necessita ser de 100%, mas deve ser consistente,
precisa e reprodutvel. Quanto mais prxima de 100% for a recuperao, melhor o mtodo analtico.
2.2.2. Linearidade e limites de quantificao
O mtodo analtico em desenvolvimento deve atender aos requisitos de sensibilidade e

detectabilidade planejados para o frmaco em funo das suas concentraes plasmticas na
curva farmacocintica. Dessa forma necessrio determinar a relao concentrao do
frmaco versus resposta do detector, visando a determinao da faixa de concentrao onde
a resposta linear e os respectivos limites de quantificao.
2.2.3. Especificidade/seletividade
Especificidade a busca individualizada do sinal de uma espcie nica do analito.
Seletividade a capacidade de um mtodo analtico de diferenciar e quantificar o analito na presena

de outros compostos na amostra, denominados de interferentes.
Os interferentes em fluidos biolgicos podem ser originrios das fontes endo/exgenas.
Interferentes endgenos: so os metablitos e/ou precursores; produtos de degradao do frmaco;

co-administrao de frmacos, vitaminas e/ou seus metablitos, produtos de interao de frmaco,
componente biolgico e outras substncias que ocorrem naturalmente em fluidos biolgicos, isto ,
hormnios, protenas, lipdios, substncias dietticas, etc.
Interferentes exgenos: impurezas dos reagente usados, substncias liberadas pelos recipientes em
uso ou resultantes de lavagem inadequadas de vidrarias, equipamentos e instrumentos.
Os nveis de interferentes devem ser avaliados antes de iniciar o desenvolvimento do mtodo. Uma
vez que o mtodo esteja no estgio de validao, o teste de seletividade deve assegurar nveis e
reprodutibilidade dos interferentes e o seu impacto na preciso e exatido do mtodo em relao ao
limite de quantificao.
Uma vez que os interferentes tenham sido definidos e minimizados durante o desenvolvimento do
mtodo nos estudos preliminares com a matriz biolgica, deve-se, ento, planejar um estudo para
melhorar a avaliao estatstica da extenso dos interferentes das matrizes biolgicas nos diferentes
12 de 41
voluntrios. Na prtica, interferncia no estudo de pr-dose das amostras um dos problemas mais
comumente observados com os mtodos analticos validados, uma vez que eles so colocados em
rotina. Isto surge da avaliao de um nmero insuficiente de voluntrios durante a validao.
Pela conferncia de Washington recomenda-se uma avaliao em de 6 voluntrios [35].
2.3. Estabilidade dos frmacos em fluidos biolgicos
2.3.1. Introduo
O desenvolvimento do mtodo a etapa mais importante nos estudos analticos da bioequivalncia,

visto que o comportamento dos frmacos nas matrizes biolgicas depende dos nveis de interferentes
que interagem com a molcula ativa. Um outro aspecto a ressaltar a mudana dos constituintes da
matriz biolgica submetida a processo de estocagem levando em considerao o tempo e a
temperatura. Assim sendo, produtos de degradao, complexao, oxidao, metablitos e outras
substncias alteram a resposta de um mtodo se o mesmo no for suficientemente seletivo para os
estudos com matrizes biolgicas frescas e envelhecidas.
Os estudos prvios de estabilidade em matrizes biolgicas so essenciais para fornecer os parmetros

de adequabilidade do mtodo em amostras envelhecidas e condies de armazenamento das amostras
para os estudos analticos da bioequivalncia. Tais estudos permitem a confiabilidade necessria ao
mtodo, pois os resultados a serem fornecidos no correro risco de serem rejeitados por erros de
metodologia, quando a amostra submetida a processo de envelhecimento. Por outro lado o
armazenamento da amostra em uma dada temperatura por um tempo determinado deve ser baseado
em dados cientficos que possam afirmar que naquelas condies de estocagem o frmaco no
sofrer alterao.
2.3.2. Reviso da literatura
A estabilidade de frmacos em fluidos biolgicos uma funo do tempo e da temperatura de

estocagem, da temperatura de estocagem, das propriedades qumicas do frmaco, matriz e recipiente.
A estabilidade de um analito numa matriz particular e recipiente relevante apenas para aquela
matriz e recipiente e no deve ser extrapolada para outros tipos de matrizes e recipientes. Os
procedimentos de estabilidade devem avaliar a estabilidade do frmaco durante a coleta e manuseio
da amostra, aps estocagem de longa durao (congelamento na temperatura de estocagem
pretendida), estocagem de curta durao (temperatura ambiente), aps ciclos de congelamento e
descongelamento e processo analtico. As condies usadas nos experimentos de estabilidade devem
ser previamente estabelecidas. O procedimento deve tambm incluir uma avaliao da estabilidade
do analito na soluo estoque.
Naturalmente, deve-se evitar que os ensaios em HPLC sejam afetados por solues reagentes no
estveis e/ou uma possvel instabilidade da soluo pronta para ser injetada. O ltimo experimento
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de estabilidade deve ser realizado antes dos estudos de validao para que se possa levar em
considerao todos os parmetros advindos da reatividade frmaco/matriz [1].
A estabilidade do analito sempre crtica nas matrizes biolgicas durante um curto perodo de
tempo. Degradao no rara, mesmo quando todas as precaues so tomadas para evitar
especificamente problemas de estabilidade do analito (ex: proteo a luz). importante verificar se
h degradao relevante entre o tempo de coleta da amostra e sua anlise para que o resultado do
estudo no seja comprometido.
Hartmann et al. [1] reconhecem que a estabilidade do frmaco na matriz biolgica deve ser parte
integrante do processo de validao, embora aponte a escassez de diretrizes para os estudos de
estabilidade. Diante desta situao, ele recomenda que o estudo de estabilidade deve envolver, no
mnimo:
a. A investigao da estabilidade do frmaco na matriz em temperatura ambiente (ou seja, a

estabilidade do frmaco antes do processo de anlise de uma amostra). Este estudo tem por
finalidade decidir se a adio de um estabilizante necessria durante o processo de coleta das
amostras.
b. A estabilidade do frmaco na soluo final de extrao durante um perodo estimado para o
tempo mximo de anlise, o que para injeo automtica varia de 24 48 horas.
c. A estabilidade do frmaco durante 3 (ou mais) ciclos de congelamento-descongelamento (um
ciclo sendo entendido como, por exemplo, descongelar a amostra, deix-la em temperatura
ambiente por 1 hora e congel-la por pelo menos 24 horas).
d. O estudo de estabilidade de longa durao do frmaco em amostras congeladas.
Com relao a detalhes especficos do estudo de estabilidade os seguintes pontos so recomendados

por Hartmann:
O nmero de valores de concentrao do frmaco para os quais a estabilidade deve ser investigada
depender da faixa de concentrao do mtodo (dynamic range), mas em todos os casos deve
incluir pelo menos o valor mnimo e o mximo.
Para compatibilizar a qualidade dos dados obtidos com a carga de trabalho necessria, recomenda-
se avaliar a estabilidade das amostras apenas para o tempo mximo que as amostras sero
armazenadas e apenas aps o ltimo ciclo de congelamento-descongelamento a que as amostras
sero submetidas. Nos casos onde o armazenamento se dar por perodos de seis meses ou
maiores, recomenda-se incluir um ponto intermedirio (por exemplo 3 meses) para que a
estabilidade seja garantida pelo menos por este tempo.
O nmero de replicadas deve ser determinado, mas um nmero mnimo de 5 replicadas parece
ser suficiente na maioria dos casos.
14 de 41
2.3.3. Cintica de degradao
O estudo da estabilidade de frmaco necessrio para determinar o tempo de vida para degradar
um percentual da sua concentrao original, geralmente 10%, em determinadas condies de
armazenamento.
O termo estabilidade qumica de um frmaco definido como a manuteno das caractersticas de

identidade, concentrao e pureza da sua forma ntegra durante um perodo de tempo e condies
pr-determinados.
Os estudos cinticos determinantes da estabilidade podem ser efetuados por curta durao e longa
durao. Os estudos de longa durao, realizados nas condies de armazenamento, geralmente
demandam um tempo relativamente longo. Todavia na prtica necessrio usar das equaes cinticas
para abreviar este tempo e possibilitar uma maior rapidez nos resultados preliminares. No entanto,
o resultado de estabilidade de longa durao dever ser apresentado conforme preconizado na
legislao vigente.
As reaes qumicas e/ou fsicas de degradao do frmaco envolvem modelos cinticos que utilizam
as equaes de Arrhenius para determinao das constantes de velocidade de reao e do tempo de
vida til. Estes modelos so classificados em: ordem zero, primeira ordem e segunda ordem.
Cintica de ordem zero
As reaes de ordem zero aparecem em sistemas heterogneos quando a superfcie da fase slida
est saturada com algum reagente, mas podem ocorrer tambm em sistemas homogneos. A constante
de velocidade de reao pode ser determinada pela seguinte equao:
[Ff] = [Fi] - k0 . t
onde [Fi] a concentrao do frmaco inicial, [Ff] a concentrao do frmaco no tempo t em

segundos, k0 a constante de velocidade de reao de ordem zero e t o tempo em segundos
decorrido para degradao de um determinado percentual do frmaco.
Cintica de primeira ordem
O modelo matemtico de um processo cintico de primeira ordem corresponde ao consumo do

frmaco na reao de forma proporcional concentrao do mesmo, presente no meio e do nmero
de interaes frmaco componentes do meio. Desta forma, a equao pode ser expressa:
Ln [Ff] = k1. t + Ln [Fi]
onde k1 a constante de velocidade de reao de primeira ordem, Ln= logaritmo neperiano.
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Cintica de segunda ordem
Neste modelo cintico, a frao de degradao do frmaco no uma constante, mas varia com a
concentrao do frmaco. Como a concentrao do frmaco diminui com o tempo, a frao de
degradao tambm diminui com o tempo. Assim sendo, podemos expressar matematicamente este
modelo pela equao abaixo:
1 / [Ff] = k2 . t + 1 / [Fi]
onde k2 a constante de velocidade de reao de segunda ordem.
Uma vez definido o modelo cintico de reao para um determinado frmaco, pode-se utilizar as
concentraes do frmaco nos diferentes dias de um estudo de estabilidade de mdia durao nas
condies isotrmicas estudadas para calcular as constantes de velocidade de reao nos vrios dias.
A constante de velocidade de reao do frmaco ser calculada por ponderao dos valores obtidos
para cada tempo, conforme equao abaixo descrita:
km = k1 . 1 + k2 . 2 + k4 . 4 + k8 . 8 + k16 . 16
1 + 2 + 4 + 8 + 16
A obteno de km permite calcular o tempo de vida do frmaco naquela condio de armazenamento

utilizando equaes apropriadas, conforme modelo cintico de ordem zero, primeira ordem e
segunda ordem.
Considerando-se um percentual de 10% de degradao do frmaco como sendo o mximo permitido,

teremos as seguintes equaes:
Ordem zero
tm = [Fi] - [F90]
k0
onde [Fi] a concentrao do frmaco inicial, [F90] a concentrao do frmaco correspondente a

90% da concentrao inicial, tm o tempo de armazenamento da amostra para atingir a concentrao
de 90% do frmaco.
16 de 41
Primeira ordem
tm = Ln[Fi] - Ln[F90] . 2,303

k1
Segunda ordem
tm = ____[Fi] - [F90]___
[Fi] . [F90] . k2
Simulao de dois exemplos de frmacos com instabilidades diferentes, exemplo captopril e ranitidina.
Suponhamos que as anlises nos 16 dias dos plasmas estocados a -20C dem os seguintes resultados,
conforme tabela abaixo:
Os dados sero tratados para determinao do modelo cintico da ordem de reao zero, primeira
ordem e segunda ordem, calculando-se o coeficiente de correlao para os pares de dados acima:
Ordem zero = massa versus tempo

Primeira ordem = Log massa versus tempo
Segunda ordem = 1 / massa versus tempo
Obs.: importante esclarecer que o valor da massa utilizado a frao residual.
Operacional
1 - A ordem de reao selecionada ser aquela que apresentar o maior coeficiente de correlao.
2 - Os valores acima para uma reao com cintica de ordem zero apresentam as seguintes constantes
de correlao e tempo de meia vida para um nvel de degradao de 10% dos dois frmacos,
utilizando as equaes acima descritas.
3 - Sendo a reao de ordem zero, utilize da equao correspondente para determinar as cinco
constantes ( de k1 a k16 ).
[Ff] = [Fi] - k . t
k= k1,k2,k4,k8,k16
17 de 41
4 - Com as constantes determinadas, calcule a constante do frmaco, km por meio da mdia

ponderada de acordo com a equao estabelecida.
km = k1 . 1 + k2 . 2 + k4 . 4 + k8 . 8 + k16 . 16
1 + 2 + 4 + 8 + 16
5 - Com o valor da km , determine o tempo estimado de estabilidade do produto (tm ) em dias.

tm = [Fi] - [F90]
km
Obs: Caso numa das concentraes estudadas o valor seja menor que 90% da concentrao inicial,
utilize, para o clculo da estabilidade terica, o valor da concentrao anterior da mesma srie, ou
seja, igual ou maior que 90%.
Portanto, os resultados simulados mostram que as amostras devem ser armazenadas na temperatura
de 20C e analisadas at o mximo de 18,82 e 134,59 dias, respectivamente, para captopril e ranitidina.
2.3.4. Problemas analticos relacionados estabilidade
A aplicao de mtodos cromatogrficos com vrios detectores na anlise quantitativa de frmacos

e compostos relacionados em amostras biolgicas tm gerado um imenso nmero de trabalhos na
literatura. Todavia, quando se necessita reproduzir uma metodologia para ser usada na rotina verifica-
se, em muitos casos, uma baixa reprodutibilidade nos dados de exatido e recuperao. Tal fato foi
discutido por Causson [36] que sugeriu um maior rigor por parte dos referees ao aceitar a publicao
de mtodos bioanalticos para quantificao de frmacos em amostras biolgicas sem os parmetros
de validao minimamente consistentes.
Geralmente, os estudos de validao de mtodos bioanalticos so realizados em plasma vencido

(envelhecido), o qual contaminado com o frmaco em estudo e os parmetros de validao so
estudados. Dependendo da estabilidade do frmaco no fludo biolgico e das substncias endgenas
dos indivduos, algumas alteraes na matriz biolgica podem acontecer e afetar a eficincia do
mtodo.
Visando uma maior segurana do mtodo bioanaltico para um determinado frmaco, sobretudo os
mais instveis, sugerido na fase de pr-estudo uma validao mais rigorosa dos estudos de
estabilidade, conforme itens abaixo mencionados:
18 de 41
Verificar o comportamento do frmaco no solvente em relao aos parmetros de preciso,

exatido e linearidade;
Verificar a estabilidade do frmaco no solvente ao longo do tempo, mnimo de 05 tempos,
durante 48 horas;
Determinar os parmetros de preciso, exatido e linearidade do frmaco nos fludos biolgicos
frescos;
Contaminar o plasma com pelo menos 03 nveis de concentrao do frmaco e determinar as
suas concentraes no tempo zero, 6, 12, 24, 48, 96 horas, 7, 14, 30 e 60 dias nas solues
estocadas nas temperaturas de 25, 4 e 20C ou eventualmente 70C;
Determinar os parmetros de preciso, exatido e recuperao das amostras submetidas aos
estudos de estabilidade;
Comparar as diferenas percentuais entre o tempo zero e os demais tempos;
Inferir as condies de armazenamento baseadas nos estudos de estabilidade.
2.4. Armazenamento das amostras
As condies de armazenamento relativas temperatura e ao tempo so determinadas pelos estudos

de estabilidade de longa durao no desenvolvimento do mtodo.
As amostras para armazenamento devem ser embaladas em sacos plsticos, resistentes a baixas
temperaturas e distribudas por voluntrio e agrupadas num mesmo estudo.
Obs: importante que as amostras da duplicata (retm) sejam armazenadas em sacos diferentes das
amostras a serem analisadas.
Controlar a temperatura de armazenamento com dispositivo de controle de temperatura ou
termmetro de mnima e mxima e registrado diariamente.
2.5. Validao do mtodo
2.5.1. Introduo
O roteiro que se segue uma recomendao para a padronizao da rotina de validao de

metodologias analticas, para a aplicao na etapa analtica dos processos de bioequivalncia, que
utilizam-se de material biolgico como sangue, soro, plasma ou urina. A metodologia a ser empregada
pressupe a existncia da melhor condio analtica, devendo levar em considerao os parmetros
obtidos dos estudos de estabilidade.
As informaes contidas neste roteiro esto voltadas para a rea instrumental. O instrumental
considerado : Cromatografia em Fase Gasosa (CFG e CG/EM) , Cromatografia em Fase Lquida
(CL , CL/EM ou CL/EM/EM), ou outros adequados ao que aqui se prope.
As recomendaes podem ser adaptadas ou modificadas, dependendo do mtodo analtico usado.

Na etapa da validao, a matriz de trabalho deve ser preferencialmente a mesma matriz objeto do
estudo. No caso de disponibilidade limitada pode-se utilizar plasma proveniente de bolsa de sangue
vencido na etapa de desenvolvimento do mtodo, atentando sempre para os efeitos de matriz. Na
etapa de validao deve-se trabalhar com o plasma obtido a partir de sangue recm coletado.
19 de 41
No pode deixar de ser considerada, para a validao da metodologia, a estabilidade do frmaco em

uma matriz biolgica a qual uma funo das condies de armazenamento, propriedades qumicas
da droga, da matriz e do sistema de acondicionamento. A estabilidade de um analito em uma matriz
particular e sistema de acondicionamento relevante apenas para aquele caso e no deve ser
extrapolada a outras matrizes e sistemas de acondicionamento. Procedimentos de estabilidade devem
avaliar a estabilidade do analito durante a coleta e manuseio de amostras, aps longa armazenagem
(congelada temperatura adequada), curta armazenagem (bancada na temperatura ambiente) e aps
a ocorrncia de ciclos de congelamento/descongelamento e ps-preparo. Para a aplicao deste
roteiro, consideram-se os seguintes tipos de validao:
a. Validao Total
Validao total importante no desenvolvimento e implementao de um mtodo quando aplicado
pela primeira vez ou quando for utilizado para quantificar um novo analito nesta mesma condio
analtica.
b. Validao Parcial
Validaes parciais so modificaes do mtodo j validado. Uma validao parcial pode compreender
desde uma pequena determinao de preciso/exatido a at quase uma validao total. Algumas
mudanas tpicas no mtodo se enquadram nesta categoria, mas no so limitadas a:
Transferncias de mtodo bioanaltico entre laboratrios ou analistas;

Mudana na metodologia analtica (ex. mudana no sistema de deteco);
Mudana no anticoagulante na coleta do fluido biolgico;
Mudana no processamento das amostras;
Mudana relevante na faixa de concentrao;
Mudanas nos instrumentos e/ou software;
Volume de amostra limitado (ex. estudo peditrico);
Demonstrao seletiva de um analito na presena de medicaes concomitantes.
2.5.2. Mtodo bioanaltico
A fase de desenvolvimento e estabelecimento do mtodo define o ensaio bioanaltico. Os parmetros

fundamentais para a validao de um mtodo so: exatido, preciso (repetitividade e
reprodutividade), seletividade, sensibilidade e estabilidade. As medidas de cada analito na matriz
biolgica devem ser validadas. Alm disso, deve-se determinar a estabilidade do analito nas matrizes
biolgicas nas quais ele foi acrescentado para construo da curva de resposta. O desenvolvimento
e estabelecimento de um mtodo bioanaltico tpico inclui a determinao:
(1) Seletividade;
(2) Recuperao;
(3) Estabilidade de curta durao;
(4) Limite de quantificao e deteco;
(5) Linearidade;
(6) Exatido, preciso;
(7) Estabilidade de longa durao.
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2.5.3. Ferramentas para a validao
1 - Equaes estatsticas
a) estimativa da varincia
b) estimativa do desvio padro
c) Coeficiente de Variao
2 - Testes de rejeio
Teste Q
Rejeita valores com base na amplitude das medidas. Para a aplicao do Teste Q utiliza-se da amplitude
ou faixa:
1 - colocar os valores obtidos em ordem crescente.

2 - determinar a diferena existente entre o maior e o menor valor da srie ( faixa ).
3 - determinar a diferena entre o menor valor da srie e o resultado mais prximo ( em mdulo ).
4 - dividir esta diferena ( em mdulo ) pela faixa, obtendo um valor Q ( comparar com tabela ).
21 de 41
5 - se Q > Q % o menor valor rejeitado e se Q < Q % o menor valor, por enquanto, aprovado.
6 - se o menor valor for rejeitado, determinar a nova faixa e testar o maior valor da srie (caso o
menor valor no tenha sido rejeitado, utilizando-se da mesma faixa testar o maior valor da
srie).
7 - repetir o processo at que o menor e o maior valores sejam aceitos, ou seja, se o menor valor
aceito, ento o maior valor testado e o processo repetido at que o maior e o menor valores
sejam aceitos.
Teste de Grubbs
Rejeita valores em relao estimativa do desvio padro. Este teste, como no teste Q, observa
valores dispersos anmalos maiores ou menores que aparecem no grupo de medidas.
Para a aplicao do Teste de Grubbs utiliza-se da amplitude em relao a mdia :
1- colocar os valores obtidos em ordem crescente.

2- determinar a mdia aritmtica.
3- determinar a amplitude do maior ( maior valor - mdia ).
4- testar o maior valor do conjunto, segundo a equao:
s = estimativa do desvio padro
5 - testar o menor valor do conjunto, segundo a equao:
6 - Compare os valores de G ( teste de Grubbs ) com os valores crticos a 95 % de confiana.
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7 - se G > G % o maior valor rejeitado e se G < G % o maior valor, por enquanto, aprovado.
8 - se o maior valor for rejeitado, determinar a nova amplitude e testar o menor valor da srie ( caso
o maior valor no tenha sido rejeitado, utilizando-se da mesma faixa testar o menor valor da
srie ).
9 - repetir o processo at que o menor e o maior valores sejam aceitos, ou seja, se o menor valor
aceito, ento, o maior valor testado e o processo repetido at que o maior e o menor valores
sejam aceitos.
3 - Determinao do Limite de Quantificao ( LQ )
Como sugesto, determinar o LQ por diluio aceitando o valor mais confivel dentro da melhor
condio analtica. Normalmente atribui-se variao mxima, em CV de 20% ao LQ.
4 - Estimativa de CV em funo da concentrao a analisar, segundo Horwitz:
CV (%) = 2 (1 - 0,5 logC)
onde: CV= Coeficiente de Variao C= g de constituinte/g de amostra
2.5.4. Glossrio
AMOSTRA: um termo genrico que engloba controles, brancos, amostras processadas e

desconhecidas, tal como descrito abaixo:
Branco: uma amostra de matriz biolgica na qual nenhum analito foi adicionado e utilizada para
nortear a seletividade e especificidade do mtodo analtico.
Amostra de Controle de Qualidade: uma amostra das matriz biolgica ao qual o analito foi
adicionado, usada para monitorar o desempenho do mtodo e nortear a integridade e validade dos
resultados, das amostras de concentraes desconhecidas analisadas em uma batelada individual.
Desconhecido: uma amostra biolgica que objeto de anlise.
AMOSTRA PROCESSADA: o extrato final (anterior a uma anlise instrumental ) de uma amostra
que foi submetida a vrias manipulaes ( ex.: diluio, extrao, concentrao).
ANALITO: um composto qumico especfico que mensurado o qual pode ser um frmaco
intacto, biomolcula ou seu derivado, metablito e ou produto de degradao em uma matriz biolgica.
COEFICIENTE DE CORRELAO (r): expressa a relao de x a y na curva, onde o valor ideal

esperado 1.
CORRIDA ANALTICA OU LOTE: um conjunto completo de amostras analticas em estudo

com nmero apropriado de controles para sua monitorao. Uma corrida analtica deve ser completa
na mesma condio analtica, respeitando-se a estabilidade do analito.
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CURVA DE CALIBRAO: utilizada com a finalidade de se obter ou verificar o ajuste ao projeto

do sistema. Neste caso definido pelo fabricante ou instituies que zelem pela qualidade.
CURVA DE RESPOSTA, CURVA DE QUANTIFICAO, CURVA DE CALIBRAO

ANALTICA: utilizada com a finalidade de se obter comparao analtica para a quantificao.
Busca a linearidade dinmica. Aplica-se na curva de resposta a relao sinal/concentrao a fim de
verificar linearidade igual relao direta ou regresso linear.
CURVA PADRO: sucesso crescente ou decrescente de pontos obtidos da relao entre a unidade
de grandeza da espcie padro pela sua intensidade de sinal, proveniente do sistema de deteco.
DETECTABILIDADE: a quantidade em unidade de grandeza ou concentrao, percebida em

confiabilidade, pelo sistema de deteco do sinal analtico.
EFEITO MATRIZ: so interferncias que afetam a resposta do sinal analtico da substncia em

anlise.
ESTABILIDADE: a estabilidade qumica de um analito em uma dada matriz dentro de condies

especficas e em determinados intervalos de tempos.
FAIXA DE QUANTIFICAO: o grau de concentrao incluindo : limite superior de

quantificao e limite inferior de quantificao que pode ser confiavelmente reproduzido e
quantificado com exatido e preciso, por meio da relao concentrao/resposta.
LIMITE DE DETECO: a menor concentrao de um analito na qual o procedimento

bioanaltico pode seguramente diferenciar do rudo de fundo.
LIMITE DE QUANTIFICAO: a menor quantidade de um analito na amostra que pode ser

quantitativamente determinada com aceitvel preciso e exatido. Tambm conhecido como Limite
Inferior de Quantificao.
LIMITE SUPERIOR DE QUANTIFICAO: a maior quantidade de um analito em uma amostra

que pode ser quantitativamente determinada, com preciso e exatido.
MATRIZ BIOLGICA: um material individualizado de origem biolgica que pode ser amostrado
e processado de maneira reprodutiva. Exemplos: sangue, soro, plasma, urina, fezes, saliva e outros
tecidos.
MTODO: uma descrio compreensvel de todos os procedimentos usados em anlises de

amostras.
PADRO DE CALIBRAO: uma matriz biolgica de concentrao conhecida do analito que

foi adicionado. Padres de calibrao so usados na construo de curvas de resposta nas quais as
concentraes dos padres de calibrao so utilizados para a determinao da concentrao do
analito.
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PADRO INTERNO: so compostos testes (exemplo: anlogos com estruturas similares, composto
estvel marcado, etc.) adicionados aos padres de calibrao e amostras em concentraes conhecidas
e constantes para facilitar a determinao do analito.
PRECISO: a proximidade da concordncia ( grau de espalhamento) entre uma srie de medidas

obtidas de mltiplas amostragens de uma mesma amostra homognea dentro de condies
determinadas.
RECUPERAO: a eficincia da extrao de um processo analtico reportado como porcentagem

da quantidade conhecida do analito conseguido por meio de passos de extrao e processamento do
mtodo.
REPRODUTIVIDADE (REPRODUTIBILIDADE): a preciso entre dois laboratrios ou ocasies

e fatos diferentes. Tambm representa a preciso do mtodo dentro das mesmas condies de
operao dentro de um perodo curto de tempo.
SELETIVIDADE: a habilidade do mtodo analtico em mensurar e diferenciar os analitos na

presena de outros componentes que possam estar presentes. Eles podem ser metablitos,
impurezas,produtos de degradao ou componentes da matriz.
SENSIBILIDADE: o grau de diferenciao entre duas concentraes prximas.
VALIDAO:
Total: o estabelecimento de todos os parmetros de validao determinados e aplicados anlise

do analito na amostra.
Parcial: a modificao de mtodos validados que no necessariamente precisam de revalidao total.
CL: Cromatografia em fase Lquida.
CL/EM: Cromatografia em fase Lquida acoplada Espectrometria de Massas.
CFG: Cromatografia em Fase Gasosa.
CG/EM Cromatografia em Fase Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas.
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2.6. Fluxograma operacional da etapa analtica da bioequivalncia
SEQNCIA 01
SEQNCIA 02
26 de 41
SEQNCIA 03
SEQNCIA 04
Completada a definio das seqncias que sero adotadas pelo centro e consultadas as respectivas
interpretaes na Fundamentao terica e operacional do Guia da Etapa Analtica, atente para o
item estabilidade, pois ele definir o incio da internao dos voluntrios.
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3. RECOMENDAES PARA A ETAPA ANALTICA
3.1. Materiais de referncia
3.1.1. Reagentes e solventes
Os reagentes e solventes devem ser rotulados apropriadamente, indicando, no mnimo, procedncia,

identidade, lote, grau de pureza, prazo de validade (quando aplicvel) e instrues especficas de
armazenamento.
Para as solues deve haver POP abrangendo, no mnimo, preparao, rotulagem, prazo de validade,
situaes de emergncia, segurana, manuseio e descarte.
As SQRs ( Substncias Qumicas de Referncia ) devem ser rastreveis.
3.1.2. Balanas e pesos de calibrao
3.1.2.1. Livro de registros ou de uso
Deve conter as seguintes informaes: data, registro de verificao diria (caso a balana no realize
a auto-calibrao), nome do operador e dados sobre a pesagem.
3.1.2.2. POP ( Procedimento Operacional Padro )
Deve conter informaes bsicas sobre a operao do equipamento, limpeza e manuteno.
3.1.3. Termmetros e outros dispositivos de verificao de temperatura
O laboratrio deve possuir pelo menos um termmetro calibrado junto a RBC, anualmente, na
faixa de uso. Este servir para a calibrao dos demais termmetros utilizados no laboratrio, que
sero verificados trimestralmente. Deve haver um POP descrevendo este procedimento.
3.1.4. Peagmetro (pHmetro)
O POP para utilizao do aparelho deve conter informaes bsicas sobre uso, cuidados de
manuteno rotineira e no-rotineira, limpeza e armazenamento dos eletrodos. A eficincia dos
eletrodos deve ser verificada periodicamente, enquanto que a calibrao dever ser feita antes do
uso. Para a calibrao, devero ser utilizadas pelo menos duas solues tampo, com um pH acima
e outro abaixo do valor a ser medido. Todos estes registros devero ser devidamente registrados no
livro de uso do aparelho.
3.1.5. Centrfuga
Deve existir um POP descrevendo o uso correto (balanceamento, capacidade mxima), procedimentos
de limpeza e descontaminao. As manutenes, rotineiras ou no, devem estar registradas no livro
de uso.
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3.1.6. Sistema de evaporao de amostras
Deve existir um POP descrevendo o uso correto, limpeza e manuteno rotineira, que devem ser
registradas no livro de uso.
3.1.7. Vidraria
Toda a vidraria deve ser de boa qualidade, estar limpa e adequadamente armazenada, quando no
estiver em uso.
A vidraria volumtrica deve ser classe A ou ento calibrada anualmente.
Deve existir POP para limpeza da vidraria.
Deve haver POP para calibrao da vidraria volumtrica, utilizando a massa da gua como referncia.
Esta calibrao dever ser feita periodicamente e os resultados devidamente arquivados.
3.1.8. Pipetas
Para as pipetas automticas deve haver um POP para a utilizao, limpeza e conservao. As
verificaes de performance e calibraes externas devem estar no livro de registros.
Pipetas mecnicas de volume fixo

Exatido e preciso usando a massa da gua, a cada trs meses.
Pipetas de volume varivel

Exatido e preciso usando a massa da gua, 02 pontos, 05 vezes, antes do uso.
3.2. Recebimento de amostras
3.2.1. Dar encaminhamento imediato aps o recebimento das amostras.

3.2.2. Preencher lista de verificao de recebimento, oriunda da etapa clnica em 03 vias ANEXO I;
3.2.3. Devolver uma via para o pesquisador responsvel e outra para o coordenador da etapa clnica,
arquivando a terceira nos registros do estudo;
3.2.4. Documentar histrico da temperatura durante o transporte, se for o caso;
3.2.5. Encaminhar comunicao (documentada) pessoa que enviou as amostras sobre possveis
irregularidades.
3.2.6. Registro de entrada de amostra
3.2.6.1. Livro para registro de entrada de amostras, indexado e etiquetado, com
numerao de pginas;
3.2.6.2. O registro de entrada das amostras deve possuir cabealho com:
Nmero do Estudo;
Princpio ativo;
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Origem;
Patrocinador.
3.2.6.3. Todas as amostras agrupadas juntas em uma ou mais pginas do livro.
3.2.6.4. Para cada voluntrio anotar:
Cdigo do voluntrio;
Perodo de estudo;
Tempos no recebidos;
Data de recebimento;
Anormalidades;
Visto do responsvel.
3.2.7. Descarte de Amostras

3.2.7.1. Em caso de perdas por acidentes:
Descontaminao do local com soluo de hipoclorito;
Descarte do material biolgico em lixeiras apropriadas, recebendo destinao normal
de lixo hospitalar;
Preencher notificao de ocorrncia e encaminhamento para o responsvel tcnico;
Informar a Comisso de Biossegurana se necessrio.
3.2.7.2. O material biolgico ps- uso deve ser descartado segundo os procedimentos:
descontaminao por processos trmicos ou qumicos, seguida de descarte como
lixo domstico;
descarte como lixo biolgico atravs de sistema especializado no tratamento desses
resduos, segundo Consulta Pblica N 48 de 04 de julho de 2000, DOU 05/07/
2000.
3.3. Estudo de estabilidade
A Resoluo RDC N 84 de 19 de maro de 2002, estabeleceu quais os tipos de estabilidade em

fluidos biolgicos que devem ser realizados na fase pr-estudo de bioequivalncia visando a validao
do mtodo para fins do estudo propriamente dito. Neste sentido, os estudos de estabilidade foram
classificados em: curta durao, longa durao e de solues-padro.
3.3.1. Estabilidade de curta durao
Congelamento e descongelamento
A estabilidade do analito deve ser determinada aps 3 ciclos de congelamento e descongelamento.
No mnimo 3 alquotas a cada concentrao (alta e baixa) devendo ser estocado a cada temperatura
pretendida por 24 horas e descongelada sem auxlio a temperatura ambiente. Quando completamente
descongelada, as amostras devem ser re-congeladas por 12 a 24 horas sob as mesmas condies. Os
ciclos de congelamento e descongelamento devem ser repetidos por 3 vezes e analisados no terceiro
ciclo. Se um frmaco instvel temperatura ambiente, por exemplo, as amostras de estabilidade
devem ser congeladas a 20 ou 70C durante 3 ciclos de congelamento e descongelamento.
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Condies de anlise
Trs (03) alquotas de cada concentrao (alta e baixa) devem ser descongeladas a temperatura
ambiente e deixadas nesta temperatura durante o tempo mximo da anlise do lote.
A estabilidade das amostras processadas, incluindo o tempo de residncia no auto-injetor, deve ser
determinada.
Deve ser demonstrado que os frmacos permanecem intactos se deixados por vrias horas
temperatura ambiente na matriz biolgica. Certos frmacos, por exemplo, captopril, AAS, etc.,
sofrem mudanas imediatas, degradao em matrizes biolgicas. Em tais casos, aditivos apropriados
e/ou agentes derivatizantes podem ser adicionados.
Solues-padro
A estabilidade do frmaco e padro interno devem ser assegurados no tempo necessrio para anlise
de todo o lote das amostras, incluindo possveis interrupes acidentais.
Dados da literatura ou testes de laboratrio devem ser conduzidos para determinar se o frmaco
puro ou em mistura com metablitos e padro interno dissolvidos num sistema de solvente so
estveis sob as condies de ensaios, especificamente em relao aos fatores fsicos, tais como:
calor, umidade, luz e exposio ao ar.
A estabilidade da soluo estoque, contendo o frmaco e padro interno, deve ser avaliada
temperatura ambiente por no mnimo 6 horas. Se a soluo estoque e padro interno so refrigeradas
ou congeladas por um perodo relevante, a estabilidade deve ser documentada. Aps completar o
tempo de estocagem desejado, a estabilidade deve ser testada por comparao com a soluo preparada
recentemente.
3.3.2. Estabilidade de mdia durao
A estabilidade de mdia durao deve ser determinada pelo armazenamento de no mnimo cinco
alquotas de cada concentrao ( alta, mdia e baixa) na temperatura de 20oC . As amostras para
este estudo devem ser analisadas nos tempo zero, um, dois quatro, oito e dezesseis dias de
armazenamento. Os dados devem ser tratados com a utilizao da equao de Arrhenius para
clculo da constante de velocidade de reao e do tempo de armazenamento na temperatura estudada.
Com os dados de estabilidade obtida e viveis com o tempo analtico, pode-se iniciar a internao
ou o estudo sobre os indivduos.
3.3.3. Estabilidade de longa durao
O tempo de estocagem num estudo de estabilidade de longa durao deve exceder o tempo entre a
data da primeira coleta das amostras e a data da anlise da ltima amostra. A estabilidade de longa
durao deve ser determinada pela estocagem de no mnimo 3 alquotas de cada concentrao (alta,
31 de 41
mdia e baixa) sob as mesmas condies das amostras de estudo. Normalmente, realizada em 03
temperaturas de estocagem, 4, -20 e 70C. O volume das amostras deve ser suficiente para as
anlises no mnimo em 03 tempos diferentes (FDA, 1997). As concentraes mdias das
determinaes de todas as concentraes utilizadas devem ser comparadas com as mdias obtidas
das anlises das amostras recm-preparadas para os estudos de estabilidade de longa durao, ou
seja, no tempo zero.
3.4. Validao
3.4.1. Seletividade
Seletividade a habilidade de um mtodo analtico em diferenciar e quantificar o analito na presena

de outros componentes na amostra. Para a seletividade, anlises de amostras branco da matriz
biolgica apropriada (plasma, urina ou outra matriz) devem ser obtidas de, pelo menos, seis fontes.
Cada amostra branco deve ser testada para interferentes, e a seletividade deve ser assegurada no
limite de quantificao.
Substncias potencialmente interferentes numa matriz biolgica incluem componentes endgenos

da matriz, metablitos, produtos de decomposio, e durante o estudo, medicao tomada
concomitantemente e outros possveis interferentes. Se o mtodo for usado para quantificar mais
de um analito, cada analito deve ser testado para assegurar que no h interferncia.
Para verificar este item, recomenda-se que, para a matriz plasma, sejam utilizadas as seguintes amostras:
04 plasmas normais
01 plasma lipmico
01 plasma hemolisado
Para verificar a interferncia, trabalhar com adio de padro sobre os plasmas em trs concentraes
distintas (alta, mdia e baixa) em triplicata por concentrao.
Considerando HPLC ou CFG, desde que interferentes no coeluam com o analito e padro
interno, considera-se seletivo para anlise. No caso do LC/MS no qual a distino pode ser
confirmada, ser tambm considerada vivel para anlise. Havendo coeluio proceder:
sendo 01 plasma : desprezar

sendo mais de 01 plasma: refazer a amostragem ou rever a metodologia
analtica.
3.4.2. Recuperao
A Recuperao de um analito em um ensaio a resposta do detector de uma quantidade de analito

adicionada e ou separada de uma matriz biolgica. A recuperao est ligada eficincia do mtodo
analtico de separao, dentro dos limites de variabilidade. A recuperao de um analito no precisa
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ser 100%, mas a quantidade de analito recuperado e do padro interno deve ser consistente, precisa
e reprodutvel. Experimentos para recuperao devem ser feitos comparando resultados analticos
de amostras a trs concentraes (baixa, mdia e alta) com solues-padro nas mesmas concentraes
representando 100% de recuperao.
Pode-se utilizar de processos analticos para verificar a separao. Um processo diz respeito
monitorao da separao que neste caso trata-se da introduo de uma massa ou volume constante
de uma substncia no interferente, na qual pode-se acompanhar visualmente seu sinal analtico,
permitindo assim identificar qualquer anomalia durante o processo de separao. Outro processo
trabalha, tambm, com a introduo de uma substncia no interferente, porm, a relao de sinal
analtico e concentrao devem ser conhecidos, o que permitir, independente de ter-se extrado o
terico ou menos, obter a concentrao do analito presente na amostra (metodologia por padronizao
interna). A recuperao deve ser confivel (deve repetir). O percentual recuperado deve ser tal que
no interfira na quantificao da corrida analtica que se segue. O percentual de recuperao desejado
, na realidade, funo da relao da detectabilidade do mtodo com o limite de quantificao
necessrio. Por exemplo, se em funo da faixa de concentrao pertinente ao ensaio em questo
for necessrio obter um limite de quantificao na matriz biolgica antes da separao de 10 ng/mL
e em meio biolgico ps-separao detectar-se com confiabilidade 6 ng/mL, a recuperao necessria
ser de no mnimo 60%. Como guia para estimar a % de recuperao mnima, pode-se utilizar da
equao:
L.Q. Obtido no Fluido Biolgico x 100

% Recuperao Mnima = -
L.Q. Estimado no Fluido Biolgico
Determinar em 03 nveis de concentrao, concentraes estas pertinentes ao estudo de

bioequivalncia, sendo a menor concentrao no mximo trs vezes o Limite de Quantificao
(LQ). Para a variabilidade das recuperaes considerar em C.V. mximo de 20%.
3.4.3. Limites
3.4.3.1. Limite de quantificao
O padro de concentrao mais baixo deve ser o limite de quantificao se as seguintes condies
forem obedecidas:
A resposta do analito no limite de quantificao for pelo menos 5 vezes maior que a resposta
comparada com a do branco.
O sinal analtico for identificvel, discreto e reproduzvel com preciso de 20% e exatido de 80-
120%.
33 de 41
3.4.4. Linearidade
Uma curva de resposta (padro) a relao entre a resposta do instrumento e concentraes

conhecidas do analito. Uma curva de resposta deve ser gerada para cada analito na amostra. Um
nmero suficiente de padres deve ser usado para definir adequadamente a relao entre concentrao
e resposta. Uma curva de resposta deve ser preparada na mesma matriz biolgica que as amostras
de um estudo, adicionando na matriz concentraes conhecidas do analito. O nmero de padres
usados na construo de uma curva de resposta ser uma funo dos valores analticos esperados
no estudo e da relao analito/resposta. Uma curva de calibrao deve consistir de uma amostra
branco (matriz processada sem o padro interno), uma amostra zero, se pertinente, (matriz
processada com o padro interno) e seis ou mais amostras intermedirias cobrindo a faixa esperada,
incluindo o limite de quantificao.
3.4.4.1. Curva de resposta
O modelo mais simples que descreve adequadamente a relao concentrao/resposta deve ser
usado. O uso de ajustes e equaes de regresso complexas deve ser justificado.
A curva de resposta deve conter no mnimo 05 pontos incluindo-se o LQ e excluindo-se o branco.

Caso haja excluso de pontos, os mesmos devem ser registrados para posterior avaliao do rgo
regulador.
3.4.4.2. Critrios de excluso
1 - Os pontos no devem exceder em 15% do valor nominal e em 20% para o Limite de

Quantificao.
2 - Os pontos excludos no devem ser consecutivos.
Obs.: Caso com a excluso, ainda que os parmetros fiquem fora do especificado, deve-se refazer a
curva.
3.4.5. Preciso
A Preciso de um mtodo analtico descreve a proximidade de medidas individuais de um analito

quando o procedimento aplicado repetidamente a mltiplas alquotas de um nico volume
homogneo de uma matriz biolgica. A preciso deve ser medida usando um mnimo de cinco
determinaes por concentrao. Um mnimo de trs concentraes pertinente a toda faixa de
estudo recomendado. A preciso determinada a cada nvel de concentrao no deve exceder 15%
em coeficiente de variao (CV) exceto no limite mnimo de quantificao, o qual no deve desviar
mais de 20% em CV. A preciso posteriormente subdividida em preciso ou repetitividade dentro da
corrida ou intra lote, que fornece a preciso durante uma nica corrida analtica, e preciso ou
reprodutividade entre corridas ou inter lote que mede a preciso ao longo do tempo, podendo
envolver diferentes analistas, equipamentos, reagentes e laboratrios.
34 de 41
3.4.5.1. Repetitividade de separao
Preparar 03 concentraes pertinentes e diferentes (Alta, Mdia e Baixa) de analito em plasma. Para
cada concentrao, obter 15 amostras, separando-os em 03 grupos. Cada grupo contendo 05 amostras
da concentrao Alta, 05 amostras da concentrao Mdia e 05 amostras da concentrao Baixa,
que devero ser analisadas nesta seqncia. Aps o trmino do primeiro grupo, inicia-se o segundo
e o terceiro
3.4.5.2. Aceitao da repetitividade
Aceita-se como Repetitvel para as sries A 1; A2 e A3 , M 1; M2 e M3 e B 1; B2 e B3 , valores de CV

menor ou igual a 15%, caso a concentrao baixa seja o L.Q., o C.V.no dever ser maior que 20%.
3.4.5.3. Reprodutividade de separao
A Reprodutividade aplicada sobre as medidas da Repetitividade.
3.4.5.4. Aceitao da reprodutividade
Aceita-se como reprodutvel o CV das mdias das series A 1; A2 e A3 , M 1; M2 e M3 e B 1; B2 e B3. O CV

resultante no dever ser maior que 15%, caso a concentrao baixa seja o L.Q., o C.V. no dever
ser maior que 20%.
Obs.: Para o procedimento de obteno da Repetitividade, pode ser aplicado rejeio a 95% de
confiana excluindo-se apenas 1 ponto em 05. Como recomendao sugere-se o testes: Q% ou de
Grubbs ou ainda equivalente. O Centro da Etapa Analtica deve definir, a priori, o critrio de rejeio
a ser adotado. Independente da rejeio para fins de clculo do CV, o valor rejeitado deve ser
documentado.
35 de 41
3.4.6. Exatido
A Exatido de um mtodo analtico descreve a proximidade da mdia dos resultados obtidos em um

teste com o valor real (concentrao) do analito. A exatido determinada pela repetio de anlises
de amostras contendo concentraes conhecidas do analito. A exatido deve ser medida usando um
mnimo de cinco determinaes por concentrao. Um mnimo de trs concentraes na faixa de
concentraes esperada recomendado. O valor mdio deve estar igual ou maior que 85% do valor
real, exceto no limite de quantificao, no qual no deve estar abaixo de 80%.
Como expresso para verificar a exatido utilize:
Mdia dos valores obtidos x 100%

% Exatido = -
Valor esperado
3.4.7. Aceitao da validao
A aceitabilidade deve usar como base os parmetros contidos das variabilidades aceitveis da
metodologia.
3.5. Aplicao do mtodo validado no estudo
A aplicao do mtodo validado do estudo analtico da bioequivalncia deve ser conduzida

obedecendo os parmetros analticos que reproduzam a confiabilidade do mtodo, conforme
procedimentos descritos na seqncia:
3.5.1. As anlises devem respeitar os tempos disponveis de estabilidades pr-determinadas.
3.5.2. Se o mtodo tem variabilidade aceitvel, as amostras podem ser analisadas atravs de uma
nica determinao, sem duplicata ou triplicata. Isto vlido para procedimentos nos quais a
variao da preciso e exatido, rotineiramente, caem dentro de limites de tolerncia aceitveis.
Em um procedimento difcil, com um analito lbil, no qual altas especificaes de preciso e
exatido so difceis de obter, devem ser executadas anlises em duplicata, ou mesmo em
triplicata, para uma melhor estimativa do analito.
3.5.3. Deve ser preparada uma curva de resposta (segue o mesmo princpio do mtodo analtico)
para cada analito, e esta deve ser usada para calcular a concentrao do analito em amostras na
corrida. Amostras de controle de qualidade podem conter mais de um analito. A curva de
resposta deve cobrir os valores esperados de concentrao nas amostras, alm de uma amostra
no limite de quantificao. No se recomenda extrapolaes de valores. Nestes casos, a curva
de resposta deve ser redefinida, ou amostras com concentrao mais alta devem ser diludas e
reanalisadas. prefervel analisar todas as amostras de um estudo em uma nica ocasio.
36 de 41
3.5.4. Uma corrida analtica consiste de amostras, amostras de controle e curva de resposta a serem
analisadas como um lote.
Lote: entende-se como a quantidade de amostras preparadas pelo mesmo profissional e para a
anlise ininterrupta, podendo consistir de um ou mais voluntrios.
3.5.5. Uma vez que o mtodo analtico foi validado para uso rotineiro, sua exatido e preciso
devem ser monitoradas regularmente para assegurar que o mtodo continua a ter um
desempenho satisfatrio. Para alcanar este objetivo, um nmero de amostras de controle
preparadas separadamente deve ser analisado juntamente com amostras desconhecidas, em
intervalos de 10 em 10 amostras. Segue como seqncia mnima:
As amostras de controle devem ser incorporadas em cada corrida e em trs concentraes,
sendo uma prxima (menor ou igual trs vezes o LQ) do limite de quantificao , uma no
meio da escala e uma prxima do mximo. Um mnimo de seis amostras de controle deve
estar contido na corrida e pelo menos quatro dessas seis amostras de controle devem estar
dentro de 15% do seu respectivo valor nominal. As amostras de controle devem ser usadas
para aceitar ou rejeitar a corrida.
3.5.6. Reanlises devem ser feitas em triplicata, se o volume de amostra permitir. As razes para
reanlise e seus resultados devem ser claramente documentados.
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41 de 41
FICHA TCNICA
Volume I Mdulo 3 Etapa Estatstica
Editores:
Arminda Lucia Siqueira UFMG
Cicilia Yuko Wada UNICAMP
Chang Chiann ANVISA
Gilberto Bernasconi USF
Colaboradores:
Reinaldo Charnet UNICAMP
Coordenao:
Apoio Logstico:
SUMRIO
PREFCIO ................................................................................................................................................ 5
1. INTRODUO ................................................................................................................................ 6
1.1. Consideraes gerais sobre bioequivalncia ............................................................................. 6
1.2. Principais medidas farmacocinticas ......................................................................................... 6
1.3. Outras medidas farmacocinticas .............................................................................................. 9
1.4. Mtodos de anlise de bioequivalncia .................................................................................. 10
1.5. Exemplo ...................................................................................................................................... 10
2. DELINEAMENTO DO ESTUDO .......................................................................................... 13

2.1. Planejamento crossover ............................................................................................................... 13
2.1.1. Perodo de eliminao (washout) e efeitos residuais (carry-over effects) ........................ 13
2.1.2. Descrio do planejamento ........................................................................................... 14
2.1.3. Consideraes de um delineamento bsico ................................................................ 14
2.1.4. Tipos de delineamento .................................................................................................. 15
2.1.5. Seleo do delineamento experimental ....................................................................... 18
2.1.6. Modelo estatstico ........................................................................................................... 19
2.2. Inferncia estatstica sobre efeitos de um delineamento crossover 2x2 ................................ 19
2.2.1. Os efeitos residuais (carryover) ....................................................................................... 21
2.2.2. O efeito da droga............................................................................................................ 23
2.2.3. O efeito de perodo ........................................................................................................ 25
2.3. Anlise de varincia .................................................................................................................. 26
2.4. Exemplo ..................................................................................................................................... 29
3. MTODOS ESTATSTICOS PARA BIOEQUIVALNCIA MDIA .......................... 31

3.1. Introduo.................................................................................................................................. 31
3.2. Intervalo de bioequivalncia .................................................................................................... 32
3.2.1 Medidas farmacocinticas sem transformao........................................................... 32
3.2.2 Medidas farmacocinticas com transformao logartmica ..................................... 33
3.3. Avaliao da bioequivalncia mdia ....................................................................................... 34
3.3.1 Intervalo de confiana .................................................................................................... 35
3.3.2 Teste de hipteses............................................................................................................ 38
3.4. Poder dos dois testes unilaterais ............................................................................................. 41
3.5. Exemplo ..................................................................................................................................... 42
4. ROTEIRO DA ETAPA ESTATSTICA EM ENSAIOS DE BIOEQUIVALNCIA 46

4.1. Roteiro da etapa estatstica ...................................................................................................... 46
4.2. Ilustrao das etapas de anlise estatstica ............................................................................. 46
5. OUTRAS CONSIDERAES SOBRE BIOEQUIVALNCIA..................................... 59
5.1. Dimensionamento da amostra ................................................................................................. 59
5.1.1. Introduo .................................................................................................................... 59
5.1.2. Conceitos bsicos ........................................................................................................ 60
5.1.3. Tamanho de amostra atravs de hipteses de intervalo
(modificado) ................................................................................................................. 60
5.2. Observaes atpicas em estudos de bioequivalncia (outliers) ............................................ 61
5.3. Ocorrncia de observaes faltantes...................................................................................... 64
5.4. Bioequivalncia individual e populacional ............................................................................. 64
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................................... 65
APNDICE - CONCEITOS ESTATSTICOS BSICOS ........................................................ 66

Volume I / Mdulo 3 - Etapa Estatstica
PREFCIO
Atualmente, esto sendo feitos no Brasil inmeros estudos com o objetivo de avaliar a
biodisponibilidade e a bioequivalncia de produtos genricos, como tambm de novas formulaes
de medicamentos j existentes no mercado.
No decorrer das atividades de inspeo dos Centros de Pesquisa que realizam esses estudos,
conduzidas pela Coordenao de Inspeo em Centros de Bioequivalncia/GGIMP/ANVISA,
observou-se uma grande carncia quanto ao esclarecimento dos mtodos estatsticos associados a
esses ensaios. Essa carncia tem como principal reflexo o comprometimento da qualidade dos
trabalhos realizados por esses Centros, que na maioria das vezes no contam com a colaborao de
um profissional de Estatstica. Dessa forma, uma srie de problemas detectada durante a inspeo
dessa etapa, e muitos deles seriam facilmente contornados caso as tcnicas necessrias avaliao
da bioequivalncia estivessem disponibilizadas de forma clara aos pesquisadores e demais envolvidos.
A partir dessa necessidade, surgiu a iniciativa por parte desta Coordenao da criao do Ncleo de
Discusso da Etapa Estatstica, um grupo de estudo que tem por objetivo a determinao de todos
os aspectos relevantes execuo da etapa estatstica nos ensaios de bioequivalncia, e que conta
com a participao de vrios especialistas da rea.
Na primeira reunio de trabalho do grupo, levantou-se a possibilidade da elaborao de um manual

que viesse atender as dificuldades dos Centros, e por conseguinte estabelecer as diretrizes reguladoras
relativas etapa estatstica dos ensaios. O material desenvolvido para o mdulo da etapa estatstica
composto por tpicos especficos bem definidos, apresentados de maneira altamente didtica,
buscando o completo aproveitamento do pblico alvo, caracterizado em geral por profissionais da
rea de sade sem especializao em mtodos estatsticos. importante ressaltar que esse material
vem atender os requisitos mnimos exigidos pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, alm de
abordar outros pontos de igual relevncia. O presente manual proposto tem tambm por objetivo a
indicao de diretrizes reguladoras de modo a respaldar as atividades de inspeo, no sentido de
melhorar cada vez mais a qualidade dos ensaios de bioequivalncia realizados no Brasil.
O mdulo da etapa estatstica composto basicamente por mtodos estatsticos associados avaliao
da bioequivalncia, considerando o critrio da bioequivalncia mdia sob delineamento experimental
crossover 2X2. No captulo de introduo, esto definidos os conceitos de biodisponibilidade e
bioequivalncia, alm das medidas farmacocinticas que so avaliadas nos ensaios, que esto
exemplificadas por conjunto de dados hipotticos que ser trabalhado em todos os captulos, de
acordo com cada novo conceito abordado. Os captulos 2 e 3 tratam dos mtodos para o planejamento
crossover e dos mtodos estatsticos para a bioequivalncia mdia, respectivamente. No Captulo 4
apresentado um roteiro para a realizao da etapa estatstica exemplificado pela anlise completa de
uma medida farmacocintica. Finalmente, no Captulo 5 so apresentadas algumas consideraes
adicionais e essenciais na prtica de um estudo de bioequivalncia. No apndice so apresentados
alguns conceitos bsicos de estatstica teis no entendimento dos mtodos apresentados.
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1. INTRODUO
1.1. Consideraes gerais sobre bioequivalncia
A equivalncia teraputica de produtos farmacuticos depende diretamente da biodisponibilidade,

que definida pela quantidade e velocidade pela qual o princpio ativo absorvido e se torna
disponvel em seu stio de ao. Um estudo comparativo de biodisponibilidade refere-se comparao
das biodisponibilidades de diferentes formulaes do mesmo frmaco, ou de frmacos diferentes.
Dois produtos so considerados bioequivalentes se as suas quantidades e velocidades de absoro
no apresentam diferenas significativas, quando administradas mesma dose molar do princpio
ativo, sob condies experimentais similares.
Os nveis de concentrao de um frmaco no organismo dependem em parte da via de administrao,

que pode ser classificada como intravascular ou extravascular. A administrao intravascular se d
diretamente na corrente sangnea por via intravenosa ou intra-arterial. A extravascular inclui os
meios de administrao oral, intramuscular, subcutneo, transdrmico e outros. Quando um frmaco
administrado no organismo, ele geralmente atravessa as fases de absoro, distribuio,
metabolizao, e finalmente, eliminao. Dessa forma, a biodisponibilidade geralmente determinada
pelas medidas farmacocinticas, ou seja, aquelas que se relacionam com a quantidade de frmaco
absorvido e com a velocidade do processo de absoro. Essas medidas podem ser obtidas a partir
de resultados da quantificao do frmaco em lquidos biolgicos, como sangue ou urina, aps
administrao extravascular com dose nica.
Dois medicamentos so considerados bioequivalentes se as suas quantidades e velocidades de

absoro no apresentam diferenas estatisticamente significativas, quando administrados mesma
dose molar do princpio ativo, sob as mesmas condies experimentais.
Um estudo de bioequivalncia refere-se basicamente comparao das principais medidas

farmacocinticas observadas no experimento, relativas aos produtos a serem testados.
1.2. Principais medidas farmacocinticas
As medidas farmacocinticas avaliadas na bioequivalncia derivam diretamente da curva de

concentrao do medicamento ao longo do tempo, que caracterizada pela quantificao de um
determinado nmero de amostras biolgicas, relativas a tempos de coleta previamente estabelecidos.
A primeira e mais importante medida avaliada a rea sob a curva de concentrao plasmtica do
frmaco versus tempo, freqentemente utilizada para medir a extenso da absoro, ou o montante
total de droga absorvido pelo organismo, aps administrao de dose nica de um medicamento. A
determinao da bioequivalncia entre dois medicamentos resulta da comparao das ASCs obtidas
no experimento. Atravs de sua representao matemtica
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(1.1)
observa-se que esta medida diretamente proporcional quantidade de frmaco efetivamente

absorvido e disponvel para ser distribudo no organismo (FD). O termo Ke.Vd, dado em (1.6),
expressa o clearance total do frmaco (depurao), ou seja, sua velocidade de eliminao a partir do
volume de distribuio, sendo que Ke corresponde constante de velocidade de eliminao total do
frmaco no organismo. Os conceitos de depurao e volume de distribuio sero abordados mais
adiante.
Dentre diversos mtodos para a determinao da ASC do tempo zero at o tempo da ltima coleta
(tk), o mais utilizado o mtodo dos trapezides (Chow & Liu,1992). Esse mtodo consiste na soma
das reas dos trapzios determinados pelos tempos de coleta e respectivas concentraes (ver Figura
1.1). Sejam C0, C1, C2,..., Ck, as concentraes obtidas em um experimento para os tempos de coleta
0, t1, t2, ..., tk,, respectivamente. A ASC de zero a tk, denotada por ASCtk, obtida da seguinte forma:
(1.2)
A rea sob a curva de concentrao versus tempo (ASC) pode tambm ser extrapolada e calculada
do tempo zero at o tempo relativo completa eliminao do frmaco. Essa medida citada na
literatura como a rea sob a curva do tempo zero a infinito. A poro adicional expressa por uma
relao entre a ltima concentrao medida Ck e a constante de velocidade de eliminao do frmaco
Ke. A constante de eliminao calculada para cada voluntrio como o coeficiente de inclinao da
reta de regresso ajustada nos 4 a 6 ltimos valores de concentrao transformados em log10 ,
multiplicada por 2,303. A rea sob a curva de zero a infinito obtida da seguinte maneira:
(1.3)
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Observa-se que a ocorrncia de alguns valores faltantes e/ou valores inesperados na curva de
concentrao, geralmente no acarretar um grande impacto no clculo de ASC. Por outro lado, se
esses valores forem relativos aos ltimos pontos da curva, como por exemplo tk, a estimativa de
ASC pode vir a ter um vis. De acordo com a legislao vigente no Brasil, a rea sob a curva do
tempo zero ao tempo tk, deve ser igual ou superior a 80% da rea sob a curva de zero a infinito.
Cmax a medida que representa a maior concentrao do frmaco observada e diretamente

proporcional ao montante total de droga absorvido pelo organismo. Tmax o tempo de coleta no
qual foi observada a ocorrncia de Cmax e relaciona-se com a velocidade de absoro do frmaco.
A determinao da bioequivalncia entre dois medicamentos, inclui tambm a comparao das
medidas de Cmax e Tmax obtidas no experimento para cada uma das formulaes (medicamentos
teste e referncia).
A RE n 478 de 19 de maro de 2002 estabelece trs medidas fundamentais determinao da

bioequivalncia entre medicamentos: a rea sob a curva de concentrao versus tempo (ASC), a
concentrao mxima observada (Cmax), e o tempo no qual essa concentrao foi alcanada
(Tmax).
A Figura 1.1 mostra uma curva de concentrao plasmtica de um frmaco e ilustra as principais
medidas farmacocinticas: ASCtk, Cmax e Tmax.
Figura 1.1. Curva de concentrao plasmtica de um frmaco
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1.3. Outras medidas farmacocinticas
Outras medidas farmacocinticas que tambm devem ser apresentadas nos estudos de bioequivalncia,
embora no necessitem de tratamento estatstico comparativo, so o volume aparente de distribuio
(Vd), a meia vida de eliminao do frmaco (t1/2) e a depurao (D).
O volume aparente de distribuio (Vd) uma medida que correlaciona a quantidade de frmaco
no organismo com a sua concentrao (C) no sangue ou no plasma, dependendo do fluido biolgico
que se esteja trabalhando. O volume no se refere a um valor fisiolgico identificvel, mas
simplesmente ao volume de lquido que seria necessrio para conter todo o frmaco no organismo
na mesma concentrao presente no sangue ou no plasma:
(1.4)
Dessa forma, o volume de distribuio de determinado frmaco pode variar em funo da idade,
sexo, doena e composio orgnica de cada pessoa. Nesse sentido, so extremamente importantes
os critrios de incluso do estudo para a seleo dos voluntrios, na tentativa de se utilizar um grupo
com caractersticas mais homogneas possveis.
A meia-vida (t1/2) de um frmaco o tempo gasto para que a concentrao plasmtica ou para que
a quantidade do mesmo no organismo diminua em 50%, e definida por:
(1.5)
Embora a meia-vida seja considerada um parmetro fraco para a determinao da eliminao de um

frmaco, ela proporciona uma boa indicao sobre o tempo gasto para que um frmaco seja removido
do organismo, funcionando como um meio para se calcular os intervalos entre as doses de
administrao de um medicamento. No caso da bioequivalncia, essa medida funciona como uma
ferramenta essencial para a determinao do tempo de descanso (washout) necessrio para completa
eliminao do medicamento ingerido no primeiro perodo do estudo. A legislao brasileira prev
que o intervalo entre os perodos do estudo deve ser de no mnimo sete vezes meia-vida do
frmaco estudado.
A depurao (D) ou clearance de um determinado indivduo a medida da capacidade do organismo

em eliminar um frmaco, e dada pelo produto do volume aparente de distribuio e da constante
de eliminao:
(1.6)
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Atualmente, existem vrios programas para uso em computador, que realizam os clculos de todas
as medidas farmacocinticas e que so amplamente usados nos estudos de biodisponibilidade/
bioequivalncia.
1.4. Mtodos de anlise de bioequivalncia
A anlise de bioequivalncia entre duas formulaes de referncia (R) e teste (T) tem sido realizada
com base nas medidas farmacocinticas apresentadas anteriormente, portanto, considerando medidas
resumo dos dados longitudinais. Os mtodos de anlise estatstica so os chamados bioequivalncia
mdia, individual e populacional. O primeiro considera a anlise sob o enfoque das mdias das
formulaes R e T, enquanto que os ltimos consideram a variabilidade existente nas medidas
farmacocinticas. A bioequivalncia mdia o mtodo mais comumente usado e ser abordado neste
manual.
Os mtodos estatsticos de bioequivalncia mdia surgiram no fim da dcada de 70 e incio da

dcada de 80, como conseqncia dos esforos do FDA ( Food and Drug Administration) de
apontar as necessidades de mtodos apropriados de avaliao estatstica dos estudos de
bioequivalncia. Os principais desenvolvimentos foram a reformulao das hipteses de
bioequivalncia (Anderson e Hauck, 1983; Schuirmann, 1981), o mtodo do intervalo de confiana
(Meltzer, 1974; Westlake, 1972, 1976 e 1981) e a abordagem bayesiana (Rodda e Davis, 1980; Madallaz
e Mau, 1981). Diversos estudos tm sido realizados desde ento para anlise de bioequivalncia com
estudos comparativos dos mtodos; podemos citar Hauck e Anderson (1992) entre eles. Chow e Liu
(1992) apresentaram a primeira edio do livro, Design and Analysis of Bioavalaibility and Bioequivalence
Studies, incluindo j seus estudos realizados nesta rea. Em 2000, publicada a segunda edio do
livro, com exaustiva apresentao dos mtodos de anlise de bioequivalncia.
A apresentao dos mtodos de bioequivalncia mdia deste manual ficar restrita somente a mtodos
padres, tanto em testes de hipteses como em intervalos de confiana.
1.5. Exemplo
A ilustrao dos mtodos para anlise de bioequivalncia mdia entre duas formulaes R (referncia)
e T (teste) ser realizada neste manual utilizando dados hipotticos. As concentraes de 24
voluntrios so apresentadas nas tabelas 1.1 e 1.2, com coletas realizadas em 13 tempos diferentes
(dados longitudinais), respectivamente nas formulaes R e T.
As tabelas 1.3 e 1.4 mostram as principais medidas farmacocinticas calculadas para as concentraes
das tabelas 1 e 2 e de acordo com o planejamento de estudo crossover (cap.2) , considerando a seqncia
de administrao dos medicamentos (RT=1,TR=2) e tambm o perodo de administrao ( perodos
1 e 2) das formulaes R e T, respectivamente.
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Tabela 1.1. Concentraes plasmticas (ng/ml) ao longo do tempo (horas) referentes ao

medicamento de referncia (R)
Tabela 1.2. Concentraes plasmticas (ng/ml) ao longo do tempo (horas) referentes ao

medicamento teste (T)
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Tabela 1.3. Medidas farmacocinticas dos indivduos no medicamento de referncia (R)
Tabela 1.4. Medidas farmacocinticas dos indivduos no medicamento teste (T)
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2. DELINEAMENTO DO ESTUDO
2.1. Planejamento crossover
A escolha dos delineamentos e os mtodos estatsticos para anlise de dados so dois aspectos
importantes num estudo de bioequivalncia. Esses dois aspectos so muito relacionados, uma vez
que o mtodo de anlise depende do delineamento utilizado. Consideraes gerais de um estudo
devem levar em conta:
Qual o objetivo do estudo?

Qual o delineamento utilizado?
Qual o mtodo estatstico utilizado?
Neste manual, restringimos a comparao de diferentes formulaes da mesma droga. Um critrio

para escolher um delineamento apropriado verificar se o delineamento selecionado pode identificar
e isolar a variabilidade inter-individual em anlise de dados. Qualquer delineamento que venha remover
essa variao da comparao entre formulaes pode ser apropriado.
O planejamento experimental mais utilizado nos ensaios de biodisponibilidade/ bioequivalncia o

crosssover, cujos detalhes sero discutidos a seguir.
2.1.1. Perodo de eliminao (washout) e efeitos residuais (carry-over effects)
importante introduzir os conceitos de perodo de eliminao (washout) e efeitos residuais (carry-

over effects) num planejamento crossover, pois a presena de efeitos residuais tem um grande impacto
na inferncia estatstica de biodisponibilidade entre formulaes.
O perodo de eliminao (washout) definido como um intervalo de tempo suficientemente

grande entre dois perodos de tratamentos para que o efeito residual de uma formulao
administrada num perodo de tratamento seja eliminado das unidades experimentais para o
prximo perodo.
O experimento crossover deve ser usado quando no existe efeito residual nos tratamentos. Se uma
droga tem uma meia-vida longa ou se o intervalo entre os perodos de tratamentos muito curto, o
efeito da droga pode persistir depois do fim de perodo da dosagem. Neste caso, necessrio
distinguir a diferena entre o efeito de droga e os efeitos residuais.
O efeito da droga aquele observado durante o perodo no qual ela administrada, enquanto
que o efeito residual o efeito da droga que persiste depois do fim do perodo da dosagem.
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Os efeitos residuais de primeira ordem so aqueles relativos a um nico perodo de tratamento,

enquanto que efeitos residuais de ordem C so aqueles que persistem nos ltimos C perodos de
tratamento. No estudo de bioequivalncia, como o perodo de eliminao normalmente considerado,
raro aparecer um efeito de droga relativo a mais de um perodo de tratamento. Neste manual,
consideramos apenas os efeitos residuais de primeira ordem, caso eles existam.
2.1.2. Descrio do planejamento
O crossover um planejamento de blocos aleatorizados modificados nos quais cada bloco recebe
mais de uma formulao de uma mesma droga em perodos diferentes. Um bloco pode ser um
indivduo ou um grupo de indivduos. Os indivduos em cada bloco recebem uma seqncia diferente
de formulaes. As vantagens em se utilizar esse planejamento para estudos de bioequivalncia so:
cada indivduo serve como seu prprio controle, o que permite uma comparao do indivduo
com ele mesmo, para as diferentes formulaes;
a variabilidade inter-individual removida da comparao entre formulaes, o que torna o
teste de diferena de tratamentos em geral mais poderoso;
com uma aleatorizao apropriada de indivduos para a seqncia de administrao de
formulaes, o planejamento produz as melhores estimativas no viciadas para diferena (ou
razo) entre formulaes.
2.1.3. Consideraes de um delineamento bsico
A legislao brasileira indica que um delineamento bsico para um estudo de biodisponibilidade in

vivo deve considerar:
questes cientficas a serem respondidas;

natureza do material de referncia e a forma de dosagem a ser testada;
disponibilidade de mtodos analticos;
consideraes de benefcio em teste humano.
Alm disso, algumas consideraes especficas para um estudo de bioequivalncia so dadas a seguir.
Delineamento experimental
A legislao brasileira recomenda que para um estudo de biodisponibilidade (dose simples ou mltipla)
deve ser adotado um delineamento do tipo crossover, a no ser que um delineamento paralelo ou
algum outro seja mais apropriado por razes cientficas vlidas. Para um delineamento paralelo,
cada indivduo recebe ao acaso somente uma das formulaes, enquanto que em um delineamento
crossover, cada indivduo recebe mais de uma formulao em perodos diferentes.
O planejamento adequado do experimento deve ter como objetivo minimizar a variabilidade que
pode advir de vrias fontes:
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variabilidade inter-individual;
variabilidade intra-individual;
efeito dos perodos, que pode ser causado por ao residual de tratamentos precedentes;
erro experimental;
variabilidade associada a tratamentos diferentes, como administrao de produtos ou dosagens
diferentes.
Aleatorizao
Inferncias estatsticas vlidas so normalmente baseadas nas suposies de que os erros do modelo
empregado so variveis aleatrias independentemente distribudas, o que pode ser assegurado atravs
da aleatorizao. A forma de aleatorizao feita de acordo com o delineamento a ser utilizado no
estudo.
Cronograma de coleta
A legislao brasileira recomenda que o cronograma de coleta das amostras deve contemplar um
tempo igual ou superior a 3-5 vezes a meia-vida de eliminao do frmaco ou do metablito, quando
o mesmo for ativo.
Perodo de eliminao
A legislao brasileira recomenda que o intervalo entre os perodos deve ser de no mnimo sete
meias-vidas de eliminao do frmaco, ou do metablito, quando o mesmo for ativo.
Nmero de voluntrios
O nmero de voluntrios sadios dever sempre assegurar poder estatstico suficiente para garantir a
confiabilidade dos resultados do estudo de bioequivalncia.
2.1.4. Tipos de delineamento
Esta seo descreve os delineamentos comumente utilizados nos estudos de bioequivalncia.
Delineamento crossover para dois medicamentos (T = teste; R = referncia)
a) Delineamento crossover 2x2
um delineamento convencional no replicado com duas formulaes, dois perodos, duas

seqncias, que pode ser representado como segue:
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Cada indivduo aleatoriamente alocado para a seqncia RT ou TR em dois perodos de dosagem.

Isto , indivduos alocados na seqncia RT (TR) recebem formulao R (T) no primeiro perodo
de dosagem e formulao T (R) no segundo perodo de dosagem. Os perodos de dosagem so
separados por um tempo suficiente para que a droga recebida no primeiro perodo seja completamente
metabolizada e/ou eliminada do corpo quando inicializar o segundo perodo de dosagem.
Aleatorizao para um estudo crossover 2x2 pode ser feita atravs de tabelas de nmeros aleatrios ou
procedimentos de aleatorizao implementados em softwares estatsticos.
b) Delineamento crossover replicado
Este delineamento recomendado para estudos de bioequivalncia de formulaes com dosagem

de liberao modificada ou produtos de alta variabilidade (coeficiente de variao intra-individual
30%), incluindo aqueles que so de liberao imediata, liberao modificada e outros produtos
de administrao oral.
Para este delineamento os mesmos lotes das formulaes teste e referncia devem ser usados para a
administrao replicada. Os perodos devem ser suficientemente espaados (washout) para garantir a
inexistncia do efeito residual.
Os delineamentos crossover replicados mais comumente usados para comparar duas formulaes
so:
i) Delineamento com quatro seqncias e dois perodos (delineamento de Balaam):
ii) Delineamento com duas seqncias e quatro perodos:
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iii) Delineamento com quatro seqncias e quatro perodos:
iv) Delineamento com duas seqncias e trs perodos:
ou
Um nmero maior de voluntrios recomendado para o delineamento de trs perodos, comparado

com o delineamento de quatro perodos, para poder alcanar o mesmo poder estatstico para a
bioequivalncia.
Delineamento crossover para trs medicamentos (delineamento de Williams com T1 = teste

1, T2 = teste 2, R = referncia)
Para comparar trs formulaes de uma droga, existe um total de trs possveis pares de comparaes
entre formulaes: formulao 1 versus formulao 2, formulao 1 versus formulao 3 e formulao
2 versus formulao 3. Como o nmero de formulaes a serem comparadas grande, mais seqncias
e conseqentemente mais indivduos sero necessrios, o que pode ser invivel. Um delineamento
de uso prtico proposto por Williams (1949) possui propriedades de balanceamento e requer poucas
seqncias e perodos. Um delineamento dito balanceado se satisfaz as seguintes condies:
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cada medicamento aplicado somente uma vez em cada voluntrio;

em cada perodo, o nmero de voluntrios que recebem cada medicamento tem que ser igual;
o nmero de voluntrios que recebem o medicamento i em algum perodo seguido pelo
medicamento j no perodo seguinte o mesmo para todo ij.
Um delineamento de Williams ilustrado como segue:
Delineamento crossover para quatro medicamentos (delineamento de Williams):
2.1.5. Seleo do delineamento experimental
Selecionar um delineamento apropriado ao planejar um estudo de bioequivalncia uma questo

importante. A resposta dessa questo depende de vrios fatores, tais como:
nmero de formulaes a serem comparadas;

caractersticas da droga e sua disponibilidade;
objetivo do estudo;
variabilidade inter e intra individuais;
durao do estudo e nmero de perodos empregados;
custo de adio de um voluntrio relativo adio de um perodo;
taxa de desistncia (dropout).
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A anlise dos dados, a interpretao dos resultados e a determinao de bioequivalncia entre

formulaes dependem diretamente do delineamento selecionado. Portanto, todos os fatores citados
acima devem ser cuidadosamente avaliados para que um delineamento apropriado seja escolhido.
2.1.6. Modelo estatstico
Num planejamento crossover, importante remover os efeitos residuais da comparao j que o

efeito de droga pode ser confundido com qualquer efeito residual. Entretanto, em algumas situaes
isso no possvel.
Levando em considerao os efeitos residuais, o seguinte modelo estatstico normalmente

considerado. Seja Yijk a resposta (por exemplo, ASCtk, Cmax) do i-simo indivduo na k-sima seqncia
no j-simo perodo:
Yijk = + Sik + Pj + F(j,k) +R(j-1,k) + ijk (2.1)
onde:
: mdia geral;
Sik: efeito aleatrio do i-simo indivduo na k-sima seqncia, onde i (indivduo) =1, 2, ..., nk e
k (seqncia) =1, 2, ..., g;
Pj: efeito fixo do j-simo perodo, j = 1, ..., p tal que j Pj=0;
F(j, k): efeito fixo da formulao administrada na k-sima seqncia e j-simo perodo tal que,
F(j, k)=0;
R(j-1, k): efeito residual fixo de primeira ordem da formulao administrada na k-sima seqncia
e (j-1)-simo perodo, tal que R(0,k) = 0 e R(j-1,k) = 0;
ijk: erro aleatrio (intra-indivduo).
Assume-se que {Sik} e {ijk} so independentes, identicamente distribudos (i.i.d) com mdia zero e
varincias s2 e t2 respectivamente, onde t=1,2, ..., L (nmero de formulaes a serem comparadas).
Assume-se tambm que {Sik} e {ijk} so mutuamente independentes. As estimativas de s2 so
geralmente usadas para explicar a variabilidade inter-individual, enquanto que as estimativas de t2
so usadas para descrever a variabilidade intra-individual, para a t-sima formulao.
2.2. Inferncia estatstica sobre efeitos de um delineamento crossover 2x2
O modelo para o delineamento crossover 2x2, corresponde a um caso particular de (2.1), com i
(indivduo) =1, 2 , ..., nk, j (perodo)=1, 2 e k(seqncia) = 1, 2. Nesse caso, a notao anterior pode
ser simplificada de modo que F(j, k) = FR ou FT e R(j-1, k) = RR ou RT como segue:
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Como a formulao administrada no primeiro perodo na primeira seqncia de referncia, ento:
Para esse delineamento, os efeitos residuais podem ocorrer somente no segundo perodo. Denota-
se o efeito residual da formulao, referncia do primeiro para o segundo perodo na seqncia 1
por RR. Portanto,
Para cada indivduo, os efeitos fixos em cada perodo e seqncia so dados por:
onde jk = E(Yijk), P1 + P2 = 0, FR +FT = 0 e RR +RT =0.
Para a comparao de biodisponibilidade entre formulaes, desejvel estimar e separar os efeitos

residuais do efeito da droga. Na prtica, normal assumir que:
no existe efeito de perodo;

no existem efeitos residuais.
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Isso se deve aos fatos de que:
um estudo bem conduzido pode eliminar o possvel efeito de perodo;

o perodo de eliminao suficientemente espaado pode ser escolhido para assegurar a ausncia
dos efeitos residuais.
Entretanto, em vrios casos, o efeito de perodo e/ou os efeitos residuais ainda podem permanecer.
A presena de efeitos residuais pode certamente aumentar a complexidade da anlise estatstica para
a verificao da bioequivalncia entre formulaes. Portanto, de interesse estabelecer alguns testes
preliminares para a presena do efeito de perodo e/ou dos efeitos residuais antes que a comparao
de biodisponibilidades entre formulaes seja feita.
2.2.1. Os efeitos residuais (Carryover)
Considere Uik=Yi1k+Yi2k, i (indivduo) = 1, 2, ..., nk, k (seqncia) =1, 2, a soma da medida

farmacocintica em estudo nos perodos 1 e 2 na k-sima seqncia e a mdia da soma na k-sima
seqncia:
(2.2)
onde so variveis aleatrias independentes provenientes de populaes normais com

varincias iguais.
A existncia de efeito residual significa que existem efeitos residuais diferentes nas seqncias
de tratamentos;
A inexistncia do efeito residual no implica necessariamente que tais efeitos sejam nulos, mas
que se existirem, tm a mesma intensidade em ambas seqncias de tratamentos.
Seja R = RT RR. Sob a restrio de que RT + RR = 0, os efeitos residuais so iguais para duas
formulaes, isto , R = 0 se e somente se RT= RR = 0. Portanto, um teste para ausncia de efeitos
residuais equivalente a um teste de igualdade de efeitos residuais. Quando h inexistncia de
efeitos residuais, os efeitos de droga (isto , F = FT FR) podem ser estimados baseado nos dados de
ambos perodos. Mas no h estimadores no-viciados para os efeitos de droga caso os efeitos
residuais estejam presentes. Portanto, de interesse examinar a existncia desses efeitos.
Os efeitos residuais podem ser determinados testando-se as hipteses:
21 de 71
A rejeio da hiptese nula nos leva concluso da presena de efeitos residuais entre formulaes.
Definindo
(2.3)
pode-se mostrar que R^ normalmente distribudo com mdia R e varincia
estimada por:
(2.4)
onde
(2.5)
Sob Ho, a estatstica
(2.6)
tem uma distribuio t de student com n1+n2-2 g. l.
Rejeitamos Ho ao nvel de se
|Tr| > t(/2, n1+n2-2) ,
onde t(/2, n1+n2-2) o valor crtico da distribuio t de student,
ao nvel de significncia , com n1+n2-2 graus de liberdade.
Como a estatstica Tr envolve a estimativa de u2 = 2(2s2 + e2) que inclui as variabilidades inter e
intra individuais, ela pode ter pouco poder quando a variabilidade inter-individual relativamente
maior que a intra-individual. Para aumentar o poder do teste, Grizzle (1965) sugeriu testar Ho usando
= 0,10.
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2.2.2. O efeito da droga
Consideremos a diferena das medidas em estudo entre os perodos 1 e 2 na k-sima seqncia:
(2.7)
e a mdia destas diferenas na seqncia k:
(2.8)
Denota-se o efeito da droga por F = FT FR. Se RT RR , ento no existem estimadores no-

viciados para F baseado nos dados de ambos os perodos. Por outro lado, se RT = RR , ento
(2.9)
onde:
(2.10)
so chamados mdias dos mnimos quadrados (least squares means) para as formulaes
R e T, respectivamente, e diferem das mdias diretas das formulaes R e T a menos que n1= n2 .
Todos os mtodos estatsticos para verificao da bioequivalncia mdia devem utilizar as mdias
apresentadas em (2.10). Pode-se demonstrar que, sob as suposies da Seo 2.1.5, F^ normalmente
distribudo com mdia F e varincia onde a estimativa de d2 dada por:
(2.11)
23 de 71
A presena do efeito da droga pode ser examinada testando-se as hipteses:
Atravs da estatstica
(2.12)
Rejeitamos Ho ao nvel de significncia se

|Td| > t(/2, n1+n2-2),
onde t(/2, n1+n2-2) o valor crtico da distribuio t de Student,
ao nvel de significncia , com n1+n2-2 graus de liberdade.
Na presena de efeitos residuais, um estimador no-viciado para F pode ser obtido usando-se
somente os dados do primeiro perodo. Neste caso, um intervalo de (1 - )100% de confiana
(IC) para F dado por
(2.13)
(2.14)
24 de 71
A hiptese nula de inexistncia de efeito da droga rejeitada se
(2.15)
e t(/2, n1+n2-2) o valor crtico da distribuio t de Student,

ao nvel de significncia .
Na prtica, na presena de efeitos residuais, os dados do primeiro perodo podem ser analisados
para avaliar a bioequivalncia entre formulaes no estudo de biodisponibilidade. Entretanto, tem-
se as seguintes conseqncias:
h pouco poder para deteco de uma diferena clinicamente significante devido ao aumento
em variabilidade;
a desconsiderao da informao do segundo perodo elimina o benefcio de um delineamento
crossover, que remove a variabilidade inter-individual da comparao entre formulaes.
2.2.3. O efeito de perodo
Um estimador no-viciado para o efeito de perodo P pode ser obtido como
As hipteses a serem testadas so
Rejeitamos Ho ao nvel se
|Tp| > t(/2, n1+n2-2),
onde
e t(/2, n1+n2-2) o valor crtico da distribuio t de Student,

ao nvel de significncia , com n1+n2-2 graus de liberdade
25 de 71
2.3. Anlise de varincia
O objetivo da anlise de varincia estudar a variabilidade nos dados observados particionando a

soma de quadrados total (SQtotal) das observaes em componentes dos efeitos fixos e dos erros
aleatrios. Por exemplo, para o delineamento crossover padro 2x2, devemos particionar a soma de
quadrados total das 2(n1+n2) observaes em componentes dos efeitos residuais, do efeito de perodo,
do efeito de droga e do erro. Seja Y ... a mdia geral das observaes. Ento,
(2.18)
onde e SQentre a soma dos quadrados referente aos indivduos (inter-
individual) e SQdentro a soma dos quadrados dentro de cada indivduo (intra-individual). Alm
disso, SQentre pode ser particionada em duas componentes: uma para os efeitos residuais e outra para
os erros entre os indivduos, ou seja,
SQentre = SQresidual + SQinter (2.19)
onde
(2.20)
(2.21)
Onde Yi.k e Y..k so as somas de Yijk nos ndices correspondentes .
Para testar a existncia de efeitos residuais, deve-se usar a estatstica
(2.22)
26 de 71
com os quadrados mdios definidos por QMresidual = SQresidual e QMinter = SQinter/(n1+n2-2), distribuda
segundo uma F com (1, n1+n2-2) graus de liberdade.
Rejeitamos a hiptese nula (inexistncia de efeitos residuais) ao nvel a se

Fr > F(, 1, n1+n2-2),
onde F(, 1, n1+n2-2) o valor crtico da distribuio F de Snedecor com
( 1, n1+n2-2) graus de liberdade.
Nota-se que uma distribuio F com (1, ) graus de liberdade igual ao quadrado de uma distribuio
t com graus de liberdade. Portanto, a estatstica Fr equivalente ao teste Tr j que Fr = Tr2.
Analogamente, a soma dos quadrados dentro de cada indivduo pode ser decomposta em trs
componentes:
SQdentro = SQdroga + SQperodo + SQintra (2.23)
onde
(2.24)
(2.25)
(2.26)
Quando RR= RT, a hiptese nula de inexistncia de efeito de droga pode ser testada usando a
estatstica
(2.27)
com QMdroga = SQdroga e QMintra = SQintra/(n1+n2-2), que distribuda segundo uma F com (1,
n1+n2-2) graus de liberdade.
27 de 71
Rejeitamos a hiptese nula (inexistncia de efeito da droga) ao nvel se

Fd > F(, 1, n1+n2-2),
(1, n1+n2-2) graus de liberdade.
Note que a estatstica Fd equivalente ao teste estatstico Td j que Fd = Td2.
Para testar a hiptese nula de inexistncia de efeito do perodo, podemos considerar a seguinte
estatstica:
(2.28)
com QMperiodo = SQperiodo e Fp distribuda segundo uma F com (1, n1+n2-2) graus de liberdade.
Rejeitamos a hiptese nula (inexistncia de efeito do perodo) ao nvel se

Fp > F(, 1, n1+n2-2),
( 1, n1+n2-2) graus de liberdade.
Pode-se verificar que Fp=Tp2, portanto, o teste estatstico Fp equivalente ao teste estatstico Tp.
Para um delineamento geral de crossover, o mtodo de anlise de varincia til na inferncia estatstica
para os efeitos fixos do modelo especificado anteriormente (2.1), sob algumas suposies de
normalidade. Pode-se notar que para um delineamento crossover padro 2x2, a estatstica t de duas
amostras equivalente ao caso especial do mtodo de ANOVA. A tabela ANOVA apresentada a
seguir.
Tabela 2.1. Anlise de varincia para um delineamento crossover 2x2
28 de 71
Essa Anova pode ser modificada desde que o efeito dos resduos seja no significante, considerando
= 0,10. Neste caso, o modelo (2.1) pode ser reduzido para:
Yijk = + Sik + Pj + F(j,k) + ijk (2.29)
onde Yijk , , Sik , Pj , F(j,k) e ijk esto definidos em (2.1). A Tabela 2.1 ser modificada com o no
particionamento da SQentre como em (2.19), e ,portanto, QMentre = SQentre/ n1+n2-1 para o efeito
inter-individual e o teste estatstico obtido atravs de F= QMentre/QMintra .
2.4. Exemplo
Utilizamos a medida ASCtk do exemplo do Captulo 1 para ilustrar as inferncias estatsticas para os
efeitos fixos do modelo (2.1). Para uma anlise preliminar dos dados, obtemos:
Esses resultados indicam que as mdias amostrais de ASCtk para as formulaes de teste e referncia
na seqncia 2 so maiores que aquelas na seqncia 1. Para um delineamento crossover 2x2, a interao
entre seqncia e perodo representa o efeito de droga se no existem efeitos residuais. Portanto,
um teste preliminar para a presena de efeitos residuais deve ser necessariamente realizado antes
que a avaliao da bioequivalncia entre formaes seja feita.
Os efeitos residuais
Como U .1 = 806,77, U .2 = 967,69 e ^ 2u = 96.080,86, os resultados do teste so Tr = 1,27 (valor-

p = 0,11), ou seja, para qualquer 0,11 rejeitamos a hiptese da existncia de efeitos residuais. O
resultado do teste indica a utilizao dos dados dos dois perodos para a anlise do efeito de droga.
O efeito da droga
Como d .1 = -1,58, d.2 = -28,32 e ^ 2d = 1.783,76, os resultados do teste so Td =1,55 (valor-p = 0,07),
ou seja, para qualquer 0,07 rejeitamos a hiptese da existncia de efeito de droga.
Deve-se notar que a hiptese nula da igualdade entre formulaes no implica na bioequivalncia
entre formulaes.
29 de 71
O efeito de perodo
Como p^ = -29,90, os resultados do teste so Tp= -1,73 (valor-p = 0,05), ou seja, para qualquer
0,05 rejeitamos a hiptese da existncia do efeito de perodo.
Anlise de varincia
Os resultados da ANOVA so apresentados na Tabela 2.2.
Tabela 2.2. Anlise de varincia para ASCtk
Note que esses resultados so equivalentes aos obtidos atravs da estatstica t de duas amostras.
Os resultados indicam que o efeito dos resduos no significante (valor-p = 0,22) e o modelo
crossover pode ser reduzido para o modelo (2.29), cuja Anova correspondente apresentada na Tabela
2.3.
Tabela 2.3. Anlise de varincia para ASCt
Nota-se que o efeito inter-individual significante, o que indica a presena de variabilidade inter-
individual. Os efeitos de perodo e de droga no so significantes.
O ajuste do modelo atravs da anlise dos resduos inter e intra-individuais deve ser baseado no
modelo reduzido.
30 de 71
3. MTODOS ESTATSTICOS PARA BIOEQUIVALNCIA MDIA
3.1. Introduo
No captulo anterior foi discutido o modelo de anlise estatstica para experimentos cruzados, em
particular o experimento 2 x 2, isto , com duas amostras de tamanhos n1 e n2 alocadas aleatoriamente
para as formulaes de referncia (R) e teste (T) e cruzados em dois perodos. A anlise do experimento
cruzado permite verificar os efeitos do perodo, seqncia e droga utilizando hipteses formuladas
como: H0: 1= 2 contra Ha: 1 2, onde i (i = 1, 2) a mdia do i-simo nvel do fator (perodo,
seqncia ou droga, cada um com dois nveis). Estas hipteses so avaliadas atravs do teste F.
Entretanto, para verificar a bioequivalncia entre as formulaes, a hiptese formulada acima no
adequada, j que a no rejeio da hiptese H0 conclui pela igualdade das duas formulaes, mas
isto no implica em bioequivalncia.
Igualdade de mdias e bioequivalncia mdia entre

duas formulaes R e T so conceitos diferentes
O objetivo dos estudos de biodisponibilidade verificar se a taxa e a extenso da absoro do

frmaco no sistema circulatrio referentes s duas formulaes (R e T) so equivalentes. Sabe-se
que os perfis de biodisponibilidade de duas formulaes podem variar para um mesmo indivduo e
por isto trabalha-se com uma avaliao em termos mdios. Se consideramos R e T as mdias
populacionais de alguma das medidas farmacocinticas da biodisponibildade, as duas formulaes
so consideradas bioequivalentes se a diferena ( R - T) ou a razo ( R / T) entre as duas mdias
diferem por menos que os limites especificados (a regra de 20% a mais utilizada). Este mtodo
de verificar a bioequivalncia denominada bioequivalncia mdia. Existem outros mtodos de
verificar a bioequivalncia (individual e populacional), brevemente citadas no Captulo 5, mas neste
captulo tratamos apenas do mtodo de bioequivalncia mdia.
O objetivo deste captulo apresentar os mtodos utilizados para verificar a bioquivalncia mdia.
Estes mtodos so baseados em intervalos de confiana e testes de hipteses para a diferena ou
razo das mdias.
Em algumas situaes, h necessidade de se trabalhar com uma transformao da medida

farmacocintica (a logartmica a mais usual) e por isto neste captulo consideramos as anlises com
e sem transformao.
31 de 71
Ilustramos todos os mtodos apresentados com os dados do exemplo do Captulo 1 para a medida
farmacocintica ASCtk.
3.2. Intervalo de bioequivalncia
Nesta seo apresentamos os limites de bioequivalncia baseados na diferena ou na razo das

mdias para os casos de medidas farmacocinticas originais ou transformadas.
3.2.1. Medidas farmacocinticas sem transformao
Nesta situao utilizam-se as mdias aritmticas das medidas farmacocinticas ( T

e R) para
definir os intervalos de bioequivalncia entre R e T.
Diferena das mdias
O intervalo de bioequivalncia expresso por . Utilizando a regra de

20%, os limites de bioequivalncia so:
(3.1)
e ento o intervalo de bioequivalncia :
(3.2)
Na prtica estes limites devem ser estimados, pois dependem do parmetro populacional e a escolha
natural onde a mdia amostral da formulao de
referncia (R). Assim, o intervalo de bioequivalncia :
(3.3)
32 de 71
Razo das mdias
O intervalo de bioequivalncia definido por Como visto acima, o intervalo

de bioequivalncia para a diferena entre as mdias aritmticas das duas formulaes 0,20 R <
T R < 0,20 R. Dividindo-se por R, obtm-se -0,20 < ( T R) / R < 0,20 ou -0,20 < T
/ R -1 < 0,20, ou ainda 0,80 < T / R < 1,20. Assim, pela regra de 20%, os limites so
e o intervalo de bioequivalncia :
(3.4)
3.2.2. Medidas farmacocinticas com transformao logartmica
Denotando por ~ a mdia geomtrica da medida farmacocintica na escala original X e a mdia

aritmtica da medida transformada de X na escala logartmica (Y = ln X), pode-se facilmente
~ Portanto, na escala original a mdia geomtrica ~= exp().
mostrar (ver Apndice) que = ln .
Resumindo, a notao utilizada :
Razo das mdias
O intervalo de bioequivalncia definido sendo que os limites so

1,25, ou seja, o intervalo de bioequivalncia dado por
(3.5)
O uso dos limites 0,80 e 1,25 para o intervalo de bioequivalncia da razo das mdias na escala
original justificado pelo fato de haver uma correspondncia a um intervalo de bioequivalncia
simtrico para as diferenas na escala transformada, como mostrado a seguir.
33 de 71
Diferena das mdias
O intervalo de bioequivalncia expresso por . Como visto acima, o

intervalo de bioequivalncia para a razo das mdias geomtricas na escala original
0,80 < ~ / ~ /
~ < 1,25. Utilizando a transformao logartmica, tem-se que log 0,80 < log ( ~ )
T R T R
< log (1,25) ou ainda 0,2231 < log ~ log ~ < 0,2231. Finalmente, 0,22331 < ~
~ <
T R T R
0,2231, isto , o inter valo de bioequivalncia das diferenas das mdias aritmticas
na escala tr a n s f o r m a d a . A s s i m , os limites so dados por =
0,2231 e o intervalo de bioequivalncia :
0,2231 < T R < 0,2231 (3.6)
A Tabela 3.1 apresenta um resumo dos limites de bioequivalncia para as quatro situaes
consideradas.
Tabela 3.1. Intervalos de bioequivalncia baseados na mdia aritmtica ou mdia geomtrica

para a medida farmacocintica original ou na escala logartmica
Note que o caso da diferena na escala original o nico em que os limites de bioequivalncia
dependem dos dados.
3.3. Avaliao da bioequivalncia mdia
A comparao de mdias (diferena ou razo) pode ser realizada atravs de mtodos paramtricos
ou no-paramtricos. Para a utilizao de mtodos paramtricos, supe-se que a varivel de interesse
tenha um determinado tipo de distribuio. Em estudos de bioequivalncia, geralmente a medida
farmacocintica com ou sem transformao pode ser descrita pela distribuio normal. Para a
utilizao de mtodos no-paramtricos, no h exigncias sobre a distribuio da varivel estudada
e por esta razo, so tambm chamados de mtodos de distribuio livre. Portanto, so boas opes
para situaes em que no se conhece a distribuio ou quando a varivel no segue a distribuio
normal.
34 de 71
A avaliao da bioequivalncia pode ser feita atravs de intervalos de confiana (IC) ou de teste de
hipteses. Existem vrios mtodos paramtricos e no-paramtricos para a construo de intervalos
de confiana e de teste de hipteses. A seguir, apresentamos somente os mtodos paramtrico e
no-paramtrico padres para cada tipo de inferncia estatstica.
3.3.1. Intervalo de confiana
Para a deciso de bioequivalncia atravs do intervalo de confiana, a seguinte ao ser tomada:
Se a regra de 20% adotada para medidas farmacocinticas sem transformao, o nvel de

significncia usualmente escolhido como 5% (=0,05) e o coeficiente de 90% de confiana
utilizado para T R ou para T / R. Para medida farmacocintica com transformao logartmica,
usando a regra 80/125, o nvel de significncia a ser escolhido tambm usualmente de 5%,
resultando um intervalo de 90% de confiana para T R ou para ~ T/~ R.
O intervalo de confiana 100(1-2)%, (L1 , U1 ) para RT significa que se o estudo for repetido
por exemplo, B vezes, ento 100(1-2)% vezes, B intervalos aleatrios iro cobrir RT , isto , ir
conter RT . Ou em termos de probabilidades, Pr (RT (L1, U1 )) = 1-2 .
Para deciso de bioequivalncia mdia, a regra usualmente adotada que o intervalo de confiana
esteja contido no intervalo de bioequivalncia. A chance que intervalo com confiana de 100(1-
2)% esteja dentro do limites de equivalncia no necessariamente maior ou igual a 1-2. Se o
coeficiente de variao (CV) for grande, o mtodo de intervalo de confiana para deciso de
bioequivalncia mdia pode no ter o nvel desejado requerido pela agncia reguladora.
Apresentamos a seguir, o mtodo paramtrico seguido do no-paramtrico padres, para a construo

do intervalo de confiana para a diferena e a razo de mdias. Consideramos o mtodo do intervalo
com menor amplitude.
35 de 71
(A) Mtodo paramtrico de intervalo com menor amplitude (shortest)
A1: Medida farmacocintica sem transformao
Diferena de mdias:
Supondo normalidade da distribuio da medida farmacocintica a ser analisada, o intervalo de

confiana para a diferena das mdias T R com nvel de confiana de 100(1-2)% [LD inf ;
LD sup ] sendo os limites calculados como:
(3.7)
onde
yT: mdia dos mnimos quadrados da formulao teste, definida por ( 2.10);
yR: mdia dos mnimos quadrados da formulao de referncia, definida por (2.10);
t(, n1+n2-2): percentil de ordem (1-) da distribuio t de Student com n1+n2-2 graus de
liberdade ;
^ d= (QMintra/2)1/2 : o desvio-padro ponderado da diferena de perodo de ambas as
seqncias definida por (2.14), e QMintra o desvio-padro intra-individual (QMintra=SQintra/
(n1+n2-2), onde SQintra dado pela expresso (2.26);
n1: tamanho de amostra da primeira seqncia do experimento cruzado 2x2 e n2: tamanho
de amostra da segunda seqncia do experimento cruzado 2x2.
Razo entre as mdias:
O intervalo de confiana para razo das mdias (T / R) com nvel de confiana de 100(1-2)%
calculado a partir dos limites do intervalo de confiana para a diferena das mdias [LDinf ; LDsup ]
pelo fato de que (T / R) / R = (T / R)+1. Assumindo que mR possa ser substitudo por yR, o
intervalo de confiana expresso em percentuais [LRinf ; LRsup ] dado por:
(3.8)
A2: Medidas farmacocinticas com transformao logartmica
Diferena de mdias:
Supondo que na escala logartmica a medida farmacocintica siga a distribuio normal, o intervalo
de 100(1-2)% de confiana para a diferena das mdias aritmticas dos log das medidas
farmacocinticas de T e R, T R obtido da mesma forma que o caso sem transformao. Basta
36 de 71
substituir em (3.7) os valores das estatsticas calculadas na escala logartmica. O intervalo ser denotado
por:
(3.9)
Razo entre as mdias:
O intervalo de 100(1-2)% de confiana para razo das mdias (T / R) calculado a partir dos
limites do intervalo de confiana para a diferena das mdias [Ldifinf ,Ldifsup ] dado por (3.8) e seus
~ ~
limites [LRinf ; LRsup ] so expressos por:
[exp {LDinf}; exp {LDsup }] (3.10)
A deciso de bioequivalncia verificada nas condies apresentadas na Tabela 3.2.
Tabela 3.2: Condies de bioequivalncia para a diferena e razo das mdias com medida
farmacocintica com e sem transformao
A chance que intervalo com confiana de 100 (1-2)% esteja dentro do limite de equivalncia no
necessariamente maior ou igual a 1-2. Se o coeficiente de variao (CV) for grande, o mtodo de
intervalo de confiana de bioequivalncia media pode no ter o nvel desejado requerido pela agncia
reguladora.
37 de 71
(B) Mtodo no paramtrico baseado no estimador de Hodges-Lehmann
O mtodo no-paramtrico para construo do intervalo de 100(1-2)% de confiana para a diferena

= T R baseado no estimador de Hodges-Lehmann, segue os seguintes passos:
1. Calcular todos os possveis pares de diferenas das diferenas de perodos entre as seqncias 1
e 2, isto , para os ndices i = 1, 2, ..., n1 e j =1, 2, ..., n2, calcular Di,j = di1-dj2, que so estimativas
de = T R para todos os pares das diferenas;
2. Ordenar as n1n2 diferenas: D(1)< D(2)<... < D(n1n2);
3. Calcular a mediana de {D(i), i= 1, 2, . . . , n1n2 } que o estimador pontual de = T

R, conhecido como estimador de Hodges-Lehmann.
4. Identificar os valores de {D(i), i= 1, 2, . . . , n1n2 } correspondentes aos percentis de ordem e 1-,

denotadas por D(w()) e D(w(1- )), que sero os limites inferior e superior do intervalo de confiana
deste mtodo.
O intervalo de confiana para este mtodo definido pelo seguinte intervalo:
(3.11)
3.3.2. Teste de hipteses
Para a verificao da bioequivalncia, quando comparamos duas formulaes R e T, necessitamos

formular as hipteses nula H0 e alternativa Ha , com o intuito de rejeitar a hiptese H0 e
conseqentemente estabelecer Ha. Ainda, necessrio fixar o erro do Tipo I, isto , o erro de
concluir bioequivalncia entre R e T quando de fato a formulao T no bioequivalente formulao
R. As hipteses nula H0 e alternativa Ha so, portanto:
H0 : no bioequivalncia versus Ha : bioequivalncia.
Estas hipteses que estabelecem a bioequivalncia mdia entre duas formulaes R e T so formuladas
em termos de intervalos.
Schuirmann (1981) introduziu o uso de hipteses de intervalo para avaliao de bioequivalncia

mdia, que pode ser formulado como dois conjuntos de hipteses unilaterais:
38 de 71
(3.12)
Quando a medida farmacocintica analisada sem transformao, inf e sup das hipteses de (3.12)
so escolhidos como 20% de R. Quando a medida farmacocintica analisada com transformao
logartmica, inf e sup assumem valores 0,2231 e 0,2231, respectivamente (ver Seo 3.2).
As hipteses de intervalo em estudos de bioequivalncia tambm podem ser expressas em termos

de razes:
(3.13)
Os valores de inf e sup quando a medida farmacocintica analisada sem transformao so

respectivamente 80% e 120 %, segundo a regra de 20% , e podem ser 80% e 125% quando se
utiliza transformao logartmica para a medida farmacocintica (ver Seo 3.2).
Se concluirmos que , rejeita-se H01 ; se , rejeita-se H02. Rejeitando-se

ambas, podemos concluir que e, portanto, que T e R so bioequivalentes
em mdia; raciocnio anlogo feito para as hipteses de intervalo para razo das mdias.
A rejeio de H01 e H02 implica na concluso de bioequivalncia mdia
Os mtodos de testes de hipteses de intervalo podem ser paramtricos, quando se supe

normalidade da medida farmacocintica em estudo, ou no-paramtricos, quando a suposio de
normalidade violada. Embora existam vrios testes para bioequivalncia, neste manual ser abordado
apenas o mtodo paramtrico padro (teste de hipteses de intervalo de Schuirmann) e no-
paramtrico padro (teste de hipteses de intervalo de Wilcoxon-Mann-Whitney).
39 de 71
(A) Dois testes unilaterais t (teste t Schuirmann) - mtodo paramtrico
Sob suposies de normalidade, os dois conjuntos de hipteses unilaterais (3.12) podem ser testados
atravs de testes t unilaterais. Conclumos que T e R so bioequivalentes se:
(3.14)
O procedimento dos dois testes t unilaterais operacionalmente equivalente ao intervalo de confiana

clssico, isto , se o intervalo de confiana clssico de 100(1-2)% para T R est dentro (inf,
sup), ento, ambas as hipteses H01 e H02 so tambm rejeitadas ao nvel de significncia pelo
procedimento dos dois testes t unilaterais.
(B) Dois testes unilaterais de Wilcoxon (teste Wilcoxon-Mann-Whitney (W-M-W)) mtodo

no paramtrico
As hipteses formuladas em (3.12) para a diferena de mdias de T e R so utilizadas no teste no-

paramtrico de W-M-W cujos clculos seguem os seguintes passos:
1 - Calcular as diferenas de perodos dik, i = 1,2, . . , nk, k= seqncia= 1, 2;

2 - Obter os estimadores de como funes lineares de d ik, i = 1, 2, .. . , nk,
k=1, 2 : bhik = dik h para indivduos da seqncia 1 (RT) ou bhik = dik para indivduos da
seqncia 2 (TR). O quadro abaixo mostra os valores de bhik , para h=inf, sup para o indivduo
i , na seqncia k:
3 - Ordenar binf,i1 , i = 1, 2, . . . , n1 e binf, i, 2, i = 1, 2, . . , n2 numa amostra combinada e assinalar

postos R(binf,ik ) aos valores ordenados.
4 - Ordenar de bsup,i, 1 , i = 1, 2, . . . , n1 e bsup, i, 2, i = 1, 2, . . , n2 numa amostra combinada e assinalar
postos R(bsup,i, k ) aos valores ordenados. Somar os postos R(binf,ik ) dos sujeitos da seqncia 1,
obtendo Rinf e somar os postos R(bsup,ik ) dos sujeitos da seqncia 1, obtendo Rsup .
40 de 71
O teste de W-M-W para as hipteses de intervalo dado em (3.12) acima baseado em Rinf e Rsup .
Conclui-se pela bioequivalncia mdia quando:
(3.15)
onde w(1-) = n1n2 w() e w() so os percentis das distribuies da estatstica de Wilcoxon-
Mann-Whitney .
Quando n1+n2 grande e a razo de n1/n2 0,5, a aproximao normal pode ser utilizada. Neste
caso, a bioequivalncia mdia verificada quando:
(3.16)
onde z o valor da normal padronizada, ao nvel de significncia .
3.4. Poder dos dois testes unilaterais
O poder de um teste estatstico para verificar a bioequivalncia entre duas formulaes R e T

definido como a probabilidade de rejeitar a no bioequivalncia entre R e T quando a formulao
R e T so bioequivalentes.
O poder de um teste est ligado a duas importantes consideraes: a primeira, para a fase de
planejamento do estudo de bioequivlncia, que clculo do tamanho de amostra, e a segunda, para
comparao entre dois testes de hipteses, por exemplo, entre teste paramtrico e no-paramtrico.
Para o clculo do poder, em estudos de bioequivalncia, necessitam-se dos valores de = T R ,
= L =U e 2d ou coeficiente de variao (CV).
41 de 71
O poder emprico dos dois testes unilaterais t pode ser obtido atravs do seguinte procedi-
mento:
Etapa 1: Gerar amostras de tamanho n1 + n2 de acordo com o modelo crossover reduzido
(2.29) com valores pr-estabelecidos de R , T , 2d e 2s .
Etapa 2: Para um dado , calcular Tinf e Tsup de (3.14).
Etapa 3: Repetir etapas 1 e 2 B vezes.
Etapa 4: O poder emprico a proporo entre as b amostras, tais que Tinf > t e Tsup < -t ,
onde t t de student com n1 + n2 2 graus de liberdade.
O poder emprico dos dois testes unilaterais de Wilcoxon pode ser obtido atravs do seguinte
procedimento:
Etapa 1: Gerar amostras de tamanho n1 + n2 de acordo com o modelo crossover reduzido de
(2.29) com valores pr-estabelecidos de R , T , 2d e 2s .
Etapa 2: Para um dado , calcular Rinf e Rsup e Winf e Wsup de (3.15) ou de (3.16).
Etapa 3: Repetir etapas 1 e 2 B vezes.
Etapa 4: O poder emprico a proporo entre as b amostras, tais que Winf > z e Wsup <
-z , onde z valor normal do padro com nvel de significncia .
Iremos considerar sucintamente o poder dos testes considerados da Seo 3.3.2, A e B. Schuirmann
(1987) apresentou a funo poder dos testes unilaterais t (Chow e Liu, pg.134, 2a.edio). O clculo
da funo poder pode ser realizado por integrao numrica ou atravs de simulao (poder emprico).
Os autores tambm realizam um pequeno estudo de simulao para comparar os testes unilaterais t
e de W-M-W utilizando os poderes empricos dos dois testes para vrios valores de = = 20% e
do coeficiente de variao (CV) . O poder do teste paramtrico maior que o poder do teste no-
paramtrico, embora as diferenas sejam inferiores a 20% em todos os casos considerados. O
procedimento para o clculo do poder emprico dos dois testes apresentado a seguir.
3.5.Exemplo
Nesta seo ilustramos os conceitos e inferncia estatstica para avaliao da bioequivalncia atravs
dos dados de ASCtk do exemplo do Captulo 1. Consideramos para ilustrao dos mtodos
apresentados acima a anlise de ASCtk com e sem transformao, isto , na escala original e na
escala logartmica. Na prtica necessrio apresentar a anlise de bioequivalncia em apenas uma
das escalas, de acordo com o resultado das anlises descritiva e de adequabilidade do modelo crossover.
42 de 71
Intervalos de bioequivalncia:
Intervalo de bioequivalncia: mtodo paramtrico
Os clculos necessrios para se aplicar os mtodos paramtricos baseados nointervalo de confiana

para as mdias e razes das formulaes T e R de ASCtk so:
Os intervalos de confiana e os intervalos de bioequivalncia so sumarizados abaixo:
Portanto, segundo os critrios utilizados para definir os intervalos de bioequivalncia, pode-se concluir
pela bioequivalncia mdia das formulaes T e R, sob a anlise da medida farmacocintica ASCtk.
43 de 71
Intervalo de bioequivalncia: mtodo no-paramtrico
O intervalo de 90% de confiana no-paramtrico baseado no estimador de Hodges-Lehmann

construdo utilizando as 12x12=144 diferenas das diferenas de perodos entre as seqncias 1 e 2
ordenadas. Os limites inferior e superior do intervalo de confiana de 90% so as diferenas
correspondentes aos percentis de ordem 5% e 95% da estatstica de Wilcoxon-Mann-Whitney para
os tamanhos das seqncias n1 e n2 (ver Anexo 2).
Os limites do intervalo de 90% de confiana para = T R foram encontrados por

LDinf = D(43) = 8,675 e por LDsup= D(w(95%)+1) = D(102) = 58,84. Portanto, como temos que
(8,675;58,84) (86,05;86,05), a bioequivalncia entre R e T, considerando anlise de ASCtk
verificada.
Dois testes unilaterais de Schuirmann:
Para testar as hipteses de diferena e razo (3.12) e (3.13), so necessrios os seguintes clculos
sumarizados a seguir.
Portanto, atravs dos resultados dos testes de Schuirmann, conclui-se pela bioequivalncia mdia de
T e R.
O poder emprico dos testes unilaterais t, obtido atravs de simulao de 1000 amostras, resultou
em 0,9520.
44 de 71
Dois testes unilaterais de Wilcoxon-Mann-Whitney (W-M-W)
Como Wsup < w (0,05) e Winf > w(0,95), conclumos pela bioequivalncia mdia entre R e T.
45 de 71
4. ROTEIRO DA ETAPA ESTATSTICA

EM ENSAIOS DE BIOEQUIVALNCIA
4.1. Roteiro da etapa estatstica
Sugerimos a apresentao de um relatrio de estudo de bioequivalncia mdia contendo as seguintes

etapas:
Sugesto do roteiro da etapa estatstica
(A) Apresentao dos dados de concentrao plasmtica e das medidas farmacocinticas para
as formulaes;
(B) Anlise descritiva dos dados acima;
(C) Avaliao preliminar dos efeitos residuais e dos efeitos fixos;
(D) Construo de ANOVA de acordo com o resultado obtido no item c);
(E) Avaliaao da bioequivalncia atravs dos intervalos de confiana e testes de hipteses
apropriados;
(F) Concluses do estudo;
(G) Apresentao das referncias bibliogrficas e computacionais e anexos quando pertinente.
4.2. Ilustrao das etapas de anlise estatstica
A. Apresentao dos dados
As concentraes plasmticas apresentadas na Introduo nas Tabelas 1.1 e 1.2 sero utilizadas para
ilustrar o roteiro de anlise estatstica. A medida farmacocintica Cmax das Tabelas 1.3 e 1.4 ser
utilizada para anlise de bioequivalncia mdia entre R e T.
B. Anlise descritiva
A avaliao estatstica da bioequivalncia deve ser iniciada por uma anlise descritiva de dados,
tanto para as observaes originais (medidas de concentrao tomadas ao longo do tempo)
como para as medidas farmacocinticas. Alm da familiarizao com os dados, esta anlise
preliminar auxilia na verificao de suposies necessrias para a aplicao dos testes estatsticos
apresentados neste manual. Portanto, tal anlise importante pela possibilidade de melhor tomada
de deciso nas anlises subseqentes para determinar se h bioequivalncia entre as formulaes
comparadas (R e T).
46 de 71
A anlise preliminar consiste na avaliao quantitativa e grfica. Na primeira so utilizadas

estatsticas sumrias (mdia aritmtica, denominada simplesmente por mdia, desvio-padro,
erro-padro, coeficiente de variao (CV), mediana, valores mximo e mximo, etc.) enquanto
que os grficos mais usuais so: grfico de linhas ou de perfil, histograma, diagrama de caixas
(boxplot), grfico de probabilidade normal, entre outros. No Anexo 1 so apresentados os
conceitos bsicos de algumas estatsticas descritivas.
B1. Anlise descritiva das concentraes plasmticas
A anlise descritiva das concentraes permite visualizar as diferenas entre as formulaes R e

T utilizando os dados originais obtidos atravs do ensaio crossover 2x2, isto , as concentraes
dos voluntrios em intervalos de tempo previamente fixados no planejamento.
Para a visualizao do comportamento das concentraes ao longo do tempo, que refletem a

absoro, distribuio e eliminao dos medicamentos R e T, recomenda-se utilizar o grfico das
mdias das concentraes em funo do tempo. Uma forma interessante consiste em adicionar
a este grfico a variao de 2 erros-padro, o que reflete a variabilidade das mdias.
Os dados hipotticos das tabelas 1.1 e 1.2 sero utilizados para ilustrar as estatsticas sumrias e os
grficos citados acima (ver tabelas 4.1 e 4.2 e figuras 4.1 e 4.2).
Tabela 4.1. Estatsticas das concentraes plasmticas (ng/ml) ao longo do tempo (horas)
do medicamento de referncia (R) em 24 voluntrios
47 de 71
Tabela 4.2. Estatsticas das concentraes plasmticas (ng/ml) ao longo do tempo (horas)
do medicamento teste (T) em 24 voluntrios
Concentrao mdia (ng/mg)

200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tempos de coleta (h)
Figura 4.1. Curva de concentrao plasmtica mdia de dois medicamentos (R=Referncia

e T=Teste) baseada em 24 voluntrios
48 de 71
Concentrao mdia (ng/mg)

250
230
210
190
170
150
130
110
90
70
50
30
10
-10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tempos de coleta (horas)
Figura 4.2. Curvas de concentrao plasmtica (mdia 2 erros-padro) de dois

medicamentos (R=Referncia e T=Teste) baseada em 24 voluntrios
Pode-se observar que as mdias, medianas e desvios-padro crescem e depois decrescem ao longo
do tempo, refletindo o comportamento natural do frmaco no organismo referentes s fases de
absoro at eliminao.
Nota-se grande variabilidade das medidas de concentrao, especialmente na vizinhana de Cmax,

ou seja, nos tempos correspondentes s maiores concentraes. Tambm pode-se perceber valores
altos para os coeficientes de variao (CV), o que significa uma grande heterogeneidade dos indivduos
quanto s concentraes plasmticas.
B2. Anlise descritiva das medidas farmacocinticas
A anlise descritiva prossegue para as medidas farmacocinticas correspondentes s concentraes

plasmticas individuais e s concentraes mdias dos voluntrios. Essas medidas resumem os
dados multivariados (concentraes plasmticas repetidas ao longo do tempo) em observaes
univariadas, as quais refletem o comportamento de absoro e eliminao dos frmacos R e T.
As estatsticas para as concentraes individuais esto apresentadas nas tabelas 4.3 e 4.4 e para as
mdias das concentraes na Tabela 4.5.
49 de 71
Tabela 4.3. Estatsticas das medidas farmacocinticas do medicamento referncia (R)
Tabela 4.4. Estatsticas das medidas farmacocinticas do medicamento teste (T)
Tabela 4. Medidas farmacocinticas das mdias das concentraes plasmticas dos

medicamentos de referncia (R) e teste (T)
Observa-se um mesmo padro das medidas farmacocinticas para os dois medicamentos (R e T)

que tambm parecido com o da mdia. Os valores dos coeficientes de variao diminuram
sensivelmente comparados com os CVs das concentraes plasmticas.
As estatsticas sumrias foram calculadas para todas as medidas farmacocinticas, embora a

anlise deva prosseguir somente utilizando as medidas farmacocinticas Cmax, ASCtk e Tmax.
Este ltimo pode ser dispensado, caso no apresente relevncia clnica para o frmaco em estudo.
B3: Anlise descritiva de Cmax
A anlise descritiva de Cmax foi apresentada nas tabelas 4.3 e 4.4. A Figura 4.3 mostra a tendncia
das mdias de Cmax dos 24 voluntrios do exemplo hipottico das tabelas 1.1 e 1.2.
50 de 71
Figura 4.3. Cmax por voluntrios nas formulaes R e T
Para a verificao do pressuposto de normalidade de Cmax, necessrio para o uso de modelos

estatsticos do crossover e do teste de bioequivalncia mdia (captulos 2 e 3), ou para a indicao da
necessidade de transformao (usualmente a logartmica), os grficos usuais so: histograma (Figuras
4.4), boxplot (Figura 4.5) e grfico de probabilidade normal (Figura 4.6) e ainda, os resultados do
teste de Shapiro-Wilks para avaliar a suposio de normalidade. Nesta avaliao sero considerados
os dados tanto na escala original quanto para a escala logartmica (base natural).
Figura 4.4. Histogramas de Cmax para os dois medicamentos nas escalas original, (a) e (b)
e logartimica, (c) e (d)
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Os histogramas no discriminam diferenas entre a distribuio das observaes com ou sem

transformao, com relao simetria, devido ao tamanho da amostra ser muito pequeno.
Figura 4.5. Boxplots para Cmax e log(Cmax)
Os diagramas de caixas dos frmacos R e T no revelam diferenas em relao s medidas centrais

como a mdia e a mediana, e nem com relao variabilidade, parecendo haver simetria, tanto em
R como em T. Observa-se ainda, a ausncia de valores discrepantes nas observaes de Cmax.
Figura 4.6. Grfico de probabilidade normal para Cmax (a-b) e log( Cmax) (c-d)
52 de 71
Pode-se verificar melhor ajuste de normalidade na medida Cmax com transformao logartmica.
Testes de Shapiro-Wilks resultaram no-significantes ao nvel de = 0,05, para Cmax com
transformao (valor-p > 0,10), isto , no rejeita-se as hipteses de normalidade de log(Cmax) nos
frmacos R e T.
C. Anlise preliminar dos efeitos
Para a anlise preliminar da medida farmacocintica Cmax obtemos as mdias para as formulaes
R e T nas seqncias 1 e 2, seguindo o quadro do exemplo 2.3, no Captulo 2.
Tabela 4.6. Mdias das formulaes R e T nas seqncias 1 e 2 ( desvios-padres)
Estas mdias podem ser visualizadas na Figura 4.7 abaixo:
Figura 4.7. Mdias de Cmax por perodos e seqncias
Observe que as diferenas entre as mdia de R e T dentro de cada perodo no so iguais, e as

mdias de T so superiores s mdias de R nos dois perodos. As retas que unem as mdias de T e
R no sendo paralelas podem indicar interao entre perodo e droga ou existncia de efeitos residuais.
A interao representa o efeito da droga, em ensaios crossover 2 x 2, na ausncia de efeitos residuais.

Portanto, necessrio um teste preliminar para verificar a presena ou no dos efeitos residuais;
para este teste aconselhvel considerar =0,10. O teste preliminar dos efeitos residuais um teste
t para duas amostras independentes (seco 2.2.1) e resultou t = 0,12 (valor-p=0,9050), indicando a
no existncia de efeitos residuais ( = 0,10). Em conseqncia, as medidas Cmax dos dois perodos
podem ser consideradas para anlise de bioequivalncia.
53 de 71
Os testes preliminares dos efeitos fixos (teste t para dados pareados), conforme Seo 2.2, indicaram
que os efeitos de perodo e de formulao foram no-significantes ao nvel de significncia de
=0,05, como mostra a Tabela 4.7.
Tabela 4.7. Resultados preliminares dos efeitos fixos
A tabela 4.8 apresenta a mdia de Cmax das formulaes R e T e os desvios-padres de Cmax.
Tabela 4.8. Mdias de Cmax das formulaes R e T
Como os efeitos residuais no so significantes ao nvel de significncia 10%, podemos prosseguir a

anlise utilizando dados dos dois perodos, com o modelo de anlise de varincia para ensaios
crossover 2x2, utilizando Cmax com transformao logartmica, como foi sugerido pela anlise
descritiva.
D. ANOVA para log(Cmax)
O modelo multiplicativo (2.1) foi ajustado para Cmax, produzindo os resultados da Tabela 4.9.
Tabela 4.9. ANOVA para log(Cmax)
Conclui-se que o efeito da seqncia no significante (valor-p = 0,76), ao nvel de significncia de

=0,10. Note-se tambm, que o teste de variabilidade inter-indivduos resultou significante (valor-
p < 0,0001), indicando presena de variabilidade entre indivduos.
54 de 71
O modelo do qual resultou a Tabela 4.9 pode ser reescrito, eliminando o efeito de seqncia, contendo
somente os efeitos fixos. O modelo reduzido produz a ANOVA da Tabela 4.10.
Tabela 4.10. Modelo multiplicativo reduzido- log(Cmax)
Nota-se que o efeito de perodo no-significante (valor-p = 0,21); embora o quadro de ANOVA
acima mostre efeito no-significante da droga (valor-p = 0,21), indicando igualdade nas mdias de
biodisponibilidade entre as duas formulaes, este resultado no implica na bioequivalncia mdia
entre as duas formulaes.
O ajuste e a verificao das pressuposies do modelo crossover so realizados atravs da anlise

de resduos. Os resduos intra e extra-indivduos so obtidos do modelo crossover reduzido,
(2.29), bem com os valores preditos do modelo. Os grficos probabilsticos normais so utilizados
para verificar a normalidade dos resduos enquanto que o grfico dos resduos intra-indivduos
versus valores preditos utilizado para verificar a adequabilidade do modelo. Os testes de
normalidade de Shapiro-Wilks (S-W) ou Anderson-Darling (A-D) podem complementar a
verificao da normalidade, e o coeficiente de correlao de Pearson, a verificao da
pressuposio de independncia entre os resduos intra e inter indivduos.
Figura 4.8. Resduos intra-indivduos versus valores preditos para log(Cmax)
55 de 71
Figura 4.9. Grficos das probabilidades normais dos resduos versus escores normais
Os resduos intra-indivduos versus valores preditos de log(Cmax) da Figura 4.8 revelam constncia
das varincias dos resduos, observada pela disperso constante dos pontos em torno do eixo
horizontal em zero, indicando adequabilidade do modelo.
Os grficos de probabilidade normais dos resduos da Figura 4.9 revelam tendncias lineares, que
podem indicar normalidades dos resduos; os testes de normalidade dos resduos resultaram no-
significantes (K-S: valor-p = 0,15 e A-D: valor-p = 0,25).
Os resduos intra e inter-indivduos no apresentam evidncias de que no sejam independentes,

desde que o teste de coeficiente de correlao de Pearson nulo resultou no-significante (valor-p =
0,106). O coeficiente de correlao foi estimado em 0,35.
Portanto, as pressuposies do modelo multiplicativo para Cmax foram integralmente atendidas;

investigado o modelo aditivo para Cmax, os resduos inter-indivduos indicaram no-normalidade,
no atendendo por conseqncia todas as pressuposies do modelo.
E. Intervalos de confiana e testes de hipteses utilizando log (Cmax)
A avaliao da bioequivalncia entre as duas formulaes, pode ser realizada utilizando mtodos
paramtricos de intervalos de confiana para as diferenas ou razo das mdias dos frmacos R
e T (mtodo shortest, (3.7)), e de testes de hipteses por intervalos (mtodo proposto por
Shuirmann, (3.14)). A anlise paramtrica pode ser complementada pela anlise no-paramtrica
(para IC, mtodo de Estimador de H-L, (3.11), e para Testes de hipteses, mtodo de Wilcoxon-
Mann-Whitney, (3.15)), embora no seja necessria se houver indicaes claras de ajuste do
modelo crossover.
56 de 71
Os resultados dos intervalos de confiana so apresentados na Tabela 4.11 e testes de hipteses so

apresentados na Tabela 4.12.
Tabela 4.11. Intervalos de confiana paramtricos para a diferena e razo das mdias e
no-paramtrico das formulaes R e T utilizando log( Cmax).
(*) mdias na escala logartmica

(**) mdias geomtricas na escala original
(***) BE= Bioequivalncia
Os intervalos de confiana paramtricos esto dentro dos limites de equivalncia para a diferena e
para a razo. Portanto, podemos concluir que existe bioequivalncia mdia entre as formulaes R
e T, quando Cmax analisada.
Os testes estatsticos realizados para verificar a bioequivalncia mdia foram os testes estatstico de
intervalos, paramtrico para a razo e no-paramtrico para a diferena. As hipteses para o teste da
razo so as seguintes:
As mdias de log(Cmax) para as formulaes R e T so dadas por yR = 5,38 e yT = 5,45 e o

estimador do desvio-padro das diferenas dos perodos ^ = 0,13. Os resultados do teste por
d
intervalo, apresentado no Captulo 3, so mostrados na Tabela 4.12. As hipteses para a diferena
das mdias so:
57 de 71
As mdias de Cmax para as formulaes R e T so dadas na Tabela 4.8 (yR = 229,73 e yT = 247,72);
ainda, as estatsticas de Wilcoxon para as duas funes lineares da diferena de Cmax entre perodos
so Rinf = 213 e Rsup = 108. Os valores do teste de W-M-W produzem resultados mostrados na
Tabela 4.12; a deciso tambm pode ser realizada porque Winf > 101 e Wsup < 43, sendo 43 e 101 os
valores do quinto e nonagsimo quinto percentis da tabela de W-M-W (Apndice A-5 de Chow e
Liu, 2001), quando n1= n2=12. Portanto, conclui-se que ambas as hiteses H01 H02 so rejeitadas
ao nvel significante de 5%.
Tabela 4.12. Testes de hipteses paramtrico para a razo das mdias e no-paramtrico
para a diferena das mdias
(1) Testes unilaterais de Schuirmann

(2) (2) Testes unilaterais de Wilcoxon-Mann-Whitney.
(*) BE=Bioequivalncia
F. CONCLUSES
A anlise paramtrica de Cmax foi realizada utilizando modelo multiplicativo (com transformao)
para o delineamento crossover, desde que a anlise descritiva sugeriu o uso da transformao logartmica
para Cmax. A verificao das pressuposies do modelo (normalidade dos resduos intra e inter-
indivduos e independncia entre eles) foram satisfeitas para o modelo multiplicativo. Verificou-se
efeitos de formulao (R e T) e de perodo no significantes, e ainda a no existncia de efeito
carryover.
Os intervalos de confiana de 90% para a diferena e razo das mdias do modelos paramtricos
satisfazem a condio de bioequivalncia para Cmax. O intervalo de confiana de 90% para diferena
das mdias pelo mtodo no-paramtrico tambm d suporte concluso da bioequivalncia mdia
entre R e T.
Testes de hipteses de intervalos para a razo das mdias utilizando log( Cmax) e para a diferena
das mdias utilizando Cmax resultam significantes ao nvel de significncia de 5%, indicando a
bioequivalncia entre R e T.
A bioequivalncia mdia entre as formulaes R e T pode ser concluda quando Cmax analisado,
segundo os critrios definidos pela RDC N 84 de 19/03/2002, com regra de 80/125 %
utilizando o modelo paramtrico e o no-paramtrico, utilizando a regra de 20%.
58 de 71
5. OUTRAS CONSIDERAES SOBRE BIOEQUIVALNCIA
Resumimos neste captulo algumas consideraes essenciais e prticas para um estudo de

Bioequivalncia. Destacamos o problema de dimensionamento de amostra, deteco e tratamento
de outliers, alm de comentrios sobre observaes faltantes.
5.1. Dimensionamento da amostra
5.1.1. Introduo
Em estudos de bioequivalncia, as seguintes questes so de importncia fundamental:
1. Quantos indivduos so necessrios a fim de se obter um poder desejado (digamos 80% ou

90%) estabelecendo bioequivalncia entre as duas formulaes dentro de limites considerados
aceitveis (por exemplo, 20% da mdia da formulao de referncia)?
2. O que se deve fazer se somente um pequeno nmero de indivduos estiverem disponveis para
o estudo devido a limitaes do oramento e/ou de algumas consideraes mdicas?
Para responder a estas perguntas, devemos utilizar uma avaliao da determinao do tamanho da
amostra, sendo que o procedimento mais comum consiste em se realizar um pr-estudo do poder
baseado na estimativa da variabilidade intra-indivduos a partir de estudos anteriores. O tamanho de
amostra apropriado escolhido de forma a se garantir um poder desejado para a avaliao da
bioequivalncia dentro de limites considerados clinicamente importantes.
Teoricamente o tamanho de amostra necessrio para realizar um estudo de bioequivalncia necessita

de algumas informaes relativas ao frmaco em estudo, tais como a variabilidade do frmaco nos
indivduos, medida pelo coeficiente de variao CV (%) e o tamanho mnimo do efeito que se quer
detectar (por exemplo, magnitude da diferena entre as mdias das duas formulaes). Estas
informaes definiriam o desenho a ser utilizado, e em conseqncia, o clculo do tamanho de
amostra requerido. Entretanto, a obteno destas informaes a priori teoricamente bastante
difcil; na prtica, a obteno pode ser realizada atravs de um estudo piloto.
A Resoluo RE n 478 de 19 de maro de 2002 sugere n=24 como o tamanho mnimo da

amostra para estudos crossover 2 x 2 de bioequivalncia mdia; utilizando a frmula aproximada
de clculo de tamanho de amostra de Chow e Liu (1992), nota-se (Tabela 5.4.1, de Chow e Liu,
2000), que o tamanho de amostra 24 estaria dentro de uma faixa de percentual de CV de 14%
a 22% para = 0% ou 5% e poder=80% ou 90%.
59 de 71
A representatividade da populao na amostra, ou validade, assegurada pelo planejamento cientfico

da pesquisa. O processo de amostragem comea com a determinao do tamanho e com a coleta
adequada.
5.1.2. Conceitos bsicos
Os elementos essenciais para o dimensionamento de amostras so: fixar um nvel de confiana , o

tamanho mnimo do efeito que se quer detectar e dentro do contexto de testes de hipteses,
acrescenta-se o poder estatstico do teste . As fontes desses dados so estudos anteriores realizados
em populaes e em condies semelhantes.
Em procedimentos mais simples, determina-se o tamanho de amostra adequado baseando-se apenas

uma varivel de destaque no estudo, o que no garante que seja suficiente para as outras variveis
tambm de interesse. Como estudos de bioequivalncia so baseados em vrias medidas
farmacocinticas idealmente, os clculos devem ser feitos para cada uma delas.
5.1.3. Tamanho de amostra atravs de hipteses de intervalo (modificado)
Liu & Chow fornecem uma frmula aproximada para calcular o tamanho da amostra baseado na
funo de poder do teste por hiptese de intervalo de Schuirmann. Como o poder para o mtodo
de Schuirmann simtrico em relao a zero, vamos considerar apenas o caso em que > 0. Para
um nvel de confiana de 1-2 , um poder de 1-, estimativa ^ d e limite de bioequivalncia pr-
fixado quando 0 < = o < , o tamanho da amostra dado por:
(5.1)
onde :
n: tamanho de amostra;
= inf = sup : limites de bioequivalncia;
e : probabilidades do erro do tipo I e tipo II, respectivamente;
t1- / 2,v e t1-,v : percentis da distribuio t de Student com v graus de liberdade correspondente
ao nvel de confiana 1-, respectivamente para hipteses bilateral e unilateral;
t1-,v : designa o percentil da distribuio t de Student com v graus de liberdade correspondente
a um poder 1-;
^d = QMintra/ 2 : estimativa do desvio-padro ponderado da diferena de perodo de ambas
as seqncias.
60 de 71
Se a regra de 20% for usada com =0,2 R, (5.1) torna-se:
(5.2)
onde
5.2. Observaes atpicas em estudos de bioequivalncia (outliers)
Um dos problemas geralmente encontrados nos estudos de biodisponibillidade e bioequivalncia,

o fato do conjunto de dados poder conter valores extremamente altos ou extremamente baixos.
Essas observaes atpicas (ouliers) podem representar um grande impacto na avaliao da
bioequivalncia. Existem basicamente trs possveis tipos de outliers nos estudos de bioequivalncia:
1. Valores inesperados na curva de concentrao plasmtica versus tempo, para determinados

tempos de coleta;
2. Valores extremamente altos ou baixos para determinada formulao (teste ou referncia);
3. Indivduos incomuns que exibem biodisponibilidade muito inferior ou muito superior com
relao ao medicamento referncia, ou seja, uma diferena muito grande para o
comportamento da curva entre as duas formulaes, implicando em valores diferenciados
para todas as medidas farmacocinticas avaliadas.
Para o primeiro tipo de outlier, Rodda (1986) indicou que as observaes inesperadas da curva de
concentrao plasmtica versus tempo, normalmente tm um efeito pequeno sobre o clculo de
ASC, e conseqentemente tem um pequeno efeito na comparao da biodisponibilidade.
O segundo tipo de outlier caracteriza-se pela presena de valores muito altos ou muito baixos para a
medida avaliada em determinada formulao, em outras palavras, significa que a distncia entre os
valores da medida farmacocintica para o medicamento teste e o medicamento referncia de um
determinado indivduo muito grande. Esse tipo de outlier tem certamente um grande impacto na
avaliao comparativa, considerando o critrio da bioequivalncia mdia, pelo fato da mdia ser um
estimador muito sensvel presena de valores extremos.
Para o terceiro tipo de outlier, similarmente ao segundo caso, como indicado por Chow e Tse (1990),
a presena de um indivduo atpico pode vir a anular a concluso de bioequivalncia do estudo. A
constatao de biodisponibilidades extremamente baixas, ou extremamente altas entre os voluntrios,
pode vir a indicar que a variabilidade da resposta a alguma das formulaes no homognea.
61 de 71
Portanto, uma anlise comparativa de biodisponibilidade, sob a presena de indivduos potencialmente

atpicos, possivelmente pode ter que lidar com a rejeio da bioequivalncia entre as formulaes
testadas, quando na realidade, elas so bioequivalentes. Nesse sentido, a seleo e os critrios para
incluso de voluntrios nos estudos podem atuar como fatores determinantes no intuito de evitar a
presena de voluntrios atpicos nos ensaios de bioequivalncia.
Para um determinado conjunto de dados, um indivduo outlier potencial pode ser detectado atravs
da plotagem dos valores da medida farmacocintica avaliada para os diversos voluntrios, da
formulao teste versus referncia (Ex: CmaxT =CmaxR). O indivduo detectado em funo do
seu respectivo ponto apresentar um grande desvio em relao reta y = x. Dessa forma, a construo
dos grficos apresentados nas figuras 5.1 e 5.2 servem como uma anlise preliminar para a deteco
de potenciais outliers.
Figura 5.1. Concentrao mxima dos 24 voluntrios para cada uma das formulaes
62 de 71
Figura 5.2. Cmax referncia versus teste para 24 voluntrios
No exemplo ilustrado pela Figura 5.1, observa-se que o voluntrio nmero 23 exibe
biodisponibilidades distintas para os medicamentos teste e referncia. A Figura 5.2, ilustra o mesmo
caso, evidenciando de uma maneira diferente a presena de um possvel outlier. Esse ponto representa
um desvio bastante grande em relao reta y=x.
Uma outra ferramenta visual bastante til para a identificao de possveis outliers o diagrama de
caixas ou grfico do tipo box-plot (ver Apndice), pois o mesmo construdo de forma a fornecer
informaes sobre a simetria e variabilidade dos dados.
Os estudos para deteco de valores potencialmente atpicos tm recebido bastante ateno nas
ltimas dcadas, em particular, o desenvolvimento de mtodos para o tratamento de outliers em
modelos de regresso linear. Como normalmente os estudos de biodisponibilidade no se aplicam
utilizao de modelos de regresso linear, torna-se necessrio o desenvolvimento de novos mtodos
que venham a proporcionar maneiras de identificar observaes atpicas nesse caso. Uma vez detectada
uma observao atpica, a questo de interesse, portanto, saber qual o peso daquele valor em
relao avaliao da bioequivalncia. Com base nas indicaes dos rgos reguladores e nas
legislaes vigentes, a retirada de voluntrios de um estudo em funo de seus dados no se
apresentarem de maneira similar aos dos outros voluntrios sem justificativa convincente pode
afetar a validao do estudo. Em muitos casos, no h como precisar se essa aparente no similaridade,
um resultado de erros laboratoriais, erros de transcrio, ou outras causas no relacionadas a
bioequivalncia. Portanto, a retirada de voluntrios do estudo no recomendada, especialmente
para experimentos no replicados. A legislao brasileira preconiza que no caso de retirada de
voluntrios que apresentarem comportamento discrepante nas medidas de absoro, em relao
aos demais voluntrios, sua excluso do estudo dever ser justificada. Nesse caso, devero ser
apresentados os resultados do estudo com e sem a incluso de seus dados, no sentido de avaliar o
impacto da retirada dessa observao.
63 de 71
5.3. Ocorrncia de observaes faltantes
Como j foi citado anteriormente, as medidas farmacocinticas avaliadas na bioequivalncia derivam

diretamente da curva de concentrao do medicamento ao longo do tempo, que caracterizada
pela quantificao de um determinado nmero de amostras biolgicas, relativas a tempos de coleta
previamente estabelecidos. Em algumas situaes, pode ocorrer a perda de amostras, impossibilitando
a quantificao de frmaco em determinado horrio de coleta. Essa perda pode ocorrer por motivos
diversos, exemplificados a seguir:
Perda da veia do voluntrio durante a coleta;

Atraso excessivo na coleta para determinado tempo;
Quebra de tubos durante a centrifugao;
Quebra de tubos nas fases seguintes.
Nesses casos, recomenda-se que a curva de concentrao sangnea seja obtida sem a interpolao
do ponto faltante, o que no compromete a obteno das medidas farmacocinticas como rea sob
a curva de zero ao ltimo tempo de coleta, e a rea sob a curva de zero a infinito. Por outro lado, a
presena de uma amostra faltante prxima ao valor de concentrao mxima pode vir a comprometer
a realidade desse parmetro. De qualquer forma, devem sempre ser considerados os valores que
foram quantificados de fato, no devendo existir nenhum tipo de procedimento para a estimao
dos valores faltantes. importante ressaltar que o excesso de valores faltantes pode vir a comprometer
a validade do estudo.
5.4. Bioequivalncia individual e populacional
O manual abordou toda a anlise estatstica baseada no critrio da bioequivalncia mdia, mas
importante ressaltar a existncia dos conceitos relativos a bioequivalncias individual e populacional.
Esses novos critrios para a avaliao da bioequivalncia podem ser bastante teis em alguns casos.
De acordo com a definio apresentada nos captulos anteriores, a bioequivalncia mdia focaliza
somente a comparao das mdias populacionais referentes s medidas farmacocinticas de interesse.
Em contrapartida, os critrios da bioequivalncias individual e populacional englobam alm das
mdias, as respectivas varincias associadas s medidas farmacocinticas avaliadas.
O critrio da bioequivalncia populacional leva em considerao a variabilidade total associada

medida de interesse. J o critrio da bioequivalncia individual agrega a variabilidade intra-individual
nas formulaes teste e referncia, alm do componente de variao associado interao entre
indivduos e formulao, que equivale a variao entre as mdias das formulaes T e R devido s
diferenas existentes entre os indivduos.
Hauck & Anderson (1992) apresentam consideraes e comparaes dos trs tipos de bioequivalncia,
bem como as indicaes para a construo dos intervalos de confiana. O Volume I9, do peridico
Statistics in Medicine de 2000, dedicado a artigos relacionados bioequivalncia individual.
64 de 71
Altman, D. G. (1991) Pratical Statistics for Medical Research. London: Chapman & Hall.
Bailar III, J. C., Mostelller, F. (1992) Medical Uses of Statistics. 2. ed. Boston-MA: NEJM Books.
Chow, S.-C., Liu, J.-P (2000) Design and Analysis of Bioavailability and Bioequivalence Studies. New York:
Marcel Dekker.
Chow, S.-C., Tse, S.-K (1990). Outlier Detection in Bioavailability/Bioequivalence Studies. Statistics
in Medicine, 9, 549-558.
Jones, B., Kenward, M. G. (1989) Design and Analysis of Cross Over Trials. London: Chapman & Hall.
Grizzle, J.E. (1965). The two-period changeover design and its use in clinical trials. Biometrics, 25,
357-381.
Guidance for Industry Bioavailability and Bioequivalence Studies for Orally Administered Drug
Products General Considerations. U.S. Department of Health and Human Services. Food and
Drug Administrations. Center for Drug Evaliation and Research (CDER), October 2000.
Hauck, W. W., Anderson, S. (1992). Types for Bioequivalence and Related Statistical Considerations.
Internacional Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 30, 5, 181-187.
Pagano, M., Gauvreau, K. (2000) Principles of Bioestatistics. Pacific Grove-CA: Duxbury.
Resoluo RDC no 10 de 2 de janeiro de 2001 /ANVISA/Ministrio da Sade.
Resoluo RDC no 84 de 19 de maro de 2002 /ANVISA/Ministrio da Sade.
Resoluo RE no 478 de 19 de maro de 2002 /ANVISA/Ministrio da Sade.
SAS- Statistical Analysis System, verso 8. SAS Institute, Cary,NC.
Schuirmann, D. J. (1981) On hypothesis testing to determine if mean of a normal distribution is
continued in a known interval. Biometrics, 37, 617 [abstract].
Soares, J. F., Siqueira, A. L. (1999) Introduo Estatstica Mdica. Belo Horizonte: DEST-UFMG.
Storpits, S, Consiglieri V. O. (2000) Bioequivalncia de Medicamentos: Objetivos, Parmetros
Farmacocinticos, Delineamento Experimental e Critrio de Avaliao. Revista Brasileira de Cincias
Farmacuticas, 36,1.
Williams, E. J. (1949). Experimental designs balanced for the residual effects of treatment. Australian
Journal of Scientific Research, 2, 149-168.
65 de 71
APNDICE - CONCEITOS ESTATSTICOS BSICOS
Apresentamos neste apndice um resumo de conceitos estatsticos bsicos envolvidos neste manual.
Destacamos estatsticas descritivas, representao grfica, noes de inferncia estatstica e de duas
tcnicas estatsticas: regresso linear simples e anlise de varincia.
Notao
X: varivel de interesse, por exemplo: Cmax, ASC, Tmax

n : tamanho da amostra
x1, x2,..., xn valores observados
I Estatsticas descritivas
Mdia aritmtica
A mdia aritmtica x dada por:
Mdia geomtrica
A mdia geomtrica x dada por:
Quando se toma a varivel X na escala logartmica, isto , Y=ln X, tem-se que:
ou ainda
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Em palavras, a mdia aritmtica na escala logartmica igual ao log da mdia geomtrica na escala
original, ou ainda, a mdia geomtrica na escala original igual ao exponencial da mdia aritmtica
na escala logartmica.
Mediana
Por definio, a mediana o valor que divide a distribuio ao meio. Em outras palavras, 50% das
observaes ficam acima da mediana e 50% abaixo.
Varincia
A varincia s2 uma medida da variabilidade dos dados em torno da mdia e definida como:
Desvio-padro
Como a unidade da varincia a unidade de medida de X ao quadrado, usual trabalhar a raiz

quadrada da varincia, estatstica conhecida como desvio-padro (s), definida como:
Erro-padro da mdia
O erro-padro da mdia s( x ) dado por
e representa o desvio-padro da distribuio das mdias.
Coeficiente de variao
O coeficiente de variao (CV), uma medida de variabilidade padronizada pela mdia, definido como
a razo entre o desvio padro e a mdia, isto :
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Percentil
Indica o valor acima ou abaixo do qual se encontra uma determinada porcentagem dos dados. De
forma geral, o percentil de ordem x, representado por Px, o valor que precedido (maior ou igual)
por (xn)/100 dos valores e seguido (menor ou igual) por (100-x)n/100. Por exemplo, a mediana o
percentil de ordem 50; o percentil de ordem 90 precedido por 90% dos valores da distribuio.
Os percentis de ordem 25, 50 e 75 so chamados, respectivamente primeiro, segundo e terceiro

quartis porque dividem a distribuio em 1/4, 2/4 = 1/2 e 3/4. So representados por Q1, Q2 e Q3
e, evidentemente, Q2 outra notao para a mediana.
II Representao grfica
Apesar de existirem inmeras formas grficas interessantes, limitaremos aos tipos de grficos mais
simples, mas bastante teis para a identificao da forma de um conjunto de dados e de sua descrio:
histograma, grfico de linhas (ou perfis), grfico de probabilidade, tambm conhecido como Q-Q
plot e boxplot.
Histograma
Histograma um grfico de barras justapostas em que no eixo horizontal est a varivel de interesse,
dividida em classes geralmente de mesmo tamanho. No eixo vertical, constri-se uma barra para
cada classe com altura igual freqncia absoluta ou relativa correspondente. A barra centrada no
ponto mdio da classe.
Grfico de linhas ou de perfis
O grfico de linhas uma representao apropriada para dados coletados ao longo do tempo.
Consiste em colocar no eixo horizontal do grfico a escala temporal (hora por exemplo) e no eixo
vertical a varivel a ser estudada (freqncia, taxa ou medida tomada). usual unir os pontos atravs
de segmentos de reta, da o nome recebido.
Atravs desses grficos possvel constatar algum tipo de tendncia e identificar alguns dados
atpicos (picos por exemplo).
Grfico de probabilidade (Q-Q plot)
O grfico de probabilidade, tambm denominado Q-Q plot, disponvel em muitos programas de

computador construdo de tal forma que se h uma boa aderncia dos dados a uma determinada
distribuio, por exemplo a normal, as observaes estaro alinhadas em torno de uma reta destacada
no grfico. A avaliao pode ser visual ou mais formalmente atravs de um teste de significncia.
Neste caso, uma boa aderncia fornece um valor-p grande.
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Boxplot
Um tipo de grfico muito til para a descrio de dados, visualizao de sua variabilidade, comparao
entre diferentes grupos o grfico em caixas, boxplot, em ingls. Foi introduzido pelo estatstico
americano John Tukey em 1977.
Para a construo do boxplot obtm-se primeiro as seguintes estatsticas: primeiro quartil (Q1), mediana
(Q2), terceiro quartil (Q3) e a distncia interquartlica (DQ), definida como DQ=Q3 - Q1. O boxplot
obtido seguindo os seguintes passos:
1. Numa reta so marcados o primeiro quartil (Q1), a mediana (Q2) e o terceiro quartil (Q3).
2. Acima dessa reta constri-se um retngulo com limites iguais s posies do primeiro e terceiro
quartis, cortado por um segmento de reta na posio relativa mediana.
3. A partir dos limites do retngulo, traam-se linhas at:
(a) encontrar um extremo (valor mximo ou mnimo) ou
(b) um valor correspondente a 1,5 DQ, se o extremo correspondente estiver a
mais de 1,5 DQ do quartil respectivo.
Os pontos que esto a mais de 1,5 DQ do quartil correspondente at 3,0 DQ so chamados
pontos externos e os que esto a mais de 3,0 DQ, pontos soltos.
O boxplot tambm fornece informaes importantes sobre o comportamento do conjunto de dados,

como simetria e variabilidade. Se a amplitude for muito maior que a distncia interquartlica e a
mediana estiver mais prxima do primeiro quartil do que do terceiro quartil, h fortes indicaes de
assimetria positiva e de grande disperso das observaes, alm da presena de outliers.
III Inferncia estatstica
A inferncia estatstica pode ser avaliada atravs de estimao (pontual ou por intervalo) e testes de
hipteses, conceitos apresentados a seguir.
Estimao pontual
O primeiro passo para se ter uma idia de um parmetro de uma distribuio (por exemplo, mdia,
desvio-padro) obter a estimativa baseada nas observaes da amostra. Por exemplo, se X segue
uma distribuio N(,2), a mdia amostral x estima a mdia populacional , e o desvio padro
amostral s estima .
Intervalo de confiana
Com a construo de intervalos de confiana agregamos ao estimador pontual informao sobre

sua variabilidade. Isto feito escolhendo-se um limite inferior e outro superior para a estimativa. De
uma maneira bem geral, a forma do intervalo de confiana para um parmetro : estimativa pontual
fator x erro-padro do estimador. Esse fator um percentil de uma distribuio de probabilidade.
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Teste de hipteses
Geralmente podemos formular os problemas atravs de duas hipteses: H0 (hiptese nula) e Ha

(hiptese alternativa). Na comparao de dois tratamentos usual fixar como hiptese nula a
inexistncia de diferena entre os dois tratamentos comparados. A hiptese nula deve ser comparada
com uma hiptese alternativa. Para cada situao existem muitas hipteses alternativas adequadas,
mas a mais usual a inexistncia de igualdade entre os tratamentos. As formulaes das hipteses
nula e alternativa para estudos de bioequivalncia esto apresentadas no Captulo 3.
O critrio de deciso baseado na estatstica de teste. De uma forma bem genrica e intuitiva
podemos dizer que a estatstica do teste mede a discrepncia entre o que foi observado na amostra
e o que seria esperado se a hiptese nula fosse verdadeira. Uma grande distncia medida pela
distribuio de probabilidade indicao de que H0 no verdadeira, devendo, portanto, ser rejeitada.
Erros do tipo I e II, nvel de significncia e poder do teste
Em termos tcnicos, a deciso de rejeitar H0 quando de fato H0 verdadeira chamada de erro do

tipo I. Para evit-lo, escolhemos um critrio de deciso (que corresponde a um percentil de uma
distribuio de probabilidade) que torna este erro pouco provvel. Na literatura, a probabilidade de
cometer este erro recebe o nome de nvel de significncia do teste, sendo usualmente representado
pela letra grega (l-se alfa).
H, no entanto, um segundo tipo de erro: no rejeitar a hiptese nula quando ela falsa. A
probabilidade do erro do tipo II usualmente representado pela letra grega (l-se beta).
A capacidade de um teste identificar diferenas que realmente existem, ou seja, de rejeitar H0 quando
realmente falsa, denominada poder do teste e definida como 1-.
Probabilidade de significncia (valor-p)
Existem duas opes para expressar a concluso final de um teste de hipteses. A primeira consiste
em comparar o valor da estatstica de teste com o valor obtido a partir da distribuio terica,
especfica para o teste, para um valor pr-fixado do nvel de significncia (por exemplo 5% ou 1%).
Na segunda abordagem, o interesse quantificar a chance do que foi observado ou resultados mais
extremos, sob a hiptese de igualdade dos grupos. Assim, essa opo baseia-se na probabilidade de
ocorrncia de valores iguais ou superiores ao assumido pela estatstica de teste, sob a hiptese de
que H0 seja verdadeira. Este nmero chamado de probabilidade de significncia ou valor-p e
freqentemente indicado apenas por p.
Portanto, quanto menor o valor-p maior a evidncia para se rejeitar H0. De um modo geral, considera-
se que valor-p menor ou igual a 0,05 indica que h diferenas significativas entre os grupos. Tambm
pode ser pensado como o menor nvel de significncia para o qual se rejeita H0.
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A deciso final sobre a hiptese nula tomada comparando-se o valor-p com um valor pr-fixado,
usualmente 0,05. Quando o valor-p menor que este ponto de corte, o resultado chamado
estatisticamente significante e, altamente significante, quando ele menor que um ponto de corte
ainda menor (digamos 0,01). Nas outras situaes o teste dito no significante. Por esta razo, os
testes so denominados testes de significncia.
Regresso linear simples
Em um estudo sobre a relao entre duas variveis (Y e X), seja Y a varivel resposta (tambm
conhecida como dependente) e X a varivel explicativa (tambm conhecida como varivel
independente ou regressor). O modelo de regresso linear simples dado por y = 0 + 1x + ,
onde 0 a constante ou intercepto, 1 o coeficiente da regresso ou inclinao da reta e o erro
aleatrio, supe-se que segue uma distribuio normal com mdia zero e varincia desconhecida,
mas que pode ser estimada a partir dos dados.
Pelo mtodo de mnimos quadrados, as estimativas de 1 e 0 so:
Uma aplicao de regresso linear simples em estudo de bioequivalncia foi citada no Capitulo 1.
ANOVA
A ANOVA a abreviao de Analysis Of Variance e consiste na decomposio da soma de quadrados

total em parcelas de somas de quadrados devido a vrias fontes de variao. Atravs das somas de
quadrados e os graus de liberdade associados a cada fonte de variao, obtm-se os quadrados
mdios, definidos como a razo entre a soma de quadrado e o grau de liberdade. Comparando-se os
valores de quadrados mdios de forma apropriada, possvel testar hipteses sobre efeitos envolvidos
no contexto do problema.
Vrios exemplos de ANOVA foram apresentados no Captulo 2, sobre o planejamento crossover.
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Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

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Manual de boas prticas em biodisponibilidade: bioequivalncia/Agncia

1. Equivalncia teraputica. 2. Bioequivalncia. 3. Disponibilidade

A partir da identificao desta necessidade, e buscando prevenir o comprometimento da qualidade

neste contexto que surge este Manual de Boas Prticas em Biodisponibilidade/Bioequivalncia,

Os ncleos de trabalho iniciaram as discusses em setembro de 2001, cada um deles cuidando de

importante ressaltar o ineditismo, mesmo em nvel internacional, da reunio de informaes

Dr. Gonzalo Vecina Neto

Volume I Mdulo 1 Etapa Clnica

1. PESQUISA CLNICA .................................................................................................................. 05

3. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................................... 25

Quando se analisam os procedimentos necessrios para a conduo de pesquisas em seres humanos,

Um breve conhecimento da origem destes regulamentos demonstra de maneira inequvoca a

At o ano de 1906 no havia qualquer regulamentao quanto venda de medicamentos ou alimentos.

As Boas Prticas Clnicas tambm foram adotadas em outros pases:

Em 1996, a realizao da Conferncia Internacional de Harmonizao (ICH) e posterior introduo

Considerando a importncia dos estudos de biodisponibilidade/bioequivalncia no contexto da

1.2. Novos medicamentos

Assim, estudos envolvendo seres humanos podem ser classificados em:

teraputicos: nos quais os sujeitos da pesquisa podem apresentar um ganho direto.

Quando consideramos a existncia de novo medicamento, podemos considerar 3 perodos de vida

Bases cientficas e tecnolgicas possibilitam a produo regular e reprodutvel de formulaes com

A confirmao de intercambiabilidade dada atravs dos estudos de equivalncia farmacutica e/

Aps a legislao de registro compulsrio de medicamentos em 1969, que facilitou a entrada de

A realizao de estudos de biodisponibilidade e bioequivalncia, de forma rotineira, no Brasil, pode

O termo biodisponibilidade , na verdade, uma contrao de disponibilidade biolgica. Considera-

Os principais parmetros farmacocinticos utilizados para a avaliao da biodisponibilidade so:

O pico de concentrao mxima Cmx;

Biodisponibilidade relativa (Bioequivalncia)

Medicamentos bioequivalentes so equivalentes farmacuticos (mesma forma farmacutica e

Medicamento genrico um medicamento similar a um produto de referncia ou inovador, que

1.4. Estudos clnicos

Estudos clnicos utilizando drogas em seres humanos so divididos convencionalmente em 4 fases:

1.5. Aspectos de segurana

1.5.1. Eventos adversos

Todos os eventos adversos observados ou voluntariamente relatados, independentemente do grupo

Exacerbao de doena preexistente, incluindo a doena em estudo, definida como manifestao

Exacerbao de doena pr-existente dever ser considerada, quando o paciente/indivduo necessitar

Resposta clnica insuficiente ou ausncia de resposta, benefcio, eficcia, efeito teraputico ou ao

1.5.2. Eventos adversos srios

Todos os eventos adversos srios (conforme definio abaixo), independentemente do grupo de

Um evento adverso srio qualquer evento adverso que:

Admisso para tratamento de condio preexistente no associada ao desenvolvimento de um

No entanto, no sero considerados admisso hospitalar os seguintes casos:

Atendimento em Pronto Socorro ou Unidades de Emergncia;

Prolongamento da hospitalizao definido como qualquer extenso da internao alm do

Tratamentos ou procedimentos cirrgicos pr-planejados devem estar registrados na

Incapacidade a perda substancial da competncia de uma pessoa desempenhar normalmente as

1.5.3. Resultados de testes laboratoriais anormais

Quando o resultado do teste est acompanhado de sintoma associado;

Quando o resultado do teste leva a uma alterao da dose da medicao do estudo ou

1.6. Das responsabilidades

O Patrocinador responsvel por providenciar as informaes necessrias ao Investigador Principal

responsabilidade do Patrocinador a escolha do Centro de Pesquisa e do Investigador Principal.

1.6.2. Investigador principal

Tambm so responsabilidades do investigador principal:

Supervisionar ou conduzir pessoalmente a pesquisa de acordo com as Normas de Boas Prticas