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396 H.

ZAHI~: C h e m i s c h e S y n t h e s e v o n P r o t e i n e n Naturwissenscha/ten

Quart. Rev. Biol. 38, 54 (1963). - - [20] HOLTFREI"ER, J., u. V. 147, t462 (1965). - - [26] GIERER, A.: Nature 212, 1480 (1966). - -
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M. MARQUISE[, S. M. MERILL, J. A. PENSWICK U. A. ZAMIR: Science Eingegangen a m 2 t . Oktober t966

Chemische Synthese von Proteinen


H E L M U T ZAHN

Deutsches Wollforschungsinstitut an der T. H. Aachen*'

Um die Zeit, als der Naturforscher und Philosoph Proteine durch schrittweise Verkntipfung einzelner
LORENZ OI~EN die erste Versammlung Deutscher Aminos~iure-Reste im Sinne yon FISCHERunerreichbar.
Naturforscher und Arzte nach Leipzig fief, wurden
erstmals Aminos/iuren aus Proteinen durch Abbau Zu einer gewissen Hoffnung berechtigte in diesen Jah-
mit S~iuren und Alkalien gewonnen. Aber erst 80 Jahre ren lediglich die Bergmann-Niemann-Regel [7], wo-
sp~iter konnte anl~tl31ich der 74. Versammlung.. der Ge- nach in den Proteinen gleiche Aminos~ure-Reste in
sellschaft Deutscher Naturforscher und Arzte in gleiehen Abst~tllden angeordnet sein sollen. Die an-
Karlsbad am 22. September t902 formuliert werden, scheinend einfache Struktur des Seidenfibroins [8]
wie sich diese Abbauprodukte der Proteine urspriing- als ein Polypeptid, in welchem jede zweite Amino-
lich zu langen Ketten vereinigt hatten, illdem zwischen s~ture aus Glycin-Resten besteht, regte zur Synthese
der Carboxyl-Gruppe der einen Aminos~iure und der yon Nylon ulld Perlon an [9]. Auch wurdell synthe-
Amino-Gruppe der folgenden Aminos~ure unter Was- tische hochmolekulare Polypeptide dargestellt [10],
serabspaltung eine S~iureamid-Bindung entstand. die sich in H~nden yon Forscherll wie BAM~ORD,
Diese Theorie verdanken wir HOFMEISTER [1], da- ELLIOTT [11] und t(ATCI-IALSKI [12] zum Studium
reals Professor Iiir Physiologic an der Universit/it physikalischer Protein-Eigenschaften wie Ketten-
StraBburg. Auf der gleichen Tagung sprach FISCHER faltung und -schraubung, Antigenicit/it ulld Bacteri-
[2] und best~itigte den Gedanken, dab s~iureamid- cidie hervorragend bew~ihrten. Vor wenigen Jahren
artige Gruppen bei der Verbindullg der Aminos~iuren gelang sogar die enzymatische Synthese von Poly-
in der Protein-Molekel die Hauptrolle spielen. Er be- peptiden in zellfreien Systemen in Gegenwart von
torte, dab ihn diese tJberzeugung schon t900 veran- synthetischen Boten-Ribonukleins~iuren [13]. Syn-
laBt babe, die synthetische Verkettung yon Amino- thetische Polypeptide silld daher nfitzliche Modell-
s~iuren zu versuchen. Die dabei gebildeten Produkte verbindungen zur Entzifferung des genetischen Codes
nannte er ,,Polypeptide". Obwohl in der damaligen geworden (vgl. MATTHAEI [14]).
Zeit noch niemand wllBte, in welcher Reihenfolge die Diese neueren Polypeptide haben zwar vor dem
in einem Protein enthaltenen Aminos~iuren mitein- Fischerschen Octadekapeptid den Vorzug, echte
allder verkettet sind, prophezeite FISCHER [3], der Makromolektile zu sein, teilen aber den Mangel, nur
Vater der Peptidchemie, schon t906, dab auch bei aus wenigen, oder auch nur einer Aminos~iure-Art zu
den Proteinen wie auch bei anderen Substanzen der bestehen und darfiber hinaus nicht molekulareinheit-
organischen Chemie eines Tages nicht nut die formel- lich zu sein.
m~il3ige Struktur aufgekl~irt, sondern auch deren Syi1-
these gelingen wiirde. Allerdings hielt er die Proteine
ffir nieht allzugroBe Molekifle. Aus drei Leucin- und Der Weg zur Insulin-Synthese
fiinfzehn Glycin-Resten baute er durch schrittweise
eindeutige Synthese 1907 ein Octadekapeptid [4] und Als im Jahre t95t GANGERzusammen mit dem Wie-
verglich dieses mit nattirlichen Proteinen. Das t Ser ner Biochemiker TuPPY [15] die erste Formel (vgl.
Peptid ist jedoch nur in beschr/inktem MaBe als Fig. t) einer aus einem Proteinmolekiil isolierten Pep-
Modell ftir Proteine verwendbar, da es nut zwei tidkette, der B-Kette aus dem Insulin verSffentlichte,
Aminos~iure-Elemente hat, w~ihrend am Bau eines war nicht nur die Hypothese von MAX BERGMANN
Proteins etwa 20 verschiedene Aminos~iuren beteiligt fiber eine regelm~iBige Reihenfolge tier Aminos~iuren
sind. in den Proteinen endgfiltig widerlegt, sondern auch
Als sp~iter in den dreil3iger Jahren die makromoleku- klar geworden, dab man eine Proteinkette nicht durch
lare Natur der Proteine, insbesondere dank der Ar- Kondensation von vorbereiteten Untereinheiten er-
beiten von SORENSEN [5] und SVEDBERG [6] allge- halter wfirde. Wer die B-Kette, ein Triakontapeptid
mein anerkannt wurde, erschien die Synthese echter synthetisieren wollte, mul3te ihre 16 verschiedenen
* Nach einem Vortrag auf der 104. Versammlung der Gesellschaft Aminos~ture-Bausteine einzeln nach dem Bauplan der
Deutscher Naturforscher und Arzte am 26. September t 966 in Wien. Sanger-Tuppy-Formel miteinander kondensieren.
5i. Jg., Heft 15/16, 1967 H. ZAHN: C h e m i s c h e S y n t h e s e v o n P r o t e i n e n 397

Nun waren vor 1951 lediglich drei kleine, nattirlich sein sollen, voriibergehend ausschalteten und nach
vorkommende Peptide, die Dipeptide Carnosin [16] beendeter Synthese wieder entfernt werden konnten,
und Anserin [17] und das Tripeptid Glutathion [18] ohne dabei die gekntipfte Peptidbindung zu sch~idigen
synthetisiert worden. Daher dachte niemand mehr (vgl. Fig. 6).
ernsthaft an eine Synthese echter Proteine, bis DU
VIGNEAUD t953 [19] die Totalsynthese des Peptid- CI,H9 ?H2SCH2C6H5
hormons Oxytocin aus neun Aminos~ure-Resten und 1~ C H2OCO- NHCHCO- NHCHCO-
Phe-Vat- Asn-Gtn- His- L e u - ~L HBr, CH3C00H
1 2 3 4 5 6
- Cys- Gly- Ser- His- Leu- Vat-
7 8 9 10 1 12
- G l u - A l a - Leu-Tyr - Leu-Val- 9 CI4H9 CH2SCH2CBH5
13 14 15 16 17 18 ~-CH2 Br, CO 2 NH3CHCO-NHCHCO-
- Cys-GLy-Gtu-Arg- Gty- P h e - B~
19 20 21 22 23 24 Fig. 4. Abspaltung einer N-terminalen Benzyloxycarbonyl-Schutz-
- Phe-Tyr-Thr - Pro- Lys-Ala gruppe mit Bromwasserstoff in Eisessig nach BEN-ISHAI und BER-
25 26 27 28 29 30 GER, t952 [24] an einem Cysteinpeptid-Derivatansder B-Kette
Fig. t. Strukturformel der B-Kette des Rinderinsulins nach SANGER des Insulins [85] B 6--8 vgl. oberste Zeile Fig. 3.
und TuPPY t951 [I$]

CH2CsH5 (~-CH2OCO- NHCHCO+


CBH5 NH2CH(C3H7)CO-
- NHCH2COOH NHxCHCO-
+ O
C6Hll N = C = NC6H u

l .CH2CBHs
N02
NHCH2CO- - NHcsco-
-

+
C6H5
>-CH2OCO N H CHCO-N H CH (C3H7) CO -
C6 Hll N H - CO - N H C6H.
HO
Fig. 2. Anwendung der Carbodiimimid-Methode yon SHEEHAN und
HEss, 1955 [Z0] zur Fragmentkondensation einer Carboxyl- mit
einer Amino-Komponente bei der Synthese des Dekapeptids B
2 t - - 3 0 nach SCHNABEL [54]
N02
BZL Fig. 5. Kondensation des p-Nitrophenylesters yon Benzyloxycar-
I
bonylphenylaIanin mit der Valinamino-Gruppe des Heptapeptid-
z-16 7 81-OEt Derivates B 2--8 zum Oktapeptid-Derivat B I - - 8 [35] (vgl. unterste
BZL BZL Zeile Fig. 3)
I l
z-1516 7 81
C3H7 C2HLCONH2
BZL BZL
I I -NHCHCO - NHCHCO - NHCHCO-
z~41sl 6 7 Bi I
C2HCO
BZL BZL
z-lul4l~l
BZL
6 ;
BZL
8 I +CF3cOON[ 6-C(CH3)3
I
C3H7 ?2H4CONH2
z~213141516 ~ 81 -NHCHCO- NHCHCO - NHCHCO-
BZL BZL
I I C2H4COOH
z-111213141s16 7 81 ,~CH2
Fig. 3. Anwendung der Nitrophenylester-Methode y o n BODANSZKY,
t 955 [21] zur gliedweisen Kettenverl/ingerung bei der Synthese des + C-CH3
N-terminalen Oktapeptids B 1--8 [35]
\ell3
die Schliel3ung der Disulfid-Brticke zum cyclischen Fig. 6. Acidolyse des ~-Tertifirbutylesters des Glutamins~ure-Restes
in Position 4 tier synthetischen geschtitzten A-Kette des Schaf-
Hormonmolektil gelang. Diese Pioniertat fiihrte zu insulins dnrch Behandlung mit Trifluoressigs~ure [39]
einem ungeheuren Aufschwung der Peptidchemie.
Neue Methoden zur gezielten Kondensation yon
Aminos~turen wurden erarbeitet. Erw~ihnt seien z.B. Immer l~nger wurden die Peptidketten, die man mit
das Dicyclohexyl-carbodiimid-Verfahren [20] (vgl. diesen und anderen neuen Methoden stufenweise ein-
Fig. 2) und die Nitrophenylester-Methode [21] (vgl. deutig synthetisierte. Schon 19~6 wurde erstmalig ein
Fig. 3 bis 5). Eikosipeptid aus dem ACTH-Molekiil durch BOIS-
Zu der bereits bew~thrten Benzyloxycarbonyl-Gruppe SONNAS 11. Mitarb. [25] synthetisiert. Der HShepunkt
E22] (vgl. Fig. 4) traten neue Schutzgruppen [23], dieser erfolgreichen Periode der Peptidsynthese war
welche diejenigen Funktionen der Aminos~iuren, die ohne Zweifel die 1963 abgeschlossene Totalsynthese
an der geplanten Kondensation yon 0~-Amino und des ganzen ACTH-Molekfils aus 39 Aminos~iure-Resten
e-Carboxyl-Gruppe zur Peptidbindung nicht beteiligt durch SCHWYZERund SIEBER [26].
398 H. ZAHN : Chemische S y n t h e s e v o n P r o t e i n e n Naturwissenscha]ten

Erste Insulin-Synthese Ketten eines Proteinmolekiils synthetisiert sind und


So ist es nicht verwunderlich, dab man in diesen es gelungen ist, diese an den richtigen Stellen mit
ftinfziger Jatlren die M6glichkeit einer chemischen Disulfid-Briicken zu verklammern, so garantiert dies
Proteinsynthese erneut diskutierte, obwohl man vor noch nicht die charakteristische Sekund~ir- und Ter-
t960 als einzige Proteinstruktur IIur die Insulin-For- ti~rstruktur, die jedes Protein im Gegensatz zu den
reel [27] (vgl. Fig. 7) kannte. Aber gerade die Insulin- Polypeptiden besitzt. Es habe also keinen Sinn, so
Formel bot verlockende Aspekte, war doch die A-Kette meinte man damals, die chemisehe Synthese selbst
nur um einen Aminos~iure-Rest l~nger als das Eikosi- eines so kleinen Proteins wie Insulin zu beginnen.
peptid yon BOlSSONI~AS u. Mitarb. und die B-Kette Diese weft verbreitete Meinung wurde um t 960 durch
zwei Forschungsarbeiten in den USA und Kanada
widerlegt. WHITE und ANrlNSEN [30] spalteten das
tetracyclische Molekiil des Enzyms Ribonuclease durch
Reduktion der vier intramolekularen Cystin-Brticken
in eine offene Kette aus t24 Aminos~turen, darunter
S S
acht Cystein-Resten. Als sie auf die verdiinnte LSsung
I
S S
T der reduzierten Kette Sauerstoff einwirken lieBen,
bildete sich unter t05 mSglichen isomeren monomole-
kularen Oxydationsprodukten nur das eine Isomere,
n~tmlich das vollaktive Enzym (Fig. 8). Das heiBt,
dab unter physiologischen Bedingungen ein natives,
biologisch aktives Protein die niedrigste Konforma-
tionsenergie besitzt [31], und dab die gesamte Infor-
mation fiir die Determinierung der dreidimensionalen
Proteinstruktur in den Aminosiiure-Sequenzen der
Fig. 7. Chemisehe Strukturformel des Molekiils des Rinderinsulins entfalteteii Polypeptidketten enthalten ist.
nach SANG~R U. Mitarb. [27]. Zeichnung nach CARPENTER [53]
Abet auch beim Zweikettenmolekt~l Insulin gelang
eine solche Resynthese, obwohl DIXON und WARD-
LAW [32] das Molektfl zuerst in die beiden Buntesalz-
Ketten zerlegten, diese isolierten und reduzierten und
dann erst kombinierten (Fig. 9). Wenn auch die Aus-
beute an Insulin bei diesen ersten Resynthesen nur
1 bis 2% betrug, batten die Autoren mit Recht den
ftir die Proteinsynthese so folgenschweren Satz for-
muliert:
"Even with the present yield it can be said that i/chemi-
cally synthesized A and B chains were available in mg
SH SH SH SH SH SH SH SH amounts it should be possible to obtain insulin by the
I I I I I I I I 124 above method and thereby provide the terminal step in
I 26 40 58 65 72 84 95 110
the total synthesis o/a protein with biological activity".
Fig. 8. Resynthese des Molekfils des Enzyms Ribonuelease aus der
offenen Thiol-Kette (unten) nach WI~IT~ und ANFINSEN [30] Gleichzeitig wurde auch an der Academia Sinica in
Schanghai an der Resynthese yon Insulin gearbeitet.
@ s,. s.. s-s Dort gelang es Do, CHANG, Lu u n d T s o u [33] nicht nur
h6here Ausbeuten an Insulin zu erzielen, sondern
SH SH -SH p S S auch das in den Resyntheseprodukten enthaltene
I~ I ! I, r l I- Hormon in Form von vollaktiveu Kristallen zu ge-
SH- Ketten Insu tin winnen. Der Weg fiir die Totalsynthese des Insulins
Fig. 9. Resynthese des Insulin-Molektils aus Thiol-A- und Thiol-B- war damit vorgezeichnet und wurde yon drei Gruppen,
Kette nach DIXON und WARDLAW [3~] sowie D u e t al. [38]
in den USA und Kanada, in der Volksrepublik China
und in Deutschland mit dem Versuch einer Synthese
sogar kt~rzer als das ACTH-Molekiih Die in der Pep- der ganzen Ketten in Angriff genommen. Dabei er-
tidsynthese wegen ihrer S/iureempfilldlichkeit bzw. gaben sieh dieselben peptid-chemischen Probleme, die
Autoxydation geftirchteten Aminos~uren Tryptophan man in fast identischer Weise 15ste. Es sind dies eine
und Methionin fehlten sogar. Dafiir enthielt Schaf- zweckm~Bige Unterteilung der Ketten in einzelne
insulin nicht weniger als vier Glycin-Reste in giinstigen Fragmente (vgl. Tabelle t), die Wahl der Peptid-
Positionen ffir eine Unterteilung der ganzen Kette in kupplungsmethoden und der Schutzgruppen ffir die
Fragmente, die mSglichst mit Glycin enden sollen. Seitenketten (vgl. Tabelle 2).
Andererseits schien das Problem der formelrichtigen
Synthese der drei Disulfid-Gruppen unl6sbar. DU Tabelle 1. Fragmente /iir die Synthese yon Insulin-Ketten 1963--1965
VIGNEAUD [28] drtickte die Meinung der Peptid-
chemiker richtig aus, als er schrieb, die Synthese der Kette Aachen Pittsburgh Schanghai
Peking
Ketten dtirfte nicht zu schwierig sein, aber das wirk-
liche Problem sei die Kntipfung der drei Disulfid- A ~--9
Bindungen, zwei zwischen den Ketten, eine innerhalb 10--21
der A-Kette. E r selbst butte schon fdiher vergeblich B 1--8 t--9 t-- 8
9--14 10--t3 9--16
versucht, reduziertes Insulin durch vorsichtige 0 x y - 15--20 t4--20 t 7--20
dation zu reaktivieren [29]. Aber selbst wenii die 21 --30 2t --30 21 --30
54. f g . , H e f t 15/16, 1967 H. ZAHN: Chemische Synthese von Proteinen 399

So nimmt es nicht wunder, dal3 gewisse gr613ere Ket- Auf der anderen Seite kritisierten Chemiker die ange-
tenfragmente wie das Katsoyannissehe Nonapeptid wandten Methoden, die zu InsuIin-Ausbeuten von nut
der A-Kette I--9 [84] oder das Aachener Oktapeptid 0,t bis 1,0% gefiihrt batten. Solange man die drei
der B-Kette 1--8 [85] mit unbedeutenden Varianten Disulfid-Brficken nicht nacheinander verknfipft hatte,
auch bei der Synthese in einem der beiden konkur- kSnne man nicht yon einer Synthese, sondern nur yon
rierenden Arbeitskreise eingesetzt wurden, t3berhaupt Insulin-Bildung aus synthetischen Ketten sprechen.
hat die yon AuBenstehenden oft angeprangerte Parai- H~iufig wurde auch die Frage laut, ob die biologische
lelarbeit auch im Falle der Insulin-Synthese deren Aktivit~it der Pr/iparate tats~ichlich von echtem In-
Erfolg entscheidend gefSrdert, well jedes Team aus sulin herrfihre, oder ob nicht schon die einzelnen Ket-
den Publikationen der anderen lernen konnte. ten oder Kettenfragmente eine insulin-/ihnliche Wir-
kung zeigen kSnnten. Diese schwerwiegenden Ein-
Tabelle 2. Bei den Imulin-Synthesen 1963--1965 verwendete Schutz- wfinde schon ein Jahr sp~iter widerlegt zu haben, ist
gruppe~r zur Blockierung yon SeitenkettenJunktionen das Verdienst der chinesischen Forschergruppen, und
damit kommen wir zur Wfirdigung der Erfolge, die
Aachen Pittsburgh China
diese durch ihre Totaisynthese yon Rinderinsulin er-
1964 t965 rungen haben.
Cystein Benzyl
Lysin Tosyl Verbesserung der Synthesen
Histidin Benzyl Durch die ihnen gelungene Resynthese von Insulin
Arginin Tosyl Nitro aus den natfirlichen Ketten ermutigt, konzentrierten
Glutamins~iure t-Butyl Methyl t-Butyl t-Butyl sich die chinesischen Forscher auf die Synthese der
A- und B-Kette. Zwischen t96t und t964 erschienen
zahlreiche Berichte fiber die Synthese der Ketten-
Ohne Zweifel durften KATSOYANNIS U. Mitarb. den fragmente. Die Synthese der beiden Ketten schliefi-
ersten grol3en Erfolg im Sommer t963 [36] ft~r sich lich wurde t964 bewerkstelligt, ebenso wie die Par-
bnchen, ais ihnen die Synthese der ganzen A-Kette tialsynthese yon Rinderinsulin aus synthetischer B-
des Schaf-Insulins gelang, die in den H~inden von und natiirlicher A-Kette sowohl als auch umge-
DIXON und WILSON bei der Kombination mit natfir- kehrt [41]. Die biologische Aktivit~it dieser haibsyn-
licher B-Bette ein insulin-haltiges Pr~tparat lieferte. thetischen Pr~iparate lag zwischen 2 und 4%. Selbst-
Wenn auch der Insulin-Gehalt nach DIXON [87] nut verst~indlich wurde auch die Kombination der syn-
0,26% betrug, so ist es doch diese Arbeitsgruppe ge- thetischen Ketten ausgeffihrt. Da aber das totalsyn-
wesen, der die erste Partialsynthese eines Proteins ge- thetische Proteinpdiparat nur eine leichte biologische
lang. Niemand erwartete oder verlangte t963 schon Aktivit/it besaB, erschien die Extraktion des kristal-
hohe Ausbeuten. Die Frage war vielmehr, ob es fiber- linen Insulins nicht praktikabel. Man sah sich des-
haupt gel~inge, Insulin aus einer synthetischen Kette halb gezwungen, die Arbeitspl~ine ffir die Synthese der
und der nattirlichen Gegenkette im Laboratorium zu Ketten abzu~indern, und insbesondere groBe Frag-
erhalten. mente nicht mehr mit Alkalien zwecks Verseifung yon
Den n~ichsten Erfolg muB man den Mitgliedern des Methylestergruppen zu behandeln. So wurde bei der
Aachener Teams der Jahre t962 und t963 zubilligen, Synthese der A-Kette das schon aus der Aachener
die noch im September t963 [38~ zwar fast alle Ket- Synthese bekannte Dodekapeptid A 10--21 einge-
tenfragmente, aber noch keine einzige Kette beisam- setzt, das keine C-terminale Estergruppe enthielt.
men hatten, und dann in einer Art "concerted team Ferner wurden aile gr6Beren Peptide mit Hilfe tier
reaction" in wenigen Wochen die Synthese beider Azid-Methode synthetisiert, um eine Racemisierung
Ketten, die Abspaitung der Schutzgruppen und die zu vermeiden. Groge Mfihe gait der Verbesserung der
Kombination der beiden synthetischen Ketten zu einzigen Methode zur Abspaltung der Schutzgruppen
einem totalsynthetischen Pr~iparat meisterten, das durch Behandlung mit Natrium in fltissigem Ammo-
immerhin 1% Insulin enthiett. niak, um so eine wirksame Deblockierung bei mini-
Im Dezemberheft 1963 der Zeitschrift ffir Naturfor- maler Sch~idigung der Peptidketten zu erreichen. Die
schung [39] berichteten wir fiber dieses erste vollsyn- aus den verbesserten synthetischen Ketten und ihren
thetische Protein. Wenige Wochen sp~ter publizier- natfirlichen Gegenketten gewonnenen haibsyntheti-
ten im 1. M~irzheft t964 des Journal of the American schen Insuline enthielten bereits 5--t0% des Protein-
Chemical Society KATSOYANNISund seine Mitarb. [40] hormons. Eine Extraktion und Aufarbeitung dieser
ihre Synthese tier B-Kette und die Kombination mit Pr~iparate ergab Kristaile von derselben Aktivit~it wie
der bereits bekannten synthetischen A-Kette zu Rinderinsulin [49].
einem Insulin-Pr~iparat mit biologischer Aktivitiit. Kondensation der synthetischen A-Kette mit der syn-
DIXON hat den Insulingehalt der Kombinationspro- thetischen B-Kette lieferte Rohprodukte, die sich wie
dukte aus den synthetischen Ketten yon KATSOYAN- 1,2 bis 2,5%iges Insulin verhielten. Trotz niedrigen
NIS mit 0,02 und 0,07% angegeben. Insulingehaltes gelang wie bei den halbsynthetischen
Die Resonanz auf die erste Insnlin-Synthese fiel hete- Pr~iparaten die Extraktion und Kristallisation [48].
rogen aus. Einige Arzte waren sich nicht fiber das Damit war erstmals die Darstellung eines syntheti-
Ausmal3 der experimentellen Schwierigkeiten im kla- schen kristallinen Proteins im Laboratorium gelungen.
ren und hofften auf einen sofortigen Einsatz des syn- Die Kristaile des synthetischen Rinderinsulins glichen
thetischen Insulins in der Diabetestherapie, besonders dem Rinderinsulin nicht nur vSllig in bezug auf den
bei solchen Patienten, die gegen natfirliches Insulin Mauskrampf- nnd Kaninchenblntzucker-Test, sondern
allergisch sind. auch hinsichtlich ehemischer Daten wie der Amino-
400 I{. ZAItN: C h e m i s c h e S y n t h e s e v o n P r o t e i n e n Nelurwissenschc~/ten

s~tureanalyse, dem Verhalten bei der Papierchromato- Wenn die Insulin-Synthese lediglich zum wissen-
graphie und Elektrophorese und nieht zuletzt auch schaftlichen Selbstzweck ausgeftihrt worden w~ire, so
im ,,Fingerprint"-Diagramm. Mit Recht beenden die k6nnte man heute nach der chinesischen Synthese
drei chinesischen Institute das einleitende Kapitel von Rinderinsulin in kristalliner Form einen Schlul3-
ihres zusammenfassenden Berichtes [44] tiber die strich unter das Kapitel Insulin ziehen. Ein neues,
Totalsynthese yon kristallinem Insulin mit der Fest- lohnendes Ziel ist es dagegen, zahlreiche modifizierte
stellung, dab alle angesammelten Mel3daten zu der Insulin-AnMoga zu synthetisieren, um an ihnen die
SchluBfolgerung fiihren, die synthetischen Kristalle Beziehungen zwischen chemischer Struktur und bio-
seien nichts anderes als kristallines Rinderinsulin. logischer Wirkung, etwa nach dem Vorbild der auf-
schlul3reichen Arbeiten an den Peptidhormonen, zu
|
CH2
I
CH2 ClI H2 CH2
I studieren [45]. Dazu ist jedoch die Ausarbeitung
einer neuen Insulin-Synthese erforderlich. Die Syn-
I
H C ~ C H
t
HC.~.~'~--CH thesen der Jahre t943 his t965 erfordern n~imlich
~H2
I x~/ i
CH2 tH2~'~-/ ~IH2/.~___~ tiber 200 Synthesestufen von den Aminos~iuren his zu
H~ H~'-~C~i. HC../~-~ HC-"~L_)/ den geschtitzten Ketten, wobei die Ausbeute wegen
I ~ "---" der unvermeidlichen Substanzverluste in jeder Stufe
.CH2~['~ C'x.,, CH2
/ \ letztlich sehr niedrig ausfitllt. Bei der nachfolgenden
Abspaltung der aromatischen Schutzgruppen von Cy-
Fig. 10. Ausschnitt aus einem Fig. 11. ,,Merrifield-Harz"-Copo- steinschwefel, Histidin und Arginin wird der gr613te
mit Divinylbenzol vernetzten lystyrol m i t eingebauten reak-
Polystyrol tiveI1 Chlormethyl-Gruppen Tell der miihevoll synthetisierten B-Kette zerst6rt.
Bei der Kombination der nach langwierigen Reini-
gungsprozessen herauspr~parierten, noch intakten
I I Ketten ist die Insulin-Bildung nur eine Nebenreak-
tion. Man ben6tigt daher unausweichlich neue Metho-
den, um l~tngere Peptidketten rasch und in guten
Ausbeuten zu synthetisieren, neue Schutzgruppen,
die sich ohne Sch~digung der Kette abspMten lassen
und neue Verfahren zur Kettenkombination.

Die Merrifield-Methode
..CH " (~ Aber schon ist eine neue Methode zur Synthese von
CHz"NH ~ Insulin-Ketten bekannt, aus der sich vielleicht eine
0 CIN1-12
C/O
~0
/C/xH
CH2 NH
M6glichkeit zur Synthese noch gr6gerer Proteinmole-
k file als Insulin ergeben wird. Gemeint ist die von
CI(CH3)3 OCNH2CO MERRIFIELD [46] in New York entwickelte Peptid-
Rc(cH) synthese an einem quellbaren, mit Reaktivgruppen
ausgestatteten Polystyrol-Kunstharz. Bei dieser Me-
Fig. 12. Aufpfropfen der letzten Aminos~ure aus der A-Kette des thode wird die Peptidkette Aminos~ture ftir Amino-
Human-Insulins auf Merrifield-Harz dureli Umsetzung mit einer s~iure im Inneren des Harzmolektils rasch und in hohen
alkoliolischen L6sung des Tri~itliylammoniumsalzes yon Butyloxy-
earbonyl-asparagin: Es entsteht das Butyloxycarbonyl-asparaginyl- Ausbeuten synthetisiert, wobei am Ende der Syn-
Polymer [47] these ein Peptidyl-Polymer vorliegt. Die letzte Stufe
einer Merrifield-Synthese besteht in der Abl6sung der
~Es w~ire so kleinlich wie unrecht, welm wir diese fertigen Peptidkette durch Acidolyse der Esterbindung
groBe Errungenschaft der synthetischen Protein- zwischen HarzbenzyI-Gruppe und dem endst~indigen
chemie dadurch zu schm~lern versuehten, dab wir Carboxyl der Peptidkette. Beim 8. Europ~ischen Pep-
hier unseren zeitlichen Vorsprung vor den Chinesen tidsymposium in Noordwijk berichtete MERRIFIELD
ausspielten, denen die Synthese der Ketten und deren [48] tiber die mit MARGLINmit der Festk6rpermethode
Kombination zu einem synthetischen Prodnkt zwei ausgeft~hrte Synthesen der Ketten des Rinderinsulins.
Jahre nach dem deutschen, bzw. dem amerikanischen Kombination der synthetischen Ketten lieferte ein
Schaf-Insulin gelang, oder wenn wir auf den niedrigen 10%iges Insulinpr~tparat. Ein halbsynthetisches Rin-
Hormongehalt des chinesischen synthetischen Roh- derinsulin aus synthetischer B- und nat~flicher A-
produktes hinweisen, das mit 1,2 bis 2,5 % auch nicht Kette enthielt 66% Insulin. Die Brauchbarkeit der
viel mehr Insulin enthielt als das Aachener Pr~iparat. Merrifield-Methode ftir die Synthese von Insulin-
Wir haben im Gegenteil das Endziel der Insulin- Ketten wurde in unserem Laboratorium durch
Synthese, die Kristallisation des im Rohprodukt ent- OKUDA best~Ltigt. Die B-Kette des Schaf-(Rinder-)In-
haltenen Insulins nie aus dem Auge verloren, konnten sulins wurde mit der Merrifield-Methode synthetisiert.
aber bisher nur bei einer Partialsynthese yon Schaf- Kombination mit konventionell synthetisierter Schaf-
Insulin genug Material fiir eine Extraktion und Kri- A-Kette [52] lieferte ein Rohprodukt (Proteingehalt
stallisation gewinnen [59]. So ergibt sich im zeitlichen ca. 50%), das einen (unkorrigierten) Insulin-Gehalt
Ablauf der Teilerfolge der drei Gruppen eine pro- von 0,7% besaB.
gressive Steigerung v o n d e r ersten Partialsynthese Die wichtigsten Teilreaktionen einerMerrifield-Synthese
t~ber die erste Totalsynthese his zur ersten Reindar- m6gen am Beispiel der ersten Stufen der Synthese der A-
stellung synthetischen Insulins in kristalliner Form. Kette des Humaninsulins [47] erI~tutert werden. Fig. 10
Und ftir diese letzte und abgerundetste Arbeit spre- zeigt zun~ichst einen winzigen Ausschnitt aus dem mit
chen wir den chinesischen Kollegen unsere uneinge- Divinylbenzol dreidimensional vemetzten Polystyrol-
schr~inkte Anerkennung und Bewunderung aus. harz. Umsetzung mit Chlormethyl~tther liefert ein
54. Jg., Heft 15/16, 1967 H . ZAItN: C h e m i s c h e S y n t h e s e v o n P r o t e i n e n 40t

Reaktiv-Harz mit ca. t Milli/iquivalent Chlormethyl- nur 3 bis 4 Std (vgl. Fig. 14). Zwei Aminos~turen k6n-
Gruppen (vgl. Fig. t t). nen t~glich angebaut werden. Nach Anbau der letzten
L~13t man nun eine alkoholische L6sung des Tri- Aminos~ture der A-Kette wird die Esterbindung zwi-
iithylammoniumsalzes von Butyloxycarbonyl-aspara- schen Harzbenzyl-Gruppe und den: C-terminalen
gin auf das Reaktivharz Asparagin durch Behandeln mit Bromwasserstoffs~ture
einwirken, so wird die C- in Trifluoressigs~ure gespalten und die S-benzylierte
I I terminale Aminos~ure der
A-Kette des Humaninsu-
A-Kette freigesetzt (Fig. 15).
Auch mit Hilfe konventioneller Synthesemethoden
lins tiber eine Esterbin- lassen sich Fortschritte erzielen. Erst ktirzlich gelang
dung (vgl. Fig. t 2) covalent es BODANSZKY[49], das aus 27Aminosiiuren beste-
auf das Harz gepfropft. In hende Polypeptid Sekretin mit seiner Nitrophenyl-
einer weiteren Stufe wird ester-Methode durch gliedweise Kettenverl~ngerung

cl;
/
die Butyloxycarbonyl-
Schutzgruppe durch S~ure-
behandlung zersetzt (vgl.
zu synthetisieren. Noch bis 1963 hatte man als gr613-
tes Peptid mit dieser Methode ein t Ser Fragment
synthetisiert [26]. So dtirfte es - - ungeachtet der
CH2 NH2 Fig. 13). Die freigelegte Skepsis maneher Fachgenossen - - in den n/tchsten
OCNH2 oCH2 Amino-Grnppe
Kondensation mit
ist ftir die
der
Jahren zu einer Synthese weiterer Proteine kommen.
Ftir diese Prognose spricht die im Sommer 1966 be-
* CO2,/C, Carboxyl-Gruppe des n~ch- kanntgewordene erste Partialsynthese eines Enzyms,
CH3 CH3 sten Aminos~ture-Derivats, der Ribonuclease S' durch HOFMANN [50] in Pitts-
Fig. t3. Acidolyse der B u t y l - des Butyloxycarbonyl-S- burgh. Die chemisehe Synthese yon sog. groBen Pro-
oxycarbonyl- Sehutzgruppe benzylcysteins,bereit. Diese teinen mit tiber 100 Aminos/turen hat also bereits
u n d F r e i l e g u n g der A m i n o -
Gruppe: E s b i l d e t sieh Aspara-
Kondensation bewirkt Di- begonnen.
ginyl-Polymer cyclohexyl-carbodiimid in
A usblick
I I I I
Wenn einmal die Geschichte der organischen Chemie
der Proteine gesehrieben werden wird, wird man ver-
mutlich Peptide und Proteine zu ein und derselben
Substanzklasse zugeh6rig betrachten. Die Renais-
sance dieser Chemic wird dabei auf das Jahr 194t
fallen, weil in ibm mit der Verteilungschromatogra-
phie [51] eine neue _5~ra der Analyse yon Aminos~tu-
cH 2oo ren, Peptiden und Proteinen begann.
CH2 NH2 CH Die ersten Ableitungen chemischer Proteinformeln
OCNH2#C~OH "c1(t2\ N H und Synthesen biologisch aktiver Polypeptide bilden
O NH/CHCI'I2SCI'~H5
d
O~-"CHCH2SCH2C6H5die Glanzleistungen der ftinfziger Jahre. Die sechziger
Jahre bringen die ersten Resynthesen von Disulfid-
CO NH Proteinen, die ersten Partialsynthesen von Enzymen
o "co und die Totalsynthese des Hormons Insulin. Unser
d
Jahrzehnt hat nunmehr die Prophezeiung EMIL
FISCHERs wahrgemaeht, indem es die Proteine wieder
Fig. 14. Gliedweise Kettenverl~ingerung m i t der DCC-Methode. Die voll in die organische Chemie integrierte.
zweitletzte Aminos~iure der A - K e t t e des Insulins, Cystein, wird als
B u t y l o x y e a r b o n y l - S - b e n z y l e y s t e i n m i t HiKe yon Dieyclohexyl-car-
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The Dynamic Behaviour of Proteins during Catalysis


H. GUTFREUND

University of Bristol and Max-Planck-Institut ffir physikalische Chemie, G6ttingen*

Approximately ~000 different enzyme catalysed containing co-factors the specific interaction of the
reactions are known at present, and it is likely that aminoacid side chains is still of critical importance.
each of these is mediated by protein molecules of Many co-factors will participate in the catalysis of
specifically different structures. A complete study of distinctly different reactions when attached to dif-
anyone of these enzyme proteins must interpret the ferent proteins (Apoenzyme).
three dimensional structure and its flexibility in terms The second order rate of combination of enzymes with
of the following known properties of enzymes: sub- their substrates are all fast, very similar and non
strate specificity, chemical catalysis, stabilisation and specific. The specificity expresses itself ill the rate of
specificity for acceptors of reactive intermediates and dissoziation and in the ability of the substrate to
specificity for interaction with modifiers which can induce conformation changes which result in tighter
activate or inhibit to regulate the rates of specific binding and in a favourable configuration of the re-
metabolic reactions. Although no enzyme has been active groups of substrate and enzyme. Examples will
completely explored with respect to M1 these proper- be given which illustrate that chemical catalysis by
ties we are now in a position to illustrate anyone of enzymes is usually due to spacially specific coopera-
these features with some enzymes. tion of at least two reactive aminoacid residues inter-
Although some enzyme have prosthetic groups such acting with the substrate. The flexibility of the
as haem, flavine nucleotides or a variety of other co- active sites of enzymes is also of importance ill the
factors as part of their catalytic site, for simplicity we regulations involving the protection of reactive inter-
shall take our examples from enzymes which are of a mediates to be passed on to specific acceptors or the
pure protein nature, that is all the catalytically active possible choice of passing products on to one of
groups are aminoacid side chains. Clearly in enzymes several enzymes capable of reacting with them.
* Vortrag anl~filich der 104. V e r s a m m h m g der Gesellschaft Deut-
The conformations of enzyme molecules depend on a
seher Naturforseher lind Arzte in Wien a m 26. S e p t e m b e r t966. complex balance of forces and steric restrictions. It is