Amyla

se
werki
ng

Namen: Wessel van Dam & Amal Abarkane

Docent: Meneer Nuijten

Klas: 5vc & 5vd

Vak: Biologie

Datum: 16-10-2015
 Inhoudsopgave
1. Samenvatting
2. Inleiding
2.1 Aanleiding
2.2 Achtergrondinformatie
2.3 Reactievergelijking
2.4 Onderzoeksvraag
2.5 Hypothese

3. Materialen en werkwijze
3.1 Materialen
3.2 Werkplan
3.3 Vragen
3.4 Controleproef

4. Resultaten

4.1 Gegevens
4.2 Waarnemingen

5. Conclusie
6. Discussie
7. Reflectie
8. Bronnen
9. Bijlagen
9.1 Opdracht 4
 1. Samenvatting
Het experiment waar dit verslag het gevolg van is, was bedoeld om de tolerantiegrenzen en
het optimumgebied van amylase te onderzoeken op grond van de zuurgraad van de
bufferoplossing. Het resultaat van dit experiment is de conclusie dat het optimum een
neutraal milieu is en de tolerantiegrenzen worden weergegeven door de pH-waarden 4,5 en
8.

2. Inleiding
2.1 Aanleiding:
Naar aanleiding van Hoofdstuk 11 waarin we de werking van enzymen hebben besproken
wilden wij met een proef de tolerantiegrenzen en het optimumgebied van het enzym amylase
testen op het gebied van zuurgraad (pH). Kortom, bij welke pH-waarden is amylase (het
beste) actief?

2.2 Onderzoeksvraag
Ons doel is dus om te weten te komen wat de tolerantiegrenzen zijn van amylase en ook wat
het optimumgebied is. Dit alles wat betreft de zuurgraad. Daarom luidt onze
onderzoeksvraag:

Wat zijn qua zuurgraad de tolerantiegrenzen van amylase en wat is het optimum?

Om hier een goede hypothese bij op te kunnen stellen, moeten we eerst de theorie
bestuderen.

2.3 Achtergrondinformatie
Amylase is een verteringsenzym dat zetmeel afbreekt. Dit gebeurt al in de mond, wanneer
het amylase in speeksel in aanraking komt met zetmeel in ons eten. Amylase zit in het
menselijk speeksel en wordt gemaakt door de speekselklieren. Amylase breekt zetmeel af
met behulp van hydrolyse. Hydrolyse is het splitsen van een molecuul door middel van water.
Hierdoor ontstaan er maltosemoleculen die na afbraak monosachariden zoals glucose
vormen. Een enzym zorgt ervoor dat een reactie sneller verloopt, daarom kan je het dus zien
als een soort katalysator. Om te weten te komen wat qua zuurgraad de tolerantiegrenzen en
het optimumgebied van amylase is testen wij het enzym bij verschillende pH-waarden.
Een reactiesnelheid is afhankelijk van een paar factoren:
1. De temperatuur van de omgeving
2. De concentratie van het enzym
3. De zuurgraad
Wanneer de concentratie van het substraat anders is, verandert de reactiesnelheid niet. De
concentratie van het substraat (in ons geval zetmeel) benvloedt de duur van de reactie.
(meer substraat een langere reactie). Als factoren anders dan de zuurgraad ook
verschillen gedurende ons experiment, zullen de resultaten minder nauwkeurig zijn. Dit
moeten we voorkomen.
2.4 Reactievergelijking
In dit experiment gaat het om de reactie die optreedt tussen amylase en zetmeel. Reden
genoeg om deze reactie nader te bestuderen. De reactie die ontstaat wanneer zetmeel in
aanraking komt met amylase is een hydrolysereactie. Wat hier gebeurt is dat door amylase
het zetmeel wordt gesplitst door middel van water. Het zetmeel (een polysacharide) wordt
hierdoor gesplitst in maltose (een disacharide) en een polysacharideketen die bij elke
splitsing kleiner wordt tot er alleen maltose overblijft. Op dezelfde manier worden deze
suikers door maltase gesplitst tot glucose (een monosacharide) overblijft (elk
maltosemolecuul 'levert' twee glucosemoleculen). De glucosemoleculen zijn klein genoeg om
het membraan van de darmepitheelcellen te kunnen passeren.
Aangezien er geen maltase wordt gebruikt in ons experiment, zullen de reageerbuizen
waarin de amylase-enzymen de zetmeelmoleculen afbreken uiteindelijk maltose-moleculen
bevatten.

In structuurformules ziet de amylasereactie er zo uit:

(C6H10O5)n + H2O (C6H10O5)n-2 + C12H22O11

Maltose wordt als volgt door maltase afgebroken:

C12H22O11 + H2O 2 C6H12O6

In de afbeeldingen is schematisch weergegeven

hoe de reacties verlopen.
2.5 Hypothese:
Van de theorie hebben wij geleerd dat zetmeel al in de mond wordt afgebroken met behulp
van amylase. De pH in de mond is (gelukkig!) ongeveer neutraal met een pH van 6 tot 7.
Door dit gegeven verwachten wij dat het optimum van amylase hiertussen ligt, dus een pH-
waarde van circa 6,5. De tolerantiegrenzen zullen waarschijnlijk rond dit gebied liggen, dus
wij schatten dat het minimum bij een waarde van 5,5 ligt en het maximum bij een zuurgraad
van 7,5. Dit is aannemelijk omdat in de maag de pH erg laag is en amylase daar niet werkt.
Het minimum ligt kennelijk boven de pH van de maag.
 3. Materialen en
werkwijze
3.1 Materialen
Voor ons experiment kregen wij een lijst met materialen die voor ons ter beschikking stonden.
Deze materialen waren:
- Bekerglas 100 ml met stamoplossing A
- Bekerglas 100 ml met stamoplossing B
- Bekerglas 100 ml met zetmeeloplossing (1 %).
- Bekerglas 100 ml met amylase-oplossing (0,3 %).
- Rekje met 12 reageerbuisjes.
- Bekerglas 250 ml
- Bekerglas 100 ml met gedestilleerd water.
- Pipetten van 10,0 - 5,0 - 2,0 ml.
- Plastic 1 ml druppelpipetjes voorzien van paperclip.
- Etiketjes.
- Microtiterplaatjes.
- Druppelflesje met jodiumoplossing.
- Stopwatch of horloge met secondewijzer.
- Tissuepapier
- Paperclips

3.2 Werkplan:
Voor het werkplan zochten wij naar soortgelijke experimenten op het internet. Hieruit hebben
wij een goed werkplan kunnen opmaken, zie hieronder:

Nadat we alle materialen hadden verzameld spoelden we het glaswerk en konden we

beginnen:
Als eerste maakten we oplossingen m.b.v. de tabel uit het instructieblad (zie
volgende bladzijde) zodat we oplossingen met verschillende pH-waarden hadden.
Deze oplossingen zitten in genummerde reageerbuisjes (zes pH-waarden, dus zes
reageerbuizen).
We gebruikten 2 microtiterplaatjes om 13 rijen van 6 kolommen te vullen met n
druppel jodium.
Aan elk van de zes reageerbuizen voegden we 2 mL van de zetmeeloplossing toe
met de pipet.
Vervolgens startten we de timer en elk tiental seconden voegden we 0,5 mL van de
amylase-oplossing toe aan de reageerbuizen, zodat na n minuut aan elke
reageerbuis 0,5 mL was toegevoegd.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Alle oplossingen zitten nu in de reageerbuizen. In onderstaande afbeelding staan nu de 6
reageerbuizen genummerd met de hoeveelheid van de oplossingen die erin zitten (in mL) en
de pH-waarden.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Na de eerste minuut haalden we elk tiental seconden een beetje oplossing uit de
reageerbuis met een pipet (op dezelfde volgorde als die waarmee we de amylase-
oplossing hadden toegevoegd, dus volgens de nummering hierboven) en voegden
n druppel hiervan toe aan de druppel jodium op het microtiterplaatje (kolom 1 (want
het komt uit reageerbuis 1), rij 1 (want het is de 1e minuut na het toevoegen van
amylase). We hadden 13 rijen voorzien van jodium, dus uiteindelijk hadden we
resultaten van 13 minuten zetmeelvertering.
Op het microtiterplaatje konden we zien wanneer al het zetmeel verteerd is: dan is de
jodiumoplossing een andere kleur geworden (namelijk geel). De rij waarin dit te zien
is, is het aantal minuten dat nodig was om al het zetmeel te verteren.
Na de proef hebben we alles schoongemaakt en teruggezet waar het hoorde.

3.3 Vragen
- Je voegt weinig zetmeeloplossing en weinig amylase-oplossing toe. Moet je ook
zo weinig bufferoplossing in de reageerbuis doen? Leg uit.

Het maakt niet uit hoeveel bufferoplossing je toevoegt omdat de bufferoplossing een
bepaalde pH aanneemt

- Welke oplossingen moeten er in de buisjes zitten (voordat je de inhoud van twee

buizen mengt)? Leg uit.

Voordat je de amylase-oplossing toevoegt aan de buffer, moet het zetmeel al bij de buffer
zitten. Als je eerst het amylase doet, kan het zijn dat de enzymen al kapot gaan door de pH
waarden. De hoeveelheid amylase verschilt dan met de andere reageerbuizen, waardoor de
resultaten minder nauwkeurig zijn. En buis bevat dus de buffer en het zetmeel, de ander de
amylase-oplossing. Laten we zeggen dat buis A de buffer en het zetmeel bevat en buis B de
amylase-oplossing bevat.

- Als je de inhoud van twee buizen mengt kun je de inhoud van buis a bij buis b
doen, maar ook andersom (inhoud van b bij a doen). Afhankelijk van wat je in
buis a en in buis b hebt gedaan is n van de twee mogelijkheden de beste.
Welke en waarom?
MOET NOG GEDAAN WORDEN!

3.4 Controleproef:
Bedenk een proef om na te gaan of de amylase het proces veroorzaakt:
 Volg de stappen van het originele werkplan opnieuw, maar gebruik in plaats van een
amylase-oplossing gedestilleerd water. Als het zetmeel niet wordt verteerd, veroorzaakt
amylase de reactie.

Oplossingentabel met pH waarden:

Stamoplossing Stamoplossing pH Buis

A B
(Na HPO )
2 4 (KH PO )
2 4

10,0 ml 9,0 1

9,4 ml 0,6 ml 8,1 2

5,2 ml 4,8 ml 6,9 3

1,8 ml 8,2 ml 6,2 4

0,5 ml 9,5 ml 5,6 5

10 ml 4,3 6

4. Resultaten
4.1 Gegevens
Allereerst staat er hieronder een foto die we na het experiment hebben gemaakt.
Deze foto weergeeft het microtiterplaatje. Als de druppels jodium donker
gekleurd zijn, dan zit er nog zetmeel in de oplossing. Is het jodium geel, dan zit er
geen zetmeel meer in.

De gegevens van het experiment hebben we verwerkt in onderstaande tabel.

Resultatentabel
Buis 1 (pH=9) 2 (pH=8,1) 3 (pH=6,9) 4 (pH=6,2) 5 (pH=5,6) 6 (pH=4,3)
Minuut
1 Z Z Z Z Z Z
2 Z Z Z Z Z Z
3 Z Z Z Z Z Z
4 Z Z Z Z Z Z
5 Z Z Z Z Z Z
6 Z Z Z Z Z Z
7 Z Z Z Z Z Z
8 Z Z V Z Z Z
9 Z Z V V Z Z
10 Z Z V V V Z
11 Z Z V V V Z
12 Z Z V V V Z
13 Z Z V V V Z
V = kleurverandering na jodium toevoegen Z= hetzelfde gebleven na jodium toevoegen

4.2 Waarnemingen
Mede dankzij de kleuren in de tabel kan je goed zien dat bij buis 1, 2 en 6 na 13
minuten nog niet al het zetmeel is afgebroken. Dit omdat het jodium nog niet van
kleur verandert is. Bij buizen 3, 4 en 5 was wel kleurverandering te zien, bij buis 3
al na 8 minuten. Bij buis 4 is al het zetmeel na 9 minuten afgebroken en bij buis 5
na 10 minuten. Hieruit kunnen we opmaken dat in buis 3 het snelst zetmeel werd
afgebroken.

5. Conclusie
De onderzoeksvraag van ons experiment was:

Wat zijn qua zuurgraad de tolerantiegrenzen van amylase en wat is het optimum?

Met de gegevens van het experiment gaan we de onderzoeksvraag beantwoorden. In

onderstaande tabel zijn onze resultaten weergegeven. Op de horizontale as zie je de pH-
waardes en op de verticale as staat het aantal minuten dat de reageerbuizen in het
experiment geen zetmeel meer bevatten (bijvoorbeeld: reageerbuis 3 had van minuut 8 tot
en met 13 geen zetmeel: 6 minuten). Nu zien we het antwoord op de onderzoeksvraag: het
optimum van amylase ligt ongeveer bij een neutrale pH-waarde . Voor het minimum en
maximum kunnen we ongeveer waardes van 4,5 en 8 nemen.
 6. Discussie
Natuurlijk is het experiment dat we hebben uitgevoerd niet perfect. Er zijn veel
dingen die nauwkeuriger konden. Allereerst waren de pipetten niet handmatig
geijkt, waardoor de hoeveelheden van de oplossingen die we hebben gebruikt in
de praktijk niet gelijk zijn aan de theoretische hoeveelheden. Als we meer of
minder zetmeel-oplossing of amylase-oplossing hebben gebruikt dan zijn de
concentraties anders. Deze concentraties benvloeden de snelheid van de reactie
en dus de resultaten. De snelheid verandert ook als de buffer een ander pH had
dan we dachten omdat de verhouding tussen stamoplossing A en B ander is. Met
pH-papier of een pH-meter zou dit probleem minder groot zijn. Wij hebben echter
geen pH-papier gebruikt. Daarbij hebben we ook maar zes verschillende
zuurgraden gebruikt. Als dit aantal groter zou zijn, zouden de resultaten ook
preciezer zijn. Mogelijk ligt het minimum van de tolerantiegrenzen wel op een pH
van 5,5! Kortom, de resultaten zijn (hoogstwaarschijnlijk) niet als betrouwbaar te
beschouwen. Een factor die invloed heeft op de reactiesnelheid die NIET
veranderd is gedurende het experiment is de temperatuur. Tijdens het
experiment is de temperatuur per reageerbuis niet of nauwelijks veranderd.

7. Reflectie
Bij dit experiment is een reflectie zeker op zijn plaats, omdat in eerste instantie
het experiment verkeerd verliep. We hadden ons werkplan voornamelijk
gebaseerd op de informatie uit een internetbron (www.nuffieldfoundation.org).
Wij hadden echter niet beseft dat de waarden/hoeveelheden van de site niet
overeenkomen met die bij het experiment. Bij de bron was de verhouding
amylase-zetmeeloplossing zo dat n reageerbuis bij de goede zuurgraad al
binnen een minuut zetmeelvrij zou zijn. Dit was niet het geval bij het experiment.
Omdat wij dit niet hadden opgemerkt maten wij in eerste instantie telkens maar
n minuut van de reactie. Natuurlijk was er in zo'n korte tijdspanne nog niet al
het zetmeel verteerd. Als gevolg hiervan deden wij het experiment opnieuw, dit
keer 13 minuten lang. Hierdoor hebben we toch nog goede resultaten
binnengekregen, maar ook dat valt in twijfel te trekken. Wie het internet
raadpleegt zal zien dat sommige bronnen een veel bredere tolerantiecurve
weergeven. Andere bronnen geven echter ook een curve die lijkt op de onze.
Zoals in de discussie gezegd is dit waarschijnlijk het gevolg van het kleine aantal
pH-waarden waar we mee hebben gexperimenteerd. Mochten we in de
toekomst een soortgelijk onderzoek doen, dan zouden we meer pH-waarden
onderzoeken om onze resultaten nauwkeuriger te maken.

8. Bronnen
1. http://www.nuffieldfoundation.org/practical-biology/investigating-effect-ph-amylase-activity (5-
10-'15)
2. http://wetenschap.infonu.nl/scheikunde/119408-het-amylase-enzym.html (13-10-'15)
3. https://nl.wikipedia.org/wiki/Speeksel (22-10-'15)
4. https://nl.wikipedia.org/wiki/Maltose (24-10-'15)
5. https://nl.wikipedia.org/wiki/Enzym (25-10-'15)
6. Nectar Biologie 5vwo leerboek, 3e editie 2014, Noordhoff Uitgevers bv (25-10-'15)

9. Bijlagen
9.1 Opdracht 4:
Bedenk een proef waarmee je kunt nagaan of het effect van de zuurgraad op het
enzym wel of niet omkeerbaar is. Anders gezegd: stel vast of de enzymmoleculen wel
of niet blijvende schade hebben ondervonden van de zuurgraad van het milieu.
Maak een werkplan voor deze proef. (Wegens tijdnood hoefden we deze proef niet uit
te voeren)

Onderzoeksvraag
Ondervinden enzymen wel of niet blijvende schade aan de zuurgraad van het
milieu?

Hypothese
Ja, enzymen ondervinden wel schade bij blootstelling aan een bepaalde zuurgraad. Wij zijn
tot deze conclusie gekomen door wat zich afspeelt in ons verteringssysteem. Kijk naar de
maag, daar vind je een lage pH. Hier werken de enzymen niet meer omdat de pH hier ver
afwijkt van hun optimum. In de twaalfvingerige darm worden nieuwe amylase-enzymen
toegevoegd. Dit moet dus betekenen dat de enzymen die door de maag kwamen niet meer
werken als ze terugkomen in een milieu met de goede zuurgraad (de twaalfvingerige darm
heeft een zuurgraad van ongeveer 7).
Ook stelt het leerboek in paragraaf 11.3: "Buiten hun optimum pH, kan de ruimtelijke
structuur van het enzym veranderen en de mogelijkheid het substraat te binden
uitgeschakeld worden."
Werkplan
Eerst deden we 0,5 ml amylase-oplossing bij een buffer met een extreme zuurgraad,
deze zuurgraad wijkt erg af van het optimum van amylase.
Vervolgens wachten we circa een half uur.
Toen voegden we een basische oplossing toe totdat de pH bij 6,9 ligt zoals buis 3 in
ons eerste experiment. We maten dit met een pH-meter.

Daarna voegden we 2 ml zetmeel-oplossing toe en vervolgden we onze proef zoals in

het 'gewone' werkplan door elke minuut te testen of er zetmeel in zat.

Als laatste vergeleken we de resultaten van deze proef met de resultaten van onze
eerste proef. Als de afbraak later was voltooid of helemaal niet, dan ondervinden
enzymen dus blijvende schade door blootstelling aan een bepaalde zuurgraad.

Door bovenstaande stappen met verschillende pH-waarden te volgen, kan in kaart

worden gebracht bij welke zuurgraden amylase schade ondervindt.