EL TEXTO EN COLOR ROJO HA SIDO MODIFICADO
Con fundamento en el numeral 4.11.1 de la Norma Oficial
Mexicana NOM-001-SSA1-2010, se publica el presente
proyecto a efecto de que los interesados, a partir del 1 de
agosto y hasta el 30 de septiembre de 2016, lo analicen,
evalen y enven sus observaciones o comentarios en idioma
espaol y con el sustento tcnico suficiente ante la CPFEUM,
sito en Ro Rhin nmero 57, colonia Cuauhtmoc, cdigo
postal 06500, Ciudad de Mxico. Fax: 5207 6890
Correo electrnico: consultas@farmacopea.org.mx.
MGA 0241. CROMATOGRAFA
La cromatografa es una tcnica desarrollada a principios de
siglo XX, que permite la separacin de sustancias que se
encuentran en una mezcla. El nombre cromatografa (kromos:
color, graphos: descripcin) se debe a que las primeras
separaciones se llevaron a cabo con pigmentos de plantas, los
cuales se observaban como bandas coloridas. En general, la
cromatografa es un proceso de migracin diferencial en el
cual los componentes de una mezcla son transportados por una
fase mvil (gas o lquido), y retenidos selectivamente por una
fase estacionaria que puede ser un lquido o un slido. De
acuerdo a la naturaleza de las fases involucradas y a los
mecanismos de separacin, la cromatografa se divide en:
Tabla 0241.1. Cromatografa de gases.
Mecanismo de separacin Tipo de muestra
Gas-lquido Fase de vapor
(particin) Lquida
Gas-slido Fase de vapor
(adsorcin)
Lquida
Tabla 0241.2. Cromatografa de lquidos.
Cromatografa Mecanismo de separacin
Plana En capa delgada (adsorcin)
En papel (particin)
En columna Lquido-slido (adsorcin)
Lquido-slido (particin)
De intercambio inico
De exclusin
CROMATOGRAFA DE GASES
En la cromatografa de gases, la fase mvil es un gas y la
estacionaria es un slido (cromatografa gas-slido) o un
lquido (cromatografa gas-lquido). En la primera, el proceso de
separacin se lleva a cabo por adsorcin entre el gas que
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transporta al soluto y el soporte, que puede ser almina, slice
gel, carbn, etc. y en la segunda, la particin se lleva a cabo
entre una fase estacionaria lquida que cubre a un slido inerte,
como slice, vidrio, etc. y el gas que transporta al soluto.
Cuando se introduce una sustancia en la corriente del gas, sta
se volatiliza por la elevada temperatura y de esta manera es
transportada por el gas transportador a lo largo de la columna
donde se distribuye entre las fases slida y lquida. Este
proceso de particin o reparto entre ambas fases est definido
por el factor de capacidad (k' ), determinado bien sea por la
cantidad o por el tiempo de residencia de la sustancia en
cuestin entre las fases respectivas:
<<<
=
=
Donde:
Cfe = Cantidad de la sustancia en la fase estacionaria.
Cfg = Cantidad de la sustancia en la fase gaseosa.
tfe = Tiempo en la fase estacionaria.
tfg = Tiempo en la fase gaseosa.
Mientras mayor tiempo pase el soluto en la fase estacionaria,
mayor ser el valor de k' y, por lo tanto, mayor el tiempo de
retencin, por lo que el valor de k' depender del soluto, la
cantidad y la composicin de la fase lquida, la temperatura y
la velocidad de flujo del gas.
Aparato. El aparato bsico para la cromatografa de gases es
relativamente simple. El gas transportador, generalmente est
disponible en cilindros que tienen una vlvula para regular la
presin del gas (manmetro) el cual es conducido hacia un
medidor, que permite el control adecuado de la velocidad de
flujo del gas (flujmetro) requerida para el anlisis de una
mezcla en particular.
Los gases ms utilizados como transportadores son el helio, el
nitrgeno y algunos otros gases inertes, dependiendo su
eleccin de las caractersticas del detector con que cuente
el aparato. Ya que los solutos que van a ser sometidos a la
cromatografa deben estar en fase de vapor, la puerta de
inyeccin se calienta a una temperatura suficientemente alta
para conseguir una vaporizacin rpida de la mezcla sin causar
degradacin trmica.
Las muestras se inyectan con una jeringa a travs de un sello
de hule o silicn que se encuentra en la puerta de inyeccin.
Es preferible inyectar directamente la muestra en el empaque
de la columna; sin embargo, en algunos casos, la muestra en
forma de vapor se mezcla con el gas transportador antes de
entrar a la columna, en donde los diferentes componentes
de la muestra vaporizada son separados debido a las interac-
ciones con la fase estacionaria.
La columna generalmente es de vidrio o metal y est localizada
en un horno que se mantiene a una temperatura seleccionada,
la cual determina el tiempo de retencin y en cierta manera la
resolucin y la eficiencia de la columna.
Un componente que programe la temperatura permite una
elucin eficiente de los compuestos sobre un amplio intervalo
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de presin de vapor. Cuando los componentes salen indivi-
dualmente de la columna, pasan a travs del detector, el cual
censa la presencia de cada uno de ellos.
La temperatura del detector debe controlarse para prevenir la
condensacin. El uso de un determinado detector, depende de
cada sustancia y se especifica en la monografa individual.
Las seales del detector pasan a travs de un amplificador o
electrmetro que est conectado a un aparato automtico que
grfica la seal, esta grfica resultante es el cromatograma, el
cual se emplea para determinar la identidad y la concentracin
de cada uno de los componentes. El detector generalmente emite
una seal proporcional a la concentracin del soluto en el gas
transportador cuando ste sale de la columna, de manera que el
cromatograma para cada producto aparece como un pico en
forma de campana a un determinado tiempo. Las curvas resul-
tantes representan exactamente el proceso de distribucin tal
como ha ocurrido durante el tiempo de residencia de los solu-
tos en la columna. Cualquier problema o mal funcionamiento de
cada uno de estos componentes del sistema cromatogrfico
puede disminuir la precisin y exactitud de la medida.
Los detectores ms comnmente utilizados en cromatografa
de gases son los de conductividad trmica, ionizacin de
flama, ionizacin de flama alcalina, captura de electrones y
espectrmetro de masas.
Debido a la alta conductividad trmica del helio, se usa como
transportador cuando se utiliza un detector de conductividad
trmica.
A menos que se especifique otra cosa en la monografa individual,
el uso de un detector de ionizacin de flama ya sea con helio o
nitrgeno como gas transportador, es lo ms recomendado, ya que
dicho detector es sensible a todos los compuestos de carbono y
tiene un intervalo amplio y dinmico de respuesta.
Dependiendo de las necesidades y caractersticas del anlisis
se selecciona el gas.
El detector de ionizacin de flama alcalina contiene una sal de
un metal alcalino o un elemento de vidrio conteniendo rubidio
u otro metal que proporciona una disminucin de la respuesta del
detector a tomos de carbn, pero aumenta la respuesta relativa
a tomos de nitrgeno, azufre y fsforo varias veces, lo que lo
convierte en un detector especfico para anlisis de pesticidas,
compuestos organofosforados y halogenados.
El detector de captura de electrones es tambin selectivo
mostrando respuesta pequea a los hidrocarburos y respuestas
extremadamente altas a algunos compuestos como aquellos
que contienen halgenos o cetonas.
Dependiendo del tipo de anlisis y cuando la deteccin es por cap-
tura de electrones, puede utilizarse como gas transportador
nitrgeno o argn que contengan pequeas cantidades de
metano.
Dependiendo de la naturaleza del anlisis, y si el mtodo lo
permite, se puede emplear el espectrmetro de masas como
detector universal, ya que es altamente sensible y muy
selectivo, ya que emplea como parmetro de identificacin de
la sustancia de inters no solo el tiempo de retencin, sino
tambin su relacin masa/carga (m/z).
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La velocidad de flujo del gas transportador especificado en las
monografas es la velocidad de flujo del gas que est saliendo
de la columna y es usualmente expresada en centmetros
cbicos por minuto a la presin atmosfrica y a temperatura
ambiente. La velocidad de flujo se mide comnmente con la
columna operando a su temperatura adecuada mediante un
medidor de flujo conectado a la salida de sta.
El gas rpidamente se enfra y se encuentra a temperatura
ambiente en el medidor de flujo. Es necesario desconectar la
columna del detector para llevar a cabo esta medida.
Para una velocidad de flujo determinada, la velocidad de flujo
lineal a travs de la columna est relacionada al cuadrado del
dimetro de la misma. De esta manera, una velocidad de flujo
de 60 mL/min para una columna de 4 mm en equivalencia a
una velocidad de flujo de 15 mL/min para una columna de
2 mm y dan tiempos de retencin semejantes.
A menos que se especifique otra cosa en la monografa
individual, se debe utilizar una velocidad de flujo entre 30 y
60 mL/min.
Columnas
Columnas capilares. Estas columnas, las cuales estn hechas
usualmente con slica fundida, tienen dimetros internos de 0.2
a 0.53 mm, y de 5 a 60 m de longitud. El lquido o fase
estacionaria, la cual es algunas veces ligada qumicamente a la
superficie inerte, posee un grosor que va de 0.1 a 1.0 m, y en
el caso de fases estacionarias no polares este grosor puede
llegar hasta 5 m. Este tipo de columnas estn disponibles de
manera comercial, y las principales ventajas que presentan
sobre las columnas empacadas son la uniformidad del empa-
quetamiento, dando una mejor resolucin an en mezclas ms
complejas.
Columnas empacadas. En el anlisis farmacutico general-
mente se emplean columnas empacadas y la manera en que se
ha llevado a cabo el empaque tiene influencia en el movimiento
relativo de los solutos a travs del sistema. Las columnas
deben ser de vidrio a menos que se especifique algn otro
material, se utilizan de varias dimensiones pero normalmente
son de 0.6 a 1.8 m de longitud y 2 a 4 mm de dimetro interno.
Las columnas de capacidad muy baja que tienen alrededor del
5 % (m/m) o menos de fase lquida en el soporte slido, son
las ms adecuadas para el uso analtico. Las columnas de alta
capacidad como aquellas que tienen un 20 % de lquido
pueden ser utilizadas para algunas sustancias de peso
molecular muy bajo.
Los materiales utilizados como soporte se encuentran dispo-
nibles en varios tamaos de partcula, entre los cuales los ms
usados son los de malla de 80 a 100 y de 100 a 120, con
columnas de 2 a 4 mm de dimetro. El material de soporte
debe ser totalmente inerte, particularmente para frmacos
polares que sern separados en columnas con fase lquida de
baja capacidad y baja polaridad.
Para el anlisis de frmacos, frecuentemente se utiliza tierra
diatomea calcinada y lavada con cido. Los soportes reactivos
pueden ocasionar descomposicin, rearreglos o picos coleados
del soluto. La reactividad del soporte se reduce tratndolo con
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un agente silanizante antes de adicionar la fase lquida. Los G10 Poliamida de cido C36 dicarboxlico con
soportes que reciben un lavado alcalino adicional deben 1,3-di-4- piperidil propano y piperidina
utilizarse con cuidado ya que el lcali residual descompone (1:0.9:0.2)
algunas fases lquidas. En algunas ocasiones se especifica una G11 Polister de Bis-(2-etilhexil)-sebacato
resina poliaromtica la cual no necesita ser cubierta con
G12 Polister de succinato de fenildietanolamina
una fase lquida.
Las fases lquidas estn compuestas por una gran variedad G13 Sorbitol
de sustancias tales como polietilenglicoles, steres, amidas de G14 Polietilenglicol (MM promedio 950-1 050)
alto peso molecular, hidrocarburos y gomas de silicona (poli- G15 Polietilenglicol (MM promedio 3 000-3 700)
siloxanos sustituidos con metilos, fenilos, nitrilos, vinilos, G16 Polietilenglicol compuesto (MM promedio
fluoroalquilos o mezclas de esos grupos). En todos los casos, 15 000). Compuesto de alto peso molecular
los lotes deben ser seleccionados cuidadosamente para la formado por polietilenglicol y un enlazante de
cromatografa de gases. diepxido (polietilenglicol 20M)
La figura 0241.1 representa un cromatograma tpico de
elucin de dos sustancias donde t1 y t2 son los tiempos G17 (75 %)Fenil-(25 %)metil polisiloxano
de retencin de las sustancias 1 y 2; h y h/2 son la altura total G18 Polialquilenglicol
y la mitad de la altura del pico desde el pice hasta la lnea G19 (25 %)Fenil-(25 %)cianopropil-(50 %)metil
base; Wh/2 es el ancho del pico a la mitad de la altura y W1 y silicn
W2 son los anchos de las bases de los picos 1 y 2, respec- G20 Polietilenglicol (MM promedio 380-420)
tivamente. Succinato de neo-pentilglicol
El pico del aire es caracterstico de los cromatogramas G21
obtenidos con detector de conductividad trmica y puede apa- G22 Bis-(2-etilhexil)-ftalato
recer antes o coincidir con el pico del disolvente; to es el G23 Adipato de polietilenglicol
tiempo muerto y corresponde al tiempo de retencin para una
G24 Diisodecil ftalato
sustancia que no es retenida por la columna.
G25 Polietilenglicol compuesto TPA.
Compuesto de alto peso molecular formado
por polietilenglicol y un diepxido
esterificado con cido tereftlico
(polietilenglicol 20M-TPA)
G26 (25 %)2-Cianoetil-(75 %)metil polisiloxano
G27 (5 %)Fenil-(95 %)metil polisiloxano
G28 (25 %)Fenil-(75 %)-metil polisiloxano
G29 3-3'-Tiodipropionitrilo
G30 Tetraetilenglicol dimetil ter
G31 Nonilfenoxipoli-(etilenoxi)-etanol (la longi-
tud promedio de la cadena de etilenoxi es
Figura 0241.1. Separacin cromatogrfica de dos sustancias. de 30) [Nonoxinol 30]
G32 (20 %)Fenil-(80 %)metil polisiloxano
Lista de fases lquidas y soportes empleadas en cromatografa (20 %)Carborano-(80 %)metil silicona
G33
de gases.
G34 Polister de dietilenglicol succinato estaba-
Fases lizado con cido fosfrico
G1 Aceite de dimetilpolisiloxano G35 Polmero de alto peso molecular de
G2 Goma de dimetilpolisiloxano polietilenglicol y diepxido esterificado
con cido nitrotereftlico
G3 (50 %)Fenil-(50 %)-metil polisiloxano
G36 (1 %)Vinil-(5 %)fenil metilpolisiloxano
G4 Polister de succinato de dietilenglicol
G5 3-Cianopropilpolisiloxano G37 Poliimida
G6 Trifluoropropilmetilpolisiloxano G38 Fase G1 conteniendo un pequeo
porcentaje de inhibidor de coleo de picos
G7 (50 %)3-Cianopropil-(50 %)fenil metilsilicn
G39 Polietilenglicol PM aprox. 1 500 (PEG 1 500)
G8 (80 %)Bis(3-cianopropil)-(20 %)3-cianopropil
fenilpolisiloxano G40 Adipato de etilenglicol
G9 Metilvinilpolisiloxano

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 G41 Fenilmetildimetilsilicona (10 % fenil sus-
tituido)
G42 (35 %) Fenil-(65 %)dimetil polisiloxano
G43 (6 %) Cianopropilfenil-(94 %)dimetil
polisiloxano
G44 Grasa hidrocarbonada de petrolato de bajo
peso molecular (2 %) y solucin de
hidrxido de potasio (1 %)
G45 Divinilbenceno-etilenglicol-dimetilacrilato
G46 (14 %) Cianopropilfenil-(86 %) metil poli-
siloxano
G47 Polietilenglicol PM aprox. 8 000 (PEG
8 000)
G48 Cianopolisiloxano altamente polar con
enlaces cruzados parciales
Soportes. A menos que se especifique otra cosa en la
monografa individual, el tamao de malla debe ser de 80 a
100 o como alternativa de 100 a 120.
S1A Tierra silcea para cromatografa de gases, tratada
de la siguiente manera: mezclar diatomita con
Na2CO3 y calcinar a 900 C. Lavar la tierra silcea
con cido, y despus con agua hasta neutralizar.
Esta tierra puede silanizarse con dimetildiclorosi-
lano para enmascarar los grupos silanol de la
superficie.
S1AB Tierra silcea tratada en la misma forma que la
anterior, pero lavada con un cido y con una base.
Tambin puede silanizarse.
S1C Soporte preparado de ladrillo refractario molido
con un pegamento de arcilla y calcinado por arriba
de los 900 C y con un lavado posterior con cido.
Tambin puede silanizarse.
S1NS Tierra silcea sin tratar.
S2 Copolmero de estireno-divinilbenceno con un
rea nominal de menos de 50 m2/g y un dimetro
de poro promedio de 0.3 a 0.4 m.
S3 Copolmero de etilvinilbenceno y divinilbenceno
con un rea nominal de 500 a 600 m2/g y un
dimetro de poro promedio de 0.0075 m.
S4 Copolmero de estireno-divinilbenceno con grupos
aromticos -O y -N; con un rea nominal de 400 a
600 m2/g y un dimetro de poro promedio de
0.0076 m.
S5 Polmero de tetrafluoroetileno de alto peso
molecular, con tamao de malla de 40 a 60.
S6 Copolmero de estireno-divinilbenceno con un
rea nominal de 250 a 350 m2/g y un dimetro de
poro promedio de 0.0091 m.
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S7 Carbn de grafito con un rea nominal de 12 m2/g.
S8 Copolmero de 4-vinil-piridina y estireno-
divinilbenceno.
S9 Polmero poroso basado en xido de 2,6-difenil-
p-fenileno.
S10 Copolmero con enlaces cruzados de acrilonitrito
y divinilbenceno altamente polar.
S11 Carbn grafitado con superficie nominal de
100 m2/g modificado con pequeas cantidades
de petrolato y polietilenglicol.
S12 Carbn grafitado con superficie nominal de
100 m2/g.
Procedimiento. Debido a que la cromatografa de gases es
principalmente un mtodo de separacin, no puede usarse para
identificar compuestos sin comparar con una sustancia de
referencia (SRef). Para el anlisis cualitativo, debe
determinarse el tiempo de retencin o el volumen que la
sustancia de referencia (velocidad de flujo por tiempo de
retencin del pico) del pico de una sustancia conocida,
inyectando al sistema una solucin de dicha sustancia.
Cuando un pico aparece al mismo tiempo o con el mismo
volumen bajo las mismas condiciones experimentales, la
probabilidad de una identificacin correcta es muy alta.
Alternativamente, los componentes individuales pueden ser
colectados en una trampa fra conforme van saliendo de
la columna para llevar a cabo otro tipo de anlisis por cualquier
mtodo instrumental o qumico y poder identificarlos
plenamente.
El tiempo de retencin o el volumen para el aire es un factor
importante ya que es utilizado para obtener los valores de
retencin absolutos y relativos para la caracterizacin de los
diferentes compuestos.
Los frmacos pueden ser identificados de acuerdo a su
retencin relativa, determinada por la siguiente frmula:
= (2 0 )(1 0 )
Donde:
t2 = Tiempo de retencin medido desde el punto de
inyeccin del frmaco en estudio.
t1 = Tiempo de retencin medido para una sustancia de
referencia determinados en la misma columna y a la
misma temperatura.
t0 = Tiempo de retencin para un componente inerte que no
se retiene en su paso a travs de la columna.
Cuando t2 = t1 es evidente que la retencin relativa es igual a 1,
es decir, no hay separacin.
En sta y en las siguientes expresiones matemticas escritas en
trminos de tiempos de retencin, estos pueden sustituirse con
los volmenes de retencin correspondientes o las distancias
en el cromatograma, ya que estos valores son proporcionales
al tiempo de retencin.
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Cuando se utiliza el detector de ionizacin de flama, el cual
no responde ni al aire ni al agua, la retencin de un compuesto
que no se retenga en la columna tal como el metano, puede
usarse para estimar t0. Cuando t0 es muy pequeo, puede ser
calculado directamente de los tiempos
de retencin (0 ). El factor de capacidad est relacionado a Para evitar estos problemas, antes de que cualquier columna
la retencin por la siguiente frmula:
= (0 ) 1 evaporacin la muestra por analizar, es conveniente utilizar
Se pueden obtener datos cuantitativos a partir de las reas bajo
los picos calculando stas grficamente o por medio de un
integrador electrnico automtico o un planmetro. Hay que
tomar en cuenta que las reas de los picos son menos precisas
para los picos pequeos y para aquellos que tengan tiempos de
retencin muy cortos.
En algunos casos, la altura de los picos puede sustituir a las
reas. Para minimizar errores grficos en picos asimtricos, el
producto que se obtiene al multiplicar el ancho del pico a la
mitad de la altura del mismo, puede tambin emplearse en vez
de las reas.
En la mayora de los casos, los anlisis farmacuticos
requieren de comparaciones cuantitativas de un cromatograma
con otro y en estas condiciones, la cantidad inyectada es una
fuente grande de error que puede minimizarse por la adicin
de un estndar interno a la sustancia por analizar.
La relacin del rea del pico de las sustancias de inters
(problemas y estndar de concentracin conocida) al rea del
pico del estndar interno se compara de un cromatograma a
otro mediante las siguientes expresiones:
=
= aparicin de un simple pico simtrico sin evidencia de
Donde:
Arref = rea relativa de la referencia.
Arp = rea relativa del problema.
Aref = rea del pico de referencia.
Aei = rea del pico del estndar interno.
Ap = rea del pico del problema.
Las reas relativas obtenidas se emplean para los clculos de
concentracin del problema considerando la concentracin
de la referencia y los pesos y/o diluciones llevados a cabo con
el problema.
Cuando la referencia interna es qumicamente similar a la
sustancia problema, se pueden controlar pequeas variaciones
en parmetros de la columna y el detector. En algunos casos,
la referencia interna puede adicionarse desde el inicio del
procedimiento para controlar tambin otros aspectos
cuantitativos del proceso.
Al hacer las curvas de calibracin, una cantidad del soluto
puede ser absorbida o adsorbida en el sistema y esto se refle-
jar en que la recta no pasar a travs del cero sino que lo har
en algn punto en la abscisa. Este efecto puede contribuir al
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error, particularmente en la medida de cantidades pequeas de
la sustancia y cuando se usa un simple punto de referencia.
A concentraciones altas de la sustancia, el soluto puede saturar
la fase lquida dando una prdida relativa a la altura o a la
simetra del pico.
sea aceptada para el anlisis, es recomendable construir una
curva de calibracin. Cuando sea necesario concentrar por
disolventes de grado especial, con objeto de evitar que tambin
se concentren las impurezas de los disolventes.
Estos disolventes especiales deben especificarse en la
monografa individual. Ya que muchos frmacos son
molculas polares que tienen grupos reactivos, una cromato-
grafa adecuada puede requerir la conversin del frmaco a
un derivado ms voltil o menos polar por el tratamiento con
reactivos especficos, esta derivatizacin tambin deber
especificarse en la monografa respectiva.
Las columnas deben acondicionarse, antes de ser usadas, a una
temperatura ms alta que la especificada en la monografa
individual, en el caso de polisiloxanos con sustituyentes
metilos o fenilos estables trmicamente, se debe seguir una
rutina para aumentar la eficiencia y la caracterstica inerte
de la columna; mantener la columna a una temperatura de
250 C por una hora con flujo de helio o nitrgeno para
remover el oxgeno y los disolventes. Detener el flujo del gas,
calentar a 340 C por 4 h y reducir el calentamiento hasta
temperatura de 250 C. Acondicionar con el gas transportador
hasta obtener un flujo estable.
Una prueba adecuada para asegurar que el soporte es inerte
cuando se utilizan fases lquidas de baja polaridad, es la
descomposicin cuando se inyecta colesterol. La columna
puede acondicionarse ocasionalmente por inyecciones
repetidas del compuesto o la mezcla que va a ser analizada.
CROMATOGRAFA DE GASES DE FASE DE VAPOR
El mtodo se basa en el anlisis de la fase de vapor en
equilibrio con la fase slida o lquida de inters. La fase de
vapor es el espacio libre superior que se encuentra entre la
muestra lquida o slida dentro de un vial, este espacio est
lleno con la muestra voltil que se desprende de la muestra por
medio del calentamiento del vial y por presurizacin interna del
mismo con el gas de arrastre que se usa para el cromatgrafo
de gases. La cromatografa de gases de fase vapor es un
mtodo adecuado para separar y determinar compuestos
voltiles presentes en muestras slidas o lquidas.
Aparato. El aparato est compuesto por un cromatgrafo de
gases equipado con un muestreador de fase vapor para
introducir la muestra problema al sistema cromatogrfico.
Muestreador de fase de vapor. Cuenta con un mdulo que
controla la presin y temperatura automticamente, pudiendo
acoplarse un dispositivo para la eliminacin de disolventes
cuando sea necesario. La muestra se introduce en un recipiente
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cerrado con una tapa con sistema de vlvula que permita el
paso del gas acarreador. El recipiente se coloca en una cmara
termocontrolada a la temperatura establecida de acuerdo a la
naturaleza de la muestra y se mantiene a esta temperatura lo
suficiente para permitir un equilibrio entre la fase slida o
lquida y la fase de vapor a analizar. El gas acarreador se
introduce en el recipiente, y despus del tiempo indicado, se abre
la vlvula de modo que el gas se expanda hacia la columna
cromatogrfica, arrastrando a los compuestos voltiles. De no
utilizarse el equipo antes descrito, es posible el uso de jeringas
hermticas para la introduccin de la muestra en un
cromatgrafo convencional; para esto, en una cmara por
separado, permitir el equilibrio evitando cambios en ste
durante el proceso de arrastre de vapor hacia la columna
cromatogrfica.
Procedimiento. Determinar los parmetros del instrumento
con ayuda de las preparaciones de referencia hasta producir
una respuesta adecuada.
Calibracin directa. Introducir, tanto la sustancia a examinar
como cada una de las preparaciones de referencia en reci-
pientes idnticos por separado, como se indica en la
monografa, evitando el contacto entre el muestreador y las
muestras. Cerrar los recipientes de manera hermtica y colocar
en la cmara termocontrolada. Permitir el equilibrio
y desarrollar la cromatografa bajo las condiciones indicadas
en la monografa.
Adicin de estndar. Agregar a un juego de recipientes
idnticos, volmenes iguales de la preparacin a examinar.
Adicionar a todos los recipientes, excepto a uno, cantidades
preestablecidas de la preparacin de referencia que contenga
la sustancia a examinar en concentracin conocida, de modo
que se genere una serie de soluciones que contengan con-
centraciones continuas crecientes de la sustancia. Cerrar
hermticamente los recipientes y colocarlos en la cmara
termocontrolada. Permitir el equilibrio y desarrollar la cromato-
grafa de acuerdo a las condiciones indicadas en la monografa.
Clculos. Graficar las concentraciones promedio contra la
cantidad presente en la preparacin de referencia. Calcular
la ecuacin linear de la grfica usando un ajuste de mnimos
cuadrados, y derivar a partir de sta la concentracin de la
sustancia que se est determinando en la preparacin.
De otro modo, extrapolar la lnea que une los puntos en la
grfica hasta que alcance el eje de concentracin. La distancia
entre este punto y la intercepcin de los ejes representa la
concentracin de la sustancia que se est determinando en
la preparacin.
CROMATOGRAFA LQUIDA
I. CROMATOGRAFA PLANA
A) Cromatografa en capa delgada
Esta tcnica es una forma de cromatografa de adsorcin que
consiste en un adsorbente slido (fase estacionaria), distribuido
uniformemente sobre una superficie plana, generalmente hojas
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de aluminio o placas de vidrio. Este adsorbente presenta cierta
capilaridad dada por las partculas finamente divididas y que
permite que la fase mvil pase entre las partculas del
adsorbente.
La separacin ocurre cuando uno de los componentes de la
mezcla es retenido en mayor grado por la fase estacionaria que
los otros componentes. La fase estacionaria puede modificarse
de acuerdo a las necesidades de separacin aunque el factor
ms importante para que sta se lleve en forma adecuada es la
fase mvil elegida.
El movimiento de cada sustancia en un determinado sistema es
caracterstico y puede ser un dato valioso en la identificacin
de ella. Esta caracterstica se conoce con el nombre de RF
(relacin de frentes) y representa la distancia recorrida por el
compuesto, con relacin a la distancia recorrida por la fase mvil
por lo que sus valores siempre oscilarn entre 0 y 1.
F =
Donde:
Do = Distancia recorrida por un compuesto desde el origen.
Df = Distancia recorrida por el frente de la fase mvil.
No todas las sustancias pueden observarse, por lo que en
muchas ocasiones es necesario observar la placa de
cromatografa despus de someterla a procesos de "revelado"
dependiendo estos de las caractersticas qumicas del
compuesto por analizar o bien observar dichas placas bajo una
fuente de luz ultravioleta.
Procedimiento. Las placas empleadas comnmente (croma-
toplacas) son de vidrio y de las dimensiones apropiadas al uso
al que sern destinadas.
Estas placas se pueden adquirir ya preparadas, es decir,
recubiertas con la capa del adsorbente (gel de slice o almina)
que se vaya a emplear o pueden prepararse en el laboratorio de
la manera que se describe a continuacin:
Preparacin de las cromatoplacas. Se requiere un dispositivo
para extender sobre las placas una capa uniforme del material con
que se van a recubrir. Se prepara una suspensin del material
de recubrimiento de acuerdo a las indicaciones del fabricante y
utilizando el dispositivo indicado se distribuye esta suspensin
sobre las placas, las cuales deben estar limpias y secas.
El grosor de la capa vara de 0.25 a 0.30 mm. Las placas se
dejan secar al aire y se deshidratan a 110 C durante 30 min
antes de utilizarse (si la monografa lo indica). Deben
conservarse protegidas de la humedad.
Mtodo
Tcnica vertical ascendente. A menos que se indique otra cosa,
la cmara para la cromatografa se emplea en condiciones de
saturacin, para lo cual se forra interiormente con papel filtro
y se vaca dentro de ste suficiente fase mvil para humedecer el
papel y que quede en el fondo una capa de disolvente de 0.5 a
1 cm de altura. La cmara se cierra hermticamente para evitar
la evaporacin de la fase y se mantiene en estas condiciones
de 45 min a 1 h antes de utilizarse.
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Es conveniente quitarle a la cromatoplaca dos tiras angostas
del recubrimiento a ambos lados.
Las soluciones que van a ser analizadas y las soluciones de las
SRef respectivas, se aplican a una distancia de 2 cm del borde
inferior de la placa y dejando 2 cm de cada lado.
La aplicacin se hace con ayuda de una micropipeta o una
microjeringa en forma de una mancha compacta no mayor de
6 mm de dimetro o en forma de banda de no ms de 2 cm
de largo y no ms de 6 mm de ancho, a menos que se
especifique otra cosa en la monografa.
Las aplicaciones de cada solucin deben estar suficientemente
separadas entre s para evitar que se mezclen. La distancia
que va a recorrer el frente del disolvente se determina de
antemano en la placa considerando el punto de aplicacin
como el origen, que en general son tres cuartas partes de la
longitud de la cromatoplaca.
Las aplicaciones se dejan secar y la placa se introduce en la
cmara conteniendo el sistema. Se tapa hermticamente y se
deja a temperatura ambiente hasta que la fase mvil ascienda
la distancia deseada. Se saca la placa y se deja evaporar el A. Tope para placas cromatogrficas.
disolvente que la impregna. B. Soporte para placas cromatogrficas.
Tcnica horizontal. Aplicar el volumen prescrito de las C. Salientes para sostener la tapa de vidrio.
disoluciones en fracciones suficientemente pequeas como D. Descanso para la placa de vidrio sinterizado.
para obtener manchas circulares de 1 a 2 mm de dimetro o E. Disolvente.
bandas de 5 a 10 mm de longitud por 1 2 mm de ancho, a una F. Canal para el suministro de disolvente.
distancia adecuada del borde inferior y de los lados de
la cromatoplaca. Aplicar las disoluciones sobre una lnea Figura 0241.2. Cmara cromatogrfica para la elucin
paralela al borde inferior de la placa, con un intervalo de al horizontal.
menos 5 mm entre las manchas.
Cuando se haya evaporado el disolvente de las disoluciones Adsorbentes
aplicadas, introducir la cantidad suficiente de fase mvil en el CD01 Celulosa
surco correspondiente de la cubeta, utilizando una jeringa o
pipeta. Colocar la placa horizontalmente y conectar el CD02 Celulosa microcristalina
dispositivo para dirigir la fase mvil siguiendo las instruc- CD03 Celulosa F254
ciones del fabricante. CD04 Tierra silcea G
Si se indica en la monografa, desarrollar la placa comenzando
simultneamente por ambos extremos. Tapar la cubeta y CD05 Tierra silcea G F254
mantenerla entre 20 y 25 C. Sacar la capa cuando la fase CD06 Tierra silcea H
mvil haya alcanzado la distancia indicada en la monografa. CD07 Gel de slice G
Secar la placa y visualizar los cromatogramas de la forma que
se prescribe (vase figura 0241.2). CD08 Gel de slice G F254

Revelado. La localizacin de las manchas de inters se hace CD09 Gel de slice H

por visualizacin directa bajo una lmpara de luz ultravioleta
(con longitudes de onda de 254 y/o 365 nm) o bien, cuando la
monografa lo recomiende, se emplea el reactivo de revelado
indicado en sta, el cual se aplica por atomizacin o en forma
de vapores.
CD10 Gel de slice H F254
CD11 Gel de slice H F254 silanizado
B) Cromatografa en papel
El soporte empleado en este tipo de cromatografa es una tira
de papel filtro de espesor y textura uniforme. En algunos casos
se puede impregnar con lquido que sea inmiscible con la fase
mvil; de esta manera, el proceso de particin se lleva a cabo
entre los dos lquidos.
Aparato. Se emplea una cmara de vidrio de dimensiones
adecuadas para colocar el papel de la cromatografa, que pueda
cerrarse hermticamente y que pueda emplearse tanto para
cromatografa ascendente como descendente.

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El papel debe ser de una absorcin apropiada; ste se corta en
tiras de una longitud no mayor al tamao de la cmara
y de una anchura no menor de 2.5 cm. El papel debe cortarse
de manera que la fase mvil corra en direccin del hilo de la
fibra del papel.
Cromatografa descendente. La tapa de la cmara de
desarrollo tiene un orificio central de aproximadamente 1.5 cm
de dimetro cerrado por un tapn.
En la parte superior de la cmara est colocado un recipiente
para el disolvente, provisto de un dispositivo, generalmente una
varilla de vidrio, para sostener el papel. A ambos lados del
recipiente se colocan dos varillas de vidrio en forma paralela
y ligeramente arriba de los bordes superiores del recipiente de
manera que sostengan el papel sin que este entre en contacto
con las paredes del tanque. Se utiliza una cantidad suficiente
del disolvente especificado en la monografa, para formar una
capa de 2.5 cm en el fondo. La cmara se cierra y se mantiene
a una temperatura de 20 a 25 C durante 24 h previas al
desarrollo cromatogrfico y mientras dure dicho proceso.
Se traza con un lpiz una lnea fina en el papel a una distancia
del extremo tal que, al colocarlo en la varilla del recipiente,
la lnea quede paralela y unos centmetros por debajo de la
varilla. La solucin del producto en estudio se aplica sobre esta
lnea; la mancha no debe exceder de 1 cm de dimetro y se
deja secar al aire. El papel ya preparado se introduce en la
cmara, se cierra y se deja en reposo durante hora y media para
que se sature. Al cabo de este tiempo se introduce por el
orificio de la tapa, suficiente fase mvil en el recipiente para
el disolvente; se tapa y se efecta el desarrollo durante la
distancia o tiempo descritos en la monografa, protegiendo
la cmara de la luz directa durante el proceso. El papel se saca
y se deja secar al aire. El mtodo de cuantificacin se describe
en la monografa.
Cromatografa ascendente. La parte superior del tanque
tiene un dispositivo desde el cual se suspende el papel para
cromatografa, que permita que ste descienda sin abrir la
cmara. En el fondo hay una cubeta conteniendo la fase mvil
hasta la cual se har descender el papel.
Se emplea una cantidad suficiente de la fase mvil elegida de
manera que forme una capa de 2.5 cm en la cubeta y si es
necesario, se puede poner otro disolvente entre la cubeta y las
paredes de la cmara. Esta se cierra y se mantiene entre 20 a
25 C durante 24 h previas al desarrollo cromatogrfico.
La muestra se aplica de la misma manera que se describi en
la cromatografa descendente pero en este caso, el extremo
aplicado se coloca en la parte inferior. El papel preparado se
introduce en la cmara, se tapa y se deja saturar durante una
hora y media. Al cabo de este tiempo, el papel se hace descender
hasta la fase mvil y se deja, para el desarrollo, durante el
tiempo o la distancia descrita en la monografa, protegiendo de
la luz directa. Se saca el papel y se deja secar al aire. El mtodo
de cuantificacin se describe en la monografa.
II. CROMATOGRAFA EN COLUMNA
A) Cromatografa de adsorcin en columna
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El soporte slido o adsorbente, (almina activada, celulosa en
polvo o slica) se introduce en forma de polvo seco o de pasta
en un tubo de vidrio, de plstico o de otro material adecuado,
procurando generar una masa uniforme y compacta, libre de
fracturas y/o burbujas; dicho tubo debe poseer un orificio
inferior estrecho (generalmente protegido por un disco de
vidrio poroso) para dar salida a la fase mvil.
Preparacin de la columna. En la parte superior de la
columna se vierte una solucin de la sustancia sometida
a cromatografa y se deja que penetre en el adsorbente;
inmediatamente despus, se introduce el disolvente, que
constituye la fase mvil y se le deja fluir hacia abajo por accin
de la gravedad o aplicando una presin positiva; durante todo
el desarrollo de la cromatografa no debe dejarse que la parte
superior de la columna se seque.
La solucin eluida se vigila de una manera continua (por
ejemplo, con una celda de absorcin ultravioleta por la que
pasa), o peridica, por ejemplo, recogiendo fracciones cada
cierto tiempo o cuando la elucin alcanza cierto volumen o
peso, y examinando despus cada fraccin para investigar el
componente separado.
B) Cromatografa de particin en columna
En este tipo de cromatografa, una fase estacionaria lquida,
inmiscible con la fase mvil, es adsorbida en la superficie del
adsorbente slido. La cromatografa se lleva a cabo del mismo
modo que la cromatografa de adsorcin en columna, teniendo
cuidado de saturar la fase mvil con la fase estacionaria antes
de ser usada para la elucin.
Cromatografa de fase normal. Generalmente el adsorbente
slido usado en la cromatografa de particin y la fase
estacionaria adsorbida en l, son polares con respecto a la
fase mvil. El adsorbente ms usado en estos casos es una
tierra silcica o almina inactiva, con partculas de dimetro y
tamao de poro adecuados para que pueda fluir fcilmente la
fase mvil.
Cromatografa de fase inversa. Es aquella en la que el
adsorbente polar se transforma en no polar por silanizacin u
otros medios (tratamiento con parafinas) y la fase fija
adsorbida es menos polar que la fase mvil.
En estos sistemas de particin, el grado de separacin de un
compuesto est regido por su coeficiente de distribucin entre
las dos fases lquidas y en los compuestos que se disocian, por
el pH de la fase ms polar.
La elucin selectiva se realiza por interaccin diferencial de
los componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y la
fase mvil; esta ltima formada por una solucin reguladora
de pH y algn solvente orgnico miscible en agua, como
metanol y/o acetonitrilo.
C) Cromatografa de intercambio inico
Se puede considerar como una forma especial de cromato-
grafa en la que la fase slida contiene un material cambiador
de iones, generalmente llamado resina de intercambio inico.
El intercambio de iones consiste en el cambio reversible del
ion presente en la solucin con el contrain del polmero
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resinoso, celulosa modificada o soporte del gel de slice; este
intercambio se aprecia claramente en los siguientes ejemplos
de una resina catinica y una aninica:
+
RSO
3 H + Na
+
RSO3 Na+ + H +
RN + (CH3 )3 OH + Cl RN + (CH3 )3 Cl + OH
La eleccin de las resinas, fuertes o dbiles, de tipo aninico o
catinico, depender en gran parte del pH en el cual deba
realizarse el intercambio y de qu cationes o aniones haya que
intercambiar. Sin embargo, las resinas fuertemente cidas y
bsicas se prestan a la mayora de las aplicaciones analticas.
Su capacidad especfica vara desde 2 hasta 5 mmol/g. En la
prctica se emplea un gran exceso (200 a 300 %) de resina
sobre la cantidad estequiomtrica calculada.
El coeficiente de selectividad indica la preferencia con que una
resina de intercambio inico fija dos o ms iones de una
solucin. En general, la resina fijar de preferencia iones
bivalentes (o multivalentes) que iones monovalentes y, ante
iones de la misma valencia, fijar preferentemente los ms
pesados.
Tratamiento de la resina de intercambio inico y
preparacin de la columna. Sumergir en agua la resina de
intercambio inico y dejar hidratar durante 24 h; introducirla
en una columna adecuada. Si se trata de una resina aninica,
transformarla en bsica pasando a travs de la columna una
solucin 2 N de hidrxido de sodio a una velocidad
aproximada de 3 mL/min hasta que el eluyente no contenga
cloruros, enseguida lavar con agua exenta de dixido de
carbono, para eliminar la alcalinidad. En el caso de una resina
de intercambio catinico, la conversin a la forma cida se
logra pasando solucin 2 N de cido clorhdrico a travs de la
columna y despus lavando con agua exenta de dixido de
carbono hasta que el lquido de lavado sea neutro.
La columna as preparada se usa de manera anloga a la
descrita para la cromatografa de adsorcin en columna, con la
excepcin de que no suele ser necesario vigilar el eluyente.
Segn el tipo de resina elegida y el tipo de material examinado,
el volumen del eluyente obtenido se recoge y se titula con
cido o base, segn convenga, utilizando un indicador
apropiado.
Una vez terminada la determinacin, puede regenerarse la
columna de intercambio de iones lavndola con solucin de
hidrxido de sodio 2 N, si es una columna de cambio aninico,
o con solucin de cido clorhdrico 2 N, si es una columna de
cambio catinico, lavando a continuacin con agua hasta
obtener una reaccin neutra.
Resinas intercambiadoras
II1. Intercambiador aninico dbil (2X): resina
polimrica con grupos amonio cuaternarios (en
forma clorada), unidos a una red polimrica
de poliestireno con enlaces cruzados y 2 % de
divinilbenceno.
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II2. Intercambiador aninico fuertemente bsico
(8X): resina polimrica con grupos amonio
cuaternarios (en forma hidroxilada), unidos a una
red polimrica de poliestireno con enlaces
cruzados y 8 % de divinilbenceno.
II3. Intercambiador aninico fuertemente bsico:
resina polimrica con grupos amonio cuaternarios
unidos a una red polimrica de ltex con enlaces
cruzados con divinilbenceno.
II4. Intercambiador catinico dbil: resina de polime-
tacrilato ligeramente cida, con grupos carboxilos en
forma protonada.
II5. Intercambiador catinico (4X): polmero de
poliestireno con enlaces cruzados y 4 %
de divinilbenceno, con grupos sulfnicos cidos
(en forma protonada).
II6. Intercambiador catinico fuertemente cido (8X):
Polmero de poliestireno con enlaces cruzados y
8 % de divinilbenceno, con grupos sulfnicos
cidos (en forma protonada).
Intercambiador catinico (8X): Polmero de
II6Ca.
poliestireno con enlaces cruzados y 8 %
de divinilbenceno, con grupos sulfnicos cidos
(con calcio como contrain).
CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA
RESOLUCIN (CLAR)
Esta tcnica es conocida tambin como Cromatografa de
Lquidos a Alta Presin (CLAP).
El xito en la aplicacin de la CLAR para un compuesto dado
depende de la combinacin correcta de las condiciones de
operacin, es decir: la preparacin de la muestra, el tipo de la
columna, la fase mvil, la longitud y dimetro de la columna,
la velocidad de flujo de la fase mvil, el tipo de deteccin, el
algoritmo de integracin, etc.
La migracin diferencial en la CLAR es resultado del equi-
librio de distribucin de los componentes de una mezcla entre
la fase estacionaria y la fase mvil. Dichos componentes se
separan en la columna y al salir de sta son conducidos por la
fase mvil en el orden en que emergieron, hacia un detector
donde se registra una respuesta proporcional a su cantidad sus
concentraciones y sus tiempos de retencin en la columna. El
cromatograma resultante muestra cada compuesto que sale
de la columna en forma de picos simtricos con un tiempo de
retencin caracterstico por lo que este tiempo puede emplearse
para identificar el compuesto. Este tiempo de retencin (t r )
se mide desde el momento de la inyeccin de la muestra hasta
el momento en que aparece el mximo del pico en el
cromatograma.
Los mecanismos o procesos de separacin que dan como
resultado la retencin de las molculas de una muestra por
parte de la fase estacionaria dan lugar a los diferentes mtodos
de cromatografa lquida; esto es: lquido-lquido o de parti-
cin, que consta de una fase estacionaria lquida de
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composicin diferente a la de la fase mvil e inmiscibles. Las
molculas de la muestra se distribuyen entre ambas fases como
sucedera en una extraccin lquido-lquido. La cromatografa
lquido-slido o de adsorcin incluye partculas de gran rea
superficial donde las molculas son atradas, y por lo tanto,
retenidas. La cromatografa de intercambio inico, en la cual
la fase estacionaria contiene grupos inicos fijos como SO3,
junto con iones de carga opuesta (contrain). Estos ltimos
estn presentes en la fase mvil en forma de sales. De esta
manera las molculas de muestras inicas son retenidas en la
columna por el intercambio inico, como lo muestra el
siguiente ejemplo:
RSO3 Na+ + X + RSO +
3 X + Na
+
Por ltimo, la cromatografa de exclusin molecular, en la cual
el empaque es un material poroso donde el tamao del poro
est bien definido. De esta manera, las molculas que son
demasiado grandes para el poro eluyen entre las partculas y
salen rpidamente de la columna, mientras que las que son
pequeas penetran en los poros aumentando su recorrido y
prolongando su tiempo de elucin. Este tipo de cromatografa
es muy empleado para separar compuestos por su tamao
molecular.
.
Soportes para CLAR
L1 Octadecil-silano enlazado qumicamente a slica
porosa o a micropartculas de cermica de 5 a
10 m de dimetro.
L2 Octadecil-silano enlazado qumicamente a gel
de slice con una superficie de porosidad
controlada y que a su vez ha sido unida a un
ncleo slido esfrico de 30 a 50 m de
dimetro.
L3 Partculas de slica porosa de 5 a 10 m de
dimetro.
L4 Gel de slice con una superficie de porosidad
controlada unida a un ncleo slido esfrico de
30 a 50 m de dimetro.
L5 Almina con una superficie de porosidad
controlada unida a un ncleo slido esfrico de
30 a 50 m de dimetro.
L6 Empaque de intercambio catinico fuerte:
polmero de fluorocarbn sulfonado cubriendo
un ncleo slido esfrico de 30 a 50 m de
dimetro.
L7 Octilsilano enlazado qumicamente a partculas
de slica totalmente porosa de 5 a 10 m de
dimetro.
L8 Capa monomolecular de aminopropilsilano
enlazada qumicamente a un soporte de gel de
slice porosa de 10 m de dimetro.
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L9 Gel de slice totalmente porosa e irregular de
10 m con una cubierta enlazada qumicamente
de un intercambiador catinico fuertemente cido.
Grupos nitrilo qumicamente enlazados a partcu-
L10
las de slica porosa de 5 a 10 m de dimetro.
L11 Grupos fenilo qumicamente enlazados a
partculas de slica porosa de 5 a 10 m de
dimetro.
L12 Empaque de intercambio aninico fuerte for-
mado por una amina cuaternaria enlazada
qumicamente a un ncleo esfrico de slica de
30 a 50 m de dimetro.
L13 Trimetilsilano enlazado qumicamente a
partculas de slica porosa, de 5 a 10 m de
dimetro.
L14 Gel de slice de 10 m de dimetro con un
recubrimiento enlazado qumicamente de
un intercambiador aninico de amonio cuater-
nario fuertemente bsico.
L15 Hexilsilano qumicamente enlazado a slica
totalmente porosa de 3 a 10 m de dimetro.
L16 Dimetilsilano qumicamente unido a partculas
de slica porosa, de 3 a 10 m de dimetro.
L17 Resina de intercambio catinico fuerte consis-
tente de un copolmero de estireno-divinilben-
ceno, con grupos sulfonato en forma protonada,
de 7 a 10 m de dimetro.
L18 Grupos amino y ciano qumicamente unidos a
partculas de slica porosa, de 3 a 10 m de
dimetro.
L19 Resina de intercambio catinico fuerte consis-
tente de un copolmero de estireno-divinilben-
ceno, con grupos sulfonato con calcio como
contrain, de 7 a 10 m de dimetro.
L20 Grupos dihidroxipropano qumicamente unidos
a partculas de slica porosa, de 5 a 10 m de
dimetro.
L21 Partculas esfricas rgidas de copolmero
estireno-divinilbenceno, de 5 a 10 m de
dimetro.
L22 Resina de intercambio catinico con grupos
sulfonato, hecha con gel de poliestireno,
partculas con dimetro de 10 m.
L23 Resina de intercambio aninico hecha de gel
poroso de polimetacrilato-poliacrilato con
grupos amonio cuaternarios, de 10 m de
dimetro.
L24 Gel hidroflico semirrgido formado por polmeros
de vinilo con grupos hidroxilo expuestos en la
superficie de la matriz, de 32 a 63 m de
dimetro.
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 L25 Tamiz molecular 100 - 5 000. Resina de
polimetacrilato con uniones cruzadas con ter
polihidroxilado.
L26 Butilsilano unido qumicamente a partculas
totalmente porosas de slica, de 5 a 10 m de
dimetro.
L27 Partculas de slica porosa de 30 a 50 m de
dimetro.
L28 Soporte multifuncional amino-C8 con base de
slica esfrica.
L29 Gamma almina para fase reversa. Partculas de
polibutadieno de bajo porcentaje de carbono,
unidasa almina, tamao de poro 80 , 5 m de
dimetro.
L30 Etilsilano qumicamente unido a slica
totalmente porosa, 3 a 10 m de dimetro.
L31 Resina intercambiadora aninica fuerte. Co-
polmero de etilvinilbenceno-55 % divinilben-
ceno, con macroporos de 2 000 , dimetro
8.5 m.
L32 Ligando quiral. Complejo L-prolina/cobre unido
a partculas irregulares de slica de 5 a 10 m de
dimetro.
L33 Slica esfrica para separacin de protenas de
4 000 a 40 000 kDa.
L34 Resina de intercambio catinico fuerte. Copo-
lmero de estireno-divinilbenceno con grupos
sulfonato en forma libre, 9 m de dimetro.
L35 Slica esfrica estabilizada con zirconio con una
monocapa hidroflica tipo diol, con tamao de
poro de 150 .
L36 3,5-dinitrobenzoil derivado de L-fenilglicina,
unido covalentemente a aminopropil slica de
5 m de dimetro.
L37 Gel de polimetacrilato para separacin de
protenas de 2 000 a 40 000 kDa.
L38 Empaque de exclusin molecular basada en
metacrilato, para muestras hidrosolubles.
L39 Resina hidroflica de gel de polihidroxime-
tacrilato.
L40 Celulosa tris-3,5-dimetilfenilcarbamato unida a
slica porosa, de 5 a 20 m de dimetro.
L41 Alfa1-glicoprotena cida inmovilizada en
partculas esfricas de slica de 5 m de
dimetro.
L42 Octilsilano y octadeclsilano qumicamente
unido a slica totalmente porosa, 3 a 10 m de
dimetro.
L43 Pentafluorofenil qumicamente unido a
partculas de slica, 5 a 10 m de dimetro.
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L44 Soporte multifuncional de intercambiador
catinico sulfnico con octilsilano qumica-
mente unido a partculas de slica de 60 , 5 a
10 m de dimetro.
L45 Beta-ciclodextrina qumicamente unido a
partculas de slica, 5 a 10 m de dimetro.
L46 Aglomerado de poliestireno-divinilbenceno con
grupos amino cuaternarios en una base de ltex,
10 m de dimetro.
L47 Intercambiador aninico microporoso de alta
capacidad, con grupos trimetilamino; 8 m de
dimetro.
L48 Resina de poliestireno sulfonatada, con enlaces
cruzados con cubierta externa de submicron,
de 15 m de dimetro.
L49 Polibutadieno sobre partculas esfricas de
zirconia, de 3 a 10 m de dimetro.
L50 Resina multifuncional de fase reversa con
intercambiador aninico fuerte. La resina es
un copolmero de etilvinilbenceno -55 % de
enlaces cruzados con divinilbenceno, sobre
soporte de ltex de 3 a 15 m de dimetro.
L51 Amilosa tris-3,5-dimetilfenilcarbamato sobre
partculas esfricas de slica de 3 a 10 m de
dimetro.
L52 Resina de intercambiador catinico fuerte a
base de slica porosa y grupos sulfopropilo;
partculas de 5 a 10 m de dimetro.
L50 Resina multifuncional con retencin de fase
reversa y funciones de intercambio aninico
fuerte. La resina consiste en etilvinilbenceno
entrecruzado en un 55 % con copolmero de
divinilbenceno, 3-5 m de dimetro y una
superficie no menor a 350 m2 /g. El sustrato est
recubierto con partculas de ltex
funcionalizadas con amonio cuaternario;
consistentes de estireno entrecruzado con
divinilbenceno.
L51 Partculas de slice, porosas y esfricas,
recubiertas con amilosa tris-3,5-
dimetilfenilcarbamato. 3-10 m de dimetro.
L52 Resina de intercambio catinico fuerte, hecha
de slice porosa con grupos sulfopropilo. 1-
10 m de dimetro.
L53 Resina de intercambio catinico dbil;
consistente de etilvinilbenceno entrecruzado en
un 55 % con copolmero de divinilbenceno, 3-
15 m de dimetro. El intercambiador est
injertado en la superficie del soporte con
monmeros funcionales de cido carboxlico
y/o cido fosfrico. Con capacidad no menor a
500 Eq/columna.
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 L54 Medio de exclusin por tamao de partcula dimetro. El sitio activo es (S)-18-corona-6-
hecho de dextrn unido de forma covalente a ter.
cuentas porosas de agarosa altamente L67 Copolmero poroso de alcohol vinlico con un
entrecruzadas. 5-15 m de dimetro. grupo alquilo C18 unido al grupo hidroxilo del
L55 Resina de intercambio catinico fuerte hecha de polmero, 2-10 m de dimetro.
slice poroso recubierto con copolmero de L68 Slice porosa y esfrica, con 10 m o menos de
cido polibutadieno-malico. Alrededor de dimetro; cuya superficie ha sido modificada de
5 m de dimetro. forma covalente con grupos alquil-amido con
alta actividad silanol.
L56 Propilsilano unido de forma qumica a
L69 Sustrato de etilvinilbenceno/divinilbenceno
partculas de slice porosas, total o
aglomerado con gotas de ltex de 130 nm
superficialmente. 3-10 m de dimetro.
funcionalizadas con amina cuaternaria,
L57 Protena ovomucoide de reconocimiento quiral,
alrededor de 6.5 m de dimetro.
unida qumicamente a partculas de slice,
L70 Celulosa tris(fenilcarbamato) recubierta sobre
alrededor de 5 m de dimetro, con un tamao
slice de 5 m.
de poro de 120 ngstroms.
L71 Polimetacrilato rgido y esfrico, 4-6 m de
L58 Resina de intercambio catinico fuerte
dimetro.
consistente de copolmero sulfonado de estireno
L72 Enlace urea entre (S)-fenilglicina y 3,5-
entrecruzado con divinilbenceno en forma
dinitroanalina unido de forma covalente a slice.
sdica. Alrededor de 6-30 m de dimetro.
L73 Partcula rgida y esfrica de
L59 Empaque con capacidad de separar protenas
polidivinilbenceno, 5-10 m de dimetro.
por su peso molecular dentro de un rango de 5-
L74 Resina de intercambio aninico fuerte hecha de
7000 kDa. El empaque es de partculas esfricas
un ncleo altamente entrecruzado de partculas
de slice de 1.5-10 m o empaque hbrido con
macroporosas de 7 m, con un tamao de poro
recubrimiento hidroflico.
promedio de 100 ngstroms, a su vez
L60 Gel de slice poroso, esfrico, 10 m o menos
consistentes de etilvinilbenceno entrecruzado
de dimetro, cuya superficie ha sido modificada
con 55 % de divinilbenceno y una capa de
de forma covalente con grupos alquil-amido y
intercambio aninico injertada en la superficie,
encapsulada
la cual est funcionalizada con iones alquilo
L61 Una resina de intercambio aninico fuerte,
amonio cuaternarios.
hidrxido selectiva, consistente de un ncleo
L75 Protena de reconocimiento quiral (albmina
altamente entrecruzado de partculas
srica bovina), unida qumicamente a partculas
microporosas de 13 m con un tamao de poro
de slice, alrededor de 7 m de dimetro, con un
menor a 10 ngstroms, hechas de
tamao de poro de 300 ngstroms.
etilvinilbenceno entrecruzado en un 55 % con
L76 Material de intercambio catinico dbil a base
divinilbenceno con un recubrimiento de ltex
de slice, 5 m de dimetro. El sustrato es cido
compuesto de microgotas de 85 nm de dimetro
polibutadien-malico polimerizado para proveer
enlazadas con iones de alcanol amonio
funcionalidades de cido carboxlico.
cuaternario (6 %).
Capacidad no menor a 29 Eq/columna.
L62 Fase unida a silano C30 sobre slice esfrica
L77 Resina de intercambio catinico dbil
totalmente porosa, 3-15 m de dimetro.
consistente de etilvinilbenceno entrecruzado en
L63 Teicoplanina unida por medio de mltiples
un 55 % con copolmero de divinilbenceno, 6-
enlaces covalentes a slice esfrica de
9 m de dimetro. La fase estacionaria es
100 ngstroms.
incertada en la superficie del soporte con grupos
L64 Resina de intercambio aninico fuertemente
funcionalizados de cido carboxlico.
bsico consistente de un 8 % de copolmero
Capacidad no menor a 500 Eq/columna (4 mm
entrecruzado de estireno divinilbenceno con un
x 25 cm).
grupo de amonio cuaternario en forma de
L78 Ligando de silano que consiste tanto de una fase
cloruro, 45-80 m de dimetro.
reversa (una cadena alquilo ms larga que C8) y
L65 Resina de intercambio catinico fuertemente
grupos funcionales de intercambio aninico
cido consistente de un 2 % de copolmero
(grupos amino primarios, secundarios, terciarios
sulfonado entrecruzado de estireno
o cuaternarios) unidos de forma qumica a
divinilbenceno con un grupo de cido sulfnico
partculas de slice porosas o no porosas o a
en la forma de hidrgeno, 63-250 m de
micro partculas de cermica, 1.0 a 50 m de
dimetro.
dimetro, o a una estructura monoltica.
L66 Recubrimiento de ter corona sobre un sustrato
de gel de slice de partculas de 5 m de

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 L79 Protena de reconocimiento quiral (Albmina
srica humana) unida de forma qumica a
partculas de slice, alrededor de 5 m de
dimetro.
L80 Partculas de slice, porosas y esfricas
recubiertas con celulosa tris(4-metilbenzoato),
5-20 m de dimetro.
L81 Resina de intercambio aninico fuerte,
hidrxido selectiva, consistente de un ncleo
altamente entrecruzado de partculas porosas de
9 m con un tamao de poro de 2 000
ngstroms y hechas de etilvinilbenceno
entrecruzado con un 55 % de divinilbenceno
con un recubrimiento de ltex hecho de
microcuentas de 70 nm de dimetro
(entrecruzadas en un 6 %) unidas con iones de
alcanol amonio cuaternario.
L82 Poliamina unida qumicamente a polmero de
alcohol polivinilico entrecruzado, 5 m de
dimetro.
L83 Resina de intercambio aninico fuerte,
hidrxido selectiva, amino cuaternaria; enlazada
a partculas de ltex unidas a un ncleo de
partculas microporosas de 10.5 m con un
tamao de poro de 10 ngstroms y consistentes
de etilvinilbenceno entrecruzado con 55 % de
divinilbenceno.
L84 Resina de intercambio catinico dbil
consistente de etilvinilbenceno, entrecruzado en
un 55 % con copolmero de divinilbenceno,
5 m de dimetro. La fase estacionaria es
injertada en la superficie del soporte con grupos
funcionales de cido carboxlico. Capacidad no
menos a 8.400 Eq/columna (5 mm x 25 cm).
L85 Ligando de silano que consiste tanto de una fase
reversa (una cadena alquilo ms larga que C8) y
grupos funcionales de intercambio catinico
dbil (grupos carboxilo) unidos de forma
qumica a partculas porosas o no porosas, 1-
50 m de dimetro.
L86 Un ncleo interno fundido de 5 m con un
ligando altamente polar que posee 5 grupos
hidroxilo fijados a la capa exterior del gel de
slice.
L87 Dodecil silano qumicamente unido a partculas
porosas de slice, 1.5-10 m de dimetro.
L88 Vancomicina unida mediante mltiples enlaces
covalentes a slice esfrica de 100-200
ngstroms.
L89 Empaque con capacidad de separar compuestos
en un rango de peso molecular de 100-3000
(determinado por xido de polietileno), aplicado
a polmeros hidrosolubles neutrales y aninicos.
Una base de resina de polimetacrilato,
entrecruzada con ter polihidroxilado (la
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superficie contiene algunos grupos funcionales
catinicos residuales).
L90 Amilosa tris-[(S)-alfa-metilbencilcarbamato]
recubierta sobre partculas porosas y esfricas
de slice, 3-10 m de dimetro.
L91 Resina de intercambio aninico fuerte
consistente de gotas porosas monodispersas de
poliestireno/divinilbenceno acopladas con
amina cuaternaria. El tamao de gota es de 3-
10 m.
L93 Fase reversa de celulosa tris(3,5-
dimetilfenilcarbamato) , fase estacionaria quiral
recubierta sobre partculas de gel de slice de 3
o 5 m.
L94 Resina de intercambio aninico fuerte
consistente de partculas microporosas de
15 m altamente entrecruzadas funcionalizadas
con ltex entrecruzado (0.5 %) para proveer
sitios de intercambio inico de alcanol amonio
cuaternario.
L95 Ligando de alquilo altamente polar con cinco
grupos hidroxilo unidos de forma qumica a
slice total o superficialmente porosa o a una
estructura monoltica de slice.
L96 Cadena alquilo, fase reversa unida a slice total
o superficialmente porosa diseada para retener
compuestos hidroflicos y polares al usar fases
mviles altamente acuosas, incluyendo 100 %
acuosa. 1.5-10 m.
L97 Resina de intercambio catinico dbil
consistente de un ncleo altamente entrecruzado
de partculas porosas de 5.5 m con tamao de
poro de 2 000 ngstroms y hechas de
etilvinilbenceno entrecruzado con 55 % de
divinilbenceno. La fase estacionaria es injertada
en la superficie del soporte cromatogrfico con
grupos funcionales de cido carboxlico.
Capacidad no menor a 2.400 Eq/columna
(4 mm x 25 cm).
L99 Amilosa tris-(3,5)-dimetilfenilcarbamato,
inmovilizada sobre partculas porosas y
esfricas de slice, 3-5 m de dimetro.
L100 Un ncleo de resina hidrofbico, microporoso,
entrecruzado en un 55 %, (partculas
microporosas de 9 m con tamao de poro de
10 ngstroms) que consiste de una bicapa de
ltex de intercambio aninico y catinico. La
primera capa es ltex totalmente sulfonado
(140 nm) y la segunda capa es ltex totalmente
aminado (76 nm).
L101 Grupos de colesterol unidos a partculas de
slice porosas o no porosas o a micro partculas
de cermica. 1.5-10 m de dimetro, o una
estructura monoltica.
L102 (Naproxeno, [S,S]-O-1)-1-(3,5-
dinitrobenzamido)-1,2,3,4-tetrahidrofenantreno
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 unido de forma covalente a partculas esfricas
y porosas de slice, 5-10 m de dimetro.
e) Registrador de seales. Al emerger un compuesto ya
separado en la columna y pasar por el detector, la seal que
provoca en ste debe ser registrada por un graficador, un inte-
grador o un sistema computarizado de procesamiento de datos.
En el caso del graficador es necesario ajustar la velocidad de
la carta y la ganancia de la seal para obtener un cromatograma
adecuado, y calcular manualmente la intensidad de la
respuesta generada por cada pico. El mtodo ms sencillo de
medicin es mediante la altura de los picos desde la lnea base
hasta el mximo del pico, aunque es deseable tener una lnea
base estable para obtener la mxima precisin. Otros mtodos
de medicin involucran el clculo del rea bajo el pico. Dicha
rea puede calcularse de muy diversas maneras: si el pico es
simtrico puede medirse el rea por triangulacin prolongando
los lados del pico hasta la lnea base midiendo el ancho y la
altura del pico. Otra forma es utilizando un planmetro o bien,
recortando y pesando el rea obtenida.
El uso de integradores electrnicos evita los errores en la
medicin de las reas. Estos integradores registran las seales
e imprimen el rea de los picos en forma numrica.
Por ltimo, el empleo de una computadora y el software
adecuado puede facilitar el procesamiento de los datos, desde
el algoritmo empleado para la integracin, hasta la
construccin de curvas de calibracin y cuantificacin de los
picos. Dichos programas deben cumplir con ciertos criterios
de aseguramiento de la calidad.
APTITUD DEL SISTEMA
Nota: cuando se haga referencia a mtodos cromatogrficos
dentro de las monografas de la Farmacopea y se indiquen los
trminos verificacin del sistema y adecuabilidad del
sistema se entender como aptitud del sistema.
El buen funcionamiento de un sistema cromatogrfico
(lquidos o gases) se ver reflejado en la calidad del anlisis.
Es necesario considerar por esta razn todos los componentes
del sistema (columna, velocidad de flujo, flujo del gas
transportador, temperatura de operacin, entre otros) para
obtener resultados ptimos.
Es conveniente preparar una curva de calibracin a concen-
traciones adecuadas, a las condiciones especificadas para el
frmaco en anlisis, as como inyectar blancos para poder
detectar alguna posible interferencia.
Las especificaciones de la columna y los parmetros del
instrumento en la monografa correspondiente no excluyen
otras condiciones de operacin adecuadas. Las variaciones
normales en el equipo y en los materiales pueden requerir
ajustes de las condiciones experimentales para obtener una
operacin aceptable.
Para asegurar la efectividad del sistema, es necesario
someterlo a una prueba antes de utilizarse. La esencia de este
tipo de pruebas es el concepto de que el equipo en general, las
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partes electrnicas, las operaciones analticas y la muestra,
constituyen un sistema analtico completo el cual puede
someterse a una prueba general de funcionamiento del sistema.
Se pueden obtener datos especficos de inyecciones
repetidas (no menos de seis inyecciones) de una preparacin
ya sea de la muestra, de la SRef o del estndar interno.
Estos datos pueden ser comparados con valores mximos y
mnimos especificados tales como eficiencia, precisin inter-
na, resolucin, tiempo de retencin, naturaleza de la curva
de calibracin, respuesta y recobros (entre otros parmetros), de
acuerdo a lo especificado en las monografas individuales.
El parmetro ms til es la reproducibilidad de inyecciones
repetidas de la solucin analtica mezclada con la solucin de
estndar interno, preparadas a partir de la SRef como se indica
en la monografa individual. La reproducibilidad de las
inyecciones repetidas se expresa como el coeficiente de variacin
de acuerdo con la siguiente frmula:
100 =1( )2
=
1
Donde:
CV = Coeficiente de variacin expresado en %.
= Media de una serie de n determinaciones.
Xi = Medida individual.
Cuando se utiliza el estndar interno la Xi usualmente se
refiere a la medida del rea relativa, (As):
= =
Donde:
ar = rea del pico correspondiente a la sustancia problema.
ai = rea del pico correspondiente al estndar interno.
Cuando se utiliza la altura de pico para la cuantificacin,
la medida Xi, indica la altura relativa, (Hs), donde hr es la
altura del pico correspondiente a la sustancia problema y hi es
la altura del pico correspondiente a la referencia interna.
= =
Algunas veces es til establecer un factor de coleo para limitar
el mximo permisible con relacin a la asimetra del pico
(figura 0241.3). Para propsitos farmacopeicos, el factor de
coleo T, se define como la relacin de la distancia del ancho
del pico, W0.05, dividido entre dos veces la distancia, f, del
mximo del pico hacia el lado izquierdo del pico. Estas
distancias deben medirse a un punto que corresponda a un 5 %
de la altura partiendo de la lnea base. Para un pico simtrico
el factor de coleo es la unidad y el valor de T aumenta
conforme el coleo va siendo ms pronunciado.
El clculo se expresa por la frmula y la figura 0241.3:
= = 0.05 2
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 Figura 0241.3. Pico cromatogrfico asimtrico.
Una medida de la eficiencia de una columna en particular se
puede conocer calculando el nmero de platos tericos (N) en
la columna con la siguiente frmula:

= 16 ( )2
Donde:
t = Tiempo de retencin de la sustancia.
W = Ancho de la base del pico obtenido extrapolando los
lados del pico hasta la lnea base, en las mismas
unidades de tiempo que t.
El valor de N es dependiente de la sustancia que est siendo
analizada y de las condiciones de operacin tales como la
velocidad de flujo, la temperatura, la cantidad del empaque de
la columna y la uniformidad de ste.
Como una medida de la eficiencia de la separacin de dos
componentes en una mezcla, la resolucin, R, se determina por
la siguiente frmula:
= 2[(2 1 )(2 + 1 )]
Donde:
t2 y t1 = Tiempos de retencin para los componentes.
W2 y W1 = Anchos correspondientes de las bases de los picos
obtenidos extrapolando los lados de los picos hasta la
lnea base.
El factor de resolucin (R) es importante para asegurar la
separacin de dos componentes que eluyen muy cercano uno
del otro y para establecer la eficiencia del sistema.
Los valores de aceptacin de cada uno de los parmetros para
la aptitud del sistema debern ser establecidos de manera
experimental.

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