Nmero de la prctica: 3

Tema de la pctica:PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA

Objetivos:
Conocer y aplicar las tcnicas para el estudio de la sensibilidad antibitica.
Realizar la tcnica de Difusin en disco y E-test

1. Fundamento terico

Introduccin
El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las
funciones ms importantes de los laboratorios de microbiologa clnica. Su realizacin se
desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad, cuyo principal objetivo es evaluar en el
laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos, traduciendo, en
una primera aproximacin, su resultado como factor predictivo de la eficacia clnica.

La prueba de susceptibilidad define la actividad in vitro de un antibitico frente a un

microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una
bacteria o poblacin bacteriana.

Su resultado, la farmacologa del antimicrobiano, en particular en el lugar de la infeccin, y los

aspectos clnicos del paciente y de su infeccin, sustentan la eleccin de los antimicrobianos en
el tratamiento de las enfermedades infecciosas.

Los ensayos de sensibilidad han de estar convenientemente normalizados y sujetos a procesos

de control que aseguren su reproducibilidad. Por el momento no existe un mtodo universal
que reproduzca las condiciones en las que se encuentra un microorganismo produciendo una
infeccin y, por tanto, la situacin ideal en las que deben desarrollarse las pruebas de
sensibilidad.

MTODOS DE DIFUSIN

Mtodo de Kirby-Bauer (difusin en disco)

Fundamento
El mtodo basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es uno de los mtodos que el
National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), ahora llamado Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI) recomienda para la determinacin de la sensibilidad
bacteriana a los antimicrobianos.

Consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de petri previamente inoculada con
el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes antibiticos. Tan
pronto el disco impregnado de antibitico se pone en contacto con la superficie hmeda del
agar, el filtro absorbe agua y el antibitico difunde al agar. El antibitico difunde radialmente a
travs del espesor del agar a partir del disco formndose un gradiente de concentracin.
Transcurridas 18-24 horas de incubacin los discos aparecen rodeados por una zona de
inhibicin.
La concentracin de antibitico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias
inhibidas se conoce como concentracin crtica y se aproxima a la concentracin mnima
inhibitoria (CMI) obtenida por mtodos de dilucin.

Sin embargo, los mtodos disco-placa no permiten una lectura directa del valor de la CMI. Para
cuantificarla, basta con haber contrastado previamente el sistema disco-placa con un gran
nmero de cepas de CMI conocidas que han estado previamente determinadas por otros
mtodos de determinacin de la sensibilidad a los antimicrobianos (ej.: mtodo de dilucin).
Esta determinacin se realiza con cientos de bacterias para minimizar errores.
Se mide el dimetro de la zona de inhibicin obtenida por cada una de tales cepas y se grafica
dicha medida frente a la CMI, obtenindose la lnea de regresin o "recta de concordancia" que
proporciona la correspondencia entre las CMI y los dimetros de inhibicin. Para determinar la
CMI de una cepa se procede a medir el dimetro de la zona de inhibicin y luego extrapolarlo
en el grfico para obtener la CMI. Existen, por tanto, unos dimetros de inhibicin, expresados
en mm, estandarizados para cada antimicrobiano.

La lectura de los halos de inhibicin debe interpretarse como sensible (S), intermedia (I) o
resistente (R) segn las categoras establecidas por el CLSI.

Control de calidad: Indicaciones y limitaciones

La prueba de susceptibilidad est indicado cuando se asla una bacteria responsable de un
proceso infeccioso y no puede predecirse su sensibilidad, especialmente si se sabe que este
tipo de bacteria puede presentar resistencia a los antimicrobianos ms habituales.
Estas pruebas de sensibilidad tambin son tiles en estudios epidemiolgicos ya que el
resultado puede ser considerado como el primer marcador epidemiolgico de que se dispone.

El mtodo de disco-placa es fcil de realizar, rpido y barato. Es una metodologa aplicable a

una amplia variedad de bacterias, fundamentalmente bacterias aerobias no exigentes de
crecimiento rpido como Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Stenotrophomonas
maltophilia, Burkholderia cepacia, Acinetobacter spp. , Staphylococcus spp. Y Enterococcus
spp. Adems, con ligeras modificaciones, puede ser aplicado a Haemophilus spp., Neisseria
gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus spp.

Estandarizacin:
Materiales:
Tubos con suero fisiolgico (0,85 g de NaCl en 100 ml de agua destilada estril), o
caldo Mueller-Hinton.
Medio de cultivo. Generalmente se utiliza agar Mueller-Hinton, regulado en su
concentracin de iones divalentes Mg2+ y Ca2+).

Cationes divalentes: El medio Mueller Hinton posee una concentracin baja de iones
divalentes y debe ser suplementado para obtener concentraciones fisiolgicas (20 a 35 g/litro
de Mg2+ y 50 a 100 g/litro Ca2+).
La variacin en cationes divalentes, principalmente Magnesio y Calcio, afecta los resultados de
ensayo de aminoglicosidos y tetraciclinas con cepas de Pseudomonas aeruginosa. Un
contenido excesivo de cationes reduce el tamao de las zonas, mientras que el bajo contenido
podra resultar en un tamao inaceptable de la zona de inhibicin.
Se prueba con la cepa P. aeruginosa ATCC 27853 con gentamicina (10ug) y debe dar una
lectura de 16 - 21 mm.

pH: El pH del medio debe ajustarse entre 7,2-7,4.

Si el pH es muy bajo, ciertas drogas parecera que pierden potencia (por ej. aminoglicsidos,
quinolonas y macrlidos), mientras otros agentes pueden presentar excesiva actividad (por ej.
tetraciclinas). Si el pH es muy alto, puede esperarse efectos opuestos.
El pH puede ser controlado por ejemplo separando una cantidad suficiente de agar en un vaso
de pecipitacin, esperar que este gelifique y sumergir la punta del electrodo. (el resto del medio
se mantiene a 70C) hasta ajustar el pH.
El ajuste se realiza con HCl o NaOH a una concentracin 0.1 N y estriles.

Timina y Timidina: El medio que contiene excesiva cantidad de Timidina o Timina puede
invertir los efectos inhibitorios de sulfonamidas y trimetoprim, dando zonas ms pequeas,
menos ntidas o ninguna zona., lo que podra resultar en un falso informe de resistencia.

El agar Mueller - Hinton a usar debe ser de tan bajo contenido en Timidina como sea posible.
Para evaluar un nuevo lote de agar se utiliza la cepa Enterococcus faecalis ATCC 29212, o
alternativamente; Enterococcus faecalis ATCC 33186 con discos de trimetoprim /
sulfametoxazole. Un medio satisfactorio dar esencialmente zonas ntidas de inhibicin de 20
mm.

Espesor: El espesor del agar en las placas de petri debe ser de 4 mm, lo que se logra con un
volumen de AMH de 60mL a 70 mL de medio para placas de 150 mm de dimetro, y de 25 mL
a 30 mL para placas de 85-100 mm de dimetro interno.
Cuando existe un espesor mayor a 4mm del agar se genera un dimetro de halo de inhibicin
menor (falsa resistencia), mientras que un espesor menor a 4mm se genera un dimetro de
halo de inhibicin mayor (falsa sensibilidad).

Humedad: El medio debe dejarse a temperatura ambiente unas dos horas antes de utilizarlo.
Si existe agua en la superficie del agar, las placas pueden colocarse en el incubador a 35C
durante unos 30 minutos con la tapa ligeramente entreabierta.

Control de crecimiento y de esterilidad: Cada vez que se prepara un nuevo lote se debe
realizar un control de crecimiento, para ello se siembra en cuadrantes una cepa ATCC de
rpido crecimiento, se incuba y a las 24 horas debe existir un crecimiento satisfactorio hasta la
4 estra.
Para controlar la esterilidad se cololoca el 10% del lote preparado en la incubado por 24 horas,
el crecimiento de una sola colonia a las 24 horas indica contaminacin y todo el lote debe ser
desechado.

Discos de antibiticos. Se deben guardar 8a 4C y dejarlos a temperatura ambiente 1

hora antes de utilizarlos. Los discos se congelarn si son antimicrobianos beta-
lactmicos y ha de transcurrir ms de una semana hasta su utilizacin. Por regla
general, se recomienda reemplazar los discos de beta-lactmicos que estn
refrigerados con aquellos que se encuentran congelados. El deterioro de los discos
ocurre si son sometidos a humedad o a frecuentes fluctuaciones de temperatura. En el
caso de utilizar dispensador, ste debe tener una tapa muy ajustada y un desecante,
que ser substituido cuando por exceso de humedad cambie de color el indicador.

Mtodo
Para la determinacin del antibiograma discoplaca en estafilococos, enterococos,
enterobacterias y bacilos gram-negativos no fermentadores utilizamos el siguiente
procedimiento:

Preparacin del inculo

Mtodo del medio de cultivo lquido: Coger de 3 a 5 colonias iguales de la placa de cultivo
de 18 a 24 horas y sembrarlas en 5 ml de un medio lquido (Brain-Heart, Todd Hewitt, Tripticasa
soja, caldo Mueller Hinton) e incubar en la estufa a 35C durante 2 a 6 horas hasta conseguir
una turbidez del 0.5 de la escala de MacFarland. Si la turbidez es superior se realiza el ajuste
necesario con suero salino estril.

Mtodo de suspensin directa de colonias: A partir de una placa de cultivo de 18 a 24 horas

coger varias colonias con un asa y ajustar el inculo a una turbidez equivalente al 0.5 de la
escala de MacFarland en suero fisiolgico. Agitar en un agitador "vortex" durante 15-20
segundos.
Se recomienda utilizar el primer mtodo si el cultivo tiene ms de 24 horas de incubacin. El
segundo mtodo es el ms adecuado para microorganismos de crecimiento difcil en medios
lquidos (Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, S. pneumoniae, estrepococos no enterococos,
Listeria, Moraxella y Corynebacterium spp.) y para estafilococos en los que se quiera detectar
la resistencia a oxacilina.

Control del inculo: Se utiliza una escala MacFarland 0.5. Para prepararlo se emplea 0.5 ml
de 0.048 M de BaCl2 (1,175% BaCl2+2H2O) en 99,5 ml de 0.18 M H2SO4 (1% v/v) con
agitacin constante. La absorcin a 625 nm ha de estar entre 0.08 y 0.10 (comprobar cada
mes). Alcuotas de 4 a 6 ml se distribuyen en tubos con tapn de rosca y se guardan en la
oscuridad a temperatura ambiente.

Inoculacin de las placas.

Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inculo, introducir un hisopo estril
dentro de la suspensin y al retirarlo rotar varias veces contra la pared del tubo por encima del
nivel del lquido con la finalidad de eliminar el exceso de inculo.

Inocular las placas de Mueller-Hinton completamente, sin dejar ninguna zona libre. Esto se
consigue deslizando el hisopo por la superficie del agar tres veces, rotando la placa unos 60
cada vez y pasndola por ltimo por la periferia del agar para conseguir una siembra uniforme.
Dejar secar de 3 a 5 minutos antes de depositar los discos.

Dispensacin de los discos.

La seleccin final de qu antibiticos deben ser estudiados depender del Laboratorio de

Microbiologa
Los antimicrobianos recomendados por el CLSI se encuentran agrupados en cuatro grupos
segn el trabajo de Washington.
En el grupo A se encuentran aquellos antimicrobianos que se han de ensayar y que
deben ser informados de forma rutinaria.
El grupo B est constituido por antimicrobianos que pueden ser valorados de forma
rutinaria, pero cuya informacin se efectuar de forma selectiva; es decir,
solamente se informarn si los del grupo A no son activos, no son apropiados para
un lugar determinado de la infeccin, o si se constata un fallo teraputico con el
grupo A.
En el grupo C estn incluidos los antibiticos que sern estudiados cuando
aparezcan problemas especficos de resistencia, por ejemplo, brotes epidmicos,
en pacientes con alergia a otros antibiticos o en infecciones inusuales.
El grupo D, se destina a antimicrobianos utilizados en infecciones del tracto
urinario.
El CLSI tambin establece recomendaciones segn el tipo de microorganismo e infeccin.

Colocar los discos con los dispensadores o manualmente con pinzas estriles, mximo 15
minutos despus de realizado la inoculacin en el agar. Debe asegurase que contacten
perfectamente con la superficie del agar, por lo que deben presionarse ligeramente sobre la
superficie del agar. No deben situarse a menos de 15 mm del borde de la placa, y han de estar
distribuidos de forma que no se produzca superposicin de los halos de inhibicin (20 mm de
borde a borde de cada disco). Para placas de 150 mm no se emplearn ms de 12 discos y
para las de 100 mm no ms de 6.
Verificar si existe alguna distribucin caracterstica especfica para la bsqueda de mecanismos
de resistencia. (BLEE, carbapenemasas, Metilasa, etc.)

Incubar las placas invertidas (agar en la parte superior), en grupos no superiores a 5 placas, a
35C en atmsfera aerbica antes de que transcurran 15 minutos.
Las placas se incubarn 16-18 horas (con estafilococos sensibles a meticilina debe prolongarse
la incubacin hasta 24 horas para confirmar la ausencia de resistencia a la meticilina).
 Lectura de los resultados.
Despus de 18 horas de incubacin leer el dimetro de las zonas de completa inhibicin con un
pie de rey o regla estandarizada. Si el microorganismo es un estafilococo o un enterococo
debemos esperar 24 horas para asegurar la sensibilidad a la oxacilina y vancomicina.
Las zonas de los medios transparentes se miden sobre el reverso de la placa y los medios que
contienen sangre sobre la superficie del agar. En las pruebas de sensibilidad a meticilina en
estafilococos el halo alrededor de la oxacilina debe observarse utilizando luz transmitida para
visualizar las colonias diminutas.

Cuando aparecen colonias dentro del halo de inhibicin, puede tratarse de mutantes
resistentes, contaminaciones, poblaciones heterogneas o cultivos mixtos y conviene volver a
identificarlas y realizar otra vez el ensayo de sensibilidad antimicrobiana. Como regla general,
no debe considerarse aquellas colonias diminutas que aparecen en el halo de inhibicin y que
han sido visualizadas mediante luz transmitida o con ayuda de una lupa, a excepcin de
estafilococos resistentes a oxacilina o enterococos resistentes a vancomicina.

Interpretacin de resultados:
La interpretacin de los resultados se realiza en funcin de las normas del CLSI.
Comparando los dimetros del halo de inhibicin con las CMIs, y estableciendo
las correspondientes rectas de regresin, se han fijado unos criterios para clasificar las cepas
estudiadas.
De esta forma se han fijado tres categoras: sensible (S), intermedia (I) y resistentes (R).

El trmino sensible indica que la infeccin ocasionada por la cepa para la que se ha
determinado la CMI o su correspondiente halo de inhibicin puede tratarse de forma adecuada
empleando las dosis habituales de antimicrobiano, en funcin del tipo de infeccin y de la
especie considerada.

El trmino intermedio indica que el halo de inhibicin traducido en valores de CMI se aproxima
a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre o tejidos y que puede
esperarse eficacia clnica en aquellas localizaciones en las que se alcanzan altas
cocentraciones de antimicrobiano (p. ej. orina) o cuando se emplean dosis ms elevadas de lo
habitual.
El CLSI tambin incluye en esta categora aquellos casos de antimicrobianos con mrgenes de
toxicidad estrechos en los que pequeos errores tcnicos podran suponer cambios de
interpretacin en la categora clnica.

Finalmente, el trmino resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por

las concentraciones habitualmente alcanzadas en sangre/tejidos del correspondiente
antimicrobiano, o a aquellos microorganismos en los que existen mecanismos de resistencias
especficos para el agente estudiado en los que no ha habido una adecuada respuesta clnica
cuando se ha usado como tratamiento el correspondiente antimicrobiano.

Reporte de resultados.
Los resultados se expresarn como sensible, intermedio o resistente.
Como reglas importantes se debe considerar las cepas de estafilococos resistentes a oxacilina
como resistentes a todos los beta-lactmicos, incluyendo la combinacin beta-lactmico ms
inhibidor de betalactamasas, todas las cefalosporinas, penicilinas y los carbapenems.
Adems se debe mantener cuidado con la edad del paciente sobre todo en el uso de
tetraciclinas, quinolonas y sulfas.

Mtodo del Epsilon test

Fundamento
El principio de este mtodo es una expansin de la tcnica de difusin en disco. En el mtodo
E-test podemos, mediante lectura directa, determinar la concentracin inhibitoria mnima
(CMI).
Consiste en una tira de plstico no poroso de 6 cm de largo por 5 mm de ancho que incorpora
un gradiente predefinido de antimicrobiano equivalente a 15 diluciones.
El protocolo para preparar el inculo es el mismo que para la difusin en disco. Siguiendo el
mtodo de difusin, una vez inoculado la placa de agar con el microorganismo, se coloca la tira
de Etest sobre su superficie, producindose de forma inmediata una difusin del antibitico
desde el soporte hasta el agar, crendose de este modo a lo largo de la tira un gradiente
exponencial de las concentraciones del antimicrobiano. Tras la incubacin de las placas, se
puede observar una zona de inhibicin elipsoidal y simtrica. Despus de la incubacin la CMI
ser el valor obtenido en el punto en el que el extremo de inhibicin intersecciona con la tira.

Indicaciones y limitaciones
En contra de lo que ocurre en la difusin en disco donde la orientacin del disco no importa, si
colocamos la tira al revs no se observa elipse de inhibicin ya que el gradiente de
concentraciones se sita solo sobre una de las caras de la tira.
El E-test se ha utilizado para determinar la CMI de diversos antibiticos en una amplia gamma
de bacterias, incluyendo Helicobacter pylori, Corynebacterium spp., estreptococos
nutricionalmente deficientes, enterococos con resistencia elevada a aminoglicsidos.
.
El E-test se considera como un mtodo alternativo para el estudio cuantitativo de la sensibilidad
antimicrobiana del que cabe destacar su sencillez y buena correlacin con la tcnica estndar
de dilucin en agar para el estudio de la CMI.

Estandarizacin:
Materiales
Tubos con suero fisiolgico (0.85 g de NaCl en 100 ml de agua destilada estril).
Hisopos estriles.
Medio de cultivo. Generalmente se utiliza agar Mueller-Hinton o el apropiado para
la especie bacteriana que se desee ensayar. Los factores del medio de cultivo que
pueden condicionar la CMI son los mismos que se describieron para la tcnica del
antibiograma disco-placa.
Tiras de E-test. Deben almacenarse a - 20C. Es importante tener en cuenta la
fecha de caducidad. En todo momento las tiras de E-test deben estar protegidas de
la humedad. Antes de utilizar se deben atemperar a temperatura ambiente durante
por lo menos 30 minutos.

Mtodo
Preparacin del inculo.
Utilizar la misma metodologa descrita en la tcnica disco-placa.

Inoculacin de las placas.

Utilizar la misma metodologa descrita en la tcnica disco-placa. Dejar absorber el inculo de
10 a 15 minutos para asegurarse que la superficie del agar est completamente seca antes de
aplicar las tiras. Este punto es crtico para optimizar la realizacin del E-test.

Dispensacin de las tiras.

Tanto si se utiliza el aplicador de las tiras como las pinzas, nos debemos asegurar que la escala
de CMI est orientada hacia arriba y que la concentracin mxima est cercana al extremo de
la placa de petri que la tira contacta completamente con la superficie del agar.
Si es necesario, eliminar las gotas de aire que puedan encontrarse por debajo de la tira
presionndola ligeramente con las pinzas.
Es importante no mover las tiras una vez que han sido colocadas en la superficie del agar ya
que el antibitico empieza a difundir rpidamente.

Cuando se utiliza una placa de petri de 100 mm depositar solo una tira por placa y poner la tira
en el centro de la placa, mientras que cuando se utiliza una placa de 150 mm no se deben
colocar ms de 6 tiras.

Incubacin.
Por regla general las placas son incubadas inmediatamente aunque pueden permanecer varias
horas sin incubacin sin que ello afecte significativamente en la determinacin de la CMI.
Sin embargo, los organismos exigentes deben ser incubados inmediatamente. La temperatura
de incubacin y la atmsfera utilizadas deben ser ptimas para el crecimiento de la especie
bacteriana.

Lectura de los resultados.

Despus del perodo de incubacin, leer la CMI en el punto de interseccin entre el extremo de
inhibicin de la elipse y la tira de E-test.

Cuando el crecimiento tiene lugar a lo largo de toda la tira y no se observa formacin de la

elipse de inhibicin, la CMI se informar como superior al valor mximo de la escala de lectura.
Cuando la elipse de inhibicin se encuentre por debajo de la tira debe ser informado como
inferior al valor mnimo de la escala de lectura.
Con ciertas combinaciones de bacterias-antibiticos, el extremo de la elipse de inhibicin puede
ser difuso.

Consideraciones sobre la lectura de los resultados:

1. Cuando la CMI coincide entre dos marcas de la tira se informar el resultado

correspondiente al valor superior.
2. Si se observan intersecciones diferentes del crecimiento bacteriano en ambas partes de la
tira, debemos informar el valor de CMI ms alto si la diferencia entre los dos valores no es
superior a la mitad de un paso de dilucin doble.
3. Para S. maltophilia o Enterococcus spp., pueden aparecer colonias pequeas en la zona de
inhibicin, por lo que se debe considerar como resistente.
4. Cuando se lea la interseccin de la elipse con las tiras de sulfamidas, trimetoprim o
cotrimoxazol, deberemos leer la interseccin en la zona de crecimiento denso y no considerar
la existencia de crecimiento en la zona poco densa.
5. Si se observan colonias grandes en la zona de inhibicin puede representar un cultivo mixto
o variantes resistentes. Debemos repetir el test a partir de colonias del cultivo primario. Si
volvemos a observar el mismo patrn, se tienen que subcultivar las colonias que crecen en la
zona de inhibicin, identificarlas y volver a realizar el Etest.
Si obtenemos el mismo resultado y el cultivo es puro, debemos informar como resistente.

Interpretacin de resultados
Como se ha observado una relacin directamente proporcional entre los valores de E-test y los
valores de referencia de la CLSI obtenidos por dilucin en agar, los puntos de corte de la CMIs
sern apropiados para categorizar la bacteria estudiada como sensible, intermedia o resistente.

Reporte de resultados
Si los resultados con la(s) cepa(s) utilizadas como control de calidad se encuentran dentro del
rango aceptable, la informacin se realizar segn los criterios aplicados a los valores de CMI
obtenidos por los mtodos de dilucin

MTODOS DE DILUCIN

Fundamento
La cuantificacin de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evala habitualmente
mediante alguna de las variantes de los mtodos de dilucin.
Estos mtodos se basan en la determinacin del crecimiento del microorganismo en presencia
de concentraciones crecientes del antimicrobiano, que se encuentra diluido en el medio de
cultivo (caldo o agar).

Los mtodos de dilucin se consideran de referencia para la determinacin cuantitativa de la

actividad de los antimicrobianos. Son los mtodos indicados cuando, adems de la actividad
inhibitoria, se quiere determinar tambin la actividad bactericida.
La gran cantidad de variables (dependientes del microorganismo, del medio de cultivo, del
inculo) que influyen en estos mtodos son responsables de oscilaciones en el resultado
finalmente obtenido, por lo que para su correcta evaluacin es necesario que se realicen de
forma estandarizada.

La determinacin de la actividad antimicrobiana mediante tcnicas de dilucin se realiza

utilizando una escala discontinua (habitualmente concentraciones crecientes en base 2 en vez
de una escala continua (como sucede en el mtodo de difusin), por lo que los valores de CMI
reales de un determinado antimicrobiano se encontrarn en algn valor situado entre la CMI
experimentalmente obtenida y la concentracin inmediatamente inferior.

Desde el punto de vista clnico la diferencia entre los valores real y experimental de CMI no
suelen ser trascendentes cuando se trata de concentraciones bajas, pero pueden tener
importancia para las CMIs altas que se acerquen a las concentraciones alcanzables in vivo.

Materiales y Mtodos

Preparacin del antimicrobiano

Los antimicrobianos a usar en las tcnicas de dilucin pueden obtenerse de los
correspondientes fabricantes, o comprarse directamente a ciertas compaas comerciales. Para
los estudios in vitro no es adecuado utilizar las preparaciones de uso clnico, sino que deben
emplearse sustancias valoradas de las que se conozcan la potencia (mg de sustancia pura por
cada mg de sustancia valorada), la fecha de caducidad y el lote de preparacin.

Las concentraciones de antimicrobianos deben prepararse al menos 10 veces ms

concentradas que la concentracin ms alta que se vaya a evaluar, y en todo caso superiores a
1000 mg/l.
Las soluciones de antimicrobianos se deben emplear el mismo da de su preparacin.
Alternativamente, se pueden congelar en alcuotas (usando tubos estriles de vidrio o plstico).
La temperatura ideal para la conservacin de estas soluciones es de al menos -60C, y en todo
caso nunca superior a los -20C. Se acepta que a temperaturas de 60C las soluciones
madres de antimicrobianos son estables, con muy contadas excepciones, durante al menos 6
meses.
El nmero de antimicrobianos a evaluar depender de las directrices de cada laboratorio. En
general, se escoge un representante de un grupo y se asume que la actividad de otros
antimicrobianos del mismo grupo, con igual mecanismo de accin y frente a los que los
mecanismos de resistencia bacteriana son similares, tendrn una actividad igual o muy similar.

Dilucin en agar

En estos mtodos se incorpora el antimicrobiano a evaluar a un medio con agar. El

antimicrobiano se aade cuando el medio an est fundido. Para lograr el rango de dilucin
deseado se prepara una serie de placas, cada una con una determinada concentracin de
antimicrobiano. Las placas se inoculan con un replicador una vez que se haya solidificado el
medio de cultivo.

Medio de cultivo. En la mayora de los casos, el medio de cultivo a emplear es agar Mueller-
Hinton, pero en funcin de los microorganismos y de sus necesidades nutritivas puede ser
adecuado o necesario aadir algn suplemento a este medio, o emplear un medio diferente.
 Preparacin del inculo.
Habitualmente se prepara una suspensin de 108 ufc/ml que posteriormente sediluye 1:10. En
la mayora de los laboratorios esta turbidez se prepara por comparacin visual (o
espectrofotomtrica) con la que corresponde al estndar 0.5 de la escala de MacFarland.
Para la inoculacin se deben preparar las series de placas de modo que se comience
inoculando un control sin antimicrobiano, se contina inoculando a partir de la placa con menor
concentracin de antimicrobiano y se finaliza sembrando una nueva placa de control sin
antimicrobiano. Cada uno de los inculos se debe sembrar en aislamiento en una placa sin
antimicrobiano para comprobar posteriormente la pureza de los mismos, y si fuera necesario
disponer de un cultivo fresco tras la correspondiente incubacin.
Las placas inoculadas se dejarn a temperatura ambiente hasta que las gotas de inculo estn
secas. Posteriormente se incuban a 35C durante 16 a 20 horas y se procede a su lectura.
La CMI es la menor concentracin de antimicrobiano que inhibe completamente el crecimiento
bacteriano (no se considera crecimiento la aparicin de una colonia aislada o de un halo tenue
debido al propio inculo). Ocasionalmente pueden verse algunas colonias o franco crecimiento
en concentraciones superiores a la CMI aparente; en estos casos se debe comprobar la pureza
del inculo para descartar una contaminacin; si esta ltima se confirma deber repetirse el
estudio.

Dilucin en caldo
El CLSI recomienda para la mayora de los microorganismos utilizar caldo Mueller-Hinton, al
que se aadirn los suplementos necesarios para asegurar el crecimiento de organismos
exigentes.
El medio debe tener un pH de 7.2 a 7.4 y estar ajustado con Ca2+ (20-25 mg/l) y Mg2+ (10-
12.5 mg/l). Esta cantidad de iones divalentes asegura la reproducibilidad de los valores de CMI
de aminoglucsidos frente a P. aeruginosa y de tetraciclinas frente a la gran mayora de
microorganismos, al compararlos con los que se obtienen con agar Mueller-Hinton.

Existen dos modalidades de los mtodos de dilucin, en las que se utilizan tubos
(macromtodo) o placas de microtitulacin (micromtodo).

Mtodo de macrodilucin.

En el mtodo de macrodilucin se emplea por cada combinacin

microorganismo/antimicrobiano una batera de tubos. Habitualmente se prepara la batera de
tubos con 1ml de medio estril sin antimicrobiano.

Al primero de ellos se aade 1 ml de la solucin inicial del tubo de antimicrobiano hasta

conseguir la concentracin ms alta a estudiar (teniendo en cuenta que este primer paso
supone la dilucin a la mitad de la solucin madre, y que una vez inoculados los tubos, con 1
ml de inculo, se diluir nuevamente la concentracin de antimicrobiano a la mitad). Tras
mezclar adecuadamente, se pasa 1 ml al siguiente tubo; el proceso se repite tantas veces
como diluciones se quieran estudiar, eliminando del ltimo tubo de la serie 1 ml de medio con
antimicrobiano, con objeto de mantener el volumen final de 1 ml.

Para cada paso de dilucin se debe emplear una pipeta diferente. La serie de tubos se
completa con uno de control sin antimicrobiano que solamente tiene 1 ml de caldo.

Mtodo de microdilucin.

En el mtodo de microdilucin cada una de los pocillos de la placa de microtitulacin con

pocillos de fondo en U representa uno de los tubos del mtodo de macrodilucin. Las placas
de microdilucin con diferentes concentraciones de antimicrobianos se pueden preparar en el
propio laboratorio o bien se pueden comprar a diferentes compaas que los suministran
congelados, deshidratados o liofilizados.

En muchos laboratorios el empleo de paneles comerciales se basa en la utilizacin de sistemas

semiautomticos de incubacin-lecturainterpretacin; esto facilita su uso, pero tiene el
inconveniente del incremento del gasto.
 Inoculacin
El inculo en los mtodos de dilucin en caldo se prepara a partir de suspensiones del 0.5 de la
escala de MacFarland, empleando cualquiera de los dos mtodos (crecimiento o suspensin
directa) indicados anteriormente.

El inculo ya diluido debe usarse antes de 15 minutos tras su preparacin.

Los tubos o placas se incubarn a 35C durante 16 a 20 horas.

Tras la incubacin se procede a la lectura de los resultados.

La CMI se define como la menor concentracin de antimicrobiano que a simple vista inhibe
completamente (o el 80% en el caso de las sulfamidas) el crecimiento del microorganismo
estudiado.

La interpretacin de los resultados, que a veces resulta compleja, se facilita tomando como
referencia el crecimiento observado en los tubos o pocillos usados como control positivo.

Correlacin de los resultados. En general, los valores de CMI obtenidos mediante

microdilucin son iguales o una dilucin menor a los que se obtienen por macrodilucin.

PROCEDIMIENTO DE LA PRCTICA
1.Preparacin de medios de cultivo:
a) medios slidos: Agar Mueller Hinton, tomar en cuenta todas las normas para su
preparacin (pH, espesor, humedad, etc).

b) Medios lquidos: Solucin salina estril (tubos tapa rosca de 5 mL cada uno)

2. realizar la prueba de susceptibilidad de una cepa pura e identificada de bacilo gram negativo
de 24 horas de incubacin por el mtodo de difusin en disco siguiendo los protocolos
indicados en el marco terico (inculo, hisopado, colocacin de discos, lecturas, interpretacin
y reporte)

3. Esterilizar y lavar el material contaminado.

CUESTIONARIO
a) Explique que son BLEE, como se producen, clasificacin, importancia, como se
detectan en el laboratorio de microbiologa (en la prueba de susceptibilidad).
b) Explique que son carbapenemasas, como se producen, clasificacin, importancia,
como se detectan en el laboratorio de microbiologa (en la prueba de susceptibilidad).
c) Explique que son las escaleras fenotpicas de resistencia bacteriana, importancia,
como se detectan en el laboratorio de microbiologa (en la prueba de susceptibilidad).