TCNICAS DE CULTIVO DE CLULAS ANIMALES IN VITRO

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla
de ciencia y arte. Inicialmente fue considerada como una tcnica particularmente
difcil de aprender. Sin embargo, hoy en da estas dificultades estn superadas
gracias a factores como los medios de composicin definida, la disponibilidad de
antibiticos, las instalaciones aspticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo
laminar, incubadoras estriles, etc), dispositivos de cultivo (botellas con tapones
filtrantes, placas de Petri ventiladas, etc).

El cultivo de tejidos se desarroll a partir de los ltimos aos del siglo XIX como
una continuacin de las tcnicas de la embriologa. En el ao 1885, Wilhem Roux
mantuvo clulas de embrin de pollo en solucin salina durante unos das. Se
considera al zologo americano R. G. Harrison como el iniciador de los cultivos de
tejidos animales. En 1907, Harrison fue el primer cientfico que emple tcnicas in
vitro para el estudio de fenmenos in vivo, realizando cultivos de mdula espinal
embrionaria de anfibios. Pudo observar el crecimiento de los axones de los
neuroblastos, y estableci que el axn se formaba por expansin a partir del
cuerpo neuronal y no por fusin de una cadena de clulas. El cultivo se realizaba
en una gota de linfa del anfibio que colgaba de un cubreobjetos sobre una cmara
sellada.
La primera limitacin para el establecimiento de cultivos era lograr un medio
nutritivo adecuado. Burrows (1910) emple plasma de pollo para nutrir los ex
plantes de tejidos embrionarios de pollo. Este medio se revel mucho mejor que
los anteriormente probados, lo que le permiti observar el crecimiento del tejido
nervioso, corazn y piel.
Burrows y Carrel demostraron que la vida del cultivo se puede prolongar
mediante subcultivos. Los medios empleados fueron plasma suplementado con
extractos de embrin.
Rous y Jones (1916) emplearon por vez primera extractos enriquecidos en tripsina
para disociar las clulas de embriones de pollo, estableciendo el primer cultivo
celular. Uno de los mayores problemas que describen para el establecimiento de
los cultivos celulares es la aparicin de mltiples contaminaciones, por lo que
desarrollaron numerosos mtodos de manipulacin en condiciones de asepsia
que an hoy da se utilizan.
En 1913 Carrel demostr la posibilidad de mantener en cultivo clulas extradas de
un animal, embrin de pollo, durante un periodo de tiempo superior al de la vida de
ste. Mantuvo en cultivo clulas de pollo durante 34 aos. Gran parte del xito en
el mantenimiento de los cultivos se debi al desarrollo del denominado frasco de
Carrel.
Entre los aos 1920 y 1940 se desarrollaron diferentes estrategias de obtencin
de cultivos y de mantenimiento de las condiciones estriles, pero sin grandes
avances. A partir de los aos 40, con el aislamiento de los primeros antibiticos,
se desarrollaron numerosas aplicaciones.
En 1948, Earle y col. aislaron clulas de la lnea celular L y mostraron que eran
capaces de formar clones en el cultivo de tejidos. Demostraron que para que una
clula llegue a dividirse necesita ser alimentada con los nutrientes correctos.
En 1952, Gry y col. establecen la primera lnea celular humana, las clulas HeLa.
El medio empleado era extremadamente complejo y poco definido: plasma de
pollo, extracto de embrin bovino y suero de cordn umbilical humano.
En 1954, Rita Levi-Montalcini y col. establecen que el factor de crecimiento
nervioso estimula el crecimiento de los axones en tejidos en cultivo. Este
trabajo supuso el Premio Nobel para Levi-Montalcini en 1986.
En 1955, Eagle realiza la primera investigacin sistemtica de los requerimientos
nutritivos de las clulas en cultivo.
En 1961, Hayflick y Moorhead establecieron que la duracin de los cultivos de
fibroblastos era finita: podan mantener estos cultivos durante 12 pases. No
consiguieron establecer lneas estables.
En 1965, Ham introduce el primer medio definido libre de suero capaz de
mantener algunas clulas de mamfero en cultivo indefinidamente.
En 1969, Augusti-Tocco y Sato establecen la primera lnea celular estable de
neuroblastoma aislando clones que establecan procesos nerviosos y que eran
elctricamente excitables. Se empiezan a establecer las primeras lneas celulares
diferenciadas.
En 1975, Kohler y Milstein establecen la primera lnea celular productora de
anticuerpos monoclonales. El establecimiento de la tecnologa de obtencin de
anticuerpos monoclonales les vali el Premio Nobel.
En la dcada de 1980 se empiezan a conocer los mecanismos de la
transformacin.
En la dcada de 1990 empezaron a producirse medicamentos a escala industrial
en biorreactores. Se desarrolla la biotecnologa.
En 1998 se produce cartlago mediante ingeniera de tejidos y en 2003 se
experimenta el auge de esta nueva disciplina.
En 2007 se reprograman clulas adultas para convertirlas en clulas
pluripotenciales inducidas.

Tipos de cultivo celular

Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de tcnicas que permiten el

mantenimiento de las clulas 'in vitro', manteniendo al mximo sus propiedades
fisiolgicas, bioqumicas y genticas. Se distinguen cuatro tipos de cultivo celular.
Cultivo de rganos
Se coloca el rgano sobre una rejilla situada en la interface lquido-gas de un
medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos. Este tipo
de cultivo permite mantener, al menos en parte, la arquitectura caracterstica del
tejido in vivo. Se conservan las interacciones histolgicas y, gracias a ello, este
tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados, por lo que
representan una buena rplica del tejido de origen. Sin embargo, no crecen
mucho (la proliferacin celular se limita a las clulas embrionarias de la periferia)
y no se pueden propagar. Se necesita un nuevo explante para cada experimento
lo que supone mucho ms trabajo y una limitada reproducibilidad de la muestra.
Cuantificar es difcil y la cantidad de material que se puede cultivar es reducida.

Explantes primarios
Se coloca un fragmento de tejido o de rgano en la interface slido-lquido de
un soporte de vidrio o de plstico. Las clulas se adhieren a la superficie y las
clulas de la periferia del explante pueden migrar y proliferar por la superficie
del soporte.

Cultivo celular primario

Es el tipo de cultivo ms utilizado. Se puede obtener a partir de explantes

primarios o de suspensiones de clulas disgregadas. La disgregacin celular se
realiza por mtodos enzimticos o mecnicos. En estos cultivos se pierden las
interacciones clula-clula y las interacciones de la clula con la matriz
extracelular. Sin embargo, las clulas son capaces de proliferar y la poblacin
celular crece notablemente. Cuando las clulas ocupan toda la superficie
disponible se dice que han alcanzado la confluencia. En esta etapa, las clulas
establecen contactos entre ellas que inhiben su proliferacin y el crecimiento se
detiene. Por eso, al cabo de un tiempo hay que trasplantar las clulas a un nuevo
soporte. Esta operacin se denomina subcultivo o pase.
Existen dos tipos de cultivo celular primario:
Cultivos en monocapa: las clulas crecen adheridas sobre un soporte slido
(plstico o vidrio). El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferacin
celular. Es el mtodo utilizado para la mayora de las clulas excepto para las
hematopoyticas.
Cultivos en suspensin: las clulas se encuentran dispersas en el medio de
cultivo. Su crecimiento no depende del anclaje. Este tipo de cultivo se restringe a
las clulas hematopoyticas, clulas madre, lneas celulares transformadas y
clulas tumorales. Alcanzan la confluencia cuando el nmero de clulas es grande
y los nutrientes son insuficientes.

Subcultivos y lneas celulares

Las clulas del cultivo primario en monocapa se dispersan por mtodos
enzimticos y se pasan a un nuevo frasco de cultivo. En el caso de clulas en
suspensin, sencillamente se diluyen en medio fresco. Los sucesivos cultivos as
formados se denominan una lnea celular. La formacin de una lnea celular a
partir de un cultivo primario implica que:
aumenta el nmero de clulas obtenidas
acaban predominando uno o dos tipos celulares: los que tienen mayor tasa
de crecimiento
la poblacin celular se hace uniforme y homognea
sus caractersticas se conservan durante las sucesivas generaciones y, si se
conservan en nitrgeno lquido, de forma indefinida

Normalmente, las lneas celulares tienen una vida finita que, segn el tipo de
clula, se puede prolongar entre 20 y 100 generaciones. Superado ese lmite, las
clulas entran en una etapa que se denomina senescencia en la que pierden su
capacidad de proliferar (supuestamente por el acortamiento de los telmeros) y
mueren. Sin embargo, algunas clulas (como las de roedores y las tumorales)
evitan la senescencia y dan lugar a lneas celulares continuas, que crecen
indefinidamente. Estas clulas pueden surgir de forma espontnea (exposicin a
radiaciones ionizantes o a carcingenos qumicos) o inducida (infeccin vrica o
transfeccin de ADN) y son el resultado de un cambio genotpico denominado
transformacin.
Las clulas transformadas se caracterizan porque:
Son inmortales: crecen indefinidamente
Su crecimiento es aberrante: se pierde la inhibicin por contacto, la limitacin
de la densidad celular durante la proliferacin y la dependencia del anclaje
Son malignas: invaden tejidos y dan lugar al crecimiento de tumores
Son genticamente inestables: son heteroploides (vara el nmero de
cromosomas) y presentan aberraciones cromosmicas

En 1952 se obtuvo la primera lnea celular continua humana. Son las

denominadas clulas HeLa, clulas extradas a partir de un tumor de cuello del
tero de una paciente afroamericana que se llamaba Henrietta Lacks.

Cultivos histotpicos y organotpicos

Los cultivos histotpicos son cultivos de un solo tipo celular que consigue
alcanzar una elevada densidad celular (tal y como ocurre en los tejidos). Los
cultivos organotpicos constan de varios tipos celulares que interaccionan
entre s de una forma que intenta parecerse lo ms posible a la original. El objetivo
final de este tipo de cultivos es la creacin in vitro de tejidos u rganos
completamente funcionales que puedan ser utilizados en injertos o en
transplantes. Los cultivos organotpicos constituyen la base de una nueva
disciplina denominada ingeniera de tejidos.
Biologa de las clulas en cultivo
Al establecer un cultivo celular se seleccionan las clulas que van a crecer en
funcin de numerosos criterios: slo formarn parte del cultivo aquellas clulas
que sean capaces de superar el proceso de disgregacin, de adherirse al sustrato
y de proliferar (bien en forma de monocapa, bien en suspensin).
El crecimiento en monocapa significa que las clulas se adherirn al sustrato y
en esa forma inician la proliferacin. Muchas lneas celulares son anclaje-
dependientes, es decir, no inician la proliferacin hasta que se han adherido al
sustrato. Este es el modo normal de proliferacin de la mayor parte de las clulas,
con excepcin de las clulas hematopoyticas maduras.
El crecimiento en suspensin es propio de aquellas clulas capaces de
proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato porque son independientes del
anclaje. Es propio de las clulas hematopoyticas, algunas lneas celulares
transformadas y de clulas procedentes de tumores. Es de destacar que en todo
tejido existe una fraccin o tipo celular que es capaz de crecer en suspensin. A
pesar de que su origen no est claro se cree que se trata de clulas madre ("stem
cells") indiferenciadas.
Cuando crecen en cultivo se establece una nueva seleccin: aumentan en
nmero aquellas clulas que tienen una mayor tasa de crecimiento. As pues,
hay que considerar al cultivo como un ente dinmico en el que las proporciones
relativas de los diferentes elementos que lo forman varan en el tiempo en funcin
de la presin selectiva a que estn sometidos. En general, cuando se alcanza la
confluencia, las clulas detienen su crecimiento, aunque pueden existir tipos
celulares neoplsicos que siguen duplicndose hasta desplazar a los otros tipos
celulares del cultivo.
Al alcanzar la confluencia es cuando muchas lneas celulares expresan sus
aspectos ms caractersticos. Es en este estado cuando su morfologa y
fisiologa son ms parecidas a su estado original. Es tambin el momento en el
que se detiene el crecimiento y se hace necesario dividir, replaquear o propagar
las clulas.
A partir del tercer replaqueo, el cultivo se estabiliza y homogeneiza: el tipo
celular de mayor tasa de crecimiento ha ocupado completamente el cultivo,
desplazando a los otros tipos celulares. En general, si no se establecen
condiciones selectivas, las clulas del tejido conjuntivo (especialmente los
fibroblastos) sern las seleccionadas. Para evitar que las clulas ms
especializadas del cultivo se vean desplazadas de ste por los fibroblastos o por
otras clulas de rpido crecimiento se han establecido protocolos detallados de
medios selectivos.
En los cultivos primarios, las clulas crecen durante un cierto nmero de pases
que depende, sobre todo, del tipo celular y de las condiciones de cultivo. As, los
hepatocitos de adultos slo se mantienen como cultivo primario, las clulas
endoteliales de cordn umbilical humano (HUVEC) permanecen en cultivo de 3 a 9
pases y los fibroblastos drmicos humanos pueden superar los 20 pases. Sin
embargo, al final todas ellas entran en una fase de senescencia en la que se
acumulan numerosas anormalidades y se pierden las funciones especializadas, lo
que conduce a la muerte del cultivo.
Slo ocasionalmente puede mantenerse un cultivo primario durante ms
generaciones de las esperadas. Ello es debido a la aparicin en el cultivo de
clulas inmortales. Estas clulas forman lneas estables o cultivos celulares
permanentes. En la mayora de los casos se desconoce la razn de la aparicin
de clulas inmortales pero se ve favorecida por infecciones virales y por
tratamientos con mutgenos, lo que podra estar relacionado con la prdida,
espontnea o inducida, de las vas de control de la divisin celular. La
capacidad de un cultivo celular primario para establecerse como lnea estable est
relacionada directamente con su variabilidad gentica. Las lneas celulares que
nunca se establecen como estables se mantienen euploides, como es el caso de
fibroblastos humanos, fibroblastos de pollo y la glia humana. Las lneas que, con
frecuencia, se convierten en aneuploides son las que suelen transformarse en
lneas celulares estables, como es el caso de las clulas epidrmicas. En general,
una lnea celular estable ser tanto ms fcil de establecer o cultivar cuanto ms
indiferenciada est, con las excepciones de las lneas tumorales de clulas
diferenciadas.
Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles porque las clulas
pierden algunas de sus propiedades diferenciadas, entre ellas la incapacidad
de dividirse. Esta prdida de algunas de sus propiedades caractersticas puede
deberse a desdiferenciacin o a desadaptacin. La desdiferenciacin implica una
prdida irreversible de una propiedad diferencial del tipo celular. Por ejemplo, un
hepatocito en cultivo puede perder algunas enzimas (como la arginasa o las
aminotransferasas), o ser incapaz de almacenar glucgeno o de sintetizar las
protenas del suero. En la desadaptacin, la prdida no es irreversible ya que se
debe a la ausencia de algn tipo e seal (hormonal, nerviosa, etc.) y que basta
con recuperar esa seal para que la caracterstica se vuelva a expresar. Por
ejemplo, cuando crecen sobre una matriz de colgeno, los hepatocitos de rata
pueden volver a expresar la enzima tirosina aminotransferasa en presencia de
ciertas hormonas (insulina e hidrocortisona).

Aplicaciones del cultivo celular

Los cultivos celulares se utilizan tanto en la investigacin bsica como en la

aplicada. En la investigacin bsica, permiten estudiar fenmenos complejos
como, por ejemplo:
la actividad intracelular: transcripcin de DNA, sntesis de protenas,
metabolismo energtico, ciclo celular, diferenciacin, apoptosis, etc.

el flujo intracelular de biomolculas: procesamiento del ARN, el movimiento

del ARN desde el ncleo hacia el citoplasma, el movimiento de las protenas hacia
diversos orgnulos, el ensamblaje y desensamblaje de los microtbulos, etc.

genmica y protemica: anlisis gentico, infeccin, transformacin celular,

inmortalizacin, senescencia, expresin gnica, rutas metablicas, etc.
 ecologa celular: el estudio de las condiciones ambientales responsables del
mantenimiento de la funcionalidad celular y de su diferenciacin, el estudio de las
necesidades nutricionales, la cintica de la poblacin celular, etc.
 las interacciones celulares: morfognesis, proliferacin celular, adhesin
celular, interacciones con la matriz, invasin celular, etc.

En la investigacin aplicada, las tcnicas de cultivo celular utilizan en reas tan

diversas como:
Virologa: Cultivo de virus animales y de plantas, produccin de vacunas, etc.

Biotecnologa: produccin industrial de frmacos en biorreactores (interfern,

insulina, hormona de crecimiento, etc.)

Inmunologa. Produccin de anticuerpos monoclonales, sealizacin,

fenmenos de inflamacin.

Farmacologa: Efecto de diversos frmacos, interacciones con el receptor,

fenmenos de resistencia, etc.

Ingeniera de tejidos. Produccin de tejidos artificiales (piel, cartlagos) para el

tratamiento de grandes quemados, injertos o autotransplantes, desdiferenciacin y
diferenciacin inducida, etc.

Toxicologa: citotoxicidad, mutagnesis, carcinognesis, etc.

Ventajas e inconvenientes de los cultivos celulares
Como ventajas podemos citar:

a) Permiten un control preciso y fino del medio ambiente

En un cultivo se pueden controlar las condiciones fsico-qumicas (pH,
temperatura, presin osmtica, presin parcial de O2 y CO2), y fisiolgicos
(hormonas, factores de crecimiento, densidad celular, etc.). Para algunas lneas
celulares se han establecido medios definidos. Un medio definido es aqul en el
que se conocen todos y cada uno de los componentes que lo forman y su
concentracin exacta. Para establecer un medio definido hay que conocer con
precisin las necesidades nutritivas de las clulas en cuestin. Sin embargo en el
caso de muchas lneas celulares, estas necesidades no se conocen. En estos
casos se utilizan medios que se suplementan con disoluciones complejas (suero,
extractos de embrin, etc.) que contienen factores hormonales y nutritivos
imprescindibles para el cultivo pero cuya naturaleza se desconoce.
b) Caracterizacin y homogeneidad de la muestra
Una muestra de tejido es siempre heterognea. Sin embargo, al cabo de uno o
dos pases, las lneas celulares cultivadas son homogneas, es decir, su
morfologa y su composicin son uniformes. La presin selectiva de las
condiciones de cultivo da lugar a un cultivo homogneo del tipo celular ms
vigoroso. A partir de ese momento se pueden obtener rplicas idnticas en cada
subcultivo y las caractersticas de la lnea celular se conservan durante varias
generaciones o de forma indefinida si la lnea celular se conserva en nitrgeno
lquido. Esto facilita mucho el tratamiento estadstico de los resultados.
c) Economa
En los cultivos celulares se emplean disoluciones con una concentracin mucho
menor que en el caso del animal completo. Adems, se garantiza el acceso
directo de la sustancia a las clulas sin que se diluya y sin que sufra ningn
tipo de modificacin metablica. El coste de los ensayos clnicos se reduce
considerablemente y se puede hacer un mayor nmero de pruebas. Tambin se
reducen los costes relacionados con la fabricacin del posible nuevo
medicamento: en lugar de fabricar cantidades del orden del gramo (para el estudio
en animales) basta con que se sinteticen unos pocos miligramos.
d) Cuestiones ticas
La investigacin biomdica supone el sacrificio cada ao de muchos miles de
animales de experimentacin. El cultivo celular no puede reemplazar siempre al
ensayo 'in vivo' pero es una alternativa vlida en muchas situaciones. Para
obtener un cultivo celular primario es posible que haya que sacrificar algn animal,
pero con ellos se pueden ensayar un elevado nmero de condiciones
experimentales que, en otras circunstancias, supondran el sacrificio de decenas o
cientos de animales de experimentacin.
Los cultivos celulares tambin pueden suponer algunas desventajas:
a) Tcnica sensible
El crecimiento de las clulas animales se tiene que realizar en estrictas
condiciones de asepsia porque su crecimiento es mucho ms lento que el de los
contaminantes ms habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas, etc.).
Adems, las clulas animales son incapaces de mantenerse vivas en ausencia de
la compleja mezcla de nutrientes presente en el plasma o en el fluido intersticial.
Todo esto condiciona en gran medida el instrumental requerido y el grado de
preparacin del personal encargado de los cultivos.
b) Cantidad y coste
Producir 1 gramo de clulas en cultivo cuesta 10 veces menos que obtenerlas a
partir del tejido de un animal. En un laboratorio normal se pueden conseguir hasta
10 gramos de clulas sin que se resienta mucho el presupuesto de investigacin.
Para producir hasta 100 gramos de clulas hay que incrementar tanto el
instrumental como el personal. Para producir cantidades mayores se necesitan
instalaciones de tipo industrial.
c) Inestabilidad
Muchas lneas celulares continuas son inestables y adoptan una dotacin
cromosmica aneuploide, lo que afecta tanto a su velocidad de crecimiento
como a su capacidad para diferenciarse. Es posible, por tanto, encontrar
diferencias significativas en la lnea celular de una generacin a la siguiente. La
nica manera de evitarlo es emplear lneas estables que se resiembran cada
determinado tiempo o despus de un determinado nmero de generaciones a
partir de un stock congelado.
d) Desdiferenciacin e identificacin de las clulas
Al propagarse la lnea celular, las clulas pierden las caractersticas fenotpicas
propias del tejido de procedencia. Este fenmeno se denomina desdiferenciacin
y, entre otras, cosas se hacen mviles e inician su proliferacin. La relacin entre
las clulas cultivadas y las clulas originales del tejido puede perderse. En este
caso se necesitan marcadores estables que permitan identificar la
procedencia de las clulas. En algunos casos es posible revertir la
desdiferenciacin, bien por medio de hormonas, bien mediante compuestos
qumicos (steres de forbol), pero no est claro si el estado rediferenciado es
equivalente al estado de diferenciacin in vivo.
e) Validez del modelo 'in vitro'
En realidad, un cultivo celular es un disgregado celular de un tejido y se diferencia
de ste en que:
se ha perdido la organizacin espacial tridimensional propia del tejido ya que
stas se propagan en dos dimensiones.
se han perdido las interacciones entre los distintos tipos celulares y entre las
clulas y la matriz extracelular. Adems, al formarse una lnea celular slo se
conservan uno o dos tipos celulares (los que proliferan a mayor velocidad).
carece de los componentes sistmicos implicados en la regulacin de la
homeostasis in vivo, especialmente los sistemas nervioso y endocrino.