UNIVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA N 5 : METABOLISMO BACTERIANO

PRUEBAS BIOQUMICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE BACTERIAS

I. INTRODUCCION:
El Metabolismo bacteriano consiste de un gran nmero de reacciones qumicas destinadas a
transformar las molculas nutritivas en energa y componentes estructurales necesarios para
los microorganismos, dichas reacciones qumicas son catalizadas por enzimas.
Las necesidades mnimas para el crecimiento son una fuente de carbono, nitrgeno, una
fuente de energa, agua y diversos iones. Aunque el oxgeno es esencial para unas bacterias,
para otras constituye una sustancia txica. Este tipo de bacterias son conocidas como
anaerobias estrictas. En cambio otras bacterias como Mycobacterium tuberculosis
requieren la presencia de oxgeno molecular para su crecimiento y en consecuencia se
denominan Aerobias estrictas y otras pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de
oxgenos a estas se les llama anaerobias facultativas. Aunque algunas bacterias obtienen la
energa de compuestos qumicos otros lo toman directamente de la energa luminosa

II. COMPETENCIAS:
Al finalizar la sgte. Practica el alumno ser capaz de:
- Realizar pruebas bioqumicas que son de utilidad general para la identificacin de bacterias.
- Realizar las lecturas e interpretaciones correspondientes de las pruebas bioqumicas
efectuadas

III. MATERIALES Y MTODOS:

Homogenizados de cepas bacterianas - Tubos con Agar TSI
Placas con Agar Nutritivo - Tubos con Agar LIA
Placas con Agar Mac Conkey - Tubos con agar SIMS
Placas con Agar XLD - Tubos con Agar Citrato de Simonds
Placas con Agar SS - Tubos con Agar Urea de Christiansen
Tubos con Caldo Nutritivo - Mecheros
Anzas de cultivo - Gradillas

IV. PROCEDIMIENTO
A. DEGRADACIN DE GLUCOSA, LACTOSA, SACAROSA, PRODUCCIN DE GAS E H2S en
medio Agar TSI: (Triple Azcar,
Hierro)
Medio empleado para la diferenciacin de enterobacterias en base a la fermentacin de los
hidratos de carbono
glucosa, sacarosa y lactosa y a la produccin de cido sulfdrico
Muestra: Cultivos Bacterianos
Medio de Cultivo: TSI
Procedimiento:
Rotular los tubos con medio de TSI
Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger un cultivo bacteriano y sembrar por picadura en el fondo y estra en la superficie del
medio TSI
flameando la boca del tubo
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Lectura e interpretacin del TSI:
a) La degradacin de los azcares con formacin de cido (acidez positiva) se manifiesta por
un cambio de color
del indicador Rojo de fenol que hace virar
- el color del medio de anaranjado rojizo a amarillo, en caso de acidez y se simboliza
con la letra A,
- o por un viraje del medio de anaranjado rojizo a rojo intenso en caso de alcalinizacin
(alcalinidad positiva) y se simboliza con la letra K.
b) La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento del medio (Gas positivo). Se
simboliza segn su
intensidad de 1+ a 3+.
c) Produccin de H2S: El tiosulfato es reducido por algunos grmenes a cido sulfhidrco, el
cual reacciona con la
sal frrica produciendo sulfuro de hierro que se manifiesta por un precipitado negro
en el medio (H2S positivo).
Se simboliza de acuerdo a su intensidad de 1+ a 3+.

d) Lectura:
- Pico alcalino/fondo alcalino (NN): No hay fermentacin de azcares. Caracterstica de bacterias
no fermentadoras.
- Pico alcalino/fondo Amarillo (K/A) : Glucosa fermentada,
Ni lactosa ni sacarosa fermentadas.
- Pico alcalino/fondo Amarillo y negro (K/A/H 2S +): Glucosa fermentada,
Ni lactosa, ni sacarosa fermentadas,
produccin de cido sulfhdrico.
- Pico Amarillo/fondo Amarillo ( A/A/H2S - ): Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas.
H2S : Negativo.

B. DESCARBOXILACION DE LA LISINA en medio agar LIA:

Esta prueba permite diferenciar los microorganismos que producen descarboxilacin o
desaminacin de la lisina. Se puede detectar adems la produccin de H 2S y es ms
sensible que el TSI para la deteccin H2S
Es muy utilizado para descartar Salmonella de aislamientos primaros.
Muestra: Cultivos Bacterianos
Medio de Cultivo: LIA
Procedimiento:
Rotular los tubos con medio de LIA
Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger un cultivo bacteriano sembrar tanto por por picadura central en el taco como
por estra sobre la superficie inclinada.
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Lectura e interpretacin del Agar LIA:
La Lisina puede ser descarboxilada (Descarboxilacin) por microorganismos LD
positivas, que la transforman en la amina cadaverina, esto produce un viraje del indicador
Prpura de bromocresol a un color violeta intenso.
Se simboliza con la letra K.
Puesto que la descarboxilacin solo tiene lugar en un medio cido (pH inferior a 6) es
necesario que se produzca previamente la acidificacin del medio de cultivo por
fermentacin de la glucosa.
Los microorganismo LD negativos, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje
al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. Se simboliza con la letra A. La incubacin
prolongada puede ocasionar una alcalinizacin en la zona de la superficie del medio de
cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al violeta. La produccin de H 2S produce
una coloracin negra debido al sulfuro de hierro producido.

C. DESAMINACIN DE LA LISINA en medio Agar LIA:

Las cepas del grupo Proteus y Providencia, con excepcin de algunas cepas de
Proteus morganii, desaminan la
Lisina a cido alfa-cetocarbnico formando compuestos pardorojizos en la superficie del
medio con la sal de
hierro y bajo la influencia del oxgeno. Se simboliza con la letra R.

D. PRUEBA DE MOVILIDAD, HIDROGENO SULFURADO Y PRODUCCIN DE INDOL en

Medio de cultivo: Agar SIM
El medio SIM es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de
indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la
familia Enterobacteriaceae.
 Procedimiento:
Rotular los tubos con medio SIM
Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger un cultivo bacteriano sembrar por picadura central en la columna vertical del
medio
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Lectura e Interpretacin:
La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo
alrededor del canal de la picadura. La no motilidad se caracteriza por el crecimiento
producido exclusivamente a lo largo de dicho canal.
La formacin de H2S se reconoce por el ennegrecimiento de la zona de crecimiento.
La produccin de Indol pone de manifiesto la presencia de la Enzima Triptofanasa que
degradar el triptofano y liberar al medio Indol que se combina con el aldehido
(paradimetilbenzaldehido) presente en el reactivo de Kovacs, si hay indol se formar
un anillo rojo en la superficie.

E. DEGRADACIN DEL CITRATO en medio Agar Citrato de Simons

Algunas enterobacterias tienen la capacidad de usar citrato como nica fuente de
carbono y energa
Finalidad: Determinar la utilizacin del citrato por bacterias como la nica fuente de
carbono.
Medio de cultivo: Agar Citrato de Simons
Procedimiento:
Rotular los tubos con medio CITRATO
Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger un cultivo bacteriano sembrar por estra en la superficie del medio
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Lectura e interpreatcin
La degradacin del citrato como nica fuente de carbono origina la alcalinizacin del
medio.
Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira a azul
oscuro, dando una reaccin positiva (Citrato +) si el crecimiento es visible; y como
reaccin negativa (citrato -) si no cambia de color

F. DEGRADACION DE LA UREA
Evala en las bacterias la capacidad de utilizar la urea como fuente de nitrgeno, mediante
la enzima ureasa, que degrada la urea en dixido de carbono y amoniaco. El amoniaco acta
como fuente de nitrgeno y capta protones, transformndose en amonio y alcalinizando el
medio. Contiene rojo fenol como indicador de pH, el cual vira el medio a fucsia cuando el pH
se torna alcalino.
Finalidad: Determinar la hidrlisis de la Urea por bacterias.
Medio de cultivo: Agar Urea de Christensen
Procedimiento:
Rotular los tubos con medio Urea
Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger un cultivo bacteriano sembrar por estra en la superficie del medio
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Lectura e Interpretacin de los resultados.
La positividad viene dada por una coloracin rosada o fucsia en el medio. Ejm Proteus
sp es positivo para la prueba

G. AGAR Mc CONKEY :
El Agar Mc Conkey es un medio Slido, Diferencial y Selectivo para el aislamiento de
Enterobacterias
 Permite diferenciar bacterias que fermentan o no, la lactosa en muestras clnicas, de agua
y alimentos.
Las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano,
Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram
positiva.
Procedimiento:
Rotular las placas
Coger una asa de siembra en aro y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger con el asa un cultivo bacteriano sembrar por agotamiento en la superficie del
medio
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Fundamento:
Por fermentacin de la lactosa, se producir cido lo que disminuye el pH alrededor de la
colonia. Esto
produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), y darn al medio un
aspecto rosceo con un
halo turbio debido al descenso del pH provocados por los cidos biliares en las
colonias. Si por el contrario
son Lactosa (-) el medio se alcalinizar por el uso de la peptona y se tornar amarillo
o incoloro
Lectura e Interpretacin
Las colonias lactosa positivas son rojas o rosadas con un halo turbio debido al descenso
de pH
Las colonias Lactosa negativas son incoloras

H. Agar XLD :
El Agar XLD (Xilosa Lisina Desoxicolato) es un medio selectivo y de diferenciacin,
utilizado para el aislamiento y diferenciacin de enterobacterias patgenas especialmente
del gnero Salmonella, Shigella y Providencia.

- La xilosa se incorpora en el medio dado que la fermentan prcticamente todos los

entricos, excepto Shigella, y esta propiedad hace posible la diferenciacin de dicha
especie
- La lisina se incluye para permitir la diferenciacin del grupo Salmonella de los
organismos no patgenos, dado que, sin lisina, Salmonella fermentara rpidamente
la xilosa y no se distinguira de las especies no patgenas. Cuando la Salmonella
agota el suministro de xilosa, la lisina es atacada por la enzima lisina descarboxilasa,
lo que genera un cambio a un pH alcalino que imita la reaccin de Shigella.
- Utiliza el desoxicolato de sodio como agente selectivo y, por consiguiente, inhibe los
microorganismos gram positivos
- El tiosulfato y la sal de hierro revelan la formacin de cido sulfdrico por la
precipitacin de sulfuro de hierro produciendo un color negro en las colonias.
Procedimiento:
Rotular las placas
Coger una asa de siembra en aro y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger con el asa un cultivo bacteriano sembrar por agotamiento en la superficie del
medio
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Lectura e interpretacin:
La degradacin de la xilosa, lactosa y sacarosa a cido produce un viraje al color
amarillo alrededor de las
colonias por su indicador rojo de fenol (Xilosas +)
Las bacterias que descarboxilan la lisina, produciendo cadaverina, se reconocen por la
presencia de un color
rojo prpura, debido al aumento de pH, alrededor de sus colonias (Xilosas -)

I. AGAR SS (SALMONELLA Y SHIGELLA) Empleo e Interpretacin:

 Medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento de especies de
Salmonella y Shigella a partir de muestras clnicas, heces y de alimentos
El verde brillante, la bilis de buey y la elevada concentracin de tiosulfato y de citrato
inhiben considerablemente la flora acompaante, bacterias Gram positivas, la mayora de
bacterias Gram negativas
Con el tiosufato e iones de hierro se pone de manifiesto la formacin de sulfuro por el
ennegrecimiento de las correspondientes colonias. Las colonias de coliformes quedan
sealadas por la demostracin de la degradacin de lactosa a cido, a cargo del indicador
de pH Rojo de fenol
Procedimiento:
Rotular las placas
Coger una asa de siembra en aro y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger con el asa un cultivo bacteriano sembrar por agotamiento en la superficie del
medio
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Lectura e interpretacin:
Las colonias de grmenes Lactosa + son rosadas hasta rojas
Las colonias de grmenes lactosa negativas son incoloras
Las colonias de microorganismos formadoras de H2S presentan un centro negro.

V. RESULTADOS:
El alumno deber dibujar cada uno de los medios utilizados del color de inicio y las
variaciones de color que stos
tuvieron con su debido fundamento, ordenadamente.

VI. CUESTIONARIO:
Por qu es necesario ajustar el pH del medio?
Para qu se aade el agar-agar? Qu cualidades tiene esta sustancia?

PRINCIPALES PRUEBAS BIOQUMICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE

BACTERIAS

Medio
Color
de Prueba Indicador Color final Resultado
inicial
cultivo
Negruzco H2S (+)
Tiosulfato de sodio y Rojo
H2S Amarillo H2S (-)
sulfato ferroso naranja
Glucosa, Amarillo Acido: A
Rojo
TSI Sacarosa y Rojo de fenol rojo Alcalino: K
naranja
Lactosa,
burbujas de aire o Gas (burbujas) Gas (+)
Gas resquebrajamiento No Gas Gas (-)
del medio
 Violeta intenso Decarboxilacin
Decarboxilas Prpura de
LIA violeta Amarillo (+)
a Bromocresol
Decarboxilacin
(-)
LIA Deaminasa Prpura de violeta Rojizo Deaminacin (+)
Bromocresol

Citrato Azul Citrato (+)

de Verde Citrato (-)
Citrato Azul de bromotimol verde
Simon
s
Transparencia del transpare Turbidez del Motilidad (+)
Motilidad
medio nte medio
SIMS Negruzco H2S (+)
Tiosulfato de sodio y transpare
H2S
sulfato ferroso nte

Paradimetilbenzaldeh Anillo Grosella Indol (+)

transpare
Indol do (reactivo de Anillo Amarillo Indol (-)
nte
Kovacs)
Rosado Urea: +
UREA Ureasa Rojo de fenol amarillo
amarillo Urea: -
Colonias Lactosa +
Mc Fermentaci
Color del rosadas Lactosa -
Conke n de la Rojo Neutro
medio C. incoloras
y Lactosa
Colonia Xilosas +
Fermentaci
XLD Rojo de fenol rojo amarillas Xilosas -
n de la Xilosa
incoloras
Fermentaci Rosadas Lactosa +
Purpura
SS n de la Rojo de fenol Incoloras Lactosa -
bajo
Lactosa