BIOTRANSFORMACIONES II

a
Vanessa Amazo Walteros 14219008, bIsabella Avila Arango 14120001
a
vaneaw_806@hotmail.com, bisabella.avila@correo.icesi.edu.co
a y b Universidad Icesi, Facultad de ingeniera, Programa Ingeniera Bioqumica,
Introduccin a Ingeniera Bioqumica
Santiago de Cali, Colombia
Noviembre 11, 2016-2
Prctica de laboratorio N 2

1. RESULTADOS

La metodologa utilizada en la prctica aadieron a botellas de vidrio con tapn.

fue la reportada por CAICEDO1.
En la presente prctica, se llev a cabo la
realizacin de una serie de procesos de
fermentacin como los procesos de
biotransformacin para distinguir en
ambos casos los agentes de
transformacin. En el cual, se emplearon
suspensiones de esporas y micelio de los
hongos Pleurotus ostreatus y Pleurotus
Sajor-caju como inculos, para fermentar
cscaras de chontaduro como sustrato y
producir un extracto enzimtico.
Cada medio fue esterilizado 15 min a 1
atm y a una temperatura de 115 C.
En segundo lugar, se tomaron 4 mL de
suspensin de cada solucin estril de
esporas y micelio de cada hongo en
solucin de Tween 80(0.003%) y bajo
cabina de flujo laminar se inoculo cada
una de las botellas de vidrio con trigo
previamente esterilizado, tal como se
muestra en la figura 1.

Se realizaron tres etapas importantes, la

primera fue el procedimiento del medio
de cultivo para cada hongo, la segunda
etapa fue la inoculacin y
biotransformacin, y por ltimo se realiz
el seguimiento y separacin, cabe aclarar
Figura 1. Botellas de vidrio conteniendo
que la primera fase ya se tena lista
medio a base de trigo inoculado con
previamente.
esporas de Pleurotus ostreautus y P.
En primer lugar, se prepararon dos sajor-caju.
medios de nutrientes para cada uno de los
Posteriormente, se dej en incubacin las
hongos, con las cantidades adecuadas, en
botellas durante 15 das a 28 C hasta que
lo cual, se utiliz 20 g de trigo tipo 1 y 90
ver produccin de esporulacin y
mL de buffer fosfato, a continuacin se
cubrimiento del sustrato, como se puede
observar en la figura 2.

Figura 2. Botellas de vidrio conteniendo
medio a base de trigo inoculado con
esporas de Pleurotus ostreautus y P.
sajor-caju. Tercer da de incubacin.
Al finalizar la incubacin, se inici la fase
1, anteriormente mencionada, en la cual
se comenz con el secado de las cascaras
de chontaduro a una temperatura de 80 C
durante 48 horas, y luego el corte de estas
para tener pedazos ms finos.
Se prepar las soluciones para cada
hongo, que contenan las cascaras de
chontaduro y solucin buffer fosfato, que
luego fueron licuadas para obtener un
jugo, como se muestra en la figura 3, y a
continuacin se le agrego Sulfato de
cobre pentahidratado para alcanzar una
concentracin de 0,003 g/L.
Figura 3. Preparacin del medio slido
con cascaras de chontaduro para
fermentacin
Para finalizar esta etapa, se verti 100 mL
de la solucin de chontaduro en cada una
de las botellas de vidrio y se esterilizo 15
min a 1 atm y a 115 C.
A continuacin, se inici la etapa dos, que
correspondi a la biotransformacin de un
medio a base de cscaras de chontaduro
por medio de la fermentacin aerbica.
Donde se tomaron los inculos formados
en las botellas de vidrio de cada hongo,
sealados anteriormente, y se aadieron a
los medios de chontaduro previamente
realizados, proceso llamado inoculacin,
cabe aclarar que cada hongo fue
transferido a una nueva botella de medio
de chontaduro. Luego de estos pasos, se
procedi a incubar en bao termostatado
a 30 C, las dos botellas de cada hongo y
las botellas de donde fue retirado el
inoculo, llamada control, como se
muestra en la figura 4.
Figura 4. Inoculacin y
biotransformacin para el hongo de
Pleurotus ostreautus y el hongo P. sajor-
caju (por separado), y los controles.
A continuacin, se encuentran las de trigo y parte
observaciones tomadas de los inculos ocre (acuosa).
formados por cada hongo, en la tabla 1.

Tabla 1. Observaciones encontradas en Siguiendo la metodologa planteada por

las botellas de trigo CAICEDO1, se hizo el seguimiento
adecuado a las cuatro botellas, en el cual
Cambios Cambios dos de ellas eran las inoculadas.
Hongo
fsicos qumicos Observamos los siguientes cambios a los
-Color caf tres das siguientes que se inocul:
transparentoso.
-No se
-No se Encontramos que la botella con el hongo
evidencia zeta.
evidencia Pleurotus Sajor-caju, estaba empezando a
Para obtener
porque no formar un hongo con morfologa
dicha
hubo Pleurotus. Mientras que en la botella con
morfologa, se
Pleurotu medicin de el hongo Pleurotus ostreatus el
debera esperar
s pH, y no se crecimiento fue lento y mnimo. Hasta
unos 20 das.
ostreatus puede sacar. que dej de crecer. Por todo lo anterior, es
-Tamao del
(PO) En este caso importante resaltar que en las cuatro
hongo ms
no botellas, encontrbamos su olor particular
voluminoso.
-Se evidencian encontramos a chontaduro, y presentando una
tres fases: un cambio diferencia de fases; lquido y slido.
blanca, pared qumico.
Se procede con la etapa final de esta
de trigo y parte
prctica, donde se realizan dos
ocre (acuosa).
filtraciones. La primera filtracin dio una
Pleurotu -Color caf -No se
torta slida, como se muestra en la figura
s Sajor- transparentoso. evidencia
-No se 5, y el filtrado lquido, como se muestra
caju porque no
(PSC) evidencia zeta. en la figura 6, en la cual se utiliz
hubo
Para obtener filtro de caf no 4. Entre 20-25 micras.
medicin de
dicha Posteriormente se le mide el pH para
pH, y no se
morfologa, se notar que su pH segua contante y sin
puede sacar.
debera esperar cambios, como se muestra en la figura 7.
En este caso
unos 20 das. no
-Presencia de encontramos
micelios y un cambio
esporas. qumico.
-Se evidencian
tres fases:
blanca, pared
 Figura 5. Torta solida de la primera Figura 8. Filtrado liquido de la segunda
filtracin. filtracin.

2. ANALISIS DE RESULTADOS

Figura 6. Filtrado liquido de la primera

filtracin.

3. CONCLUSIONES
El almidn es un
componente muy
importante de las cascaras
de chontaduro (57,5% de
la composicin total) y al
afectar la concentracin de
este se alteran las
Figura 7. Medicin de pH, despus de
caractersticas fsicas (olor,
generar las mezclas.
sabor, color) y qumicas
(pH) del sustrato.
Posteriormente, se realiz una segunda
filtracin que dio una torta slida, como
se muestra en la figura 8, en el papel
Filtro whatman entre 8-10 micras, y el Las especies de hongos
filtrado lquido, como se muestra en la Pleoreoutus Ostreautus y Sajor-
figura 8, en el vaso de precipitado. caju tienen la capacidad de
degradar el almidn contenido en
las cascaras de chontaduro y
transformarlo a glucosa (a travs
del proceso de hidrolisis
enzimtica). Debido a este
importante factor es posible
determinar que este medio es
adecuado para el crecimiento del
hongo.
 Es necesario que el medio Cali: Universidad Icesi, Facultad
no sea completamente de ingeniera, laboratorio de
aislado del entorno, con el Introduccin a la Ingeniera
fin de que sea posible el Bioqumica. 2016. P. 1-10.
intercambio de gases
(oxgeno y dixido de
carbono), el cual es
2. PLASCENCIA DAZ, Daniel.
necesario para que el
DESARROLLO DE UN
hongo pueda realizar su
INCULO CON
fase de crecimiento
DIFERENTES SUSTRATOS
completa. MEDIANTE
FERMENTACIN SLIDA
SUMERGIDA. Universidad
4. BIBLIOGRAFIA Autnoma de
1. CAICEDO ORTEGA, Nelson. Chihuahua,Chih. Mxico.
Practica 2: Junio, 2009.
BIOTRANFORMACIONES II.
 7.2. Realice un cuadro comparativo entre el bioproceso de bioconversin (clulas
completas de Saccharomyces cerevisiae) y el de cultivo de clulas fngicas. Tenga en
cuenta entre otros aspectos los siguientes: Tipo de reaccin, tiempo de reaccin, sustratos,
facilidad de medicin de variables y control, separacin del producto, operacin de los
bioreactores.

Transformacin enzimtica Fermentacin

Tipo de reaccin Sntesis Es diferente por la liberacin de CO2 y la
presencia de dos microorganismos
(hongos).
Tiempo de 1 hora 2 das
reaccin
Sustratos Miel B, Jarabe de Glucosa y Vinaza Cscaras de chontaduro y el trigo tipo 1
facilidad de Muy poca. Solo se puede regular la Ms manejable. Regular la temperatura,
medicin de presin y la temperatura monitoreo de pH y CO2 y regulacin de la
variables y agitacin.
control
Separacin del No hubo. Solo interaccin entre la Proceso de filtracin. Obtenemos residuos
producto levadura y el sustrato. slidos, biomasa, medio fermentado y un
lquido remanente con nutrientes que
contiene una pequea cantidad de almidn.
Operacin de los El vaso de vidrio con tapn, El vaso de vidrio con un tapn de algodn
bioreactores controla la presin y permite que y gasa, permitiendo que el bioproceso no
ocurra la transformacin. se contamine.

7.3. A qu razn(es) atribuye las diferencias o similitudes (color, pH, olor) entre los
lquidos filtrados (sobrenadante) obtenidos en cada uno de los tratamientos. Describa por
favor los cambios fsicos y qumicos (pH) que observ en cada lquido (incluyendo el
control).

La principal razn de las diferencias entre el color, pH y olor entre los lquidos filtrados
radica en la descomposicin del almidn del sustrato. La degradacin de este componente
afecta la composicin qumica de las cascaras de chontaduro. Por ejemplo el medio con el
hongo P. Sajor caju tiene un pH ms bajo (4,0), un color ms claro y un olor ms suave
debido a que gran parte del almidn del sustrato fue degradado y convertido en azucares
necesarias para el crecimiento del hongo. Por otro lado el lquido filtrado correspondiente al
hongo P. Ostreautus tena un pH de 5,0, el cual es superior al del P. Sajor caju, debido a
que el almidn degradado durante el corto crecimiento de este hongo fue muy bajo.
Tambin por este motivo el color fue un poco ms oscuro y el olor ms intenso. Finalmente
las caractersticas del lquido filtrado del control en cuanto a pH y color son muy similares
al del lquido del P. Ostreautus. Sin embargo debido a que el medio se contamin, su olor
fue mucho ms fuerte y muy similar al del etanol.

7.4. Si usted necesitase monitorear algunas variables del medio bajo condiciones de
fermentacin a lo largo del tiempo de incubacin, que modificaciones hara al bioreactor
que emplea.

Es necesario que muchas variables sean controladas durante el bioproceso. Una alternativa,
para que esto sea posible, es modificar el bioreactor utilizando diferentes herramientas que
permitan monitorear la temperatura, el pH de la reaccin, el tiempo, el intercambio de gases
y la interaccin entre el agente de biotransformacin y el sustrato.
La temperatura es posible controlarla mediante el empleo de un material aislante en
la fabricacin del recipiente donde ocurre la reaccin. De manera que la temperatura
permanece constante durante todo el proceso. Otra alternativa es instalar una
especie de refrigerador en el bioreactor que tenga un rango de temperatura
pertinente para cada tipo de reaccin. De esta manera se podr conservar la
temperatura del medio.
Con respecto al pH se debe crear un sistema integrado por un electrodo, un
transmisor y una bomba dosificadora. El primero es el encargado de detectar el pH
de la reaccin. El transmisor debe informar a la bomba dosificadora si existe una
anomala o modificacin del pH. Si existe, la bomba debe proporcionar una
sustancia acida o alcalina (depende de la situacin) que contrarreste la acidez o
alcalinidad del medio y logre nuevamente alcanzar el pH deseado.
El tiempo es otra variable que es importante de determinar. Para asegurar que la
reaccin ocurra nicamente durante un tiempo establecido se debe implementar un
cronometro que indique el momento y la frecuencia con el que el bioreactor debe
apagarse o encenderse.
Para lograr el intercambio de gases con el medio ambiente se debe crear un filtro en
una parte del bioreactor que permita la salida y entrada de gases en este. Es
necesario definir que el filtro est compuesto por materiales como el algodn que
permiten este intercambio pero de manera regulada.
Finalmente la interaccin entre el agente de biotransformacin y el sustrato debe ser
regulada mediante la agitacin del medio, ya que los agentes se ubican normalmente
en la superficie del medio y el sustrato tiene la tendencia a acentuarse en el fondo de
este. Por este motivo se debe crear un sistema de agitacin que tenga diferentes
velocidades y se pueda ajustar dicha opcin dependiendo de la reaccin.
7.5. Detalle para cada bioproceso los factores ambientales que pudieron afectar el
desempeo de cada agente de biotransformacin. Cuales fueron medidos, cules
controlados?

Los factores ambientales que afectaron el bioproceso de la levadura fermentada fueron el

pH, la temperatura y la presin. El pH fue un factor ya que la fermentacin se debe realizar
entre un rango de 2.5 y un mnimo de 8.0 a 8.5 mximo. Para que el desempeo de la
levadura sea la correcta, se deben efectuar bajo estos valores. El bajo grado de acidez no
permite que el agente patgeno se desarrolle, lo cual puede ocasionar que cambie la
composicin de la levadura.

La temperatura, hace parte de esos factores ambientales que afectaron el bioproceso de la

levadura porque la fermentacin es una reaccin exotrmica de calor que contribuye con el
aumento de la temperatura. Cuando esta temperatura disminuye o aumenta por encima de
los rangos establecidos la fermentacin no se realiza de la manera correcta. La presin
tambin es un gran factor ya que cuando la presin aumenta esto trae como consecuencia
que la actividad celular disminuya.

En los hongos afecta igualmente el pH cuando este mismo sobrepasa los rangos de acidez o
de basicidad. Tambin se contaminan al igual que cuando no cumple con la temperatura
adecuada y la presin, estos factores son de gran importancia para que se cumpla
adecuadamente la fermentacin y as poder evitar la contaminacin del hongo.

7.6. Qu otras alternativas diferentes de bioproceso propondra Usted para el

aprovechamiento de estos residuos agroindustriales empleados en esta prctica. Busque en
internet y presente sus propuestas (dos mnimo) bajo un esquema de diagrama de entradas y
salidas que contengan todos los elementos (sustrato, agente de transformacin, productos).
Las reacciones qumicas no son obligatorias.

La fermentacin solida puede ser definida como un cultivo de microorganismos adheridos a

un soporte solido poroso y humedecido en el cual el medio liquido est extendido en una
capa muy fina en contacto con una interface area. Las bacterias, levaduras y hongos son
los microorganismos que pueden crecer en fermentacin slida.2

De acuerdo a la literatura, la segunda parte de la prctica se considera un bioproceso por la

fermentacin anteriormente mencionada, debido a que los hongos utilizados tienen esa
caracterstica fundamental de poder crecer en este tipo de fermentacin. El modelo de
crecimiento de micelios da una ventaja adicional a los hongos sobre los microorganismos
unicelulares en la utilizacin de los nutrientes del medio de cultivo. Adems otra razn
importante, son las enzimas. Estas son excretadas por las puntas de las hifas sin que se
diluyan como sucede en otros tipos de fermentacin, como lo es en la lquida. Finalmente,
estas enzimas permiten penetrar en los sustratos slidos que en este caso fue en las cscaras
de chontaduro, aumentando su disponibilidad de nutrientes al interior de sus cscaras.